WO2013064129A1 - Adjuvantes para vacunas polisacaridicas y las formulaciones resultantes - Google Patents

Adjuvantes para vacunas polisacaridicas y las formulaciones resultantes Download PDF

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WO2013064129A1
WO2013064129A1 PCT/CU2012/000006 CU2012000006W WO2013064129A1 WO 2013064129 A1 WO2013064129 A1 WO 2013064129A1 CU 2012000006 W CU2012000006 W CU 2012000006W WO 2013064129 A1 WO2013064129 A1 WO 2013064129A1
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polysaccharide
response
usa
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Oliver Germán PEREZ MARTÍN
Belkis Romeu Alvarez
Miriam de San Juan Bosco LASTRE GONZÁLEZ
Caridad Zayas Vignier
Elizabeth GONZÁLEZ AZNAR
Julio Antonio BALBOA GONZÁLEZ
Osmir Cabrera Blanco
Maribel CUELLO PÉREZ
Luis Guillermo GARCÍA IMIA
Reinaldo Acevedo Grogues
Ramón Faustino BARBERÁ GONZÁLEZ
José Luis PÉREZ QUIÑOY
Francklin Tomás SOTOLONGO PADRÓN
Concepción CAMPA HUERGO
Gustavo Victoriano SIERRA GONZÁLEZ
Aleida MANDIAROTE LLANES
Daniel Tomás CARDOSO GONZÁLEZ
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Instituto Finlay. Centro De Investigación- Producción De Sueros Y Vacunas.
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • This invention relates to vaccinology, particularly to polysaccharide vaccines and adjuvants.
  • the technical objective pursued is to obtain immunogenic compositions for mucosal and parenteral applications comprising a single capsular saccharide or multiple bacterial preferably unconjugated and potent adjuvants capable of inducing immune memory and functioning in young children in order to use them in the pharmaceutical industry as vaccines. for the treatment and prevention of human and veterinary diseases.
  • Thymus Dependents whose representatives are independent proteins and T (TI). These are subdivided into TI-1 (Lipopolysaccharides, LPS or lipooligosaccharides) and into TI-2 (Polysaccharides, Ps). Bacteria can be coated with a Ps capsule to protect against the immune response. Most of the Ps of pathogenic bacteria are negatively charged or neutral behaving as TI-2 antigens. The less have positive and negative charges in their repetitive units ('switcherionics') as with Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae type 1 and these behave like TD antigens.
  • the repetitive units of the Ps TI interact directly with the surface receptors (immunoglobulins) of the B lymphocytes, without requiring or inducing a T response. Therefore, they do not work in neonates where the marginal areas of the lymph nodes, where they are stored the Ps, are immature. Consequently, no immune memory is induced, which requires a cellular response, T.
  • Immune memory is the ability of the immune system to remember a previous encounter with a pathogen or vaccine. Immune memory is the essential condition of vaccinology. This is only induced against TD antigens.
  • the globally accepted strategy to solve the IT of the Ps is the Covalent Conjugation.
  • the carrier activates T cells by increasing the expression of important surface molecules in the antigen presentation and produces important cytokines to induce memory and stimulate the production of TD antibodies.
  • Oligosaccharides Meningitidis serogroup C conjugates have been approved for human use as Menjugate® (Costantino et al.
  • a Non-Covalent Conjugation involves weak unions in which they intervene: Van der Waals forces, Hydrophobic, Hydrogen bridges and Ionic interactions, could be enhanced by powerful adjuvants.
  • Adjuvants are substances that enhance the specific immune response against an antigen, causing a faster induction of the antigen and increasing its duration (Vogel FR. Dev. Biol. Stand. 1998,92: 241-248). Alumina remains the most commonly used adjuvant in parenteral vaccines. However, this is not a potent adjuvant that could help new vaccines by subunits. It is considered that it only has distribution system properties and a new mechanism of action independent of Toll-like receptors that involves Nalp3 has recently been described (Eisenbarth SC et al. Nature, 2008,453: 1 122-1 126). Its mucosal utility has also not been proven and it is assumed that it preferentially induces a Th2 response.
  • Licensed vaccine adjuvants are scarce (MF59, AS02, Virosoma, AFPL1, Proteollin, MPL, etc.) and few are those of mucosal application, of which there are none licensed in humans (LT mutants (LT63K, LTR72), CpG , Chitosana, ISCOM and AFCol) (Singh M and O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002, 19 (6): 715-728, Pérez O et al. Immunology and Cell Biology. 2004,82: 603-610).
  • Adjuvants are involved in: stimulating the innate response (Immunopotentiators); properly distribute the antigens (Delivery System) (Pashine A Valianti NM. Nat. Med. 2005, 1 LS63-68; Singh M and O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002, 19 (6) : 715-728) and direct the immune response towards the desired protective responses (Immunopolarization) (O Pérez, et al. PharmacologyOnline, 2006.3: 762-64).
  • the development of Immunopotentiators or delivery systems that are effective by mucosal route is another primary goal of vaccine development and global pharmaceutical companies. These have focused on looking for Adjuvant Systems that combine one or more immunopotentiators with an adequate delivery system.
  • proteoliposomes and their cochlear derivatives that contain several immunopotentiators that act synergistically, have the capacity to distribute and polarize the immune response preferentially towards Thl patterns with the induction of cytotoxic responses (CTL, Pérez O , et al. Scand J Immunology 2007.66: 271-77; certificate of author of invention OCPI 23313, 2008; Pérez Mart ⁇ n OG et al; WO / 2004/047805; WO / 2003/094964 and EP1716866).
  • cochleates developed by us are derived from proteoliposomes (outer membrane vesicles, mainly from bacteria) that contain proteins and lipids (proteolipid structures) and were aimed at obtaining potent mucosal adjuvants.
  • proteoliposomes outer membrane vesicles, mainly from bacteria
  • cochleates not derived from Proteoliposomes Pérez Mart ⁇ n OG et al., OCPI, CU / P / 201 1/123.
  • cochleates have also been obtained from synthetic or purified lipids (Gould-Fogerite et al. US Pat. No.
  • N. meningitian serogroup C (PsC) polysaccharide co-administered with AFCol induces mucosal and systemic response in murines (Scand J Infec ⁇ Dis, 201 1, 1-5 and Expert Vaccine Review 201 1). It has also been reported that TLR ('Toll-like receptor') agonists generate a long-lasting humoral response against Ps planes ⁇ Streptococcus pneumoniae) in adult mice and infants; but only when they are administered 2 days after Ps (Taillardet M, et al. JID 2010, 202: 470-479), that is, they are two different formulations with few vaccine possibilities. In addition, the response that boosts is especially the specific IgG3, subclass induced mainly by the flat Ps and not by the conjugates.
  • PsC N. meningitian serogroup C
  • the invention provides immunogenic compositions for mucosal and parenteral applications comprising 1) a single or multiple bacterial capsular saccharide not conjugates and 2) powerful adjuvants.
  • the composition preferably comprises 3) one or more additional antigens and / or 4) one or more adjuvants.
  • the invention also provides an immunogenic composition for parenteral application, comprising saccharides of at least PsC and AFPL1 adsorbed on alumina. Additionally, the use of AFPL of serogroup A and / or W135 of N. meningitidis and the homologous Ps (PsA) without restricting them.
  • the invention also provides an immunogenic composition for mucosal application, comprising saccharides of at least PsC or PsVi and AFCol without being restricted thereto.
  • the capsular Ps in the compositions of the invention are preferably unconjugated without excluding the conjugates, which allows obtaining fast formulations particularly important during epidemics.
  • the cytokine microenvironment created by powerful non-inert adjuvants allows B-T collaboration, its functionality in infants and infants and the induction of essential immune memory against Ps.
  • the present invention aims to obtain immunogenic compositions for mucosal and parenteral applications comprising a single or multiple bacterial capsular saccharide preferably unconjugated and potent adjuvants capable of inducing immune memory and functioning in young children in order to use them in the pharmaceutical industry as vaccines for the treatment and prevention of human and veterinary diseases.
  • Proteoliposome means vesicles obtained from the outer membrane of microorganisms, particularly bacteria using various methods, such as: isolation without detergent; a process that includes detergent (such as deoxycholate, SDS, etc.) or the extraction from vesicles ("bleb") of crop supernatants and, particularly, those disclosed in US 5,597,572.
  • Proteoliposomes are made up of abundant proteins inserted in the lipid structure.
  • “Finlay adjuvants” means the families of AFPLx and AFCox.
  • AFPLx means the family of Finlay Adjuvants extracted from the outer membrane of microorganisms such as AFPL 1 of N. meningitidis serogroup B, AFPL2 of Vibrio cholerae and those obtained from N. meningitidis serogroup A or W 135, Bordetella pertusis, Escherichia coli, among others.
  • AFCox is meant the family of cochleates derived from the respective Proteoliposomes such as AFCo l of N. meningitidis serogroup B, AFPL2 of V. cholerae among others.
  • “Cochleates not derived from Proteoliposomes” means that they are not derived from a proteoiiposome as referred to in the patent (WO / 2004/047805), Pérez O et al. Infect Immun. 2001, 69 (7): 4502 ⁇ 1508 and Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004, 82: 603-610) nor to those produced from synthetic lipids (Gould-Fogerite et al. US Pat. No. 5, 643, 574, July 1, 1997), but those referred to in the applied patent (Pérez Mart ⁇ n OG et al., CU / P / 201 1/123).
  • Powerful non-inert adjuvants means AFPLx and AFCox derived or not from Proteoliposomes that contain one or more "MAMP", particularly of synergistic action (such as LPS, Porins and traces of bacterial DNA among others) but not limited to these adjuvants and containing several proteins that induce proinflammatory cytokines that polarize the response to a predominant Thl pattern.
  • MAMP synergistic action
  • MAMP means molecular structures conserved in microbes, pathogenic or not (better known as PAMP), capable of stimulating the innate immune system and thereby inducing a potent adaptive response and even being involved in polarizing the immune response.
  • adjuvants containing several MAMP of synergistic action is desirable when powerful adjuvants are required.
  • the line of the adjuvant systems of GlaxoSmithKline is based on the combination of several compounds with adjuvant effect, while the "Adjuvant Finlay" derived from proteoliposomes are a good example of the synergistic action among several MAMPs.
  • the present invention finds that the AFCol and the AFPL1 are capable of switch to IT from Ps to TD and even more towards a cellular pattern, Th 1.
  • the mucous and parenteral system are organized differently and even the mucosal is more compartmentalized.
  • There are no licensed mucosal adjuvants in human vaccines and it is more difficult to induce a mucosal response than parenterally (Bouvet, JP et al. I & I. 1994, 62: 3957-3961 and Nardelli-Haefliger, DR, et al. J. Virol. 1999, 73: 9609-9613). It was found that the nasal route was as efficient as the parenteral way to induce memory and function in neonatal and infant mice when using adjuvant Ps with the referred adjuvant potent.
  • TI antigens such as the PsC and PsA of serogroup C and A of N. meningitiáis, respectively, and the Ps Vi of Salmonella Typhi were efficiently supported by Finlay Adjuvants.
  • the A + C combination was also efficient as well as the homologous adjuvant of PsA by AFPL of serogroup A and W135.
  • the Ps, as well as their oligosaccharide fractions were also efficiently adjuvant. In these, memory response was induced before a booster dose several months after immunization.
  • the adjuvant Ps vaccine formulations of the present invention can be used in human and veterinary prophylactic vaccines.
  • the novelty of the present invention lies, first, in obtaining adjuvant formulations of unique IT antigens that do not require covalent conjugation to break the IT of Ps. It is particularly novel that not only can the IT of the Ps be changed, but immune memory responses similar to the conjugated Ps are induced and function in neonates and infants, for which powerful stimuli are required by the immature characteristics of their immune systems It is particularly novel that the formulations work when applied by mucosal and / or parenteral or simultaneous immunization routes.
  • Example 1 Obtaining the formulations of AFPLl and AFCol with the polysaccharides of Nesisseria meningitidis serogroup C or Polysaccharide Vi of Salmonella Typhi
  • Resuspension Solution 30 mM Tris and 1% sodium deoxycholate, pH 7.6 • Formation Solution (SF): 30 mM Tris, 10 mM CaCl 2 and 100 mM NaCl, pH7.4
  • N. meningitdis proteoliposome in the SR is resuspended and adjusted to a concentration of 2 mg in 1 mL (10 mL)
  • the SF is added at the same volume as the resuspended proteoliposome (10 mL) at a flow of 8.3 mL per minute in slow agitation
  • Example 2 Immunogenicity of the intranasal formulation of AFCol and AFPL1 co-administered with Vi polysaccharide (PsVi) from Salmonella Typhi Immunization Protocol.
  • PsVi Vi polysaccharide
  • Balb / c mice were immunized with three intranasal doses (i.n) of 25 ⁇ , of AFPL1 or AFCol (50 ⁇ g) applied at 0, 7 and 14 days co-administered with 25 ⁇ g of PsVi.
  • PsVi was used by the route in at the same concentration and dose as the formulations with AFPL1 and AFCo l, 25 ⁇ g of PsVi in 25 ⁇ , and the flat Cuban PsVi vaccine, Vax-TyVi®, a dose of 5 ⁇ g of PsVi in 100 ⁇ , im All groups received a booster dose via i.m 100 days after the last dose with the Cuban vaccine, Vax-TyVi (5 ⁇ g of PsVi in 100 ⁇ ).
  • Blood collection was performed 15 days after the last dose.
  • blood was extracted by puncturing the retro-orbital plexus using heparinized capillaries.
  • the blood samples obtained were incubated for 1 h at 37 ° C, then centrifuged at 12,500 g for 10 min to extract the serum. This was stored at -20 ° C until use.
  • SB Blocking solution
  • BSA St. Louis, MO, USA
  • SL Washing solution
  • SSTF SSTF, 0.05% Tween-20 (v / v);
  • SDM Sample dilution solution
  • BSA BSA
  • Anti-mouse IgG and anti-mouse IgM conjugated to peroxidase SIGMA, St. Louis, MO, USA
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • the reaction is stopped by adding 50 ⁇ of a stop solution and •
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • a specific antigen systemic response far superior to that achieved by the flat polysaccharide vaccine or the polysaccharide administered by the nasal route (Fig. 1A and I B) is induced with nasal formulations as adjuvants as stimulants of the anti-polysaccharide response.
  • the adjuvant AFPLl and AFCo l by the nasal route are capable of stimulating the specific antigen response against the polysaccharide Vi
  • Example 3 Determination of the IgGl, IgG3, IgG2a and IgG2c anti Polysaccharide Subclass Pattern for the intranasal formulation of AFPLl or AFCol co-administered with PsVi
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • Finlay adjuvants by the nasal route allow the induction of a varied pattern of subclasses, typical of the TD antigen response.
  • Induction of IgG2a and IgG2c anti PsVi evidences the induction of a cellular response, typical characteristic of TD antigens.
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • Example 5 Kinetics of anti-polysaccharide antibodies of the intranasal formulation of AFPL1 or AFCol co-administered with Salmonella Typhi Vi (PsVi) polysaccharide and secondary response after a Vax-TyVi booster
  • Example 2 Method of obtaining and processing samples.
  • the animals were challenged with an intramuscular dose of the Vax-TyVi Cuban flat polysaccharide vaccine (5 ⁇ g / 100 ⁇ ).
  • an intramuscular dose of the Vax-TyVi Cuban flat polysaccharide vaccine (5 ⁇ g / 100 ⁇ ).
  • blood was extracted by puncturing the retro-orbital plexus using heparinized capillaries. Blood collection was performed at 15, 30, 60, 90, 100 and 1 12 days after the last dose.
  • the blood samples obtained were incubated for 1 h at 37 ° C, then centrifuged at 12,500 g for 10 min to extract the serum. This was stored at -20 ° C until use. Detection of IgG anti PsVi by ELISA
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • SDM Sample dilution solution
  • BSA BSA
  • Anti-mouse IgG conjugated to peroxidase SIGMA, St. Louis, MO, USA
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • TI-2 antigens are not able to raise a secondary response after repeated doses of flat polysaccharide.
  • the primary immunization of PsVi with the adjuvants AFPLl and AFCol was able to develop a secondary immune response of superior to primary memory, a distinctive feature of conjugate vaccines or protein vaccines, where repeated doses of the antigen cause antibody titers similar to or greater than primary responses (booster response).
  • Example 6 Determination of the affinity index and the cumulative reduction in affinity for the intranasal formulation of AFPLl or AFCol and PsVi after a dose of Booster with VaxTyVi 100 days after the last dose
  • SB Blocking solution
  • BSA St. Louis, MO, USA
  • Washing solution SSTF, 0.05% Tween-20 (v / v);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • Antibodies produced by polysaccharide vaccines are less functional than antibodies induced by protein antigens.
  • an increase in the affinity index was observed after immunization with Vax-TyVi parenterally, suggesting the induction of a memory response of B cells.
  • the immunization of a booster dose with the homologous antigen can lead to high affinity memory B cells being recruited, even when there are antibodies present, these cells compete for the antigen with low affinity virgin B cells, resulting in Final production of high affinity antibodies.
  • Example 7 Determination of the IgGl, IgG3, IgG2a and IgG2c anti Polysaccharide Subclass Pattern for the intranasal formulation of AFPLl or AFCol co-administered with PsVi after a booster dose with Vax-TyVi at 100 days after the last dose
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • the reaction is stopped by adding 50 ⁇ 50 of a stop solution and •
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • the subclass response pattern induced with the use of both adjuvants in the nasal route formulations in the secondary response was similar to the anti-PsVi subclass pattern obtained in the primary response (Fig. 6A, 6B, 6C, 6D).
  • the secondary response of lgG2c and IgG2a anti-PsVi was higher than the primary response (Fig. 6C and 6D).
  • the specific anti-PsVi response of IgG2a and IgG2c was superior in the formulation containing AFCol, as an adjuvant. (Fig. 6C and 6D).
  • the response against flat PsVi was characterized by high IgG3 values, typical of TI-2 antigens (Fig 6B).
  • the subclass response of the adjuvant formulations showed a subclass response pattern superior to that obtained in the primary response.
  • Finlay adjuvants through the nasal route allow the induction of an unrestricted pattern of subclasses, typical of the TD antigen response.
  • Induction of IgG2a and IgG2c anti polysaccharide values indicates the induction of a cellular response, typical characteristic of TD antigens.
  • Example 8 Determination of effector T cells by standard ELISPOT after a booster dose with Vax-TyVi 100 days after the last dose
  • Blocking solution Complete DMEN medium (10% Bovine Fetal Serum and 0.29g / L L-glutamine) (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Dilution solution SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA); ⁇ 0.1 M Acetate Solution (SA): 0.2M Sodium Acetate and 0.2M glacial acetic acid, pH 5
  • SAEC Aminoethylcarbazole
  • Substrate buffer solution 800 SAEC in 24 mL SA, slow addition and moderate agitation, filter by 0.45 ⁇ and add 12 ⁇ , of ⁇ 2 0 2
  • the results of cells secreting IFN- ⁇ anti-LVSP were expressed as the number of cells secreting IFN- ⁇ when stimulated with lO pSVI 5.
  • TI-2 antigens such as flat Ps are unable to stimulate a T-cell response, since they only activate B cells in the absence of T-cell cooperation. Only conjugated Ps vaccines are able to stimulate T-cell activation. , given by the presence in the conjugate of the carrier protein.
  • the detection of an IFN- ⁇ anti PsVi response after a booster dose with the homologous antigen was extremely surprising since primary immunization was carried out with formulations that did not include covalent conjugation, which confirms that the use of potent adjuvants In the formulations with TI-2 antigens, this thymus-independence can be reversed, behaving like a conjugate vaccine.
  • Example 9 Systemic immunogenicity of the intranasal formulation of AFCol co-administered with Neisseria meningitidis serogroup C (PsC) polysaccharide after nasal reinforcement with PsC
  • PsC Neisseria meningitidis serogroup C
  • Blood collection was performed at 21 days after the last dose and 21 days after the i.n booster with PsC alone.
  • To obtain the serum blood was extracted by puncturing the retro-orbital plexus using heparinized capillaries. The blood samples obtained were incubated for 1 h at 37 ° C, then centrifuged at 12,500 g for 10 min to extract the serum. This was stored at -20 ° C until use.
  • SB Blocking solution
  • BSA St. Louis, MO, USA
  • SL Washing solution
  • SSTF SSTF, 0.05% Tween-20 (v / v);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and ⁇ Stop solution: H2SO 4 2 M.
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • the secondary anti-PsC IgG response found after intranasal immunization of flat PsC adjuvant with AFCol was similar to the primary response in formulations containing the adjuvant by the nasal route (Fig. 8).
  • TI-2 antigens are not capable of inducing a secondary memory response after repeated doses of flat polysaccharide.
  • the primary immunization of PsC with the adjuvant AFCol was able to develop a secondary immune response similar to the primary response, a distinctive feature of conjugate vaccines or protein vaccines, where repeated doses of the antigen cause antibody titers similar to or greater than the primary responses ( booster response).
  • Example 10 Mucosal immunogenicity of the intranasal formulation of AFCol co-administered with polysaccharide C of Neisseria meningitidis (PsC) after nasal reinforcement with flat PsC Immunization Protocol See example 9.
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • the plates are then washed three times and 100 ⁇ / ⁇ of the second conjugate (Streptavidin-peroxidase) 1: 2500 in SDM is added and incubated for 30 min at 37 ° C.
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • the IgG2a response detected in animals immunized with PsC and AFCol suggests the induction of a cellular response, characteristic that is mainly observed with conjugated TD or Ps antigens.
  • mice were immunized with an intramuscular dose (im) of 100 ⁇ ,, of AFPL1 (12 ⁇ g) co-administered with 5 ⁇ g of PsVi.
  • im intramuscular dose
  • AFPL1 12 ⁇ g
  • PsVi adsorbed in alumina was used at a final concentration equal to the formulation with and the flat Cuban PsVi vaccine, Vax-TyVi®, a dose of 5 ⁇ g of PsVi in 100 ⁇
  • im All groups received a booster dose by im route 100 days after the last dose with the Cuban vaccine, Vax-TyVi (5 ⁇ g of PsVi in 100 ⁇ ).
  • Blood collection was performed 15 days after the last dose.
  • blood was extracted by puncturing the retro-orbital plexus using heparinized capillaries.
  • the blood samples obtained were incubated for 1 h at 37 ° C, then centrifuged at 12,500 g for 10 min to extract the serum. This was stored at -20 ° C until use.
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • mice anti-IgG conjugate diluted 1: 2500 or mouse anti-IgM conjugate diluted 1: 2500 in SDM is added;
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • a systemic antigen specific response is markedly superior to that achieved by the flat polysaccharide vaccine or to the formulation of the polysaccharide with the aluminum hydroxide adjuvant (Fig. 1 1 A and 1 IB).
  • the predominant immune response produced by polysaccharide vaccines is of the IgM type, where there is very little IgG response.
  • the adjuvant AFPLl by the intramuscular route is capable of stimulating a high systemic IgG specific antigen response against PsVi.
  • Example 13 Determination of the IgGl, IgG3, IgG2a and IgG2c Anti Polysaccharide Subclass Pattern for the intramuscular formulation of AFPLl and PsVi
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • the reaction is stopped by adding 50 ⁇ . of a detention solution and •
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • the adjuvant AFPL1 parenterally allows to reduce the induction of IgG3, a typical subclass of the response of unconjugated TI-2 antigens.
  • Example 14 Determination of the affinity index and the cumulative percent reduction with different concentrations of Thiocyanate for the intramuscular formulation of AFPLl and PsVi
  • SB Blocking solution
  • BSA St. Louis, MO, USA
  • SL Washing solution
  • SSTF SSTF, 0.05% Tween-20 (v / v);
  • SDM Sample dilution solution
  • BSA BSA
  • Solution with chaotropic agent with Potassium Thiocyanate at different concentrations of molarity KSCN 0.1M, 0.25M, 0.5M and 1M
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • Example 15 Immunogenicity of the formulation of derived outer membrane vesicles (Proteoliposome, PL) of N. meningitid serogroups A and W135 co-administered with polysaccharide A of N. meningitidis serogroup A (PsA)
  • Balb / c mice were immunized with two subcutaneous doses (sc) of 100 ⁇ , with 2.5 ⁇ g of each PL derived from N. meningitid serogroups A and W 135 (PLA and PLW 135, respectively) co-administered with 5 ⁇ g of PsA.
  • sc subcutaneous doses
  • PsA alone or with the aluminum phosphate adjuvant was used at a final dose of PsA of 5 ⁇ g in 100 ⁇ L, PLA and PLW135 without capsular polysaccharide (2.5 ⁇ g each) and the PsA conjugate vaccine (MenAfriVac ) at a dose of 0.2 ⁇ g of PsA in 100 ⁇ , by sc
  • Blood collection was performed 15 days after the last dose.
  • blood was extracted by puncturing the retro-orbital plexus using heparinized capillaries.
  • the blood samples obtained were incubated for 1 h at 37 ° C, then centrifuged at 12,500 g for 10 min to extract the serum. This was stored at -20 ° C until use.
  • Polysaccharide A was produced by the Finlay Institute Production Plant, respectively, under conditions of good manufacturing practices; Coating buffer solution (STR): Na 2 C0 3 1 1 mM, NaHC0 3 35 mM (pH 9.6)
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • a systemic anti PsA IgG response is significantly superior to that achieved by the flat polysaccharide and similar to the response induced by the MenAfriVac conjugate vaccine of said polysaccharide, which in turn brings as an adjuvant aluminum phosphate (Fig. 14A).
  • the primary response characterized by the induction of IgM was superior in the groups immunized with the flat polysaccharide (Fig. 14 B)
  • the predominant immune response produced by polysaccharide vaccines is of the IgM type, where there is very little specific IgG response, this response being only different when the polysaccharide is conjugated to a carrier protein.
  • the use of formulations containing potent adjuvants such as PL combined with flat PsA without covalent conjugation allowed to stimulate a high systemic IgG specific antigen response against PsA and induce lower levels of IgM response, similar to the response obtained with the conjugate vaccine commercial of this polysaccharide.
  • Example 16 Determination of the serum anti-PsA bactericidal antibody titer of the outer membrane vesicle formulation (Proteoliposome, PL) derived from N. meningitid serogroup A and W135 co-administered with TV polysaccharide A. meningitidis (PsA)
  • HBSS Hank balanced salt solution
  • BSA bovine serum albumin
  • Titres were expressed as the inverse of the highest dilution of serum causing 50% lysis or more of cells with respect to suspension control.
  • Serum bactericidal activity in mice immunized by sc with two doses (0 and 21 days), of the flat PsA adjuvant with PLA + PsW or conjugate were evaluated at 0, 21 and 35 days. Similar bactericidal activity was found between the conjugate group and the adjuvant with PLs. Bactericidal activity was also induced in the group that without PsA contained the PLA (Table. 1). Conclusions
  • Adjuvant Ps formulations with potent adjuvants such as PL induce similar serum bactericidal activities as the MenAfriVac conjugate vaccine.
  • Example 16 Determination of the Pattern of IgGl, IgG3, and IgG2a anti PsA Subclasses for intramuscular formulation of outer membrane vesicles of A and W135 co-administered with PsA
  • SB Blocking solution
  • BSA St. Louis, MO, USA
  • SL Washing solution
  • SSTF SSTF, 0.05% Tween-20 (v / v);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • Example 17 Determination of the affinity index for the formulation of outer membrane vesicles (Proteoliposome, PL) of A and W135 and PsA
  • SSTF Phosphate buffered saline solution 0.15 M (pH 7.2); ⁇ Blocking solution (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • Example 18 Induction of IgG and IgM anti PsC and serum bactericidal activity against N. meningitidis serogroups B and C in infants vaccinated with VA-MENGOC-BC ® and who are currently under one year old
  • VA-MENGOC-BC ® contains 50 ⁇ g of PsC and 50 ⁇ g of AFPL1 adsorbed in alumina per dose. Subsequently, serum IgG and IgM responses were evaluated in groups at different months (n in Fig. 17).
  • SB Blocking solution
  • BSA St. Louis, MO, USA
  • SL Washing solution
  • SSTF SSTF, 0.05% Tween-20 (v / v);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and ⁇ Stop solution: H 2 S0 4 2 M.
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • the strain N. meningitidis serogroup C (Cl 1) and B Cu 385 preserved in skim milk (OXOID, Basingstoke, Hampshire, United Kingdom) at -70 ° C in multiple aliquots was used.
  • a frozen aliquot was taken the day before the test was carried out and seeded by depletion to obtain isolated colonies on Mueller-Hinton Agar plates (OXOID, Basingstoke, Hampshire, United Kingdom) supplemented with 10% SBF (SIGMA, St. Louis, MO, USA) and the vancomycin-colymycin-nystatin (VCN) inhibitor (bioMerieux SA, Marcy I'Etoile, France).
  • the results of anti PsC IgG were expressed in U / mL using an anti PsC standard curve. Samples were considered positive above 367 U / mL. The results of IgM anti PsC were expressed as OD. In this test the samples are considered positive above the value of the means plus 2 standard deviations of the control samples.
  • the bactericidal titer was determined as the reciprocal of the maximum dilution of the serum that caused> 90% death of the CU or Cu 385 strain and was detected by the color invariability of the pH indicator. The titration was performed with the naked eye and the OD was read at 405 nm in a microplate reader (Labsystems Multiskan ® Multiso ⁇ ) to confirm the results. The results are expressed as a percentage of respondents. Results
  • the anti PsC IgG response increased from the first dose and remained positive in all the groups evaluated between 4 and 12 months of age (Fig. 17 A).
  • the IgM anti PsC also remained positive in all the groups evaluated (Fig. 17B).
  • the bactericidal response was similar for serogroups B and C except at 4 months in which the anti-C response predominated (Fig. 17C).
  • IgG response to IgM and anti PsC bactericide was induced during primovaccination with unconjugated PsC adjuvant with AFPLl absorbed in alumina in infants. These lasted up to a year.
  • Example 19 Persistence of the IgG and IgM anti PsC response in primovaccinated with VA-MENGOC-BC ® for at least 15 years
  • VA-MENGOC-BC ® contains 50 ⁇ g of PsC and 50 ⁇ g of AFPLl adsorbed in alumina per dose. Subsequently, serum IgG and IgM responses were evaluated in groups at different months (n in Fig. 18).
  • the IgG anti PsC response is maintained until age 15 although in low titres (Fig. 18A). However, there is anti-PsC IgM response in all groups except at 6 years (Fig. 18B).
  • Example 20 Subclasses of IgG anti PsC and its duration in primovaccinated with VA-MENGOC-BC ® compared to flat PsC vaccine
  • Blocking solution SB: SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Sample dilution solution SDM: SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, USA);
  • Substrate buffer solution Na 2 HP0 4 52 mM, 25 mM citric acid (pH 5.6) and
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a wavelength of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • IgG anti PsC The predominant response of IgG anti PsC was IgG4 and IgG3 (Fig 19A) and not the characteristic of the flat Ps which is the IgG2 observed in those vaccinated with the flat vaccine (Fig. 19 C). This response was maintained during the first year and to a lesser extent up to 15 years (Fig. 19A and 19B).
  • Adjuvation of flat PsC not conjugated with AFPLl adsorbed on alumina changes the response pattern of flat Ps (IgG2) in humans and is effective for vaccination in childhood.
  • FIG. 1 Immunogenicity of the intranasal formulation of AFCol and AFPL1 co-administered with PsVi.
  • C57BL / 6 mice were immunized with 3 doses i.n (25 ⁇ ) of AFCol or AFPL1 (50 ⁇ g) and PsVi (25 ⁇ g).
  • PsVi was used only by the i.n route (3 doses of 25 ⁇ g of PsVi) and the Cuban typhoid vaccine, Vax-TyVi (5 ⁇ g / 100 ⁇ ) by the intramuscular route.
  • the evaluation of the levels of IgG (A) and IgM (B) anti PsVi was performed in serum extracted 15 days after the last dose, by ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 2 independent experiments.
  • the significant differences between the means of the different groups were determined by Tukey multiple comparison test, present in the Graph Pad Prism 4 software (Calif.). The value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • FIG. 1 Response of IgGl, IgG3, IgG2a and IgG2c anti-PsVi subclasses for the intranasal formulation of AFCol and AFPL1 co-administered with PsVi.
  • C57BL / 6 ⁇ mice were immunized with 3 in (25 L) doses of AFCol or AFPL1 (50 ⁇ g) and PsVi (25 ⁇ g).
  • PsVi was used only by the in route (3 doses of 25 ⁇ g of PsVi) and the Cuban vaccine against typhoid fever, Vax-TyVi (5 ⁇ g / 100 xL) by the intramuscular route.
  • FIG. 3 Determination of affinity index and affinity reduction percent for intranasal formulation of AFPL1 or AFCol and PsVi.
  • C57BL / 6 mice were immunized with 3 doses in (25 AFC or AFPL1 (50 ⁇ g) and PsVi (25 As controls, PsVi was used only by the in route (3 doses of 25 ⁇ g of PsVi) and the Cuban typhoid vaccine, Vax-TyVi (5 ⁇ g / 100 xL) by the intramuscular route.
  • FIG. 4 Kinetics of anti-PsVi antibodies of the intranasal formulation of AFPL1 or AFCol co-administered with PsVi from Salmonella Typhi (PsVi) and the secondary response after a Vax-TyVi booster.
  • C57BL / 6 mice were immunized with 3 in (25 ⁇ L) doses of AFCol or AFPL1 (50 ⁇ g) and PsVi (25 ⁇ g).
  • PsVi was used only by the in route (3 doses of 25 ⁇ g of PsVi) and the Cuban vaccine against typhoid fever, Vax-TyVi (5 ⁇ g / 100 by the intramuscular route.
  • the evaluation of the levels of IgG (A) anti PsVi was performed in serum extracted 15, 30, 60, 90, 100 and 1 12 days after the last dose, by ELISA.
  • the comparison between the primary and secondary specific anti-PsVi IgG response (B) was determined with the sera removed - 15 days after the first immunization schedule and 12 days after the Vax-TyVi booster.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 2 independent experiments.
  • the significant differences between the means of the different groups were determined by Tukey multiple comparison test, present in the Graph Pad Prism 4 software (Calif.). The value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • PsVi was used only by the i.n route (3 doses of 25 ⁇ g of PsVi) and the Cuban typhoid vaccine, Vax-TyVi (5 ⁇ / 100 ⁇ ) by the intramuscular route.
  • In the figure show the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 2 independent experiments.
  • the significant differences between the means of the different groups were determined by Tukey multiple comparison test, present in the Graph Pad Prism 4 software (Calif.).
  • the value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant and represented by * ** (p ⁇ 0.001); ** (p ⁇ 0.01) and * (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 7 Determination of effector T cells by standard ELISPOT after a booster dose with Vax-TyVi 100 days after the last dose.
  • C57BL / 6 mice were immunized with 3 in (25 ⁇ ) doses of AFC as AFPL1 (50 ⁇ g) and PsVi (25 ⁇ g).
  • PsVi was used only by the in route (3 doses of 25 ⁇ g of PsVi) and the Cuban vaccine against typhoid fever, Vax-TyVi (5 ⁇ g / 10 ⁇ ) by the intramuscular route.
  • the evaluation of IFN- ⁇ secreting cells specific anti PsVi was determined in serum spleens extracted 10 days after booster with Vax-TyVi, by ELISA The means of 2 independent experiments are shown in the figure.
  • FIG. 8 Determination of the systemic immunogenicity of the intranasal formulation of AFCol co-administered with polysaccharide C of Neisseria meningitidis (PsC) after nasal reinforcement with flat PsC.
  • Balb / c mice were immunized with 3 doses i.n (25 ⁇ ) of AFCo l (50 ⁇ g) and PsC (10 ⁇ g).
  • PsC was used only by route i.n (3 doses of 10 ⁇ g).
  • the evaluation of the levels of IgG anti PsC was carried out in serum extracted 21 days after the last dose, by ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 2 independent experiments.
  • PsC was used only by route i.n (3 doses of 10 ⁇ g).
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 2 independent experiments.
  • the value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant and represented by * * * (p ⁇ 0.001); * * (p ⁇ 0.01) and * (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 10 Determination of the IgGl, IgG2a anti Polysaccharide Subclass Pattern for intranasal formulation of AFCol co-administered with PsC after nasal reinforcement with flat PsC
  • Balb / c mice were immunized with 3 in (25 ⁇ ) doses of AFCol (50 ⁇ g) and PsC (10 ⁇ g).
  • the PsC was used only by the in route (3 doses of 10 ⁇ g).
  • the evaluation of IgG levels le IgG2a anti PsC was performed in serum extracted 21 days after the last dose, by ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 2 independent experiments.
  • FIG. 11 Immunogenicity of the formulation by the intramuscular route of AFPL1 and PsVi.
  • C57BL / 6 mice were immunized with 1 dose i.m (100 ⁇ ) of AFPL1 (12 ⁇ g) and PsVi (5 ⁇ g).
  • PsVi adsorbed in alumina 5 ⁇ g of PsVi and 400 ⁇ g of alumina
  • Vax-TyVi 5 ⁇ g / 100 ⁇ L
  • the evaluation of the levels of IgG (A) and IgM (B) anti PsVi was performed in serum extracted 15 days after the last dose, by ELISA.
  • the figure shows the mean and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 2 independent experiments.
  • the significant differences between the means of the different groups were determined by Tukey multiple comparison test, present in the Graph Pad Prism 4 software (Calif.).
  • the value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant and represented by *** (p ⁇ 0.001); ** (p ⁇ 0.01) and * (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 12 Response of IgGl, IgG3, IgG2a and IgG2c anti-PsVi subclasses for the intramuscular formulation of AFPL1 and PsVi.
  • C57BL / 6 mice were immunized with 1 dose i.m (100 ih) of AFPL1 (12 ⁇ g) and PsVi (5 ⁇ g).
  • PsVi adsorbed in alumina 5 ⁇ g of PsVi and 400 ⁇ g of alumina
  • Vax-TyVi 5 ⁇ g / 100 ⁇ L
  • IgGl (A), IgG3 (B), IgG2c (C) and IgG2a (D) anti PsVi was performed in serum extracted 21 days after the last dose, by ELISA
  • the means are shown in the figure and standard deviation of the mathematical relationship of the values (OD) of 2 determinations in 2 independent experiments.
  • the significant differences between the means of the different groups were determined by multiple comparison test Tukey and Bonferroni, present in the Graph Pad Prism 4 software (Calif.).
  • the value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant and represented by *** (p ⁇ 0.001); ** (p ⁇ 0.01) and * (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 14 Immunogenicity of the outer membrane vesicle formulation (Proteoliposome, PL) of N. meningitidis A and W135 by the subcutaneous route and polysaccharide A (PsA) of N. meningitidis serogroup A.
  • Balb / c mice were immunized with 2 subcutaneous (sc) dose of N outer membrane vesicle (sc) meningitidis serogroup A and W135 (2.5 ⁇ g each) and PsA (5 ⁇ ).
  • FIG. 15 Response of IgG1, IgG3 and IgG2a anti PsA subclasses for formulation with the outer membrane vesicles (Proteoliposome, PL) of N. meningitidis A and W135 with PsA.
  • Balb / c mice were immunized with 2 doses (100 ⁇ sc) subcutaneous (sc) of outer membrane vesicle of N. meningitidis serogroup A and W135 (2.5 ⁇ g each) and PsA (5 ⁇ g).
  • FIG. 17 Response of IgG and IgM anti polysaccharide C (PsC) of N. meningitidis serogroup C and serum bactericidal activity (SBA) in infants primovaccinated with VA-MENGOC-BC ® and who are less than one year old. Each group of n sera comes from a total of 151 infants who were vaccinated at 3.5 (first dose) and 5 (second dose) months.
  • A anti PsC IgG
  • B anti PsC IgM and C
  • the arrows represent the doses with VA-MENGOC-BC ® , a bivalent vaccine containing PsC adsorbed in alumina next to AFPL1.
  • FIG. 18 Persistence of the response of IgG and IgM anti polysaccharide C (PsC) of N. meningitidis serogroup C in infants primvacccinated with VA-MENGOC-BC ® and who are between 2 and 15 years old. Each group of n sera comes from a total of 191 first vaccinated at 3.5 (first dose) and 5 (second dose) months and are now children (136) and school children and adolescents (55). A, anti PsC IgG and B, anti PsC IgM.
  • PsC polysaccharide C
  • FIG. 19 Subclasses of induced serum IgG and its duration in primary infants vaccinated with VA-MENGOC-BC ® .
  • Each group of n sera comes from a total of 388 first-vaccinations at 3.5 (first dose) and 5 (second dose) months and are now infants 151 infants, 136 children, school children and adolescents 55 and young adults 46. Fifteen additional young adults They received a dose of flat vaccine A + C (Pasteur Merieux Connaught).
  • A subclasses of IgG anti PsC in children under one year
  • B subclasses of IgG anti PsC from 2 to 15 years
  • C subclasses of IgG anti PsC in immunized with flat A + C vaccine.

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Abstract

La invención provee composiciones inmunogénicas para aplicaciones mucosales yparenterales comprendiendo (1) un sacárido capsular único o múltiples bacteriano noconjugados y (2) potentes adyuvantes. Polisacáridos u oligosacáridos planos son preferidos sin excluir la adición de los potentes adyuvantes a polisacáridos conjugados. Es preferido que los adyuvantes sean los AFCox (Adjuvant Finlay Cocleato familia x) o AFPLx (Proteoliposoma familia x). Es preferido la vía mucosal sin excluir la parenteral o combinaciones de estas. La invención también provee composiciones inmunogénicas a) un antígeno sacarídico capsular de serogrupo C o serogrupo A de. Neisseria meningitidis, b) los adyuvantes AFPL1 adsorbido en alúmina por vía parenteral o AFPL1 no adsorbido o AFCol por vía nasal y c) la aplicación de dos 'priming' parenteral y mucosal simultáneos con cualesquiera de los potentes adyuvantes formulados con los referidos antígenos. El empleo de potentes adyuvantes formulados con polisacáridos no conjugados aumentan la respuesta inmune mucosal y sistémica polarizando la respuesta Timo independiente de los polisacáridos hacia una respuesta Timo Dependiente con un patrón Thl, celular, que garantiza su funcionalidad en niños pequeños e induce memoria inmune sin requerir la conjugación covalente.

Description

ADJUV ANTES PARA VACUNAS POLISACARIDICAS Y LAS FORMULACIONES
RESULTANTES
Memoria Descriptiva Todos los documentos citados aquí son incorporados por referencia en su totalidad. Solicitudes de Patentes Relacionadas
Esta patente es una continuación de la Solicitud de Patente PCT/CU2003/000016 solicitada en Cuba el 27/1 1/02 y publicada en ingles (WO 2004/047805 Al); de la Solicitud de Patente PCT/CU2003/00007 solicitada en Cuba el 8/5/02 y publicada en ingles (WO 03/094964 Al); de la Solicitud de Patente PCT /CU2004/000017 aplicada el 30/12/2003 y publicada en ingles (WO 2005063287 Al) ; de la Solicitud de Patente PCT /CU2009/000008 solicitada el 13.11.09 y publicada EP2359850 (Al), de la Solicitud de Patente PCT/CU201 1/000002 aplicada en el 201 1 y de la Solicitud de Patente CU/P/201 1/123 solicitada el 31/5/201 1. Las enseñanzas de las aplicaciones anteriores son incorporadas aquí en su totalidad por referencia.
RAMA DE LA TÉCNICA
Esta invención se relaciona con la vaccinología, particularmente con las vacunas polisacáridicas y los adyuvantes. El objetivo técnico que se persigue es obtener composiciones inmunogénicas para aplicaciones mucosales y parenterales comprendiendo un sacárido capsular único o múltiples bacterianos preferiblemente no conjugados y potentes adyuvantes capaces de inducir memoria inmune y funcionen en niños pequeños con el fin de emplearlos en la industria farmacéutica como vacunas para el tratamiento y prevención de enfermedades humanas y veterinarias. ESTADO DEL ARTE
Atendiendo a la respuesta que inducen los antígenos se clasifican en Timo Dependientes (TD) cuyos representantes son las proteínas y T independientes (TI). Estos se subdividen en TI-1 (Lipopolisacáridos, LPS o lipooligosacáridos) y en TI-2 (Polisacáridos, Ps). Las bacterias pueden recubrirse de una cápsula de Ps para protegerse de la respuesta inmune. La mayoría de los Ps de las bacterias patogénicas están cargados negativamente o son neutros comportándose como antígenos TI-2. Los menos presentan cargas positivas y negativas en sus unidades repetitivas ('switerionicos') como ocurre con Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae type 1 y éstos se comportan como antígenos TD. Las unidades repetitivas de los Ps TI interactúan directamente con los receptores (inmunoglobulinas) de superficie de los linfocitos B, sin requerir ni inducir respuesta T. Por ello, no funcionan en los neonatos donde las zonas marginales de los nodulos linfáticos, lugar donde se almacenan los Ps, están inmaduras. Consecuentemente, no se induce memoria inmune, la que requiere de respuesta celular, T. La memoria inmune es la capacidad que tiene el sistema inmune de recordar un encuentro previo con un patógeno o vacuna. La memoria inmune es la condición esencial de la Vaccinología. Esta sólo se induce contra los antígenos TD. No obstante, existen varias vacunas de Ps planos humanas desde hace varios años, como la inyectable tetravalente de los serogrupos A, C, Y y W135 (Armand et al. (1982) J. Biol. Stand. 10:335-339. y Cadoz et al. (1985) Vaccine 3:340-342). Aunque efectivas en adolescentes y adultos, ellas inducen una pobre respuesta inmune, una protección de corta duración con ausencia de memoria y no pueden ser usados en infantes (ej. MMWR (1997) 46(RR-5) 1-10). Otro problema de los Ps es que inducen hiporespuesta de anticuerpos frente a una dosis de refuerzo o contacto con dicho agente y pueden llegar a afectar la memoria inducida contra ellos (ej. Granoff D and Pollard A J. The Pediatric Infectious Disease Journal 2007; 26(8):716-22). La estrategia globalmente aceptada para resolver la TI de los Ps es la Conjugación Covalente. Esta forma enlaces estables y no reversibles entre el Ps y un portador, generalmente una proteína, que al aportar epitopes T, convierte a los antígenos TI conjugados en TD, lo que garantiza su funcionalidad en neonatos, la inducción de memoria inmune y no inducir hiporespuesta. El portador activa las células T aumentando la expresión de moléculas de superficie importantes en la presentación antigénica y produce citocinas importantes para inducir memoria y estimular la producción de anticuerpos TD. Oligosacáridos de N. meningitidis serogrupo C conjugados se han aprobado para uso humano como Menjugate® (Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698). No obstante se requiere mejorar las conjugadas de los serogrupos A, W135, Y y X así como en su manufactura. No obstante, la purificación de los Ps así como su transformación en oligosacáridos esta consolidada (Frash (1990) p.123-145 of Advances in Biotechnological Processes vol. 13 (eds. Mizrahi & Van Wezel y WO 03/007985).
Otra posibilidad, no explorada y menos aceptada, podría ser la presentación de los Ps en un ambiente de potentes adyuvantes que resuelvan la TI induciendo memoria inmune y funcione en los niños, particularmente en menores de 2 años de edad. Una Conjugación No Covalente cursa por uniones débiles en las que intervienen: fuerzas de Van der Waals, Hidrofóbicas, puentes de Hidrógeno e interacciones Iónicas, pudiera ser potenciada por potentes adyuvantes.
Los adyuvantes son sustancias que potencian la respuesta inmune específica contra un antígeno, provocando una inducción más rápida de esta y aumentando su duración (Vogel FR. Dev. Biol. Stand. 1998,92:241-248). La alúmina continúa siendo el adyuvante más usado en las vacunas parenterales. No obstante, este no es un potente adyuvante que pudiera ayudar a las nuevas vacunas por subunidades. Se considera que sólo posee propiedades de sistema de reparto y recientemente se ha descrito un nuevo mecanismo de acción independiente de los receptores parecidos a Toll que involucra al Nalp3 (Eisenbarth SC et al. Nature, 2008,453: 1 122-1 126). Su utilidad mucosal tampoco ha sido probada y se asume que induce preferentemente una respuesta Th2. Los adyuvantes vacunales licenciados son escasos (MF59, AS02, Virosoma, AFPL1, Proteollin, MPL, etc.) y pocos son los de aplicación mucosal, de los que no hay ninguno licenciado en humanos (mutantes de LT (LT63K, LTR72), CpG, Quitosana, ISCOM y AFCol) (Singh M y O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002, 19(6):715-728, Pérez O et al. Immunology and Cell Biology. 2004,82:603-610).
Los adyuvantes están involucrados en: estimular la respuesta innata (Inmunopotenciadores); distribuir adecuadamente los antígenos (Sistema de Reparto ['Delivery System']) (Pashine A Valianti NM. Nat. Med. 2005, 1 LS63-68; Singh M y O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002, 19(6):715-728) y dirigir la respuesta inmune hacia las respuestas protectoras deseadas (Immunopolarización) (O Pérez, et al. PharmacologyOnline, 2006,3 :762-64). El desarrollo de inmunopotenciadores o sistemas de reparto que sean efectivos por vía mucosal es otro objetivo principal del desarrollo de vacunas y de las compañías farmacéuticas mundiales. Estas se han centrado en buscar Sistemas de Adyuvantes que combinen uno o varios inmunopotenciadores con un adecuado sistema de reparto. Nosotros, por el contrario, hemos partido de proteoliposomas y sus derivados cocleares que contienen varios inmunopotenciadores que actúan en forma sinérgica, tienen capacidad de reparto y que polarizan la respuesta inmune preferencialmente hacia patrones Thl con la inducción también de respuestas citotóxicas (CTL, Pérez O, et al. Scand J Immunology 2007,66:271 -77; certificado de autor de invención OCPI 23313, 2008; Pérez Martín OG y cois; WO/2004/047805; WO/2003/094964 y EP1716866). Los cocleatos desarrollados por nosotros son derivados de proteoliposomas (vesículas de membrana externa, fundamentalmente de bacterias) que contienen proteínas y lípidos (estructuras proteolipídicas) y estaban dirigidos a obtener potentes adyuvantes mucosales. Por otro lado, hemos desarrollado también cocleatos no derivados de Proteoliposomas (Pérez Martín OG y cois., OCPI, CU/P/201 1/123). Mundialmente también se han obtenido cocleatos a partir de lípidos sintéticos o purificados (Gould-Fogerite et al. U. S. Pat. No 5, 643, 574, July 1 , 1997; Zarif, Methods Enzymol 2005,391 :314-29; Miclea, Varma et al. Biochim Biophys Acta 2007, 1768(1 1):2890-8; and Syed, Woo et al. Int J Pharm 2008, 363(1 -2): 1 18-25).
Nosotros hemos encontrado que el polisacárido de N. meningitiáis serogroup C (PsC) coadministrado con el AFCol induce respuesta mucosal y sistémica en murinos (Scand J Infecí Dis, 201 1, 1-5 y Expert Vaccine Review 201 1). También se ha reportado que agonistas de los TLR ('Toll-like receptor') generan una respuesta humoral de larga duración contra Ps planos {Streptococcus pneumoniae) en ratones adultos y en infantes; pero sólo cuando son administrados 2 días después del Ps (Taillardet M, et al. JID 2010, 202:470-479), es decir, son dos formulaciones diferentes con pocas posibilidades vacunales. Además, la respuesta que potencia es sobre todo la IgG3 específica, subclase inducida principalmente por los Ps planos y no por los conjugados.
Revelaciones de la Invención
La invención provee composiciones inmunogénicas para aplicaciones mucosales y parenterales comprendiendo 1 ) un sacárido capsular único o múltiples bacteriano no conjugados y 2) potentes adyuvantes. La composición preferiblemente comprende 3) uno o más antígenos adicionales y/o 4) uno o más adyuvantes.
La invención también provee una composición inmunogénica para la aplicación parenteral, comprendiendo sacáridos de al menos PsC y AFPL1 adsorbidos en alúmina. Adicionalmente, el empleo de AFPL del serogrupo A y/o W135 de N. meningitidis y el Ps homólogo (PsA) sin restringirse a estos.
La invención también provee una composición inmunogénica par la aplicación mucosal, comprendiendo sacáridos de al menos PsC o PsVi y AFCol sin restringirse a éstos.
Es preferible que los Ps capsulares en las composiciones de la invención sean preferiblemente no conjugados sin excluir los conjugados, lo que permite la obtención de formulaciones rápidas particularmente importante durante epidemias.
El microambiente de citocinas creado por potentes adyuvantes no inertes permite la colaboración B-T, su funcionalidad en neonatos e infantes y la inducción de memoria inmune esenciales contra los Ps. La presente invención tiene como objeto obtener composiciones inmunogénicas para aplicaciones mucosales y parenterales comprendiendo un sacárido capsular único o múltiples bacteriano preferiblemente no conjugados y potentes adyuvantes capaces de inducir memoria inmune y funcionen en niños pequeños con el fin de emplearlos en la industria farmacéutica como vacunas para el tratamiento y prevención de enfermedades humanas y veterinarias. Por "Proteoliposoma" se entiende a las vesículas obtenidas de la membrana externa de microorganismos, particularmente bacterias usando diversos métodos, como pueden ser: su aislamiento sin detergente; un proceso que incluya detergente (como desoxicolato, SDS, etc.) o la extracción a partir de vesículas ("bleb") de sobrenadantes de cultivos y, particularmente, los revelados en US 5,597,572. Los proteoliposomas están constituidos por abundantes proteínas insertadas en la estructura lipídica.
Por "Adyuvantes Finlay" se entiende a las familias de AFPLx y AFCox.
Por "AFPLx" se entiende a la familia de Adyuvantes Finlay extraídos de la membrana externa de microorganismos tales como AFPL 1 de N. meningitidis serogrupo B, AFPL2 de Vibrio cholerae y los obtenidos de N. meningitidis serogrupo A o W 135, Bordetella pertusis, Escherichia coli, entre otros.
Por "AFCox" se entiende a la familia de cocleatos derivados de los respectivos Proteoliposomas tales como AFCo l de N. meningitidis serogrupo B, AFPL2 de V. cholerae entre otros.
Por "Cocleatos no derivados de Proteoliposomas" se entiende que no son derivados de un proteoiiposoma según se refiere en la patente (WO/2004/047805), Pérez O et al. Infect Immun. 2001 , 69(7):4502^1508 y Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004, 82:603- 610) ni tampoco a los producidos a partir de lípidos sintéticos (Gould-Fogerite et al. U. S. Pat. No 5, 643, 574, July 1 , 1997), sino los referidos en la patente aplicada (Pérez Martín OG y cois., CU/P/201 1/123).
Por "potentes adyuvantes no inertes" se entiende a los AFPLx y AFCox derivados o no de Proteoliposomas que contienen uno o varios "MAMP", particularmente de acción sinérgica (tales como LPS, Porinas y trazas de DNA bacteriano entre otros) aunque sin limitarse a estos adyuvantes y que contienen varias proteínas que inducen citocinas proinflamatorias que polarizan la respuesta hacia un patrón predominantes Thl .
Por "MAMP" se entiende a estructuras moleculares conservadas en los microbios, patógenos o no (más conocidos como PAMP), capaces de estimular al sistema inmunitario innato y con ello, inducir una potente respuesta adaptativa e incluso estar involucrados en polarizar la respuesta inmune.
El uso de adyuvantes que contienen varios MAMP de acción sinérgica es deseable cuando se requiere de potentes adyuvantes. La línea de los sistemas de adyuvantes de GlaxoSmithKline se basa en la combinación de varios compuestos con efecto adyuvante, mientras que los "Adjuvant Finlay" derivados de proteoliposomas son un buen ejemplo de la acción sinérgica entre varios MAMP. Sin embargo, a diferencia de lo anteriormente patentado o en proceso de patente por nuestro grupo (Pérez Martín OG y cois., OCPI, CU/P/201 1/123), la presente invención encuentra que el AFCol y el AFPL1 son capaces de cambiar al TI de los Ps a TD y más aún hacia un patrón celular, Th 1. El sistema mucoso y el parenteral están organizados de forma diferente e incluso el mucosal esta más compartimentado. No existen aún adyuvantes mucosales licenciados en vacunas humanas y es más difícil inducir respuesta por vía mucosa que por vía parenteral (Bouvet, J P et al. I & I. 1994, 62:3957-3961 and Nardelli-Haefliger, DR, et al. J. Virol. 1999, 73:9609-9613). Fue encontrado que la vía nasal fue tan eficiente como la parenteral para inducir memoria y funcionar en los ratones neonatos e infantes al emplear los Ps adyuvados con los referidos potentes adyuvantes.
También forma parte de la presente invención la obtención de diferentes formulaciones vacunales que aprovechan la capacidad de los Adyuvantes Finlay de funcionar por ambas vías, mucosal y parenteral, para inducir respuestas de memoria y funcionar en los neonatos e infantes contra los Ps y ser aplicados en una estrategia de vacunas unitemporales ('Single Time Vaccination Strategy') como se describe en la patente aplicada (Vacunas Unitemporales: CU/P/2008/215).
Antígenos TI como el PsC y el PsA del serogrupo C y A de N. meningitiáis, respectivamente, y el Ps Vi de Salmonella Typhi fueron eficientemente adyuvados por los Adyuvantes Finlay. La combinación A+C también fue eficiente así como la adyuvación homologa del PsA por AFPL del serogrupo A y W135. De igual forma los Ps, así como sus fracciones oligosacáridicas fueron también eficientemente adyuvados. En estos se indujo respuesta de memoria ante una dosis de refuerzo varios meses después de la inmunización. Las formulaciones vacunales de Ps adyuvadas de la presente invención pueden ser usadas en vacunas profilácticas humanas y veterinarias.
La novedad de la presente invención radica, primeramente, en la obtención de formulaciones adyuvadas de antígenos TI únicas que no requieren conjugación covalente para romper la TI de los Ps. Es particularmente novedoso que no solo se logre cambiar la TI de los Ps, sino que se induzcan respuestas de memoria inmune similares a los Ps conjugados y funcionen en los neonatos e infantes, para las cuales se requieren de potentes estímulos por las características inmaduras de sus sistemas inmunes. Es particularmente novedoso que las formulaciones funcionen al ser aplicadas por vías de inmunización mucosal y/o parenteral o simultáneas.
Es particularmente novedoso que de esta forma se puedan ampliar el arsenal de vacunas combinadas de Ps. La solución propuesta tiene las siguientes ventajas:
• No se requiera la conjugación covalente que es más costosa;
• Se obtienen formulaciones de Ps y potentes adyuvantes menos costosas que logran inducir memoria y funcionar en neonatos e infantes aspectos críticos de los Ps;
• No se requiera la eliminación y control final de los productos químicos empleados en la conjugación covalente;
• Durante epidemias pueden emplearse los Ps y los adyuvantes previamente producidos para sus formulaciones inmediatas;
• Se puede usar en formulaciones vacunales profilácticas y terapéuticas combinadas al emplear varios Ps o sus oligosacáridos a la vez; y « Se adiciona a la respuesta sistémica inducida por las vacunas parenterales respuestas específicas de IgAS (secretoria), principal protector mucosal, al se aplicadas por vía mucosa o mucosal y parenteral simultáneas.
La presente invención será descrita a través de los siguientes ejemplos específicos donde se comparan las respuestas por vía parenteral (subcutánea e intramuscular) y mucosa (intranasal) usando tres Polisacárídos: PsVi, PsC y PsA.
Ejemplo 1. Obtención de las formulaciones de AFPLl y AFCol con los polisacárídos de Nesisseria meningitidis serogrupo C o polisacárido Vi de Salmonella Typhi
Formulación del AFCol por ciclo cerrado
Reactivos y Soluciones · Solución de Resuspensión (SR): Tris 30 mM y desoxicolato de sodio 1%, pH 7.6 • Solución de Formación (SF): Tris 30 mM, CaCl210 mM y NaCl 100 mM, pH7.4
• Solución de Lavado (SL): Tris 10 mM, pH7.2
• Proteoliposoma de N. meningitidis serogrupo B, lote 9012B producido por la Planta de Producción del Instituto Finlay
• Polisacárido C de N. meningitidis serogrupo C y Polisacárido Vi de S. Typhi, lotes 31 - IMC-9003 y 31 -ESVi-OOl , respectivamente producidos por la Planta de Producción del Instituto Finlay
Metodología
• Se resuspende el proteoliposoma de N. meningitdis en la SR y se ajusta a una concentración de 2 mg en 1 mL (10 mL)
• Incubar a 37°C por 15 minutos
• Sonicar por 5 minutos
• Filtrar por membranas de 0.2 μηι
• Para el proceso de formación se adiciona el SF a igual volumen que el proteoliposoma resuspendido (10 mL) a un flujo de 8.3 mL por minutos en agitación lenta
• Dejar en reposo por 15 a 30 minutos
• Adicionar la SL a tres veces el volumen alcanzado después del proceso de formación (60 mL)
• Centrifugar 2200 rpm por 10 minutos
• Decantar volumen de exceso y dejar volumen final al mismo volumen de formación alcanzado, quedando la formulación a una concentración de 1 mg en lmL
• Observación al microscopio óptico Opton Standard 25
• Luego se adiciona por coadministración los polisacáridos a una concentración final de 0.4 mg en 1 mL de PsC ó 1 mg en 1 mL para PsVi. Resultados y conclusión
Se corrobora la formación de pequeñas estructuras tubulares uniformes en el caso del AFCo l
Ejemplo 2. Inmunogenicidad de la formulación intranasal de AFCol y AFPL1 coadministrado con polisacárido Vi (PsVi) de Salmonella Typhi Protocolo de Inmunización. Para evaluar la inmunogenicidad de las formulaciones, ratones Balb/c fueron inmunizados con tres dosis intranasales (i.n) de 25 μΐ, de AFPL1 o AFCol (50 μg) aplicadas a los 0, 7 y 14 días coadministrada con 25 μg de PsVi. Como grupos controles se empleó el PsVi por la ruta i.n a igual concentración y dosis que las formulaciones con AFPL1 y AFCo l , 25 μg de PsVi en 25 μΐ, y la vacuna cubana plana de PsVi, Vax-TyVi®, una dosis de 5 μg de PsVi en 100 μΐ, i.m. Todos los grupos recibieron una dosis de refuerzo por vía i.m a los 100 días de la última dosis con la vacuna cubana, Vax-TyVi (5 μg de PsVi en 100 μί).
Método de obtención y procesamiento de muestras. La extracción de sangre se realizó a los 15 días después de la última dosis. Para la obtención del suero, la sangre se extrajo por punción del plexo retro-orbital utilizando capilares heparinizados. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 12500 g durante 10 min para extraer el suero. Este fue conservado a -20°C hasta su uso.
Detección de IgG por ELISA
Reactivos y Soluciones · PsVi fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); · Solución de lavado (SL): SSTF, 0.05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); • Anti-IgG de ratón y anti-IgM de ratón conjugadas a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina (Sigma, USA) a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del polisacárido a una concentración de 10 μg/mL mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa y anti-IgM de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM;
• Se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μΏροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΕ de una solución de detención y • La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados.
Los resultados de IgG anti PsVi fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 2 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar).
Resultados
Se induce con las formulaciones nasales empleando adyuvantes como estimuladores de la respuesta anti-polisacárido una respuesta sistémica antígeno específica muy superior a la alcanzada por la vacuna de polisacárido plano o al polisacárido administrado por la ruta nasal (Fig. lA y I B).
Conclusiones
El adyuvante AFPLl y el AFCo l por la ruta nasal son capaces de estimular la respuesta antígeno específica contra el polisacárido Vi
Ejemplo 3. Determinación del Patrón de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti Polisacárido para la formulación intranasal de AFPLl o AFCol coadministrado con PsVi
Protocolo de Inmunización y toma de muestras. Ver ejemplo 2. Detección de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti Polisacárido por ELISA Reactivos y Soluciones:
• PsVi fue producido por la planta de de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6) · Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v); • Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgG3 e IgG2c de ratón conjugado a peroxidasa (Southern Biotech, Birmingham, EUA);
• Anti-IgGl e IgG2a de ratón biotinilada (SIGMA, St. Louis, MO, EUA)
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología: · En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del polisacárido a una concentración de 10 μg/mL mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado biotinilado anti-IgGl e IgG2a de ratón diluido 1 :5000 en SDM;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG3 e IgG2c de ratón peroxidasa diluido 1 :6000 en SDM
• Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL; • Para la IgGl e IgG2a que son biotiniladas, a continuación se procede a lavar tres veces las placas y se añade 100 μί/ροζο del segundo conjugado (Estreptavidina-peroxidasa) 1 :2500 en SDM y se incuba por 30 min a 37°C. · Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiafnina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados.
Los resultados de subclases IgGl , IgG3, IgG2a, IgG2c anti PsVi fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 3 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar). Resultados
El empleo del AFPLl y el AFCol por la ruta nasal indujo altos valores de IgG2c (Fig2C) e Igg2a anti-PsVi (Fig 2D) con el empleo de ambos adyuvantes (Fig. 2A, 2B).
Conclusiones
Los Adyuvantes Finlay (AFPLl y AFCol ) por la vía nasal permiten la inducción de un patrón variado de subclases, típico de la respuesta de antígenos TD. La inducción de IgG2a e IgG2c anti PsVi evidencia la inducción de una respuesta celular, característica típica de los antígenos TD.
Ejemplo 4. Determinación del índice de afinidad y del por ciento de reducción acumulada con diferentes concentraciones de Tiocianato para la formulación intranasal del AFPLl o el AFCol y el PsVi
Protocolo de Inmunización y toma de muestras. Ver ejemplo 2.
Detección de la afinidad de los anticuerpos anti PsVi por ELISA de avidez Reactivos y Soluciones:
• PsVi fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución con agente caotrópico con Tiocianato de Potasio a diferentes concentraciones de molaridad: KSCN 0.1 M, 0.25M, 0.5M y 1M
• Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología:
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del Polisacárido a una concentración de 10
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para PsVi mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 :25 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C; • Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο por duplicado las diferentes concentraciones del agente caotrópico (0.1 M, 0.25M, 0.5M y 1 M) y se deja siempre una parte de la placa con las muestras a la que se adiciona solo SSTF;
• Incubación a temperatura ambiente por 15 minutos;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM
• Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01 % (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 Υ, de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de maduración de la afinidad de los anticuerpos para una concentración de Tiocianato de Potasio fueron expresados como índice de afinidad (%) que se calcula como título del suero tratado con Tiocianato entre título del suero no tratado con Tiocianato (PBS+Tween) por 100 y el Porciento de reducción de la absorbancia fue expresado para cada muestra y con cada concentración de Tiocianato
Resultados
Se logra inducir con ambos adyuvantes y el polisacárido por la vía nasal un índice de avidez muy superior a la vacuna polisacarídica o a la inmunización del polisacárido solo por la vía mucosal (Fig. 3A y 3B). Conclusión
La mayor afinidad de las muestra de suero de los grupos inmunizados nasalmente con los adyuvantes Finlay y el PsVi sugiere una formación más fuerte del complejo antígeno- anticuerpo, quizás dado por las señales coestimuladoras del adyuvante, las cuales favorecen la formación de los centros germinales, llevando a la proliferación y selección de un mayor número de células B de alta afinidad a los epítopes del antígeno, característico de los antí genos TD.
Ejemplo 5. Cinética de anticuerpos anti-polisacárido de la formulación intranasal de AFPL1 o AFCol coadministrado con polisacárido Vi (PsVi) de Salmonella Typhi y respuesta secundaria después de un refuerzo con Vax-TyVi
Protocolo de Inmunización. Ver ejemplo 2.
Método de obtención y procesamiento de muestras. A los 100 días después de la última dosis (ejemplo 2), los animales fueron desafiados con una dosis intramuscular de la vacunas cubana de polisacárido Vi plano Vax-TyVi (5 μg/100 μί). Para la obtención del suero, la sangre se extrajo por punción del plexo retro-orbital utilizando capilares heparinizados. La extracción de sangre se realizó a los 15, 30, 60, 90, 100 y 1 12 días después de la última dosis. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 12500 g durante 10 min para extraer el suero. Este fue conservado a -20°C hasta su uso. Detección de IgG anti PsVi por ELISA
Reactivos y Soluciones
• Polisacárido Vi fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6) · Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0.05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); • Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina ( Sigma, USA) a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del polisacárido a una concentración de 10 μg/mL mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL; · En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM; · Se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min; · La reacción se detiene mediante la adición de 50 ih de una solución de detención y • La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de IgG anti PsVi de cada uno de los tiempos medidos fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 2 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar).
Resultados
La respuesta secundaria de IgG antígeno específica encontrada después de una dosis intramuscular con la vacuna de polisacárido plano (Vax-TyVi) fue superior en las formulaciones que contenían los adyuvantes por la ruta nasal (Fig. 4A y 4B).
Conclusiones
Los antígenos TI-2 no son capaces de levantar una respuesta secundaria después de dosis repetidas de polisacárido plano. La inmunización primaria del PsVi con los adyuvantes AFPLl y AFCol fue capaz de desarrollar una respuesta inmune secundaria de memoria superior a la primaria, rasgo distintivo de las vacunas conjugadas o vacunas proteicas, donde dosis repetidas del antígeno causan títulos de anticuerpos semejantes o superiores a las respuestas primarias (respuesta booster).
Ejemplo 6. Determinación del índice de afinidad y del por ciento de reducción acumulada de la afinidad para la formulación intranasal del AFPLl o el AFCol y el PsVi después de una dosis de Refuerzo con VaxTyVi a los 100 días de la última dosis
Protocolo de Inmunización y toma de muestras. Ver ejemplo 2.
Detección del Afinidad de los anticuerpos anti PsVi por ELISA de avidez
Reactivos y Soluciones
• Polisacárido Vi fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); • Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución con agente caotrópico con Tiocianato de Potasio a diferentes concentraciones de molaridad: KSCN 0.1M, 0.25M, 0.5M y 1M
• Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2SO4 2 M. Metodología · En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΕ/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del Polisacárido a una concentración de 10 μg/mL para PsVi mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 :25 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μΕ/ροζο por duplicado las diferentes concentraciones del agente caotrópico (0.1M, 0.25M, 0.5M y 1M) y se deja siempre una parte de la placa con las muestras a la que se adiciona solo SSTF; · Incubación a temperatura ambiente por 15 minutos;
• Lavar tres veces con SL; • Se adicionan 100 μΙ ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM
• Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μΙ7ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μL de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de maduración de la afinidad de los anticuerpos para una concentración de Tiocianato de Potasio fueron expresados como índice de avidez (%) que se calcula como título del suero tratado con Tiocianato entre título del suero no tratado con Tiocianato (PBS+Tween) por 100 y el Porciento de reducción de la absorbancia fue expresado para cada muestra y con cada concentración de Tiocianato
Resultados
Se logra inducir con ambos adyuvantes y el PsVi por la vía nasal un índice de afinidad superior a la vacuna polisacarídica o a la inmunización del polisacárido solo por la vía mucosal. Incluso los valores de índice de afinidad obtenidos son superiores a los obtenidos en la respuesta primaria (Fig. 5A y 5B).
Conclusión
Los anticuerpos producidos por las vacunas polisacarídicas son menos funcionales que los anticuerpos inducidos por los antígenos proteicos. Sin embargo, en los animales inmunizados con los adyuvantes nasales AFPL1 y AFCol y el PsVi no conjugado covalentemente fue observado un incremento en el índice de afinidad después de la inmunización con Vax-TyVi por vía parenteral, sugiriendo esto la inducción de una respuesta de memoria de células B. La inmunización de una dosis de refuerzo con el antígeno homólogo, puede llevar a que sean reclutadas células B de memoria de alta afinidad, inclusive cuando haya presencia de anticuerpos, estas células compiten por el antígeno con las células B vírgenes de baja afinidad, dando como resultados final la producción de anticuerpos de una alta afinidad.
Ejemplo 7. Determinación del Patrón de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti Polisacárido para la formulación intranasal de AFPLl o AFCol coadministrado con PsVi después una dosis de refuerzo con Vax-TyVi a los 100 días después la última dosis
Protocolo de Inmunización, toma de muestras y dosis de refuerzo. Ver ejemplos 2 y 5.
Detección de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti PsVi por ELISA
Reactivos y Soluciones
• PsVi fue producido por la planta de de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgG3 e IgG2c de ratón conjugado a peroxidasa (Southern Biotech, Birmingham, EUA);
• Anti-IgGl e IgG2a de ratón biotinilada (SIGMA, St. Louis, MO, EUA)
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΐ,/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda; « En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΕ/ροζο del polisacárido a una concentración de 10 μg/mL mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μ!7ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda. · Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado biotinilado anti-IgGl e IgG2a de ratón diluido 1 :5000 en SDM;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG3 e IgG2c de ratón peroxidasa diluido 1 :6000 en SDM
• Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL; · Para la IgGl e IgG2a que son biotiniladas, a continuación se procede a lavar tres veces las placas y se añade 100 μί/ροζο del segundo conjugado (Estreptavidina-peroxidasa) 1 :2500 en SDM y se incuba por 30 min a 37°C.
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS; · Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ, de una solución de detención y • La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados. Los resultados de subclases IgGl, IgG3, IgG2a, IgG2c anti PsVi fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 2 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar).
Resultados
El patrón de respuesta de subclases inducido con el empleo de ambos adyuvantes en las formulaciones por la ruta nasal en la respuesta secundaria fue similar al patrón de subclases anti-PsVi obtenido en la respuesta primaria (Fig. 6A, 6B, 6C, 6D). La respuesta secundaria de lgG2c e IgG2a anti-PsVi fue superior a la respuesta primaria (Fig. 6C y 6D). La respuesta anti-PsVi específica de IgG2a e IgG2c fue superior en la formulación que contenía el AFCol , como adyuvante. (Fig. 6C y 6D). La respuesta contra el PsVi plano estuvo caracterizada por altos valores de IgG3, típico de los antígenos TI-2 (Fig 6B).
Conclusiones
La respuesta de subclases de las formulaciones adyuvadas mostró un patrón de respuesta de subclases superior al obtenido en la respuesta primaria. Los Adyuvantes Finlay por la vía nasal permiten la inducción de un patrón no restringido de subclases, típico de la respuesta de antígenos TD. La inducción de valores de IgG2a e IgG2c anti polisacárido indica la inducción de una respuesta celular, característica típica de los antígenos TD.
Ejemplo 8. Determinación de células T efectoras por ELISPOT estándar después de una dosis de refuerzo con Vax-TyVi 100 días después la última dosis
Protocolo de Inmunización, toma de muestras y dosis de refuerzo. Ver ejemplos 2 y 5. Reactivos y Soluciones
• Polisacárido Vi fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Anticuerpo monoclonal anti-ratón IFN-γ (BD Pharmingen, BD Bioscience) • Medio de Cultivo DMEN (Sigma, St Louis, MO)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): Medio DMEN completo (Suero fetal Bovino 10% y L- glutamina 0.29g/L) (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución Lavado 1 (SL1): SSTF;
• Solución de lavado 2 (SL2): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v);
• Anti-IFN-γ de ratón biotinilado ( BD Pharmingen, BD Bioscience);
• Solución de dilución (SD): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); · Solución de Acetato al 0.1 M (SA): Acetato de Sodio 0.2M y ácido acético glacial 0.2M , pH 5
• Solución de Aminoethylcarbazol (SAEC): O. lmg de Aminoetilcarbazol (Sigma, St. Louis, MO, EUA) en 1 mL de Dimetilformamida (Sigma, St. Louis, MO, EUA)
• Solución tampón sustrato (STS): 800 de SAEC en 24 mL de SA, adición lenta y agitación moderada, filtrar por 0.45 μηι y adicionar 12 μΐ, de Η202
Metodología
• En placas de 96 pozos de ELISPOT (Multiscreen IP, Millipore, USA) se añaden 100 μί/ροζο de anticuerpo monoclonal anti-ratón IFN-γ en SSTF (1/200) y se incuba toda la noche a 4oC en cámara húmeda; · Sacrificio de los ratones C57BL/6 y colecta de los bazos en medio DMEN completo (Suero Fetal Bovino al 10% y L-glutamina 0.29g/L)
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μΕ/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL1 ; · Adición de lxl 07 células de bazo por pozo por triplicado en medio DMEN completo • Estimulación de las células con l(^g/mL del PsVi, se utiliza como control positivo células estimuladas con Concavalina A (ConA 5 μ^πιΐΐ,) y contro negativo células con medio de cultivo solo.
• Incubar 24 horas a 37°C y 5% de C02
• Lavar tres veces con SL1 ;
• Lavar tres veces con SL2;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del anticuerpo anti- IFN-γ de ratón biotinilado a una concentración de trabajo de 1/1000 en SD;
• Incubación toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SL2;
• Lavar tres veces con SL1 ;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del segundo conjugado (Estreptavidina-peroxidasa) 1 :2500 en SD y se incuba por 2 horas a 37°C.
• Lavar tres veces con SL2;
• Lavar tres veces con SL1 ;
• Añadir 100 μί/ροζο de la solución de STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• Determinación y conteo de los spot por Estereomicroscopio (Opton, Stemi V i l). Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de células secretoras de IFN-γ anti-PsVi fueron expresados como el número de células que secretan IFN-γ cuando son estimuladas con el PsVi lO5.
Resultados
Se detectó en la formulación con el adyuvante AFCol una respuesta de células secretoras de IFN-γ anti PsVi después de una dosis de refuerzo con el antígeno homologo pero sin conjugar por la vía parenteral (Fig. 7). Conclusiones
Los antígenos TI-2 como los Ps planos son incapaces de estimular un respuesta de células T, pues solo activan células B en ausencia de la cooperación de las células T. Únicamente las vacunas conjugadas de Ps son capaces de estimular la activación de las células T, dado por la presencia en el conjugado de la proteína portadora. La detección de una respuesta IFN-γ anti PsVi después de una dosis de refuerzo con el antígeno homólogo fue extremadamente sorprendente pues la inmunización primaria se llevó a cabo con formulaciones que no incluía la conjugación covalente, lo cual nos confirma que el uso de potentes adyuvantes en las formulaciones con antígenos TI-2 puede revertir esta timo-independencia, comportándose como una vacuna conjugada.
Ejemplo 9. Inmunogenicidad sistémica de la formulación intranasal de AFCol coadministrado con polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C (PsC) después de un refuerzo nasal con el PsC
Protocolo de Inmunización. Para evaluar la inmunogenicidad de las formulaciones después de una dosis de refuerzo intranasal con PsC plano 70 días después de la última dosis, ratones Balb/c adultos fueron inmunizados con tres dosis intranasal (i.n) de 25 \iL, de AFCol (50 μg) coadministrada con 10 μg de PsC a los 0, 7 y 14 días. Como grupos controles se empleó el PsC solo a una concentración final y número de dosis igual que la formulación con AFCol . Ambos grupos recibieron una dosis de refuerzo por vía i.n a los 70 días de la última dosis con el PsC plano (10 μg de PsC en 25 iL).
Método de obtención y procesamiento de muestras. La extracción de sangre se realizó a los 21 días después de la última dosis y 21 días después del refuerzo i.n con PsC solo. Para la obtención del suero, la sangre se extrajo por punción del plexo retro-orbital utilizando capilares heparinizados. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 12500 g durante 10 min para extraer el suero. Este fue conservado a -20°C hasta su uso.
Detección de IgG anti PsC por ELISA
Reactivos y Soluciones
• Polisacárido C fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura; • Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); · Solución de lavado (SL): SSTF, 0.05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y · Solución de detención: H2SO4 2 M.
Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina (Sigma, USA) a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda; « En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del Polisacárido a una concentración de 2.5 μg/mL para PsC mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μΕ/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda. · Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM;
• Se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda; • Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS; « Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados Los resultados de IgG anti PsC fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 2 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar).
Resultados
La respuesta secundaria IgG anti PsC encontrada después de la inmunización intranasal del PsC plano adyuvado con AFCol fue similar a la respuesta primaria en las formulaciones que contenían el adyuvante por la ruta nasal (Fig. 8).
Conclusiones
Los antígenos TI-2 no son capaces de inducir una respuesta secundaria de memoria después de dosis repetidas de polisacárido plano. La inmunización primaria del PsC con el adyuvante AFCol fue capaz de desarrollar una respuesta inmune secundaria semejante a la respuesta primaria, rasgo distintivo de las vacunas conjugadas o vacunas proteicas, donde dosis repetidas del antígeno causan títulos de anticuerpos semejantes o superiores a las respuestas primarias (respuesta booster).
Ejemplo 10. Inmunogenicidad mucosal de la formulación intranasal de AFCol coadministrado con polisacárido C de Neisseria meningitidis (PsC) después de un refuerzo nasal con PsC plano Protocolo de Inmunización. Ver ejemplo 9.
Método de. obtención y procesamiento de muestras. La extracción de saliva y lavado vaginal se realizó 7 días y 28 días después de la última dosis, respectivamente. De igual forma se realizó la extracción de saliva y lavado vaginal 7 y 28 días después del refuerzo i.n con PsC solo. Para la obtención de la saliva se inmunizaron los ratones con pilocarpina 0.3%, ΙΟΟμί para estimular la salivación, se recogió la saliva de los animales en pool, en frío y luego fueron inactivadas las proteasas en baño termostatado a 56°C por 15 minutos. El lavado vaginal de los ratones se realizó con 50 de SSTF, 3 veces. Las muestras de saliva y de lavado vaginal fueron centrifugadas a 10 OOOg por 10 minutos y conservadas a -20°C hasta su uso.
Detección de IgA anti PsC por ELISA en saliva y lavado vaginal Reactivos y Soluciones
• PsC fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0.05% Tween-20 (v/v); · Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgA de ratón biotinilada (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Conjugado de estreptavidina peroxidasa(SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y · Solución de detención: H2SO4 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΙ7ροζο de Poli-L-lisina (Sigma, USA) a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA),: añadir 100 μ!7ροζο del Polisacárido a una concentración de 2.5 μg/mL para PsC mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de la saliva 1 :2 y el lavado vaginal 1 : 10 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado biotinilado anti-IgA de ratón diluido a una concentración de 2μg/mL en SDM;
• Se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Como la IgA es biotinilada, a continuación se procede a lavar tres veces las placas y se añade 100 μΕ/ροζο del segundo conjugado (Estreptavidina-peroxidasa) 1 :2500 en SDM y se incuba por 30 min a 37°C.
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΕ de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus). Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de IgA anti PsC fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 3 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar).
Resultados
Se detectó respuesta secundaria IgA antígeno específica en muestras de saliva (Fig. 9A) y lavado vaginal después de la inmunización intranasal de PsC plano (Fig. 9B).
Conclusiones Los antígenos TI-2 no son capaces de levantar una respuesta secundaria después de dosis repetidas de polisacárido plano. La inmunización primaria del PsC con el adyuvante AFCol fue capaz de desarrollar una respuesta inmune secundaria semejante a la respuesta primaria, rasgo distintivo de las vacunas conjugadas o vacunas proteicas, donde dosis repetidas del antígeno causan títulos de anticuerpos semejantes o superiores a las respuestas primarias (respuesta booster). La detección de niveles de IgA en ambas superficies mucosales nos da la idea que estamos reactivando clones de células B comprometidos en la respuesta de IgA que fueron activados durante la respuesta primaria a nivel de la mucosa, siendo esta respuesta superior cuando el adyuvante está presente en la formulación. La detección de este anticuerpo a nivel mucosal tiene un papel fundamental en la disminución de la colonización mucosal. Ejemplo 11. Determinación del patrón de subclases IgGl, IgG2a anti Polisacárido para la formulación intranasal de AFCol coadministrado con PsC después de un refuerzo nasal con PsC plano
Protocolo de Inmunización. Ver ejemplo 9.
Detección de Subclases IgGl, IgG2a anti Polisacárido por ELISA Reactivos y Soluciones
• Polisacárido C fue producido por la planta de de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6) • Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v); · Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgGl e IgG2a de ratón biotinilada (SIGMA, St. Louis, MO, EUA)
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΕ/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del polisacárido a una concentración de 2.5 μg/mL mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL; · En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado biotinilado anti-IgGl e IgG2a de ratón diluido 1 :5000 en SDM; · Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL; • Para la IgGl e IgG2a que son biotiniladas, a continuación se procede a lavar tres veces las placas y se añade 100 μί/ροζο del segundo conjugado (Estreptavidina-peroxidasa) 1 :2500 en SDM y se incuba por 30 min a 37°C.
• Añadir 100 μΕ/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01 % (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μί de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de subclases IgGl y IgG2a anti PsC fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 2 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar).
Resultados
Se detectó respuesta secundaria de subclases IgGl y IgG2a anti PsC después de la inmunización intranasal de PsC plano adyuvado con AFCo l (Fig. 10).
Conclusiones
La respuesta de IgG2a detectada en los animales inmunizados con el PsC y el AFCol sugiere la inducción de una respuesta celular, característica que se observa fundamentalmente con los antígenos TD o Ps conjugados.
Ejemplo 12. Inmunogenicidad de la formulación intramuscular de AFPL1 coadministrado con polisacárido Vi de Salmonella Typhi (PsVi)
Protocolo de Inmunización. Para evaluar la inmunogenicidad de las formulaciones, ratones Balb/c fueron inmunizados con una dosis intramuscular (i.m) de 100 μΐ,, de AFPL1 (12 μg) coadministrada con 5 μg de PsVi. Como grupos controles se empleó el PsVi adsorbido en alúmina a una concentración final igual que la formulación con y la vacuna cubana plana de PsVi, Vax-TyVi®, una dosis de 5 μg de PsVi en 100 μΐ, i.m. Todos los grupos recibieron una dosis de refuerzo por vía i.m a los 100 días de la última dosis con la vacuna cubana, Vax- TyVi (5 μg de PsVi en 100 μΐ).
Método de obtención y procesamiento de muestras. La extracción de sangre se realizó a los 15 días después de la última dosis. Para la obtención del suero, la sangre se extrajo por punción del plexo retro-orbital utilizando capilares heparinizados. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 12500 g durante 10 min para extraer el suero. Este fue conservado a -20°C hasta su uso.
Detección de IgG e IgM anti PsVi por ELISA
Reactivos y Soluciones
• PsVi fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
i
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0.05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgM de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina (Sigma, USA) a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda; • En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΙ ροζο del Polisacárido a una concentración de 10 μ πύ. para PsVi mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μΏροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 o del conjugado anti-IgM de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM;
• Se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ^ de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de IgG anti PsVi fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 3 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar). Resultados
Se induce una respuesta sistémica antígeno específica notablemente superior a la alcanzada por la vacuna de polisacárido plano o a la formulación del polisacárido con el adyuvante hidróxido de aluminio (Fig. 1 1 A y 1 IB). Conclusiones
La respuesta inmune predominante producida por las vacunas polisacarídicas es de tipo IgM, donde hay muy poca respuesta IgG. El adyuvante AFPLl por la ruta intramuscular es capaz de estimular una alta respuesta sistémica IgG antígeno específica contra el PsVi.
Ejemplo 13. Determinación del Patrón de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti Polisacárido para la formulación intramuscular de AFPLl y PsVi
Protocolo de Inmunización y toma de muestras. Ver ejemplo 12.
Detección de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti Polisacárido por ELISA
Reactivos y Soluciones
• Polisacárido Vi fue producido por la planta de de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v); · Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgG3 e IgG2c de ratón conjugado a peroxidasa (Southern Biotech, Birmingham, EUA);
• Anti-IgGl e IgG2a de ratón biotinilada (SIGMA, St. Louis, MO, EUA) · Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda; · En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΙ7ροζο del polisacárido a una concentración de 10 μ§/πιΕ mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda. · Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μΕ/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado biotinilado anti-IgG l e IgG2a de ratón diluido 1 :5000 en SDM;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG3 e IgG2c de ratón peroxidasa diluido 1 :6000 en SDM
• Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL; · Para la IgGl e IgG2a que son biotiniladas, a continuación se procede a lavar tres veces las placas y se añade 100 μί/ροζο del segundo conjugado (Estreptavidina-peroxidasa) 1 :2500 en SDM y se incuba por 30 min a 37°C.
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS; · Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ. de una solución de detención y • La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados Los resultados de subclases IgGl , IgG3, IgG2a, IgG2c anti PsVi fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 3 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar).
Resultados
El empleo del AFPLl por la ruta parenteral indujo valores de IgG3 menores a los obtenidos con los restantes grupos y respuestas en las demás subclases (Fig. 12 A, 12B,12C y 12D).
Conclusiones
El adyuvante AFPLl por la vía parenteral permite reducir la inducción de IgG3, subclase típica de la respuesta de los antígenos TI-2 no conjugados.
Ejemplo 14. Determinación del índice de afínidad y del por ciento de reducción acumulada con diferentes concentraciones de Tiocianato para la formulación intramuscular del AFPLl y el PsVi
Protocolo de Inmunización y toma de muestras. Ver ejemplo 12.
Detección del índice de Afinidad de los anticuerpos anti PsVi por ELISA de avidez
Reactivos y Soluciones: · Polisacárido Vi fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); · Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); • Solución con agente caotrópico con Tiocianato de Potasio a diferentes concentraciones de molaridad: KSCN 0.1M, 0.25M, 0.5M y 1M
• Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΕ/ροζο dé Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del Polisacárido a una concentración de 10 μg/mL para PsVi mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 :25 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο por duplicado las diferentes concentraciones del agente caotrópico (0.1M, 0.25M, 0.5M y 1M) y se deja siempre una parte de la placa con las muestras a la que se adiciona solo SSTF;
• Incubación a temperatura ambiente por 15 minutos;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM
• Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda; • Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01 % (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS; · Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 iL de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados Los resultados de maduración de la afinidad de los anticueipos para una concentración de Tiocianato de Potasio fueron expresados como índice de avidez (%) que se calcula como título del suero tratado con Tiocianato entre título del suero no tratado con Tiocianato (PBS+Tween) por 100 y el Porciento de reducción de la absorbancia fue expresado para cada muestra y con cada concentración de Tiocianato Resultados
Se logra inducir con la formulación del adyuvante y el polisacárido por la vía intramuscular un índice de afinidad superior a la vacuna polisacarídica o cuando se emplea el hidróxido de aluminio como adyuvante (Fig. 13A yl 3B).
Conclusión La mayor afinidad en la muestra de suero del grupo inmunizado con el adyuvante AFPL 1 por la ruta intramuscular y el PsVi sugiere una formación más fuerte del complejo antígeno- anticuerpo.
Ejemplo 15. Inmunogenicidad de la formulación de vesículas de membrana externa derivadas (Proteoliposoma, PL) de N. meningitídis serogrupos A y W135 coadministradas con polisacárido A de N. meningitídis serogrupo A (PsA)
Protocolo de Inmunización. Para evaluar la inmunogenicidad de las formulaciones, ratones Balb/c fueron inmunizados con dos dosis subcutáneas (s.c) de 100 μΐ,, con 2.5 μg de cada PL derivado de N. meningitídis serogrupos A y W 135 (PLA y PLW 135, respectivamente) coadministrados con 5 μg de PsA. Como grupos controles se empleó el PsA solo o con el adyuvante fosfato de aluminio a una dosis final de PsA de 5 μg en 100 iL, los PLA y PLW135 sin polisacárido capsular (2.5 μg de cada uno) y la vacuna conjugada de PsA (MenAfriVac) a una dosis de 0.2 μg de PsA en 100 μΐ, por la vía s.c.
Método de obtención y procesamiento de muestras. La extracción de sangre se realizó a los 15 días después de la última dosis. Para la obtención del suero, la sangre se extrajo por punción del plexo retro-orbital utilizando capilares heparinizados. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 12500 g durante 10 min para extraer el suero. Este fue conservado a -20°C hasta su uso.
Detección de IgG e IgM anti PsA por ELISA
Reactivos y Soluciones
• Polisacárido A fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura; · Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0.05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgM de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2SO4 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μ!7ροζο de Poli-L-lisina (Sigma, USA) a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del Polisacárido a una concentración de 10 μg/mL para PsA mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF; · Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL; · Se adicionan 100 μΕ/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 o del conjugado anti-IgM de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM;
• Se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01 % (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ, de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus). Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de IgG anti PsA fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 3 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar).
Resultados
Se induce una respuesta de IgG anti PsA sistémica significativamente superior a la alcanzada por el polisacárido plano y similar a la respuesta inducida por la vacuna conjugada MenAfriVac de dicho polisacárido, que a su vez trae como adyuvante el fosfato de aluminio (Fig. 14A). La respuesta primaria caracterizada por la inducción de IgM fue superior en los grupos inmunizados con el polisacárido plano (Fig. 14 B)
Conclusiones
La respuesta inmune predominante producida por las vacunas polisacarídicas es de tipo IgM, donde hay muy poca respuesta IgG específica, siendo esta respuesta únicamente diferente cuando se conjuga el polisacárido a una proteína portadora ('carrier'). El empleo de formulaciones que contengan potentes adyuvantes como los PL combinados con el PsA plano sin conjugación covalente permitió estimular una alta respuesta sistémica IgG antígeno específica contra el PsA e inducirse menores niveles de respuesta de tipo IgM, similares a la respuesta obtenida con la vacuna conjugada comercial de este polisacárido. Ejemplo 16. Determinación del título de anticuerpos bactericidas anti PsA en suero de la formulación de vesículas de membrana externa (Proteoliposoma, PL) derivadas de N. meningitídis serogrupo A y W135 coadministradas con polisacárido A de TV. meningitidis (PsA)
Protocolo de Inmunización y toma de muestras. Ver ejemplo 15 Reactivos y Soluciones
• Complemento de gazapo (Peí Freez lote 08432);
• Solución salina balanceada de Hank (HBSS) (Sigma lote RNBB 6657);
• Albúmina de suero bovino 10% (BSA) (Sigma lote 1 19K8412); Metodología
• En placas de 96 pozos estériles para cultivo de tejido con fondo en U (Becton Dickinson, EUA), se añaden 20 μΙ7ροζο de HBSS con BSA al 0.1%, desde la columna 1 hasta la 1 1 y 10 μΙ7ροζο en la columna 12.
• Se añaden 20 μΐ^ del suero a evaluar en la columna 1. Se realizan diluciones dobles seriadas hasta la columna 9.
• Se añaden 10 μί/ροζο de complemento de gazapo desde la columna 1 hasta la 10.
• Se añaden 10 μΙ7ροζο de complemento de gazapo calentado a 56°C durante 30 minutos en las columnas 1 1 y 12.
• Se añaden 10 μ!7ροζο de la suspensión celular conteniendo como cepa blanco de la reacción en el ensayo bactericida se usó la Mk499/03 (serogrupo A) y se incuba 1 h a 37°C.
• Se extraen 10 μΙ7ροζο y se siembran en placas de agar sangre de carnero al 5% por el método de la placa inclinada.
• La determinación de los títulos se realiza mediante el conteo de colonias utilizando el programa Sorcerer asociado a un contador automático de colonias (Perceptive Instrument).
Expresión y Cálculo de los Resultados. Los títulos fueron expresados como el inverso de la mayor dilución del suero que causa lisis al 50% o más de células con respecto al control de suspensión.
Resultados
La actividad bactericida sérica en ratones inmunizados por vía s.c con dos dosis (0 y 21 días), de las PsA plano adyuvado con PLA+PsW o conjugado fueron evaluados a los 0, 21 y 35 días. Se encontró actividad bactericida similar entre el grupo conjugado y el adyuvado con PLs. También se indujo actividad bactericida en el grupo que sin PsA contenía el PLA (Tabla. 1). Conclusiones
Formulaciones de Ps adyuvadas con potentes adyuvantes como los PL inducen similares actividades bactericidas séricas que la vacuna conjugada MenAfriVac.
Ejemplo 16. Determinación del Patrón de Subclases IgGl, IgG3, e IgG2a anti PsA para la formulación intramuscular de vesículas de membrana externa de A y W135 coadministrados con PsA
Protocolo de Inmunización y toma de muestras. Ver ejemplo 15 Detección de Subclases IgGl, IgG3 e IgG2a anti Polisacárido por ELISA Reactivos y Soluciones: · PsA fue producido por la planta de de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); · Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti-IgG3 e IgG2c de ratón conjugado a peroxidasa (Southern Biotech, Birmingham,
EUA); · Anti-IgGl e IgG2a de ratón biotinilada (SIGMA, St. Louis, MO, EUA)
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda; • En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΙ7ροζο del polisacárido a una concentración de 10 μg/mL mientras se añaden ST e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda; · Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 :50 y se aplican 100 μΕ/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C; · Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado biotinilado anti-IgGl e IgG2a de ratón diluido 1 :5000 en SDM;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG3 de ratón peroxidasa diluido 1 :6000 en SDM · Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Para la IgGl e IgG2a que son biotiniladas, a continuación se procede a lavar tres veces las placas y se añade 100 μί/ροζο del segundo conjugado (Estreptavidina-peroxidasa) 1 :2500 en SDM y se incuba por 30 min a 37°C. · Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΕ de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus). Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de subclases IgGl , IgG3, IgG2a artti PsVi fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 3 desviaciones estándar de las muestras control (grupos sin inmunizar). Resultados
El empleo de PL formulados con PsA por la ruta subcutánea indujo altos valores de IgGl (Fig. 15 A) e IgG2a anti-PsA (Fig. 15B) similares a MenAfric aunque menores respuestas de IgG3 que ésta última (,Fig. 15C).
Conclusiones El empleo de PsA combinados con PLW135 como adyuvantes del PsA por vía subcutánea permitió la inducción de un patrón mixto de subclases polisacárido específico; este tipo de respuesta de subclases es típico de antígenos TD, pues los antígenos TI-2 inducen una respuesta de subclases restringida siendo la IgG3 la subclase dominante. La inducción de una respuesta de IgG2a anti PsA confirma el poso de TI-2 a TD y polarización hacia un patrón Thl como ocurre con la conjugación de los Ps.
Ejemplo 17. Determinación del índice de afinidad para la formulación de vesículas de membrana externa (Proteoliposoma, PL) de A y W135 y el PsA
Protocolo de Inmunización y toma de muestras. Ver ejemplo 15
Detección de la afinidad de los anticuerpos anti PsA por ELISA de avidez Reactivos y Soluciones
• PsA fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2); · Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); • Solución con agente caotrópico con Tiocianato de Potasio a una concentración de molaridad: KSCN 0.25M
• Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); · Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΕ/ροζο del Polisacárido a una concentración de 10 μg/mL para PsA mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF; · Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 :25 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL; · Se adicionan 100 μί/ροζο por duplicado la concentración del agente caotrópico (0.25M) y se deja siempre una parte de la placa con las muestras a la que se adiciona solo SSTF;
• Incubación a temperatura ambiente por 15 minutos;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM
• Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda; • Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min; · La reacción se detiene mediante la adición de 50 de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de maduración de la afinidad de los anticuerpos para una concentración de Tiocianato de Potasio fueron expresados como índice de afinidad (%) que se calcula como título del suero tratado con Tiocianato entre título del suero no tratado con Tiocianato (PBS+Tween) por 100.
Resultados
Se logra inducir con los PLA y PLW135 y el PsA en la formulación por la ruta subcutánea un índice de avidez muy superior al polisacárido plano, al polisacárido con el adyuvante fosfato de aluminio y semejante al índice de afinidad inducido por la vacuna conjugada comercial (Fig. 16).
Conclusión
La mayor afinidad de las muestras de sueros del grupo inmunizado con PLA+PLW135 y PsA sugiere una formación más fuerte del complejo antígeno-anticuerpo, quizás dado por las señales coestimuladoras del adyuvante, las cuales favorecen la formación de los centros germinales, llevando a la proliferación y selección de un mayor número de células B de alta afinidad a los epítopes del antígeno, característico de los antígenos TD y las vacunas conjugadas. Ejemplo 18. Inducción de IgG e IgM anti PsC y actividad bactericida sérica contra N. meningitidis serogrupos B y C en infantes primovacunados con VA-MENGOC-BC® y que actualmente son menores de un año
Protocolo de Inmunización. Para evaluar la inmunogenicidad de VA-MENGOC-BC® se inmunizaron un total de 151 infantes que fueron vacunados a los 3.5 (primera dosis) y 5 (segunda dosis) meses. VA-MENGOC-BC® contiene 50 μg de PsC y 50 μg de AFPL1 adsorbidos en alúmina por dosis. Posteriormente se evaluaron las respuestas séricas de IgG e IgM en grupos a diferentes meses (n en Fig. 17).
Método de obtención y procesamiento de muestras. La extracción de sangre se realizó por punción venosa en el Hospital Juan Manuel Marques. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 12500 g durante 10 min para extraer el suero. Este fue conservado a -20°C hasta su uso.
Detección de IgG e IgM anti PsC por ELISA
Reactivos y Soluciones · PsC fue producido por la planta de Producción del Instituto Finlay, respectivamente, bajo condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA); · Solución de lavado (SL): SSTF, 0.05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti IgG e IgM humana conjugada a peroxidasa (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y · Solución de detención: H2S04 2 M.
Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina (Sigma, USA) a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda; · En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο del Polisacárido a una concentración de 2.5 μg/mL para PsC mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda; • Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μί/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti-IgG de ratón peroxidasa diluido 1 :2500 en SDM;
• Se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ, de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Detección de actividad bactericida sérica
Como antígeno en este ensayo se usó la cepa N. meningitidis serogrupo C (Cl 1) y B Cu 385 conservada en leche descremada (OXOID, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) a -70°C en múltiples alícuotas. El día anterior a la realización del ensayo se tomó una alícuota congelada y se sembró por agotamiento para obtener colonias aisladas en placas Agar Mueller-Hinton (OXOID, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) suplementado con SBF 10% (SIGMA, St. Louis, MO, EUA) y el inhibidor vancomicina-colimicina-nistatina (VCN) (bioMerieux SA, Marcy I'Etoile, Francia). Las placas se incubaron toda la noche a 37°C en atmósfera de CO2 5%. Una colonia aislada fue transferida a una placa del mismo medio previamente atemperada e incubada durante 4 h a 37°C en 5%> de C02. Las células se recogieron con solución salina fisiológica pH 7,2-7,4 y la suspensión celular se ajustó espectrofotométricamente a una DO en un rango entre 0,5-0,55 leído a 600 nm. Procedimiento
Todos los pasos del EBSc fueron realizados en un Gabinete de Seguridad Biológica. Las muestras de suero se diluyeron en placas de micro-titulación (Costar Laboratories, Cambridge, Mass, EUA) desde 1 :2 hasta 1 :4096 en SSHB con SAB 0,1 % (SIGMA, St. Louis, MO, EUA) (pH 7,2). Se añadieron 12,5 por pozo de la suspensión celular, aproximadamente 100 unidades formadoras de colonias (UFC), en todos los pozos de la microplaca. Posteriormente se añadieron 12,5 iL del complemento. Las placas se incubaron a 37°C en atmósfera sin C02 durante 30 min. Luego se añadió 150
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por pozo de Caldo Mueller-Hinton (OXOID, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) con glucosa 2% (BDH Laboratory Supplies Poole, Reino Unido), indicador de pH Púrpura de Bromocresol 0,002% (Fluka Chemika, Suiza) y VCN. El indicador de pH se preparó previamente al 1 ,6% en etanol. El inhibidor VCN se empleó para asegurar la ausencia de contaminaciones que pudieran afectar el resultado de este ensayo. Las placas se incubaron 20 h a 37°C en atmósfera de C02 5%. Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de IgG anti PsC fueron expresados en U/mL usando una curva patrón anti PsC. Las muestras se consideraron positivas por encima de 367 U/mL. Los resultados de IgM anti PsC fueron expresados como DO. En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor de las medias más 2 desviaciones estándares de las muestras controles. El título bactericida se determinó como el recíproco de la máxima dilución del suero que causó >90% de muerte de la cepa C U o Cu 385 y se detectó por la invariabilidad de color del indicador de pH. La titulación se realizó a simple vista y se leyó la DO a 405 nm en un lector de microplacas (Labsystems Multiskan® Multisoñ) para confirmar los resultados. Los resultados se expresan en porcentaje de respondedores. Resultados
La respuesta de IgG anti PsC se incrementó desde la primera dosis y se mantuvo positiva en todos los grupos evaluados comprendidos entre 4 y 12 meses de edad (Fig. 17 A). La IgM anti PsC también se mantuvo positiva en todos los grupos evaluados (Fig. 17B). La respuesta bactericida fue similar para los serogrupos B y C excepto a los 4 meses en que predominó la respuesta anti C (Fig. 17C). Conclusiones
Se indujo respuesta de IgG a IgM y bactericida anti PsC durante la primovacunación con el PsC no conjugado adyuvado con AFPLl absorbidos en alúmina en infantes. Estas duraron hasta un año. Ejemplo 19. Persistencia de la respuesta de IgG e IgM anti PsC en primovacunados con VA-MENGOC-BC® hasta al menos 15 años
Protocolo de Inmunización. Para evaluar la persistencia de la respuesta inducida por VA- MENGOC-BC® se inmunizaron un total de 191 infantes que fueron vacunados a los 3.5 (primera dosis) y 5 (segunda dosis) meses. VA-MENGOC-BC® contiene 50 μg de PsC y 50 μg de AFPLl adsorbidos en alúmina por dosis. Posteriormente se evaluaron las respuestas séricas de IgG e IgM en grupos a diferentes meses (n en Fig. 18).
La detección de IgG e IgM anti PsC por ELISA se realizó como se describe en Ejemplo 18 Resultados
La respuesta de IgG anti PsC se mantiene hasta los 15 años aunque en títulos bajos (Fig. 18A). No obstante, hay respuesta de IgM anti PsC en todos los grupos excepto a los 6 años (Fig. 18B).
Conclusiones
Persistió la respuesta de IgG a IgM anti PsC inducida por primovacunación con el PsC no conjugado adyuvado con AFPLl absorbidos en alúmina en infantes aunque a bajos títulos hasta los 15 años.
Ejemplo 20. Subclases de IgG anti PsC y su duración en primovacunados con VA- MENGOC-BC® en comparación con vacuna de PsC plana
Protocolo de Inmunización y obtención y procesamiento de las muestras. Ver descripción en ejemplos 18 y 19;: Adicionalmente, se incluyeron 15 adultos jóvenes que fueron vacunados con una dosis de vacuna A+C plana.
Detección de Subclases IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 anti PsC por ELISA
Reactivos y Soluciones • PsC fue producido por la planta de de Producción del Instituto Finlay condiciones de buenas prácticas de manufactura;
• Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 1 1 mM, NaHC03 35 mM (pH 9,6)
• Solución salina tamponada con fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2);
• Solución de bloqueo (SB): SSTF, 1% BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Solución de lavado (SL): SSTF, 0,05% Tween-20 (v/v);
• Solución de dilución de las muestras (SDM): SL, 1 % BSA (SIGMA, St. Louis, MO, EUA);
• Anti IgGl , IgG2, IgG3 e IgG4 humana biotinilada (SIGMA, St. Louis, MO, EUA)
• Solución tampón sustrato (STS): Na2HP04 52 mM, ácido cítrico 25 mM (pH 5,6) y
• Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μί/ροζο de Poli-L-lisina a una concentración de 3 μg/mL, mientras se añaden SSTF e incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda;
• En placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Costar, EUA), añadir 100 μΕ/ροζο del polisacárido a una concentración de 10 μg/mL mientras se añaden STR e incubar toda la noche a 4°C en cámara húmeda;
• Lavar tres veces con SSTF;
• Añadir 200 μΕ/ροζο de SB e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Lavar tres veces con SL;
• En SDM se realiza dilución de los sueros 1 : 100 y se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de cada una de las muestras diluidas y se incuban 2 h a 37°C;
• Lavar tres veces con SL;
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti subclases biotinilado de ratón diluido 1 :5000 en SDM; • Se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda;
• Lavar cinco veces con SL;
• Se añade 100 μί/ροζο del segundo conjugado (Estreptavidina-peroxidasa) 1 :2500 en SDM y se incuba por 30 min a 37°C.
• Añadir 100 μί/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y 6 mg/mL de ortho-fenilendiamina (OPD) en STS;
• Se incuba en la oscuridad durante 30 min;
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ, de una solución de detención y
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una longitud de onda de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Expresión y Cálculo de los Resultados
Los resultados de subclases IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 anti PsC fueron expresados como DO. Resultados
La respuesta predominante de IgG anti PsC fue la IgG4 e IgG3 (Fig 19A) y no la característica de los Ps planos que es la IgG2 observada en los vacunados con la vacuna plana (Fig. 19 C). Esta respuesta se mantuvo durante el primer año y en menor medida hasta los 15 años (Fig. 19A y 19B).
Conclusiones
La adyuvación del PsC plano no conjugado con el AFPLl adsorbidos en alúmina cambia el patrón de respuesta de los Ps planos (IgG2) en humanos y son efectivos por su vacunación en la infancia.
Breve descripción de las figuras:
Figura 1. Inmunogenicidad de la formulación intranasal de AFCol y AFPL1 coadministrado con PsVi. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 μί) de AFCol o AFPL1 (50 μg) y PsVi (25μg). Como controles se utilizó el PsVi solo por la ruta i.n (3 dosis de 25 μg de PsVi) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5 μg/100 μί) por la ruta intramuscular. La evaluación de los niveles de IgG (A) e IgM (B) anti PsVi se realizó en suero extraído 15 días después de la última dosis, mediante ELISA. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif.). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo.
Figura 2. Respuesta de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti-PsVi para la formulación intranasal de AFCol y AFPL1 coadministrado con PsVi. Ratones C57BL/6 ^ fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 L) de AFCol o AFPL1 (50 μg) y PsVi (25μg). Como controles se utilizó el PsVi solo por la ruta i.n ( 3 dosis de 25 μg de PsVi) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5 μg/100 xL) por la ruta intramuscular. La evaluación de los niveles de IgGl (A), IgG3 (B), IgG2c (C) e IgG2a (D) anti PsVi, se realizó en suero extraído 15 días después de la última dosis, mediante ELISA En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por *** (p<0.001 ); ** (p <0.01) y * (p<0.05).
Figura 3. Determinación del índice de afinidad y del por ciento de reducción de la afinidad para la formulación intranasal del AFPL1 o el AFCol y el PsVi. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25
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de AFCo l o AFPL1 (50 μg) y PsVi (25 Como controles se utilizó el PsVi solo por la ruta i.n ( 3 dosis de 25 μg de PsVi) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5 μg/100 xL) por la ruta intramuscular. La evaluación del índice de avidez de los anticuerpos IgG (A) anti PsVi se realizó en suero extraído 15 días después de la última dosis, mediante ELISA de avidez con el agente caotrópico Tiocianato de Potasio 0.25M. La evaluación del por ciento de reducción de la absorbancia (B) se realizó mediante ELISA de avidez con diferentes concentraciones del agente caotrópico (0.1M, 0.25M, 0.5M y 1M). En la figura se muestra el por ciento de reducción de la absorbancia calculado para cada concentración de Tiocianato de Potasio de 2 determinaciones en experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por *** (p<0.001); ** (p <0.01) y * (p<0.05).
Figura 4. Cinética de anticuerpos anti-PsVi de la formulación intranasal de AFPL1 o AFCol coadministrado con PsVi de Salmonella Typhi (PsVi) y la respuesta secundaria después de un refuerzo con Vax-TyVi. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 \iL) de AFCol o AFPL1 (50 μg) y PsVi (25 μg). Como controles se utilizó el PsVi solo por la ruta i.n (3 dosis de 25 μg de PsVi) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax- TyVi (5 μg/100
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por la ruta intramuscular. La evaluación de los niveles de IgG (A) anti PsVi se realizó en suero extraído 15, 30, 60, 90, 100 y 1 12 días después de la última dosis, mediante ELISA. La comparación entre la respuesta primaria y secundaria IgG anti-PsVi específica (B) se determinó con los sueros extraídos - a los 15 días del primer esquema de inmunización y a los 12 días del refuerzo con Vax-TyVi. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif.). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo.
Figura 5. Determinación del índice de afinidad y del por ciento de Reducción de absorbancia para la formulación intranasal del AFPL1 o el AFCol y PsVi después de una dosis de Refuerzo con VaxTyVi a los 100 días de la última dosis Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 μί) de AFCol o AFPL1 (50 μg) y PsVi (25 μg). Como controles se utilizó el PsVi solo por la ruta i.n ( 3 dosis de 25 μg de PsVi) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5 μg/100 μί) por la ruta intramuscular. La evaluación del índice de avidez de los anticuerpos IgG (A) anti PsVi se realizó en suero extraído 12 días después del refuerzo con Vax-TyVi, mediante ELISA de avidez con el agente caotrópico Tiocianato de Potasio 0.5M. La evaluación del porciento de reducción de la absorbancia (B) se realizó mediante ELISA de avidez con diferentes concentraciones del agente caotrópico (0.1M, 0.25M, 0.5M). En la figura se muestra el porciento de reducción de la absorbancia calculado para cada concentración de Tiocianato de Potasio de 2 determinaciones en experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por *** (p<0.001); ** (p <0.01) y * (p<0.05).
Figura 6. Determinación del Patrón de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti- PsVi para la formulación intranasal de AFPL1 o AFCol coadministrado con PsVi después una dosis de refuerzo con Vax-TyVi 100 días después de la última dosis Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 μί) de AFCol o AFPL1 (50 μg) y PsVi (25 μ ). Como controles se utilizó el PsVi solo por la ruta i.n ( 3 dosis de 25 μg de PsVi) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5μ /100μί) por la ruta intramuscular. La evaluación de los niveles de IgG l (A), IgG3 (B), IgG2c (C) e IgG2a (D) anti PsVi, se realizó en suero extraído 12 días después de refuerzo con Vax-TyVi, mediante ELISA En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif.). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por * ** (p<0.001); ** (p <0.01 ) y * (p<0.05).
Figura 7. Determinación de células T efectoras por ELISPOT estándar después de una dosis de refuerzo con Vax-TyVi 100 días después la última dosis. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 μί) de AFCo l o AFPL1 (50 μg) y PsVi (25 μg). Como controles se utilizó el PsVi solo por la ruta i.n (3 dosis de 25 μg de PsVi) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5 μg/10 Ομί) por la ruta intramuscular. La evaluación de las células secretoras de IFN-γ anti PsVi específicas se determinó en bazos suero extraído 10 días después de refuerzo con Vax-TyVi, mediante ELISA En la figura se muestran las medias de 2 experimentos independientes.
Figura 8. Determinación de la inmunogenicidad sistémica de la formulación intranasal de AFCol coadministrado con polisacárido C de Neisseria meningitidis (PsC) después de un refuerzo nasal con PsC plano. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 μί) de AFCo l (50 μg) y PsC ( 10 μg). Como controles se utilizó el PsC solo por la ruta i.n (3 dosis de 10 μg). La evaluación de los niveles de IgG anti PsC se realizó en suero extraído 21 días después de la última dosis, mediante ELISA. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif.). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por * * * (p<0.001 ); * * (p <0.01 ) y * (p<0.05). Figura 9. Determinación de la inmunogenicidad mucosal de la formulación intranasal de AFCol coadministrado con PsC de Neisseria meningitidis después de un refuerzo nasal con PsC plano. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 iL) de AFCo l (50 μg) y PsC (10 μg). Como controles se utilizó el PsC solo por la ruta i.n (3 dosis de 10 μg). La evaluación de los niveles de IgA en saliva (A) y en lavado vaginal (B) anti PsC se realizó en saliva extraída 7 días y el lavado vaginal 28 días después de la última dosis, mediante ELISA. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif.). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por * * * (p<0.001 ); * * (p <0.01 ) y * (p<0.05).
Figura 10. Determinación del Patrón de Subclases IgGl, IgG2a anti Polisacárido para la formulación intranasal de AFCol coadministrado con PsC después de un refuerzo nasal con PsC plano Ratones Balb/c fueron inmunizados con 3 dosis i.n (25 μί) de AFCol (50 μg) y PsC ( 10 μg). Como controles se utilizó el PsC solo por la ruta i.n (3 dosis de 10 μg). La evaluación de los niveles de IgG l e IgG2a anti PsC se realizó en suero extraído 21 días después de la última dosis, mediante ELISA. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes.
Figura 11. Inmunogenicidad de la formulación por la ruta intramuscular del AFPL1 y el PsVi. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 1 dosis i.m (100 μί) de AFPL1 (12 μg) y PsVi (5 μg). Como controles se utilizó el PsVi adsorbido en Alúmina (5 μg de PsVi y 400μg de Alúmina) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5 μg/100μL), ambos con una únicá dosis intramuscular. La evaluación de los niveles de IgG (A) e IgM (B) anti PsVi se realizó en suero extraído 15 días después de la última dosis, mediante ELISA. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif.). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por *** (p<0.001 ); ** (p <0.01) y * (p<0.05).
Figura 12. Respuesta de Subclases IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2c anti-PsVi para la formulación intramuscular de AFPL1 y PsVi. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 1 dosis i.m (100 ih) de AFPL1 (12 μg) y PsVi (5 μg). Como controles se utilizó el PsVi adsorbido en Alúmina (5 μg de PsVi y 400μg de Alúmina) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5 μg/100μL), ambos con una única dosis intramuscular. La evaluación de los niveles de IgGl (A), IgG3 (B), IgG2c (C) e IgG2a (D) anti PsVi, se realizó en suero extraído 21 días después de la última dosis, mediante ELISA En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey y Bonferroni, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif.). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por *** (p<0.001); ** (p <0.01) y * (p<0.05).
Figura 13. Determinación del Índice de afinidad y del por ciento de reducción de la afinidad para la formulación intramuscular del AFPL1 y el PsVi. Ratones C57BL/6 fueron inmunizados con 1 dosis i.m (100 μί) de AFPL1 ( 12 μg) y PsVi (5 μg). Como controles se utilizó el PsVi adsorbido en Alúmina (5 μ§ de PsVi y 400μ de Alúmina) y la vacuna cubana contra fiebre tifoidea, Vax-TyVi (5 μg/100 μί), ambos con una única dosis intramuscular. La evaluación del índice de avidez de los anticuerpos IgG (A) anti PsVi se realizó en suero extraído 15 días después de la última dosis, mediante ELISA de avidez con el agente caótropico Tiocianato de Potasio 0.25M. La evaluación del por ciento de reducción de la absorbancia (B) se realizó mediante ELISA de avidez con diferentes concentraciones del agente caotrópico (0.1M, 0.25M, 0.5M y 1M). En la figura se muestra el por ciento de reducción de la absorbancia calculado para cada concentración de Tiocianato de Potasio de 2 determinaciones en experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Califi). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por *** (p<0.001); ** (p <0.01) y * (p<0.05).
Figura 14. Inmunogenicidad de la formulación de vesículas de membrana externa (Proteoliposoma, PL) de N. meningitidis A y W135 por la ruta subcutánea y el polisacárido A (PsA) de N. meningitidis serogrupo A. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis (100 μί) subcutáneas (s.c) de vesícula de membrana externa de N, meningitidis serogrupo A y W135 (2.5 μg de cada una) y PsA (5μ ). Como controles se utilizó el PsA solo y adsorbido en Fosfato de Aluminio (5 μg de PsA y 400 μg de Alúmina) y la vacuna conjugada comercial de polisacárido A, MenAfriVac (2 μg/100μL), todos en 2 dosis s.c. La evaluación de los niveles de IgG (A) e IgM (B) anti PsA se realizó en suero extraído 15 días después de la última dosis, mediante ELISA. En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo.
Figura 15. Respuesta de Subclases IgGl, IgG3 e IgG2a anti PsA para la formulación con las vesículas de membrana (Proteoliposoma, PL) externa de N. meningitidis A y W135 con el PsA. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis (100 μί) subcutáneas (s.c) de vesícula de membrana externa de N. meningitidis serogrupo A y W135 (2.5 μg de cada una) y PsA (5 μg). Como controles se utilizó el PsA solo y adsorbido en Fosfato de Aluminio (5 μg de PsA y 400 μ§ de Alúmina) y la vacuna conjugada comercial de polisacárido A, MenAfriVac (2 μg/100 μί), todos en 2 dosis s.c. La evaluación de los niveles de IgGl (A), IgG3 (B), e IgG2a (C) anti PsA, se realizó en suero extraído 21 días después de la última dosis, mediante ELISA En la figura se muestran las medias y desviación estándares de la relación matemática de los valores (DO) de 2 determinaciones en 2 experimentos independientes. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif). El valor de P<0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por *** (p<0.001); ** (p <0.01) y * (p<0.05). Figura 16. Determinación del índice de Afinidad anti-PsA para la formulación de las vesículas de membrana externa de N. meningitidis A y W135 con el PsA. Ratones Balb/c fueron inmunizados con 2 dosis (100 μί) subcutáneas (s.c) de vesícula de membrana externa de N. meningitidis serogrupo A y W135 (2.5 μg de cada una) y PsA (5 μg). Como controles se utilizó el PsA solo y adsorbido en Fosfato de Aluminio (5 μg de PsA y 400 μg de Alúmina) y la vacuna conjugada comercial de polisacárido A, MenAfriVac (2 μg/100 μί), todos en 2 dosis s.c. La evaluación del índice de avidez de los anticuerpos IgG (A) anti PsA se realizó en suero extraído 15 días después de la última dosis, mediante ELISA de avidez con el agente caótropico Tiocianato de Potasio 0.25M. Las diferencias significativas entre las medias de los diferentes grupos se determinaron mediante test de comparación múltiple Tukey, presente en el Graph Pad Prism 4 software (Calif.). El valor de P <0.05 se consideró como estadísticamente significativo y se representó por *** (p<0.001); ** (p <0.01) y * (p<0.05).
Figura 17. Respuesta de IgG e IgM anti polisacárido C (PsC) de N. meningitidis serogrupo C y actividad bactericida sérica (SBA) en infantes primovacunados con VA- MENGOC-BC® y que son menores de un año. Cada grupo de n sueros proviene de un total de 151 infantes que fueron vacunados a los 3.5 (primera dosis) y 5 (segunda dosis) meses. A, anti PsC IgG; B, anti PsC IgM y C, actividad bactericida sérica contra los serogrupos B y C de N. meningitidis. Las flechas representan las dosis con VA-MENGOC-BC®, vacuna bivalente que contiene el PsC adsorbido en alúmina junto al AFPL1.
Figura 18. Persistencia de la respuesta de IgG e IgM anti polisacárido C (PsC) de N. meningitidis serogrupo C en infantes primovacunados con VA-MENGOC-BC® y que tienen entre 2 a 15 años. Cada grupo de n sueros proviene de un total de 191 primovacunados a los 3.5 (primera dosis) y 5 (segunda dosis) meses y ahora son niños (136) y escolares y adolescentes (55). A, anti PsC IgG y B, anti PsC IgM.
Figura 19. Subclases de IgG sérica inducida y su duración en infantes primovacunados con VA-MENGOC-BC®. Cada grupo de n sueros proviene de un total de 388 primovacunados a los 3.5 (primera dosis) y 5 (segunda dosis) meses y ahora son niños infantes 151 infante, niños 136, escolares y adolescentes 55 y adultos jóvenes 46. Quince adultos jóvenes adicionales recibieron una dosis de vacuna plana A+C (Pasteur Merieux Connaught). A, subclases de IgG anti PsC en menores de un años; B, subclases de IgG anti PsC de 2 to 15 años; and C, subclases de IgG anti PsC en inmunizados con vacuna A+C plana.
Dra. Dánice Vázquez D' Alvaré
Agente Oficial
LEX S.A
Ave. Ira. No.1001 Esq. a 10
Miramar. Playa. CP 1 1300
Ciudad Habana. Cuba
TELF. (537)204-9093 FAX (537)2079533

Claims

REIVINDICACIONES ADJUV ANTES PARA VACUNAS POLISACARIDICAS Y LAS FORMULACIONESRESULTANTES
1. Composición inmunogénica adyuvada para la aplicación parenteral, mucosal o simultánea conteniendo antígenos polisacarídicos no conjugados.
2. Composición inmunogénica según la Reivindicación 1, que contiene (a) un antígeno capsular de N. meningitidis serogrupo C o el Polisacárido Vi de Salmonella Typhi no conjugados y (b) el AFCol como adyuvante para la aplicación mucosal o el AFPL1 como adyuvante para la aplicación parenteral.
3. Composición inmunogénica según la Reivindicación 1 , que contenga: (a) un antígeno capsular de N. meningitidis serogrupo A no conjugado y (b) el AFPLx homólogo (proveniente de N. meningitidis serogrupo A) absorbido en alúmina como adyuvante para la aplicación parenteral.
4. Las composiciones inmunogénicas de las reivindicaciones 1-3, al que se añada un polisacárido conjugado.
5. Las. composiciones inmunogénicas de las reivindicaciones 2-3, conteniendo el mismo adyuvante (AFPLx o AFCox) aplicado por ambas rutas, parenteral y mucosal.
6. Composición inmunogénica según reivindicación 1 a 4, donde los antígenos polisacarídicos sean purificados de microbios, convertidos en oligosacáridos, obtenidos de forma recombinante o sintéticos.
7. La composición de las reivindicaciones 1 a la 4, cuando la composición incluye sólo meningococo, uno, dos, o los tres sacáridos de (1) meningococo, (2) Haemophylus influenzae y (3) Streptococo pneumonieae.
8. Las composiciones inmunogénicas de las reivindicaciones 1-7, donde los adyuvantes, AFPLx o AFCox, polarizan la respuesta de antígenos polisacarídicos no conjugados hacia un patrón Thl después de ser administrada a un sujeto permitiendo así, que dichas formulaciones, funcionen en neonatos, infantes e induzcan memoria inmune.
Dra. Dánice Vázquez D' Alvaré
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597572A (en) 1987-07-30 1997-01-28 Centro Nacional De Biopreparados Method of producing Neisseria meningitidis B vaccine, and vaccine produced by method
US5643574A (en) 1993-10-04 1997-07-01 Albany Medical College Protein- or peptide-cochleate vaccines and methods of immunizing using the same
WO2003007985A2 (en) 2001-06-20 2003-01-30 Chiron Srl. Capsular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
WO2003094964A1 (es) 2002-05-08 2003-11-20 Instituto Finlay, Centro De Investigación- Pruducción De Vacunas Y Sueros Composición vacunal contra las alergias, método para su obtención y empleo en el tratamiento de las mismas
WO2004047805A1 (es) 2002-11-27 2004-06-10 Instituto Finlay. Centro De Investigacion-Produccion De Vacunas Y Sueros. Obtencion de estructuras cocleares, composiciones vacunales, adyuvantes y sus intermediarios.
WO2005063287A1 (es) 2003-12-30 2005-07-14 Instituto Finlay. Centro De Investigación-Producción De Sueros Y Vacunas Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones resultantes
EP2359850A1 (en) 2008-11-19 2011-08-24 Instituto Finlay, Centro de Investigacion-Produccion de vacunas y sueros Single-time vaccines

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597572A (en) 1987-07-30 1997-01-28 Centro Nacional De Biopreparados Method of producing Neisseria meningitidis B vaccine, and vaccine produced by method
US5643574A (en) 1993-10-04 1997-07-01 Albany Medical College Protein- or peptide-cochleate vaccines and methods of immunizing using the same
WO2003007985A2 (en) 2001-06-20 2003-01-30 Chiron Srl. Capsular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
WO2003094964A1 (es) 2002-05-08 2003-11-20 Instituto Finlay, Centro De Investigación- Pruducción De Vacunas Y Sueros Composición vacunal contra las alergias, método para su obtención y empleo en el tratamiento de las mismas
WO2004047805A1 (es) 2002-11-27 2004-06-10 Instituto Finlay. Centro De Investigacion-Produccion De Vacunas Y Sueros. Obtencion de estructuras cocleares, composiciones vacunales, adyuvantes y sus intermediarios.
WO2005063287A1 (es) 2003-12-30 2005-07-14 Instituto Finlay. Centro De Investigación-Producción De Sueros Y Vacunas Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones resultantes
EP1716866A1 (en) 2003-12-30 2006-11-02 Instituto Finlay, Centro de Investigacion-Produccion de vacunas y sueros Proteoliposomes and derivatives thereof as cytotoxic response-inducing adjuvants and resulting formulations
EP2359850A1 (en) 2008-11-19 2011-08-24 Instituto Finlay, Centro de Investigacion-Produccion de vacunas y sueros Single-time vaccines

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARMAND ET AL., J. BIOL. STAND., vol. 10, 1982, pages 335 - 339
BOUVET, J P ET AL., I & 1, vol. 62, 1994, pages 3957 - 3961
BRACHO G. ET AL.: "AFCo I, a meningococcal B-derived cochleate adjuvant, strongly enhances antibody and T-cell immunity against Plasmodium falciparum merozoite surface protein 4 and 5.", MALARIA JOURNAL, vol. 8, 2009, pages 35, XP021049967 *
CABRERA O. ET AL.: "Preparacion and evaluacion of conjugados of polisacarido Vi de Salmonella typhi con toxoide tetanico.", VACCIMONITOR, 2002, pages 6 - 9, XP055151253 *
CADOZ ET AL., VACCINE, vol. 3, 1985, pages 340 - 342
COSTANTINO ET AL., VACCINE, vol. 10, 1992, pages 691 - 698
EISENBARTH SC ET AL., NATURE, vol. 453, 2008, pages 1122 - 1126
EXPERT VACCINE REVIEW, 2011
FRASH: "Advances in Biotechnological Processes", vol. 13, 1990, pages: 123 - 145
GRANOFF D; POLLARD A J., THE PEDIATRIC INFECTIOUS DISEASE JOURNAL, vol. 26, no. 8, 2007, pages 716 - 22
INSTITUTO FINLAY.: "CENTRO DE INVESTIGACION- PRODUCCION DE SUEROS Y VACUNAS Y UNIVERSIDAD DE CAMBRIDGE", FACULTAD PARA LAS CIENCIAS VETERINARIAS, 14 July 2005 (2005-07-14) *
MICLEA, VARMA ET AL., BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1768, no. 11, 2007, pages 2890 - 8
MMWR, vol. 46, no. RR-5, 1997, pages 1 - 10
NARDELLI-HAEFLIGER, DR ET AL., J. VIROL., vol. 73, 1999, pages 9609 - 9613
O PEREZ ET AL., PHARMACOLOGY ONLINE, vol. 3, 2006, pages 762 - 64
PASHINE A; VALIANTI NM., NAT. MED., vol. 11, 2005, pages 63 - 68
PÉREZ 0 ET AL., IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY, vol. 82, 2004, pages 603 - 610
PEREZ ET AL.: "New vaccines require potent adjuvants like AFPLl and AFCol.", SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 66, 2007, pages 271 - 277, XP008149175 *
PEREZ O ET AL., IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY., vol. 82, 2004, pages 603 - 610
PEREZ O ET AL., INFECT IMMUN., vol. 69, no. 7, 2001, pages 4502 - 4508
PEREZ O ET AL., SCAND J IMMUNOLOGY, vol. 66, 2007, pages 271 - 77
ROMEU ET AL.: "AFCol as nasal adjuvant of capsular polysaccharide from Neisseria meningitidis serogroup C induces systemic and mucosal immune responses.", SCANDINAVIAN JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, vol. 43, October 2011 (2011-10-01), pages 809 - 813, XP008173446 *
SCAND J INFECT DIS, 2011, pages 1 - 5
See also references of EP2777712A4 *
SINGH M; O'HAGAN DT, PHARM. RES., vol. 19, no. 6, 2002, pages 715 - 728
SYED, WOO ET AL., INT J PHARM, vol. 363, no. 1-2, 2008, pages 118 - 25
TAILLARDET M ET AL., JID, vol. 202, 2010, pages 470 - 479
VOGEL FR, DEV. BIOL. STAND., vol. 92, 1998, pages 241 - 248
ZARIF, METHODS ENZYMOL, vol. 391, 2005, pages 314 - 29

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