ES2617242T3 - Vacunas de Salmonella no tifoidea - Google Patents

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ES2617242T3 ES09785078.8T ES09785078T ES2617242T3 ES 2617242 T3 ES2617242 T3 ES 2617242T3 ES 09785078 T ES09785078 T ES 09785078T ES 2617242 T3 ES2617242 T3 ES 2617242T3
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Abstract

Un polipéptido inmunogénico que comprende o consiste en: (i) un polipéptido que es una OmpD de Salmonella no tifoidea, o un fragmento inmunogénico de la misma que tiene la capacidad de generar una respuesta de anticuerpos contra la Salmonella no tifoidea (NTS); o (ii) una variante de un polipéptido como se ha definido en (i) que tiene dicha capacidad, para su uso en terapia.

Description

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DESCRIPCION
Vacunas de Salmonella no tifoidea Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a vacunas contra las infecciones por Salmonela no tifoidea (NTS), en particular a la provision en dichas vacunas de un inmunogeno que generara anticuerpos que se dirijan a la protelna de la membrana externa porina (OmpD). Preferentemente, por ejemplo, esta puede ser la propia OmpD o un fragmento de OmpD que mantenga la capacidad para inducir anticuerpos eficaces contra NTS, especialmente el serovar Typhimurium de Salmonella enterica - al que se hace referencia posteriormente como STm. Dicho polipeptido puede proporcionarse en combination con una molecula de excipiente adyuvante. Se puede proporcionar como parte de una vacuna multi-subunitaria con uno o mas de otros antlgenos derivados de Salmonela.
Antecedentes de la invencion
El serovar Typhi de Salmonella enterica (S. typhi), Salmonella paratyphi A y las salmonellas no tifoideas (NTS) son la causa principal de enfermedades. Mientras la fiebre tifoidea sigue siendo un problema de salud publica mundial, en algunas regiones tales como el Africa sub-sahariana las enfermedades por serovares no tifoideos de Salmonella enterica, principalmente Typhimurium aunque tambien se incluye Enteritidis, son particularmente preocupantes como causa que da lugar a mortalidad en ninos y adultos con VIH. Esto es completamente distinto a las infecciones por NTS en Occidente que producen primariamente una gastroenteritis auto-limitante cuyo impacto es como mucho simplemente de importancia economica.
La Salmonela coloniza los macrofagos y la resolution de la fase intracelular de la infection esta controlada por linfocitos T CD4 efectores que interactuan con los fagocitos infectados. Sin embargo, esta bien reconocido que la muerte por infeccion con NTS habitualmente se asocia con bacteriemia y hay muchas pruebas de que la bacteriemia se produce en individuos que carecen de anticuerpos especlficos que limiten la diseminacion extracelular y el crecimiento de NTS (por ejemplo, MacLennan, J. Clin. Invest. (2008) 118:1553). Por lo tanto, se ha expuesto que las infecciones por NTS producen una bacteriemia progresiva en adultos VIH+ y ninos, muriendo alrededor del 50 % de los individuos infectados. Adicionalmente, en el Africa sub-sahariana, las infecciones por NTS producen una enfermedad mortal en ninos no VIH+, principalmente entre 6 y 24 meses, que se iguala o sobrepasa al impacto de la enfermedad por neumococos. De nuevo, la gravedad de la enfermedad en dichos ninos infectados por NTS se asocia estrechamente con bacteriemia; la mortalidad asociada con dicha bacteriemia infantil es aproximadamente del 25 % en los que alcanzan el estado cllnico. La susceptibilidad de dichos ninos se correlaciona con la perdida de anticuerpos maternales y la falta de inmunidad adquirida activamente contra Salmonela.
Aunque se utilizan vacunas para prevenir la fiebre tifoidea producida por S. typhi, la vacunacion contra la fiebre tifoidea no parece inducir una protection cruzada contra STm. En algunos casos, esto se debe claramente a la presencia diferencial de antlgenos (por ejemplo como con el uso del antlgeno Vi), pero dicha falta de proteccion cruzada se puede extender tambien a vacunas de bacterias inactivadas o atenuadas. Actualmente no existen vacunas o medidas preventivas contra NTS. Los antibioticos tales como las fluoroquinolinas se utilizan ampliamente para tratar las infecciones por Salmonela, pero la aparicion de cepas de Salmonela resistentes a multiples farmacos (MDR) es un problema creciente y tambien que su administration puede ser demasiado tarde tras la presentation para ser eficaces. Por lo tanto existe la necesidad real de un medio preventivo eficaz para combatir la infeccion por NTS.
Los inventores expusieron anteriormente que la STm induce una respuesta de anticuerpos atlpica en los ratones que se caracteriza por la rapida y masiva expansion de celulas plasmaticas extra-foliculares. La induction de esta respuesta es independiente de linfocitos T, aunque la activation de la respuesta de IgG2a es dependiente de la ayuda de linfocitos T CD4. Estos estudios tambien identificaban que la respuesta activada precoz de anticuerpo se dirigla a antlgenos en la membrana externa de STm (Cunningham y col. (2007) J. Immunol. 178, 6200-6207). Otros autores han expuesto que las preparaciones de porina aislada de la cepa de Salmonela tifoidea serovar Typhi de Salmonella enterica (S. typhi o ST) tambien inducen una respuesta de anticuerpo atlpicamente de larga duration en ratones (Secundino y col. (2005) Immunology, 117, 59-70). Este trabajo demostraba que las porinas de membrana externa tanto OmpF como OmpC contribuyen a la respuesta de anticuerpo siendo la OmpC la principal protelna responsable. Sin embargo, la composition de protelna de membrana externa (Omp) de las membranas externas de ST y STm son diferentes y dicho trabajo con ST no es aplicable directamente a STm. Ademas, Secundino y col. exponen que el suero anti-porina de S. typhi no reaccionaba de manera cruzada con STm.
En la membrana externa de STm, pero no en la de S. typhi, hay una tercera porina, OmpD, ademas de OmpF y OmpC. La OmpD es una porina trimerica que comparte un grado de homologla con OmpF y OmpC, primariamente en la estructura en barril. Mientras que la expresion de OmpF y OmpC se regula por OmpR y es sensible a un cambio en la osmolaridad, la expresion de OmpD aumenta en anaerobiosis y se suprime al descender el pH. Singh y col. previamente miraron la capacidad de los anticuerpos monoclonales contra porinas de STm para proporcionar una inmunoproteccion pasiva contra STm en ratones (Microbial Pathogenesis (1996) 21, 249-263). No se encontro ningun anticuerpo monoclonal contra los epltopos de OmpC y OmpD expuestos en la superficie que protegiera
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contra la infeccion por STm. Se descubrio que una mezcla de dichos anticuerpos solamente extendla el tiempo de supervivencia de ratones desafiados con membrana externa de STm purificada. Sin embargo, esto representa un repertorio de anticuerpos muy diferente de la respuesta de anticuerpo contra STm in vivo y no proporciona information en la contribution de cualquier porina individual de STm a la respuesta de anticuerpo frente a la infeccion por STm.
El documento WO 2007/062795A (Stifung Tierarztkiche Hochschule Hannover), Selke y col. ("Immunization of pigs to prevent disease in humans: construction of a protective efficacy of salmonella enterica serovar typhimurium live negative-marker vaccine" Infection Immun: Vol. 75 pp 2476-2483, 2007) y Can J Mircobiol ("OmpD but not OmpC is involved in adherence of salmonella enterica serovar typhimurium to human cells " Vol. 50, pp 719-727, 2004) proporcionan visiones utiles de los antecedentes de la presente invention.
Sorprendentemente, los inventores han demostrado ahora que la respuesta natural de anticuerpo a OmpD en STm es suficiente para conseguir reducciones marcadas en el numero de celulas bacterianas STm. Una preparation altamente purificada de Omp de STm que contenla las porinas OmpD, OmpC y OmpF demostraba que inducla una rapida respuesta de anticuerpo especlfica contra porina proteica en ratones deficientes en linfocitos T asociada con la induction de una poblacion de linfocitos B1b innatos; se demostro que la inmunizacion con dichas Omp aisladas producla respuestas protectoras equivalentes contra la infeccion de STm, a las de STm inactivadas. Sin embargo, en los ratones inmunizados con porina infectados con STm OmpD- se eliminaba la protection y los anticuerpos de los ratones inmunizados con porina se unlan deficientemente con preparaciones de pared celular deficientes en OmpD. Ademas, se demostro que las preparaciones de Omp de S. typhi no proteglan de manera cruzada a pesar de la alta homologla entre las porinas OmpC y OmpF de ST y STm. Esto es consistente con el importante papel de los anticuerpos contra OmpD para combatir la infeccion por NTS. Por lo tanto, los inventores han demostrado ahora que la OmpD es un primer candidato para una subunidad de vacuna contra NTS.
Sumario de la invencion
En un primer aspecto, la presente invencion proporciona por lo tanto un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en:
(i) un polipeptido que es una OmpD de Salmonela no tifoidea, o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad de generar una respuesta de anticuerpo contra Salmonela no tifoidea (NTS); o
(ii) una variante de un polipeptido como se define en (i) que tiene dicha capacidad, para su uso en terapia.
El polipeptido inmunogenico puede comprender:
(i) un polipeptido que es una OmpD o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad para generar una respuesta de anticuerpo contra NTS, especialmente S. typhimurium (STm); o
(ii) una variante de un polipeptido como se define en (i) que tiene dicha capacidad,
para su uso en terapia (terapia preventiva o tratamiento), mas particularmente para su uso en el tratamiento o prevention de la infeccion y/o la enfermedad por NTS, especialmente la infeccion y/o enfermedad o STm o S. enteritidis. Preferentemente, dicho polipeptido inmunogenico puede ser la OmpD nativa de Salmonela no tifoidea, por ejemplo, la OmpD que se deriva de STm, o un fragmento inmunogenico de la misma. Las variantes adecuadas incluyen tanto las variantes naturales como los analogos modificados que mantengan la especificidad de anticuerpo deseada.
Tambien se proporciona el uso de un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en:
(i) un polipeptido que es una OmpD o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad de generar una respuesta de anticuerpo contra NTS, especialmente STm; o
(ii) una variante de un polipeptido como se define en (i) que tiene dicha capacidad,
para su uso en la fabrication de una composition vacunale para el tratamiento o prevencion de la infeccion y/o enfermedad por NTS tal como la infeccion y/o enfermedad por STm. Preferentemente la composicion vacunal sera eficaz contra STm y S. enteritidis. Se pueden emplear uno o mas polipeptidos inmunogenicos junto con el polipeptido que se define en (i) o (ii) anteriormente, por ejemplo, que se seleccionan de entre (i) las porinas de la membrana externa de NTS y/o ST y/o S. paratyphi o fragmentos inmunogenicos de las mismas.
En otro aspecto, se proporciona una composicion vacunal que proporciona un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en:
(i) un polipeptido que es una OmpD de una Salmonela no tifoidea, o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad para generar una respuesta de anticuerpo contra una Salmonela no tifoidea (NTS); o
(ii) una variante de polipeptido como se define en (i) que tiene dicha capacidad,
en el que la composicion vacunal comprende ademas uno o mas polipeptidos inmunogenicos adicionales.
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En un aspecto adicional, se proporciona una composicion vacunal que proporciona un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en:
(i) un polipeptido que es una OmpD de una Salmonela no tifoidea, o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad para generar una respuesta de anticuerpo contra una Salmonela no tifoidea (NTS); o
(ii) una variante de un polipeptido como se define en (i) que tiene dicha capacidad,
y que incluye un adyuvante. El componente antigenico de dicha vacuna puede comprender o consistir en dicho polipeptido antigenico. El adyuvante puede estar separado de este antlgeno o se proporciona en una protelna de fusion conjugada con el polipeptido que se define en (i) o (ii) anteriormente, por ejemplo, se puede proporcionar la OmpD conjugada con toxoide tetanico, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, toxoide de colera u otro excipiente adyuvante polipeptldico. Como se ha indicado anteriormente, dicha composicion vacunal puede incluir otros antlgenos para extender su amplitud espectro, por ejemplo para proporcionar una vacuna de amplio espectro tanto para NTS como para las Salmonelas causantes de fiebre tifoidea.
En un aspecto adicional, se proporciona una composicion vacunal como se ha definido anteriormente para su uso en un procedimiento para tratar o prevenir la infeccion por NTS, especialmente la infeccion por STm, y la infeccion por S. paratyphi y/o ST.
En un aspecto relacionado, se proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la infeccion y/o enfermedad por Salmonela que contiene OmpD, especialmente la infeccion por NTS y/o enfermedades tales como la infeccion y/o enfermedad por STm, que comprende la administracion de un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en el polipeptido que se define en (i) y (ii) anteriormente.
La OmpD tambien es caracterlstica de la membrana externa de Salmonella paratyphi. Por lo tanto, ahora se extrapola que la OmpD de S. paratyphi, especialmente, por ejemplo, la OmpD de S. paratyphi A, tambien se puede utilizar en la vacuna para tratar o prevenir la infeccion y/o enfermedad por Salmonella paratyphi.
Por lo tanto, en un aspecto relacionado tambien se proporciona ahora un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en:
(a) un polipeptido que es una OmpD de S. paratyphi o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad para generar una respuesta de anticuerpo contra S. paratyphi, o
(b) una variante de un polipeptido como se define en (i) que tiene dicha capacidad,
para su uso en la terapia (terapia preventiva o tratamiento). Dicho polipeptido inmunogenico puede estar incluido en una vacuna multi-subunitaria como se ha expuesto anteriormente.
Desde otra perspectiva adicional relacionada, se proporciona el uso de un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en
(a) un polipeptido que es una OmpD de S. paratyphi o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad para generar una respuesta de anticuerpo contra S. paratyphi; o
(b) una variante de un polipeptido como se define en (i) que tiene dicha capacidad,
para su uso en la fabricacion de una composicion vacunal para su uso en el tratamiento o prevencion de la infeccion y/o enfermedad por Salmonela que contiene OmpD, especialmente la infeccion o enfermedad por S. paratyphi. Como en el caso de las composiciones vacunales para NTS expuestas anteriormente, se puede emplear uno o mas polipeptidos inmunogenicos adicionales, por ejemplo, que se seleccionen de entre las porinas de membrana externa de NTS (por ejemplo, preferentemente una OmpD de NTS tal como la OmpD de STm), y/o ST y/o S. paratyphi o fragmentos inmunogenicos de las mismas.
En un aspecto relacionado, se proporciona una composicion vacunal que proporciona un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en el polipeptido que se define en (a) o (b) anteriores y que incluye un adyuvante. El adyuvante puede ser una molecula excipiente de adyuvante conjugado con el polipeptido que se define en (a) o (b). Este puede ser una protelna de fusion, tal como cualquiera de las que se describen en el presente documento.
En otro aspecto adicional relacionado, se proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la infeccion y/o enfermedad por Salmonela que contiene OmpD, especialmente S. paratyphi, que comprende la administracion de un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en el polipeptido que se ha definido en (a) o (b) anteriormente.
La presente invencion tambien es util en el tratamiento y particularmente la profilaxis de la bacteriemia. En particular, la bacteriemia se puede suprimir en pacientes vacunados con el presente inmunogeno.
Los anticuerpos que se producen por el presente inmunogeno son preferentemente tipo IgG o IgM.
La secuencia de aminoacidos de la OmpD es bien conocida. La referencia del presente documento al polipeptido OmpD tambien puede cubrir la secuencia de polinucleotido que lo codifica.
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Descripcion detallada
La OmpD para su uso en una vacuna de acuerdo con la invention se puede aislar de las celulas bacterianas o producirse de manera recombinante. Como se ha indicado anteriormente, las versiones truncadas de OmpD tambien se pueden emplear siempre que mantengan la inmunogenicidad necesaria. Los analogos de dicho fragmento de OmpD u OmpD completa que mantengan la capacidad para dar lugar a una respuesta de anticuerpo que se desea, especialmente, por ejemplo, contra STm, se pueden construir por tecnicas conocidas de modification proteica. Pueden tener una o mas sustituciones y/o eliminaciones y/o adiciones, por ejemplo una o mas sustituciones conservadoras que den como resultado una inmunogenicidad deseada que se mantiene observable en estudios de desaflo, por ejemplo en ratones desafiados con STm.
Se conciben variantes, fragmentos o analogos de OmpD, siempre que den lugar a una respuesta inmunitaria que se describe en el presente documento.
Las variantes tienen preferentemente al menos un 80 %, mas preferentemente al menos un 85 %, mas preferentemente al menos un 90 %, mas preferentemente al menos un 95 %, mas preferentemente al menos un 99 %, mas preferentemente al menos un 99,5 % y mas preferentemente al menos un 99,9 % de homologla de secuencia (como sea apropiado) respecto a la secuencia de aminoacidos de la OmpD de tipo silvestre, que esta altamente conservada entre los generos, o con una secuencia de polinucleotido que la codifica o una complementaria de la misma. Dicha determination se puede hacer utilizando el programa BLAST por ejemplo.
Se puede proporcionar una OmpD o un fragmento o un analogo de la misma en forma de protelna de fusion. Como se ha indicado anteriormente, se puede considerar conveniente o preferible proporcionar, por medio de dicha protelna de fusion, un componente adyuvante. Los polipeptidos adecuados que se van a utilizar para este fin se pueden seleccionar de excipientes polipeptldicos bien conocidos en la tecnica de vacunas para este fin, algunos de los cuales se han enumerado anteriormente. Las flagelinas y otros excipientes polipeptldicos tambien se pueden considerar para este fin. Sin embargo, igualmente se puede proporcionar un adyuvante por separado.
Como tambien se ha indicado anteriormente, el uso de una OmpD nativa, un fragmento de la misma o una variante de dicho polipeptido que mantenga la capacidad para generar el anticuerpo pueden combinarse deseablemente con el uso de uno o mas polipeptidos inmunogenicos adicionales en una vacuna multi-subunitaria. Por lo tanto, se pueden proporcionar uno o mas polipeptidos inmunogenicos adicionales que se seleccionan de entre los polipeptidos que comprenden o consisten en (i) una porina de membrana externa de NTS, ST o S. paratyphi, por ejemplo, una OmpC de ST o un fragmento inmunogenico de la misma, y (ii) versiones modificadas de dichos polipeptidos que mantengan la capacidad para generar una respuesta de anticuerpo contra Salmonela. Dicho polipeptido puede ser, por ejemplo, una variante de OmpD nativa en comparacion con la OmpD de STm o un fragmento inmunogenico de la misma. Como se ha senalado anteriormente, dicho uno o mas polipeptidos inmunogenicos adicionales se pueden proporcionar para ampliar la especificidad, incluyendo la provision de una vacuna de amplio espectro eficaz contra NTS, especialmente STm, y adicionalmente contra salmonellas tifoideas tales como S. typhi y/o S. paratyphi.
Ademas de los estudios que se muestran en las Figuras 1-4, los inventores han llevado a cabo experimentos adicionales y han llegado a varios hallazgos adicionales como se exponen posteriormente.
Los inventores han determinado, por ensayos estructurales, que las porinas aisladas utilizadas en estos estudios mantienen sus propiedades nativas, demostrando que los anticuerpos se dirigen a las porinas proteicas funcionales.
Los presentes inmunogenos han demostrado ahora que inducen celulas plasmaticas especlficas de porinas en el bazo de ratones 4 dlas tras la infection. Esto demuestra que la respuesta es inducida rapidamente por estos inmunogenos, lo que claramente es beneficioso para una vacuna.
Los inventores han descubierto que los linfocitos T son necesarios para la production eficaz de anticuerpos IgG activados contra porinas. Sin embargo los linfocitos T no son necesarios para la induction de IgM. Por lo tanto, los anticuerpos generados contra el inmunogeno seran preferentemente IgM o IgG. En el caso de IgG, se prefiere que el vacunado o el paciente tengan un recuento de linfocitos T suficiente para facilitar la induccion de IgG. Si no es asl, entonces bastara con otros tipos de inmunoglobulinas, tal como IgM.
La inmunizacion con porinas ha demostrado que es suficiente para suprimir la bacteriemia, un marcador de la gravedad de la enfermedad. Por lo tanto, la profilaxis de la bacteriemia es particularmente preferida, aunque tambien se concibe el tratamiento.
De hecho, los inventores han demostrado tambien que la inmunizacion de un paciente o un vacunado dos veces confiere un beneficio mayor que una sola inmunizacion. Se prefiere por lo tanto que el tratamiento comprenda al menos dos o mas, y preferentemente 3 o mas o, 4 o mas, vacunaciones que comprenden el presente inmunogeno. Sin embargo se prefieren particularmente dos vacunaciones. Se pueden separar adecuadamente mas de dos o mas dlas.
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Los inventores han confirmado que la infeccion de ratones, con bacterias que carecen de OmpF y OmpC (las otras porinas que se encuentran en la preparacion purificada de porinas) pero que aun expresan OmpD, disminuye y la bacteriemia se suprime tras la inmunizacion con el presente inmunogeno. Por el contrario, en los ratones inmunizados con porinas de bacterias que carecen de OmpD pero que tienen suficiente OmpF y OmpC no disminuye (vease la Figura 3), con una moderada bacteriemia a un nivel mas marginal. Ademas, aun se mantienen los anticuerpos que se unen a las porinas de la pared celular.
Por ultimo, los inventores han demostrado que el modelo murino tambien responde a las vacunas tales como las de polisacarido Typhim (una vacuna actual contra la fiebre tifoidea). Esto puede ser importante porque los ninos menores de 2-3 anos no responden a esta vacuna y son los ninos de esta edad los que son susceptibles a NTS. Esto apoya la importancia de estos linfocitos B1b. Preferentemente, el polisacarido Typhim tambien se puede utilizar como adyuvante en la presente invencion, en particular en una vacuna para ninos de 3 anos de edad o menores.
Cuando se hace referencia a un uso particular, se apreciara que esta englobe el procedimiento de tratamiento correspondiente. En otras palabras, la invencion tambien proporciona un procedimiento de tratamiento y procedimientos de vacunacion de un individuo o una poblacion, comprendiendo dichos procedimientos por ejemplo la administration del presente inmunogeno, opcionalmente con un adyuvante a un paciente que necesita del mismo o a un individuo o poblacion que se va a vacunar.
Los medios de suministro del inmunogeno adecuados se conocen bien en la tecnica, pero pueden incluir el uso de un inmunogeno soluble, la encapsulation en liposomas, o la formation de un ISCOM (Complejo inmunoestimulante). El suministro puede ser tambien por medio de un polinucleotido que codifique el inmunogeno, por ejemplo suministrado por medio de un plasmido o un vector vlrico (tal como retrovlrico) que comprende dicho polinucleotido. Por lo tanto, el polipeptido inmunogenico puede, preferentemente, expresarse a partir de un polinucleotido. Tambien se prefiere el uso de adyuvantes basados en aluminio y otros.
La invencion se describe ademas a continuation en la siguiente ejemplificacion en referencia a las figuras siguientes:
Breve descripcion de las figuras
Figura 1. Resultados de los estudios que muestran que las porinas inducen una respuesta de anticuerpo especlfica, rapida en ausencia de linfocitos T. (A) A los 4 dlas tras la infeccion por via i.p. con STm, los ratones deficientes en linfocitos T pueden inducir una respuesta de celulas plasmaticas esplenicas, extra-folicular, rapida contra STm que da como resultado unos aumentos notables de anticuerpos sericos contra LPS y Omp, pero no contra flagelina. (B) Las Omp altamente purificadas de STm, OmpC, OmpD y algunas OmpF. (C) Las porinas inducen rapidamente anticuerpos IgM independientes de linfocitos T que son especlficos de porinas proteicas. Todos los ratones se inmunizaron/infectaron por via i.p. NI = no inmunizados.
Figura 2. Resultados que muestran que los anticuerpos contra las porinas de STm pueden proteger contra STm como se trata adicionalmente posteriormente. (A) Los ratones que se inmunizaron con STm inactivada por calor o las porinas purificadas (Figura 1B) mostraban una calda aproximadamente equivalente a 100-1000 veces del numero bacterias en el bazo en comparacion con los ratones no inmunizados, 4-5 dlas tras la infeccion con STm. (B) La protection conferida por la inmunizacion con porinas esta mediada por linfocitos B ya que la infeccion de los ratones inmunizados con porinas que careclan de linfocitos B (ratones IgH -/-) no conferla ninguna ventaja (panel de la izquierda). Ademas, la opsonization de bacterias con anticuerpos a partir de ratones deficientes en linfocitos T inmunizados con porinas antes de la infeccion conferla significativamente mas proteccion que la opsonizacion con sueros de ratones no inmunizados (panel de la derecha). (C) En ratones deficientes en CD28 que no pueden activar eficazmente IgG1 o IgG2a pero que siguen teniendo linfocitos B e IgM, aun se inducen anticuerpos contra las porinas y se confiere proteccion pero esta proteccion no es tan grande como cuando se inducen anticuerpos activos. (D) La inmunizacion con porinas puede disminuir la infeccion por una cepa de STm (SL 1344) altamente virulenta en cepas susceptibles de ratones. (E) Mientras las porinas de STm que contienen OmpD, OmpC y OmpF podlan conferir beneficios contra la infeccion, las porinas de ST preparadas de manera similar y que contienen OmpF y OmpC no podlan. Ademas, este beneficio no era debido a LPS ya que la inmunizacion con una preparacion comercial altamente pura de LPS de STm (Axxora) tambien fallaba en conferir proteccion contra la infeccion.
Figura 3. Resultados que demuestran que la proteccion con porinas puede estar mediada, en gran parte, por la OmpD. (A) Los ratones se sensibilizaron con porinas durante 35 dlas antes del desaflo con STm o STm deficiente en OmpD y se evaluaron las respuestas 5 dlas despues. El numero de bacterias en el bazo y el hlgado era similar en el grupo de STm deficiente en OmpD, independientemente de si los ratones se inmunizaban con porinas de antemano. (B) Reactividad de IgM en los sueros de ratones deficientes en linfocitos T o ratones deficientes en linfocitos T inmunizados durante 7 dlas con porinas. Los sueros se ensayaron contra dos grupos de antlgenos: fracciones de pared celular de STm o STm carente de OmpD. La union de los sueros inmunes a la fraction de porina (encuadrada) a partir de STm deficiente en OmpD esta disminuida.
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Figura 4. La STm y las porinas purificadas inducen una poblacion de linfocitos B1b independientemente de linfocitos T que puede proteger contra la infeccion. (A) Linfocitos de la cavidad peritoneal evaluados antes, o 4 dlas despues del antlgeno. La fila superior muestra la expresion de B220 y CD5. Debajo esta la expresion de CD21 y Cd23 para la poblacion de Bib, B220intCD5. (B) Linfocitos B1b en ratones deficientes en linfocitos T no inmunizados e inmunizados con porinas. NI = no inmunizados. (C) Linfocitos B1b transferidos a ratones IgH-/- (deficientes en linfocitos B) e inmunizados con porinas confieren proteccion contra STm. Los ratones deficientes en linfocitos B y quimericos se sensibilizaron con porinas durante 21 dlas antes de la infeccion durante 5 dlas. Los quimericos estaban protegidos contra la infeccion (panel de la izquierda) y produclan IgM anti-porinas. Los animales deficientes en linfocitos B sin linfocitos B1b pero sensibilizados con porinas no estaban protegidos. La caracterizacion de estas celulas habla mejorado respecto a la reciente publicacion de los inventores: Cunningham y col. (PNAS, June 16, 2009, vol. 106, n° 24, pp 9803-9808).
Figura 5. La inmunizacion con porinas disminuye la bacteriemia tras la infeccion con STm. los recuentos bacterianos en la sangre de ratones TS NI e inmunizados con porinas, infectados con 5 x 106 STm (panel de la izquierda) o STm que carece de OmpD (panel central) o STm que carece de OmpR (panel de la derecha) durante 5 dlas. NI = no inmunizados. * -significa P < 0,05.
Figura 6. Las inmunizaciones multiples con porinas confieren mayor proteccion contra la infeccion por STm que la inmunizacion unica. Recuentos de bacterias en bazo e hlgado de ratones TS que se inmunizaron una vez (panel de la izquierda) o dos veces (panel de la derecha) con porinas e infectados con 3 x 103 STm de la cepa Sl 1344 durante 4 dlas. NI = no inmunizados *- significa P < 0,05; **- significa P < 0,01.
Figura 7. La infeccion con STm deficiente en OmpR, que carece de OmpF y OmpC pero mantiene la expresion de OmpD, es moderada tras la inmunizacion con porinas. Los ratones TS no inmunizados (NI) o inmunizados con porinas se infectaron con 5 x 106 STm (clrculos cerrados) o 5 x 106 STm que careclan de OmpR (STmOmpR- cepa RAK83; clrculos abiertos) durante 5 dlas y se enumeran los numeros bacterianos en bazo (panel de la izquierda) e hlgado (panel de la derecha). Analisis de Inmunotransferencia (derecha) de IgM de ratones TCRBbd-/- NI e inmunizados con porinas contra aislados de paredes celulares de STm o STm que carece de OmpR. La region encuadrada muestra la Mr aproximada de la porina OmpD. Se aplico el ensayo de Mann-Whitney para comparar la significacion estadlstica entre los grupos unidos por barras. *-significa P < 0,05.
Figura 8. La induccion de IgG aumenta los beneficios de la inmunizacion con porinas. Inducen linfocitos B1b. Los ratones TS o TCRbd-/- NI o inmunizados con porinas se infectaron con 5 x 106 de STm durante 5 dlas y se enumeran los numeros bacterianos (panel de la izquierda). El panel de la derecha muestra los tltulos de IgM en el suero de los ratones TS y TCRbd-/- NI e inmunizados con porinas infectados el dla 5 con STm. NI-no inmunizado. **-significa P < 0,01; NS - no significativo.
La presente invention se describira ahora en los siguientes Ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Materiales y procedimientos
Ratones, cepas bacterianas e inmunogenos
Los ratones de tipo silvestre (TS) se obtuvieron de colonias domesticas. Las fuentes de ratones deficientes geneticos se expusieron en otro sitio (Cunningham y col. (2007) J. Immunol. 178, 6200-7 y Gaspal y col. (2008) J. Immunol. 180, 2824-9) con la exception de los ratones deficientes en pSTCR, que se obtuvieron en Jax. Todos los ratones y grupos tenlan una edad (6-12 semanas) y sexo establecido antes de su uso. El serovar Typhimurium de Salmonella enterica SL1344 es una cepa TS y la cepa SL3261 es una cepa atenuada deficiente en AroA. La STm deficiente en OmpD se genero con la SL3261 como base.
Las preparaciones de Omp total se generaron como se habla descrito anteriormente por extraction con un 2 % (v/v) de Triton X-100 a partir de envolturas celulares y recolectadas por centrifugation. Se generaron las porinas purificadas utilizando procedimientos bien establecidos (Salazar-Gonzalez y col. (2004) Immunol. Letts 93, 115-22) a partir de ST (cepa 9933) y STm (cepa ATCC 14028).
En resumen, se aislaron las porinas del sobrenadante celulas sonicadas tratadas con nucleasa y con MgCl2, seguido por el tratamiento repetido con tampones que contenlan Tris HCl con SDS y una purification final con FPLC sobre una columna Sephacryl S-200. Las fracciones que contenlan porinas se evaluaron por electroforesis en gel antes de la dialisis extensa contra PBS que contenla un 0,1 % de SDS. Tras la purificacion, las porinas se almacenaron a TA o a -80 DC. El ensayo de lisado de amebocitos Limulus mostraba que la contamination con LPS era de 0,06 EU / 480 pg de porinas. La identidad proteica se confirmo por digestion con tripsina y analisis utilizando un espectrometro de masas con tiempo de vuelo Quadrupole en la Unidad Funcional de Genomica y Proteomica en la Universidad de Birmingham.
Se obtuvo LPS de STm de calidad TLR en (Axxora; producto ALX-581-011-L002) y estaba altamente purificado para eliminar cualquier reactividad cruzada con TLR2. Se genero la flagelina como se describio en otro sitio y se purifico
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hasta la homogeneidad por inmunoprecipitacion. OVA, calidad Imject, se adquirio en Thermo Scientific.
Inmunizacion e infeccion de ratones y experimentos de opsonizacion
Los ratones se inmunizaron por via i.p. con protelnas o LPS a 20 pg en PBS por animal, a menos de que se estableciera otra cosa. Los ratones se infectaron con cepas atenuadas de bacterias a 105 o 106 organismos por animal como se ha descrito para cada experimento. Los ratones se infectaron por via i.p. con 3 x 103 bacterias TS SL1344. En los tiempos especificados tras la infeccion, los ratones se sacrificaron y se aislaron los tejidos. El numero de bacterias por bazo o hlgado se identifico por cultivo directo de los tejidos como se ha descrito anteriormente. Los experimentos que implicaban la infeccion de los ratones tras la opsonizacion de la bacteria in vitro se llevaron a cabo como se habla descrito anteriormente. Antes de la opsonizacion, los complementos de los sueros se inactivaron por calor a 56 DC durante 20 minutos antes de la dilucion y mezcla con las bacterias durante 30 minutos a temperatura ambiente. En cada experimento, se utilizo un unico suero por raton y habitualmente se utilizaron multiples ratones por cada muestra de suero. Para cada experimento se evaluo la viabilidad bacteriana y el fallo en aglutinarse.
Inmunohistologia, ELISA, electroforesis en gel y transferencia de Western
La inmunohistologia para la deteccion de celulas plasmaticas (celulas CD138+, anticuerpo de BD Pharmingen) y las celulas IgD+ se habla descrito anteriormente (Cunningham y col. (2007) J. Immunol, 178, 6200-7) con la exception de que el anti-IgD que se utilizaba era un policlonal de oveja (Abcam ab9177 - 1; 1:1000) y el complejo estreptavidina-APC que se utilizo era el kit Vectastain ABC-AP de Vector Laboratories. Los sueros se evaluaron en cuanto a los niveles de anticuerpos por ELISA utilizando procedimientos que se han descrito anteriormente, en los que los antlgenos se revistieron con 5 pg/ml para antlgenos proteicos y LPS o 10 pg/ml para el organismo completo. Se utilizaron anticuerpos de cabra anti-IgM de raton unidos a fosfatasa alcalina (Southern Biotechnology Associates) y se desarrollo el color utilizando comprimidos de fosfato de p-nitrofenilo Sigma Fast. Las protelnas se separaron en un gradiente de gel de 4-20 % (Thermo Scientific) o en geles al 12 % o 15 % utilizando procedimientos convencionales. Para la transferencia, tras la electroforesis las proteinas se transfirieron en una membrana PVDF y se bloqueo la membrana. La membrana se bloqueo durante una noche y se lavo antes de eliminar la HRP endogena utilizando el sustrato SG (Vector Laboratories). Tras lavar la membrana se incubo con el suero apropiado durante una noche y luego se sondearon con anticuerpo de cabra anti-IgM de raton conjugado con HRP (Southern Biotech) durante 2 horas a temperatura ambiente. La membrana se lavo entonces antes de desarrollarse utilizando la Supersenal Quimioluminiscente (Thermo Scientific).
Analisis FACS y clasificacion celular
Las celulas del exudado peritoneal (PEC) se obtuvieron por lavado y se tineron con uno o mas de estos mAb anti- IgM de raton FITC, CD3 PerCPcy5, Cd5 PEcy5, B220 APC, CD21FITC y CD23PE (todos ellos de E-bioscience; clones eB121-15F9, 145-2C11, 53-73, RA3-6B2, 8D9, B3B4 respectivamente). Las celulas se analizaron con un citometro de flujo FAC-Callibur (BD Biosciences) y los datos se analizaron utilizando WinMDI2.9. Para la transferencia, las celulas se aislaron de los ratones inmunizados 4 dias previamente con porinas y linfocitos B1b (B220int CD5) y se clasificaron utilizando un clasificador celular MoFlo. Las celulas (2 x 105) se transfirieron a ratones IgH-/- y tres dias mas tarde se inmunizaron por via i.p. con 20 pg de porinas. El exito de la transferencia se confirmo por los anticuerpos anti-IgM y anti-porina del suero a los 5 dias despues y antes del desaflo con STm.
Estadisticas
Las estadisticas se calcularon utilizando el ensayo de intervalos de suma no parametrica de Mann-Whitney. Los valores de p se calcularon utilizando el programa Analyze-it.
Resultados
1. La preparation de STm y protelnas totales de membrana externa de STm induce una respuesta rapida de celulas plasmaticas independientes de T
Como se ha indicado anteriormente, se habla establecido anteriormente que las STm podlan inducir una rapida y extensa respuesta de linfocitos B y que una diana principal de la respuesta activada temprana eran las protelnas de la membrana externa pero no los LPS o FliC. Para diseccionar esta respuesta con mas detalle, se utilizaron ratones que carecian completamente de linfocitos T (ratones deficientes pT-CR). La infeccion con Salmonela atenuada daba como resultado un gran aumento de celulas plasmaticas CD138+ sobre el dia 4 de la infeccion y esto era paralelo a la rapida induction de suero IgM contra Salmonela (Fig. 1A). El analisis mas detallado de la respuesta de anticuerpos demostraba que habia una induccion mas fuerte de anticuerpo contra LPS y una preparacion de proteinas de membrana externa total pero una induccion de anticuerpos mucho menos marcada contra FliC (Fig. 1A).
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2. Inmunizacion de ratones deficientes en linfocitos T con una preparacion de porina de STm altamente purificada
Para extender los estudios senalados anteriormente, se investigo la respuesta a una preparacion de porina de membrana externa altamente purificada que contenla OmpC, OmpD, y OmpF en ratones deficientes en linfocitos T (Fig. 1B). El ELISA y transferencia de Western de los sueros de ratones inmunizados confirmaban la induccion de IgM especlfica del antlgeno (Fig. 1C). Por lo tanto los anticuerpos contra las porinas de STm se inducen en ausencia de ayuda de linfocitos T.
3. La proteccion contra la infeccion por STm inducida por porinas esta mediada completamente por linfocitos B
Se evaluo entonces si el anticuerpo inducido tras la inmunizacion con una unica dosis de porinas purificadas podia disminuir la infeccion por STm. Se inmunizaron ratones TS con porinas y se desafiaron con Salmonela atenuada 35 dlas mas tarde. Como comparacion inicial, se comparo el nivel de proteccion que ofrecen las porinas con el que ofreclan las bacterias inactivadas por calor. La inmunizacion tanto con porinas purificadas como con bacterias inactivadas reducla la carga bacteriana esplenica una media de 2-3 logs (Fig. 2A). Ademas, el anticuerpo inducido por porinas al 4° dla de inmunizacion podia reducir la infeccion aproximadamente un 50 % (datos no mostrados). Para evaluar si los linfocitos B mediaban en esta proteccion, se inmunizaron ratones TS y ratones que carecian de todas las celulas B (ratones deficientes en IgH) con porinas y se infectaron tras 35 dias. Esto demostraba una anulacion completa de la proteccion conferida por las Omp en ausencia de linfocitos B (Fig. 2B). Por el contrario, la opsonizacion de bacterias con suero de ratones deficientes en linfocitos T inmunizados con porina era suficiente para disminuir la infeccion.
Como se ha demostrado que los linfocitos B son necesarios para la proteccion y la IgM sola podria conferir un beneficio, se determino si habia un beneficio aditivo con anticuerpos activados, sobre y por encima de IgM, inmunizando animales deficientes en CD28 con Omp e infectados 35 dias mas tarde. Mientras que la induccion de IgM con porinas esta favorecida en ratones deficientes en CD28 (Fig. 2C) estos ratones eran incapaces de inducir una activacion. Estos estudios demostraban que las cargas bacterianas eran aproximadamente 10 veces mayores en animales deficientes en CD28 indicando que un 90 % de la proteccion que se observaba estaba mediada por la IgG (Fig. 2C). Estos resultados eran similares a los que se encontraban en experimentos equivalentes utilizando ratones deficientes en CD40L, que tambien tenian una activacion defectuosa.
Despues se evaluo si el anticuerpo anti-porina podia reducir la carga bacteriana en ratones infectados con STm TS SL1344. Esto demostraba que las cargas bacterianas en el bazo e higado 4 dias tras la infeccion tenian numeros medios de bacterias de 20 y 40 veces menores respectivamente en comparacion con los ratones que no se habian inmunizado (Fig. 2D).
Por ultimo, se examino si cualquier contaminacion residual con LPS podia tenerse en cuenta para estos hallazgos y si las porinas de ST podian proporcionar beneficios similares. Los ratones se inmunizaron con LPS de STm de calidad TLR disponibles en el mercado o con porinas de ST y luego se infectaban 35 dias mas tarde. Sorprendentemente, los LPS de calidad TLR no conferian proteccion contra la infeccion con bacterias atenuadas (Fig. 2E). De manera similar, como se ha senalado anteriormente, las porinas de ST no conferian una proteccion selectiva. La falta de proteccion que ofrecian las porinas de ST era sorprendente considerando la homologia casi completamente identica entre la OmpF y OmpC de ST y STm.
4. La proteccion conferida por las porinas de STm esta mediada por anticuerpos contra OmpD
Para ensayar si la OmpD contribuia a la proteccion que ofrecia la inmunizacion por porina de STm, los ratones se inmunizaron con porinas de STm y despues de 35 dias se infectaron con STm o STm que carecia de OmpD. Esto demostraba que la inmunizacion no conferia beneficios a los ratones infectados con STm deficientes en OmpD (Fig. 3). Entonces se evaluo como los anticuerpos inducidos por las porinas de STm en ratones deficientes en linfocitos T se unian a una preparacion de membrana externa de bacterias deficientes en OmpD. Los anticuerpos no se unian a la fraccion de porina de las preparaciones proteicas de membrana externa de bacterias que carecian de OmpD. Esto indica que el anticuerpo contra OmpD es una diana importante para el anticuerpo contra STm y puede proporcionar proteccion contra una infeccion posterior por STm.
5. Las porinas y STm, pero no los LPS ni la flagelina, inducen una poblacion de linfocitos B CD19+B220intCDS peritoneales
Para evaluar si las poblaciones de linfocitos B innatos se inducian tras la inmunizacion con STm y porinas de STm, se inmunizaron ratones TS y se evaluaron las respuestas peritoneales el dia 4 tras la inmunizacion. Las porinas inducian una poblacion de linfocitos B que se caracterizaba por tener el fenotipo B220intCD5-, caracteristico de los linfocitos B1b que son CD19+ e IgM+ pero tenian una baja expresion de CD21 y CD23 (Fig. 4A y datos no mostrados). Aunque esta poblacion tambien era inducida por las STm vivas, no era inducida por los LPS de calidad TLR altamente purificados ni por FliC ni OVA en 0,1 % de SDS (Fig. 4A). Para confirmar la independencia de T de esta poblacion de linfocitos B, se inmunizaron ratones deficientes en pSTCR y deficientes en CD28 con proteinas aisladas o Salmonela (Fig. 4B; datos no mostrados para ratones deficientes en pSTCR pero resultados similares para ratones deficientes en CD28). Se descubrio que la poblacion B1b era inducida tras la inmunizacion con STm y porinas en ausencia de linfocitos T. Por lo tanto, las STm y las porinas de STm, pero no los LPS inducen una poblacion peritoneal
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de linfocitos B que tienen un fenotipo celular B1b. Tambien se ha demostrado que las STm que carecen de OmpR (el regulador de la expresion de OmpF y OmpC y que carecen de la expresion de ambas protelnas) tambien inducen dichos linfocitos B (datos no mostrados).
6. Los anticuerpos de linfocitos B1 b B220+CD5- son suficientes para proporcionar una protection suficiente
Para determinar si el anticuerpo producido por los linfocitos B1b en respuesta a las porinas de STm es suficiente para proporcionar proteccion, se generaron ratones quimericos. Se aislaron celulas B220+CD5- a partir de ratones TS intactos inmunizados 4 dlas antes con porinas y se clasificaron 2 x 105 celulas B220+CD5- y se transfirieron a ratones deficientes en linfocitos B. Cuarenta y ocho horas mas tarde, los receptores de linfocitos B1b y los ratones deficientes de linfocitos B se inmunizaron con porinas de STm. Tras 21 dlas, el exito de la transferencia se confirmo midiendo la IgM anti-porina de los ratones quimericos inmunizados y de control. Al dla siguiente, los ratones inmunizados e intactos se infectaron con 106 Salmonelas atenuadas por via i.p. y se evaluaron la carga bacteriana y los anticuerpos del suero 5 dlas mas tarde. Esto demostraba que solo los ratones que tenlan anticuerpos anti-porina y linfocitos B en el momento de la infection eran capaces de disminuir la infection bacteriana (Fig. 4C). Los ratones que se inmunizaron con porinas en ausencia de linfocitos B tenlan numeros bacterianos equivalentes a los ratones no inmunizados. Por lo tanto, el anticuerpo de los linfocitos B1b transferidos era capaz de limitar la proteccion.
Sumario
Para resumir los puntos clave de estos estudios, se ha demostrado:
1. La respuesta independiente de T contra STm es selectiva con respuestas tempranas pronunciadas contra LPS y Omp pero no contra la molecula FliC de flagelina (Fig. 1A). Una preparation de Omp altamente purificada que contenla las porinas OmpD, OmpC, y OmpF induce una rapida respuesta de anticuerpos especlficos de la porina proteica en ratones deficientes en linfocitos T (Fig. 1B y 1C);
2. La inmunizacion con porinas o bacterias inactivadas conferlan una proteccion similar contra STm y la proteccion por porinas era totalmente dependiente de linfocitos B. La IgG aumentaba la eficacia de IgM aproximadamente 10 veces. Por ultimo, la proteccion no se inducla contra LPS puro o flagelina o porinas de S. typhi, que carece de OmpD (vease la Figura 2 y los datos no se muestran);
3. La infeccion de ratones inmunizados con porina de STm deficiente en OmpD anulaba la proteccion (Fig. 3A) y el anticuerpo de los ratones inmunizados con porina tenia una union alterada con una preparacion de membrana externa de STm deficientes en OmpD (Fig. 3B);
4. Las porinas y STm, pero no los LPS, FliC u OVA, inducen linfocitos B1b B220intCD5- en ratones TS y deficientes en linfocitos T (Fig. 4A y B). La transferencia de linfocitos B1b a ratones deficientes en linfocitos B con inmunizacion por porinas podia proteger contra la infeccion por STm y esto depende de anticuerpos (Fig. 4C); y
Los linfocitos B1b se auto-renuevan y de manera interesante se ha identificado que son importantes en otras infecciones tales como las causadas por Borrelia hermensii y Streptococcus pneumoniae. Ademas se ha expuesto que los linfocitos B1b tambien pueden responder a proteinas bacterianas de Borrelia - la proteina de union al complemento factor H.
Que la proteina OmpD es la diana principal del anticuerpo inducido por las porinas de STm y que los LPS no tienen signification en esta respuesta se demostro por:
i) la utilization porinas purificadas que tengan niveles de contamination de LPS indetectables (< 0,01 EU/100 pg de porinas);
ii) la inmunizacion con LPS de STm altamente purificados, como los controles muestran que esto no protege;
iii) la demostracion de la perdida de beneficios de la inmunizacion con porina tras la infeccion con bacterias deficientes a OmpD pero suficiente LPS;
iv) la perdida de union del anticuerpo de ratones inmunizados con porina a las paredes celulares bacterianas deficientes en OmpD;
v) todas las reducciones de titulos bacterianos se anulaban si los linfocitos B no estaban presentes durante la inmunizacion;
vi) las porinas inducian una poblacion de linfocitos B1b no inducida por LPS que era suficiente para conferir proteccion frente a la infeccion.
En conjunto estos implican fuertemente que el anticuerpo contra las porinas y en particular la OmpD puede reducir el nivel de la infeccion por NTS.
Conclusion
Por lo tanto se indica que la respuesta de anticuerpo contra OmpD puede reducir la infeccion por STm y que esta respuesta esta mediada por linfocitos B y al menos en parte por medio de la induction de una poblacion de linfocitos B1 b independiente de T que es suficiente para disminuir por si misma la infeccion por STm.
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Ejemplo 2
El siguiente trabajo adicional se llevo a cabo siguiendo los protocolos del Ejemplo 1 cuando era apropiado:
1. En la NTS, la bacteriemia frecuentemente refleja la gravedad de la enfermedad. Por lo tanto, los inventores estudiaron los efectos de la inmunizacion con porinas sobre la bacteriemia inducida por la infeccion posterior con STm y STm que carecla de OmpR (que da lugar a la expresion deficiente de OmpF y OmpC) o sTm deficiente en OmpD. Los inventores demostraron que la inmunizacion con porina puede anular la bacteriemia en la infeccion por STm (Figura 5, panel de la izquierda) y se vio tras la infeccion de ratones sensibilizados con porina con STm deficiente en OmpR (Figura 5, panel central) pero mucho menos tras la infeccion con STm deficiente en OmpD (Figura 5, panel de la derecha). Esto indica que el anticuerpo contra las porinas, en particular OmpD, puede reducir la bacteriemia notablemente.
2. Una unica inmunizacion con porinas es suficiente para disminuir la carga bacteriana de STm. Para evaluar si la inmunizacion de dos veces aumentaba el beneficio de la inmunizacion con porina se inmunizaron ratones dos veces con porinas y se infectaron con la cepa SL1344 de STm. Esto demostro que la inmunizacion de dos veces conferla un beneficio mayor que la inmunizacion unica (Figura 6).
3. La infeccion de ratones, inmunizados con porina, con bacterias que careclan de OmpD revela que la inmunizacion con porina (careciendo de OmpD) no confiere beneficios en terminos de reduccion del numero bacteriano en los tejidos. Por el contrario, la infeccion de los ratones que careclan de OmpF y OmpC, pero que si expresaban OmpD, disminuye tras la inmunizacion con porinas. Esto demuestra que los anticuerpos anti-OmpF u OmpC no son tan potentes para controlar la infeccion como el anticuerpo anti-OmpD. Ademas, el anticuerpo de los ratones inmunizados con porina se podia unir a las porinas de la pared celular de bacterias que careclan de OmpF y OmpC, pero no OmpD (Figura 7).
4. Como los efectos de reduccion de la infeccion tras la inmunizacion con porinas esta mediada por linfocitos B y es independiente de T los inventores evaluaron si los Ac activados conferian un beneficio adicional sobre y por encima de la IgM. Para ensayar esto se inmunizaron ratones de tipo silvestre (TS) y deficientes en linfocitos T con porinas y se infectaron 35 dias mas tarde. Mientras que la IgM especifica de porina se inducia en todos los grupos tras la infeccion (Figura 8), la IgG especifica de porina era como mucho indetectable en ratones deficientes en linfocitos T. Las cargas bacterianas eran aproximadamente 40 veces mayores en los ratones deficientes en linfocitos T. En conjunto con el hallazgo de que la inmunizacion con porina solo era eficaz en presencia de celulas B y todos los grupos de animales intactos tenian un numero de bacterias similar 5 dias tras la infeccion, estos datos sugieren que > 90 % del beneficio esta mediado por IgG (Fig. 2C).

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en:
    (i) un polipeptido que es una OmpD de Salmonella no tifoidea, o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad de generar una respuesta de anticuerpos contra la Salmonella no tifoidea (NTS); o
    (ii) una variante de un polipeptido como se ha definido en (i) que tiene dicha capacidad, para su uso en terapia.
  2. 2. Un polipeptido inmunogenico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el polipeptido inmunogenico es para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevention de la infection y/o enfermedad por NTS.
  3. 3. Un polipeptido inmunogenico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el polipeptido inmunogenico es para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevencion de la infeccion y/o enfermedad por Salmonella typhimurium (STm).
  4. 4. Un polipeptido inmunogenico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipeptido inmunogenico comprende o consiste en OmpD que se puede obtener de STm, o un fragmento inmunogenico del mismo.
  5. 5. Un polipeptido inmunogenico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el polipeptido inmunogenico es una protelna de fusion en la cual la secuencia de polipeptido definido en (i) o (ii) se une a una segunda secuencia de polipeptido.
  6. 6. Un polipeptido inmunogenico para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5 en el que dicha segunda secuencia de polipeptido es un excipiente adyuvante proteico.
  7. 7. Una composition vacunal que comprende un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en:
    (i) un polipeptido que es una OmpD de Salmonella no tifoidea, o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad de generar una respuesta de anticuerpos contra la Salmonella no tifoidea (NTS); o
    (ii) una variante de un polipeptido como se ha definido en (i) que tiene dicha capacidad,
    en la que la composicion vacunal comprende adicionalmente uno o mas polipeptidos inmunogenicos adicionales.
  8. 8. Una composicion vacunal de acuerdo con la reivindicacion 7 en la que dicho uno o mas polipeptidos inmunogenicos adicionales se seleccionan de entre polipeptidos que comprenden o consisten en:
    (i) una porina de membrana externa de NTS, S. typhi (ST) o S. paratyphi o un fragmento inmunogenico de la misma; y
    (ii) analogos de la misma que mantengan la capacidad para generar una respuesta de anticuerpos contra Salmonella.
  9. 9. Una composicion vacunal que comprende un polipeptido inmunogenico que comprende o consiste en:
    (i) un polipeptido que es una OmpD de Salmonella no tifoidea, o un fragmento inmunogenico de la misma que tiene la capacidad para generar una respuesta de anticuerpos contra la Salmonella no tifoidea (NTS); o
    (ii) una variante de un polipeptido como se ha definido en (i) que tiene dicha capacidad,
    en la que la composicion vacunal incluye ademas un adyuvante.
  10. 10. Una composicion vacunal de acuerdo con la reivindicacion 9 en la que dicho adyuvante es un polipeptido inmunogenico en forma de protelna de fusion en la cual la secuencia polipeptldica definida en (i) o (ii) se une a una segunda secuencia polipeptldica, opcionalmente en la que dicha segunda secuencia polipeptldica es un excipiente adyuvante proteico.
  11. 11. Una composicion vacunal de acuerdo con la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10 que incluye uno o mas polipeptidos inmunogenicos adicionales.
  12. 12. Una composicion vacunal de acuerdo con la reivindicacion 11 en al que dicho uno o mas polipeptidos adicionales se seleccionan de entre polipeptidos que comprenden o consisten en:
    (i) una porina de membrana externa de NTS, ST o S. paratyphi o un fragmento inmunogenico de la misma; y
    (ii) analogos de la misma que mantienen la capacidad de generar una respuesta de anticuerpos contra Salmonella.
  13. 13. Una composicion vacunal de acuerdo con la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevencion de una infeccion por NTS, especialmente una infeccion por STm.
  14. 14. Una composicion vacunal de acuerdo con la reivindicacion 11 o la reivindicacion 12, para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevencion de la infeccion por NTS, especialmente la infeccion por STm, y la infeccion por S. paratyphi y/o ST.
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