WO2000013704A1 - Formulacion de acidos nucleicos y acemanano - Google Patents
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Abstract
La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el uso de nuevas formulaciones de adyuvantes con antígenos vacunales. El objectivo técnico que se persigue con la invención propuesta es, precisamente, el desarrollo de formulaciones capaces de potenciar la respuesta inmune del organismo a vacunas de ácidos nucleicos. Para lograr este objetivo se desarrolló una formulación que contiene como componentes fundamentales al ácido nucleico vacunal y al acemanano en proporciones adecuadas, además de estabilizadores y preservo. Las formulaciones de esta invención son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales tanto para uso humano como veterinario.
Description
FORMULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y ACEMANANO
Sector técnico
La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el desarrollo de nuevas formulaciones inmuno- potenciadoras que permitan el aumento en cantidad y calidad de la respuesta inmune a antígenos vacunales.
El objetivo técnico que se persigue con la invención propuesta es, precisamente, el desarrollo de formulaciones capaces de potenciar la respuesta inmune del organismo al ácido nucleico vacunal. Técnica anterior
La utilización efectiva de los adyuvantes actuales para la potenciación de este nuevo tipo de vacunas no es obvia, siendo relativamente reciente el hallazgo de compuestos que potencian al ADN vacunal. Incluso uno de los primeros descubrimientos en el campo de la inmunización con ácido desoxiribonucleico (ADN) fue la ineficiencia de la alúmina, adyuvante de uso general en las vacunas establecidas en el mercado. El uso de la inmunización directa con ADN comienza a partir del año 1990. Actualmente la investigación se desarrolla tanto en el campo de las vacunas preventivas como en las recientes terapias génicas de células somáticas para el tratamiento de neoplasías malignas, infecciones y enfermedades metabólicas.
Las vacunas de ADN plasmídico tienen muchas ventajas sobre las demás estrategias vacunales. Al igual que los virus atenuados o recombinantes, los vectores plasmídicos posibilitan la activación de células T citolíticas CD8+ (Wang, B. et al. 1993 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4156-4160; Xiang, Z.Q. et al. 1994 Virology 199: 132- 140). El ADN, una vez inoculado, es capaz de continuar expresando sus genes constituyentes por varios meses y no parece ser patogénico o mutagénico a la célula inyectada, dado que la mayoría de los plásmidos existen de una forma circular, no replicativa y no integrativa (Wolff, J.A. et al. 1990 Science
247: 1465). Se ha reportado además que las vacunas de ADN no inducen anticuerpos anti ADN (Xiang, Z.Q. et al. 1995 Virology 209: 569) y no se han observado en el sitio de la inoculación reacciones inflamatorias serias u otras complicaciones. Por otra parte el ADN no sólo es manipulado fácilmente, sino que puede ser producido de forma barata, en grandes cantidades y con altos niveles de pureza (Tsuji, T. et al. 1997 Eur. J. Immunol. 27: 782-787).
Aunque los mecanismos involucrados en la inducción y el mantenimiento de la respuesta inmune aun no están claros, se ha usado con éxito la estrategia de coinocular plásmidos que codifican para citoquinas y factores coestimulatorios. Se conoce que hay otros factores que influyen en la respuesta, por ejemplo características propias del vector, que pueden afectar la velocidad de transcripción (Davis et al. 1993 Hum. Gene ther. 4: 151- 159). Actualmente se conoce que los miocitos tienen la capacidad de presentar antígenos asociados a MHC clase I (Pardoll, D.M. and Beckerrieg, A.M. 1995 Immunity 3: 165; Cohén, J. 1993 Science. 259: 1745), pero estas células expresan pobremente las moléculas de MHC clase I y clase II. Para una presentación antigénica eficaz es esencial una señal coestimu-latoria o segunda señal antígeno-independiente para la proliferación de células T y su activación, luego de la interacción antígeno específica del receptor de células T (TCR) y el sistema principal de histocompatibilidad (MHC) (Bluestone, J.A. , 1995 Immunity 2: 555). Con el uso de plásmidos que codifican para las moléculas coestimulatorias B7- 1 y B7-2, se puede expresar en los miocitos una señal coestimulatoria como la que ellos constitutivamente son incapaces de poseer (Hohlfeld, R. y Engel, A.G. 1994 Immunol Today, 15: 269), induciendo mayores niveles de proliferación y activación de células T específicas para el antígeno introducido. Aplicado a la inmunidad tumoral, se ha visto que la pobre inmunogenicidad de muchos tumores se debe, parcialmente, a la falta de moléculas coestimulatorias. La transducción de ADN que codifica para
B7- 1 o B7-2 en células tumorales ha potenciado la actividad antitumoral (Townsend, S.E. y Allison, J.P. 1993 Science 259: 368; Gajewski, T.F., 1996 J. Immunol. 156: 465; Yang, G. et al. 1995 J. Immunol. 154: 2794). Recientemente se ha reportado que la inoculación en un mismo adenovirus de genes que codifican para el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y para B7- 1, induce una mayor respuesta citotóxica específica para el antígeno viral con respecto a la generada por el gen del antígeno viral solamente (He, X.-S. et al. 1996 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 93: 7274). Se ha demostrado también que la coinoculación de ADN del plásmido de expresión de B7-2 junto a ADN vacunal de VIH- 1 incrementa la respuesta celular específica para VIH- 1 , con respecto a la inoculación del ADN de VIH- 1 solo. Se encontró además que esta potenciación de la inmunidad celular por B7-2 es dependiente de interferón-γ (IFN-γ) (Tsuji, T. et al. 1997 Eur. J. Immunol. 27: 782-787). En este mismo trabajo se mostró que la coinoculación de un plásmido que expresa B7- 1 no es capaz de potenciar la respuesta celular con respecto al ADN vacunal de VIH- 1 solo. Una posible explicación está en que las moléculas B7-2 son inducidas más rápidamente en las células presentadoras de antígenos (APC) que las moléculas B7- 1 (Hathcock, K.S. et al. 1994 J. Exp. Med. 180: 631), por lo que las moléculas B7-2 son más apropiadas para la presentación antigénica inicial. Resultados similares se han obtenido por otros autores, que han demostrado la potenciación de la respuesta citotóxica de linfocitos CD8+ restringidos al MHC clase I (Kim, J.J. et al. 1997 Nature Biotechnology 15: 641-646). El IFN-γ es una citoquina pleiotrópica que puede potenciar respuestas inmunes mediadas por células T, al regular positivamente la expresión de los determinantes del MHC. El tratamiento de mioblastos en cultivo con IFN-γ ejemplifica lo anterior. En consecuencia se obtienen mioblastos susceptibles a la citolisis por células T y además les permite proveer señales para la proliferación de líneas de células T. Sin embargo, se ha encontrado que la coinyección de dos plásmidos que expresan la proteína
G del virus de la rabia y el IFN-γ no tuvo efecto sobre la respuesta inmune antiviral (Xiang, Z. et al. 1995 Immunity 2: 129- 135).
Otros estudios han mostrado que el efecto del IFN-γ depende del promotor utilizado. En el caso de los promotores virales, como el promotor temprano del virus de simios 40 (SV-40) o el de las proteínas MHC clase I, se reduce la respuesta inmune para el vector de expresión del antígeno en presencia de IFN-γ. Las respuestas B y T auxiliadoras al vector que expresa el antígeno bajo el control del promotor de MHC clase II no resultaron afectadas (Xiang, Z. et al. 1997 Vaccine Vol 15 (8): 896-898). El factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) también ha sido coinoculado en un plásmido que lo codifica (Xiang, Z. et al. 1995 Immunity 2: 129- 135) . Esta citoquina induce respuestas inmunes primarias (Tao, M.-H. et al. 1994 Nature 362: 755-758) por la activación o reclutamiento de células profesionales presentadoras de antígenos (Heufler, C. et al. 1988 J. Exp. Med. 167: 700-705).
En 1995, Xiang y colaboradores evidenciaron que el efecto potenciador del plásmido que expresa GM-CSF sobre la respuesta inmune humoral de la proteína G del virus de la rabia, depende de la coinyección de los dos plásmidos. La inoculación de ambos plásmidos por separado con varias horas de diferencia no generó ningún efecto en la magnitud de la respuesta de anticuerpos al virus de la rabia, sugiriendo que tanto la cotransfección de células individuales como la proximidad de la APC a la célula secretora de GM-CSF es crucial, reflejando la actividad local de la citoquina (Xiang, Z. et al. 1995 Immunity 2: 129- 135). La potenciación de la respuesta de anticuerpos neutralizantes que se observa por coinoculación con el plásmido que expresa GM-CSF refleja el efecto primario de esta citoquina sobre la respuesta de células T auxiliadoras, que a su vez resulta en un incremento en la activación de células B antígeno específicas. En experimentos con líneas celulares dependientes de citoquinas, la ausencia de respuesta a IL-4 indica que las vacunas de ADN inducen principalmente células T auxiliadoras Thl,
como se mostró previamente, y que la citoquina GM-CSF potencia este patrón de respuesta (Xiang, Z. et al. 1995 Immunity 2: 129- 135). Una citoquina de mucha importancia inmunomoduladora es, sin dudas, la IL- 12. Se ha demostrado que el plásmido de expresión de la IL- 12 coinoculado junto al que codifica para una proteína de VIH- 1 , potencia la inmunidad mediada por células específica para VIH- 1. Aunque los mecanismos involucrados en la inducción y mantenimiento de la respuesta inmune no están claros, este tipo de estrategia puede ser fructífera (Takashi, T. et al. 1997 J. Immunol. 158: 4008-4013). En adición a sus propiedades adyuvantes, el tratamiento de los pacientes VIH-positivos con esta citoquina retarda la progresión a la enfermedad. Hay pacientes que logran normalizar la hiporespuesta de células T al virus y restablecen su producción de IFN-γ por monocitos de sangre periférica (Clerici, M. et al. 1993 Science 262: 1721), así como la actividad citotóxica mediada por células natural killer (NK) (Chehimi, J. et al. 1992 J. Exp. Med. 175: 789) . También se ha observado que la IL- 12 inhibe la apoptosis de células CD4+ (Radrizzani, M. et al. 1995 Cell. Immunol. 161: 14). En estudios de coadministration de plásmidos que codifican IL-6 y hemaglutinina, inoculados con la pistola génica Accell, se confirió protección al reto con el virus de la influenza en ratones. Los ratones que recibieron el ADN del plásmido que expresa hemaglutinina sólo exhibieron un aclaramiento acelerado del reto viral, pero no se protegieron de la infección, mientras que a los que se coinoculó el plásmido de la IL-6 no se les detectó virus en los pulmones luego del reto (Larsen, D.L. et al. 1998 J. Virol. 72 (2): 1704-1708).
La creación de un sistema de envío genético eficiente es un reto de la terapia génica. Recientemente se ha estudiado la asociación y estabilidad de ADN plasmídico, que codifica para ovoalbúmina, con partículas poliméricas de un tamaño que alcanza las mieras: microesferas biodegradables de ácido poliláctico y coglicólico, poli DTH-carbonato (un
pseudopoliaminoácido) y partículas de poliestireno de alrededor de lμm. Las mismas difieren en carga eléctrica e hidrofobicidad y han sido ensayadas tanto para la inmunización mucosal como parenteral. El ADN se adsorbió tanto sobre las partículas biodegradables como sobre las que no lo son. Los resultados encontrados demostraron que se obtienen respuestas superiores luego de la administración de ADN asociado a partículas con respecto a la inoculación de ADN libre. La inoculación intranasal (i.n.) e intramuscular (i.m.) de ADN en sistemas particulados genera respuestas similares a nivel sérico (Alpar, H.O. et al. 1997 Biochemical Society Transactions 25: 337S).
El efecto adyuvante del ubenimex (UBX), un inmunomodulador anticancerígeno, sobre una vacuna anti-VIH basada en ADN, se evaluó en un modelo murino. El UBX se coinoculó intramuscularmente en ratones balb/c y se generaron respuestas de anticuerpos IgG entre 103 y 105 veces mayores a aquellos obtenidos sin el UBX. Este compuesto también generó una mayor respuesta tanto de hipersensibilidad retardada (DTH) específica contra VIH, como de linfocitos T citotóxicos (CTL), medida por el método de liberación de 51Cr. El perfil de citoquinas de los linfocitos reestimulados mostró que el UBX eleva los niveles de IL-2 e IFN-γ y disminuye la producción de IL-4. El análisis de las subclases de inmunoglobulinas mostró una elevación en los niveles de IgG2a en el grupo adyuvado con UBX, así como una disminución en la síntesis de IgGl e IgE. El UBX puede tener uso' clínico dada su baja inmunogenicidad y toxicidad, actuando como un adyuvante para vacunas de ADN (Sasaki, S. et al. 1998 Clinical and Experimental Immunology 111- 1: 30-35).
El uso de mananos recubriendo estructuras químicas como N t-butyl N' tetradecylamino-propionamidina (diC14 amidina), potenció la respuesta inmune antígeno específica a un plásmido que contenía el gen de la proteína gpl60 del virus del SIDA. El recubrimiento del diC14 con el mañano aumentó significativamente la respuesta DTH antígeno específica inducida por el ADN. La actividad CTL también fue marcadamente
potenciada por esta mezcla. El efecto inmunomodulatorio se inhibió cuando se trató la mezcla con anticuerpos anti IFN-γ in vivo, lo cual evidencia que el IFN-γ juega un papel importante en la inducción de la inmunidad celular generada por las vacunas de ADN. El resultado del análisis del isotipo de las inmunoglobulinas antígeno específicas, así como la medición de citoquinas, mostró que el ADN vacunal incorporado en la amidina diC14 recubierta de mañano generó una respuesta Th l (Sasaki, S. et al. 1997 Eur. J. Immunol. 27 (12): 3121-3129) . Se ha evaluado también la respuesta inmune a la vacunación con ADN vía i.n. e i.m. contra VIH- 1 usando monofosforil-lípido A (MPL-A) como adyuvante. Ambas rutas de inmunización generaron niveles similares de inmunidad celular, pero la respuesta de IgA secretada a nivel de intestino fue mayor en el caso de los animales inmunizados por ruta intranasal. El MPL-A demostró su adyuvanticidad por ambas rutas (Sasaki, S. et al. 1998 Infection and Immunity 66 (2): 823-826).
Un elemento de importancia en la determinación del tipo de respuesta inmune lo constituye el compartimento celular donde se expresa el antígeno codificado por el vector plasmídico. En un estudio con las formas secretada, anclada a membrana o intracelular de la glicoproteína D de herpesvirus bovino- 1 , que induce consistentemente títulos de anticuerpos séricos neutralizantes, se pudo evidenciar una diferencia en la velocidad de seroconversión. Los ratones que fueron inmunizados con la forma auténtica -anclada a membrana-, así como los que se correspondían a la forma secretada, seroconvirtieron antes que los inmunizados con la forma citosólica de la glicoproteína D. Durante las primeras 14 semanas, los ratones que recibieron la forma auténtica desarrollaron los niveles más altos de IgG, mientras que los ratones que recibieron la forma citosólica tuvieron la menor media geométrica. Estos últimos, generaron medias de títulos que excedieron los otros grupos a las 23 semanas del inicio de la inmunización. El perfil de citoquinas de linfocitos de bazo fue característico de una respuesta Thl, con producción de IFN-γ sin
importar la forma del antígeno. Para la forma secretada, el isotipo de IgG por ELISA no correlacionó con este perfil de citoquinas (Lewis P.J. et al. 1997 Vaccine 15 (8): 861-864).
La influencia de la localización celular en la efectividad de la inmunización con ADN también se ha estudiado usando ovoalbúmina como modelo. Se evaluaron tres formas de ovoalbúmina: citoplasmática, anclada a membrana y secretada, siendo la variante secretada la que generó más IgG específica, en un rango de 10 a 100 veces. Sorprendentemente, se observó una mayor respuesta citotóxica en la forma secretada que en la anclada a membrana y la citoplasmática (Boyle J.S. et al. 1997 International Immunology 9, (12): 1897- 1906).
Trabajos recientes han demostrado que la ruta de inmunización influencia la magnitud de la respuesta. La inyección intradérmica (i.d.) resultó más eficiente que la vía i.m. en la generación de anticuerpos en ratones inmunizados tanto con proteínas como con ADN. Aunque por inmunizaciones con ADN se obtuvieron niveles de IgG total similares a los generados por los controles de proteína soluble, la avidez de los anticuerpos anti-ovoalbúmina fue 100 y 1000 veces mayor por vía intramuscular e intradérmica respectivamente. El examen de la respuesta de subclases de IgG evidenció un predominio de la subclase IgG2a en el caso del plásmido inoculado por vía i.m., coincidiendo con una elevada producción de IFN-γ, mientras era predominante la IgG l en el caso del plásmido y las proteínas solubles inoculadas por vía i.d., coincidiendo con una producción detectable de IL4. La respuesta CTL se obtuvo sólo después de la inmunización con ADN. En las dos primeras semanas la vía i.d. produjo la respuesta más fuerte, pero esta disminuyó hasta el nivel de la i.m. con posterioridad. De aquí que la inmunización con ADN puede diferir de la inmunización con proteínas por su capacidad de generar una rápida respuesta CTL y por la mayor avidez de los anticuerpos que se producen, ambos parámetros importantes en el diseño de vacunas (Boyle J.S. et al. 1997 PNAS 94 (26): 14626-14631).
Muchos carbohidratos complejos de origen natural estimulan las células del sistema inmune y reticuloendotelial (Davis, S.E. 1975 Am. Chem. Soc. Sympos. Series 15, Jeanes A. Hodge J. Eds. Am. Chem. Soc. Washington D.C.). Entre ellos están los polímeros de plantas y hongos como son los glucanos, dextranas y lentinanos -todos ellos polímeros de glucosa- y los mananos, entre los que se encuentran glucomananos y galactomananos. También se encuentran los lévanos y xylanos (Tizard, I.R. et al. 1989 Mol. Biother 1 : 290-296). La actividad de muchos de estos poliglicanos sobre los macrófagos -que tienen receptores de glucanos y mananos- incluye la inducción de fagocitosis y secreción de citoquinas, leucotrienos y prostaglandinas. El lentinano, un glucano común de las setas, estimula la respuesta celular y de anticuerpos a eritrocitos de carnero, mientras el levano es mitogénico para células B, y activador de macrófagos (Simón, P.M. 1994 Exp. Opin. Invest. Drugs 3 (3): 223-239). El acemanano es un mañano compuesto por mañosas con O-acetilaciones en aproximadamente 8 de cada 10 restos. Se extrae como componente mayoritario de la sustancia mucilaginosa o gel de la hoja de Aloe barbadensis Miller, planta medicinal usada desde la antigüedad. Distintas pruebas in υitro indican que los mananos activan monocitos y macrófagos, induciendo la elaboración de interferón-γ, factor-α de necrosis tumoral, factor estimulador de colonias de monocitos y granulocitos, IL- lβ e IL-6 (Peng, S.Y. et al. 1991 Mol. Biother. 3: 79-87). El acemanano potencia la generación de linfocitos T citotóxicos (Womble, D. et al. 1988 Int. J. Immuno-pharmacol. 10: 967-974), la actividad citotóxica de células NK (Marshall G.D. et al. 1993 J. Immunol. (part II) 150: Abstr 1381) y también, modestamente, la alorespuesta humana in υitro. El aumento de la actividad citotóxica y la secreción de IFN-γ apoya el uso terapéutico como antiviral y antitumoral del acemanano. Se ha evidenciado su actividad antiretroviral en el caso del virus de la leucemia felina (Sheets, M.A. et al. 1991 Mol. Biother. 3: 41-45). Recientemente se han solicitado patentes para el uso del acemanano como adyuvante para
vacunas. (McAnalley, B.H. EP 0 619 1 17 A2; Nordgrem, R.M. WO 93/ 14195; Aguilar, J.C. et al. CU27/ 1997) pero en ninguno de los tres casos se protege el uso del acemanano en formulaciones vacunales conteniendo ADN como antígeno o alguna formulación con un ácido nucleico en particular.
Uno de los principales problemas de las vacunas basadas en ácidos nucleicos en la actualidad es la pobre generación de anticuerpos. La forma más comúnmente utilizada para solucionar este problema es la introducción de compuestos que provocan daño muscular, como pequeñas proporciones de compuestos procedentes de venenos de serpientes, y la posterior inoculación del ADN varios días después en el músculo que se encuentra en estado regenerativo. La respuesta luego de la inyección con ADN en músculo normal no es tan buena como en músculo en estado regenerativo, necesitándose un desarrollo práctico en este aspecto para que la vacunación con ADN se convierta en una alternativa realista a la vacunación clásica (Davis, H.L. et al. 1994 Vaccine 12 ( 16): 1503- 1509).
Descripción detallada de la invención En el trabajo objeto de la presente invención se reporta por primera vez una formulación vacunal cuyos componentes fundamentales son el acemanano y el ácido nucleico vacunal en proporciones adecuadas. Esta formulación es novedosa por la potenciación de la respuesta que se genera al unir ambos componentes. Los resultados aquí presentados avalan la introducción de estas formulaciones vacunales para la inmunoprofilaxis e inmunoterapéutica de enfermedades causadas preferentemente por patógenos intracelulares y cáncer. En la actualidad los mecanismos de acción del acemanano y otros polisacáridos inmunoestimulantes aun no están esclarecidos totalmente. Un mecanismo propuesto involucra a los macrófagos y células
dendríticas, que poseen receptores específicos para patrones antigénicos presentes en la superficie de los patógenos, discriminando así entre lo que es "peligroso" y lo que no lo es. De acuerdo a esto se genera, en el sitio de la inoculación sistémica, una fuerte monocitemia. La consistencia viscosa del acemanano lo convierte en un vehículo activo que incrementa la permanencia del antígeno en el sitio de inoculación. No se descartan otras actividades como la inducción de citoquinas, la activación de mecanismos de fagocitosis, el reclutamiento de distintas poblaciones de células del sistema inmunológico y el incremento de la actividad presentadora de antígenos.
La formulación objeto de esta invención presenta, de acuerdo al tamaño de la especie a inmunizar un volumen de 0.01 hasta 5mL y una dosis de 0.001 a 5mg de ácido nucleico. La dosis de acemanano se encuentra en un rango de concentraciones de O.O lmg/mL hasta 0.5 mg/mL de hexosas equivalente a un rango de hasta 5mg/mL de peso liofilizado, en un volumen de 0.01 a 5mL de acuerdo con la especie.
La baja reactogenicidad del acemanano con respecto a los adyuvantes de nueva generación y la respuesta T independiente para el propio adyuvante son otras características que hacen atractiva a esta formulación.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1:
Con el objetivo de evaluar la actividad inmunopotenciadora del acemanano sobre plásmidos, para su utilización en vacunas de ADN, se realizó un esquema de inmunización por vía intraperitoneal en ratones machos Balb/c de 8 a 12 semanas de vida. El plásmido utilizado posee el promotor de citomegalovirus y codifica para la proteína β-galactosidasa. La actividad inmunopotenciadora se cuantificó por ensayo inmuno- enzimático (ELISA) para la determinación de la respuesta de IgG anti-β-
galactosidasa en suero. Las inoculaciones se realizaron los días 0, 15 y 30. Las extracciones fueron los días -2 (preinmune), 45, 90 y 120. El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa. Se demostró, con el uso de acemanano junto al plásmido pCMVβgal, que es posible obtener respuestas de anticuerpos séricos anti β-galactosidasa significativamente superiores a las obtenidas por el plásmido inoculado en PBS. En general, los grupos inoculados con acemanano intraperitonealmente (grupos 4 y 5) se diferenciaron significativamente de los que no lo tenían y fueron inoculados por la misma vía (grupos 2 y 3). La diferencia que se generó el día 45 en el grupo donde se incorporó el oxalato de calcio a una concentración de 0.5mg/mL (grupo 4) no se mantuvo los días 90 y 120 (figura 1) . La inoculación del plásmido se realizó sin preparación previa del músculo, por lo que se encontraba en estado normal. Esto pudiera explicar por qué los títulos de anticuerpos son bajos cuando se inocula el plásmido en PBS por vía intramuscular (grupo 1).
Ejemplo 2: Con el objetivo de demostrar la actividad inmunopotenciadora por vía intramuscular, se preparó una formulación del polisacárido acemanano y el plásmido pCMVβgal, que se administró intramuscularmente a un grupo de 8 ratones. Como control se administró la misma cantidad de plásmido en PBS (figura 2). El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa.
Se demostró, con la formulación para uso intramuscular de acemanano junto al plásmido pCMVβgal (grupo 1), que es posible obtener respuestas de anticuerpos séricos anti β-galactosidasa significativamente superiores a las obtenidas por el plásmido inoculado por la misma vía en PBS (grupo 2) .
En este experimento tampoco se realizó una preparación previa o daño muscular con el fin de inducir un estado de regeneración, por lo que el músculo se encontraba en su estado normal.
Ejemplo 3:
Con el objetivo de demostrar la actividad inmunopotenciadora por vía intramuscular e intraperitoneal, se preparó una formulación del polisacárido acemanano y el plásmido pAEC-M7CR2, que se administró intramuscular e intraperitonealmente a grupos de 8 ratones. La proteína codificada por este plásmido se corresponde con un polipéptido recombinante quimérico que porta regiones del virus del SIDA (VIH- 1) Como control se administró la misma cantidad de plásmido en PBS por ambas vías (figura 3) y además, se inoculó el plásmido parental -que no codifica la proteína. El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa.
Se demostró, con la formulación acemanano 0.35mg/mL + plásmido lOOμg por dosis de lOOμL para ambas rutas, que es posible obtener respuestas de anticuerpos séricos anti CR2 significativamente superiores a las obtenidas por el plásmido inoculado por la misma vía en PBS (grupo
2).
En este experimento tampoco se realizó una preparación previa o daño muscular con el fin de inducir un estado de regeneración, por lo que el músculo se encontraba en su estado normal.
Ejemplo 4:
Con el objetivo de evaluar la actividad inmunopotenciadora del acemanano sobre complejos (plásmido-proteína) inoculados por vía mucosal, se realizó un esquema de inmunización por vía intranasal en grupos de 7 ratones hembras Balb/c de 6 a 8 semanas de vida. El plásmido utilizado posee el promotor de citomegalovirus y codifica para la
proteína β-galactosidasa. Este plásmido se acomplejó con la proteína Opc de Neisseria meningitidis generando complejos de un tamaño menor de 5μm. La actividad inmunopotenciadora se cuantificó por ensayo inmuno- enzimático (ELISA) para la determinación de la respuesta de IgG anti- β- galactosidasa en suero. Las inoculaciones se realizaron los días 0, 14, 28 y 42. La extracción se realizó el día 56.
El análisis estadístico de los resultados se realizó por el test de Student: p<0.05 se consideró diferencia significativa.
Se demostró, con el uso de acemanano junto al complejo plásmido pCMV βgal-proteína Opc, que es posible obtener respuestas de anticuerpos séricos anti β-galactosidasa significativamente superiores a las obtenidas por los complejos plasmidio pCMV βgal-proteína Opc sin el PS, 15 días después de culminado el esquema de inmunización.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema de 3 dosis (0, 15 y 30 días). Extracciones a los 45, 90 y 120 días. En todos los grupos se inocularon lOOμg de plásmido en un volumen de lOOμL. El grupo 1 se inoculó intramuscularmente, los restantes grupos se inocularon vía intraperitoneal. Figura 2. Esquema de 3 dosis (0, 15 y 30 días). La extracción se realizó el día 45. En los dos grupos se inocularon lOOμg de plásmido en un volumen de lOOμL. Ambos grupos se inocularon intramuscularmente.
Figura 3. Esquema de 5 dosis (0, 21, 44, 64 y 76 días) . La extracción se realizó el día 92. En todos los grupos se inocularon lOOμg de plásmido en un volumen de lOOμL. Las rutas de inmunización fueron intramuscular (grupos 1-3) e intraperitoneal (grupos 4 y 5).
Figura 4. Esquema de 4 dosis (0, 14, 28, 42 días). La extracción se realizó el día 56. En todos los grupos se inocularon lOOμg de plásmido en un volumen de 50μL. Las rutas de inmunización fueron intramuscular e intranasal.
Claims
1. Una formulación vacunal de ácidos nucleicos y acemanano caracterizada porque el ácido nucleico puede estar libre, adsorbido o encapsulado en sistemas de envío de antígenos particulados donde el acemanano potencia su respuesta inmune.
2. Una formulación vacunal de ácidos nucleicos y acemanano de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque el acemanano se encuentra en un rango de concentraciones de hasta 0.5 mg/mL hexosas equivalente a un rango de hasta 5mg/mL de peso liofilizado, en un volumen de 0.01 a 5mL de acuerdo con la especie.
3. Una formulación vacunal de ácidos nucleicos y acemanano de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada por que el ácido nucleico se encuentra en un rango de dosis de 0.001 a 5 mg.
4. Una formulación de ácidos nucleicos y acemanano de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque puede ser utilizada con fines terapéuticos.
5. Una formulación de ácidos nucleicos y acemanano de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque puede ser utilizada con fines preventivos.
6. Una formulación de ácidos nucleicos y acemanano de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque puede ser administrada por vía sistémica.
7. Una formulación de ácidos nucleicos y acemanano de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizada porque puede ser utilizada administrada por vía mucosal.
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