ES2301418B1 - Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotoxica y las formulaciones resultantes. - Google Patents
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Abstract
Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes
inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones
resultantes.
La presente invención se relaciona con el campo
de las composiciones vacunales para el tratamiento efectivo o
prevención de infecciones fúngicas, virales, protozoarias o
bacterianas (preferiblemente intracelulares) y cáncer. El objetivo
técnico que se persigue es obtener adyuvantes para uso en vacunas
profilácticas o terapéuticas utilizando Proteoliposomas bacterianos
y derivados de estos, que al ser aplicadas junto a antígenos
insertados en su estructura conjugados o mezclados a estos induzcan
una respuesta de linfocitos T citotóxica contra dicho antígeno. De
esta forma se obtienen formulaciones múltiples del Proteoliposoma o
sus derivados con antígenos heterólogos, que al ser aplicados por
vía parenteral o mucosal (preferentemente nasal) inducen respuestas
citotóxicas. Este nuevo uso de los Proteoliposomas y sus derivados
y las formulaciones antigénicas resultantes son aplicables a la
obtención de nuevas vacunas en la industria farmacéutica.
Description
Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes
inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones
resultantes.
La presente invención se relaciona con el campo
de las vacunas y su uso en medicina. Más particularmente, ésta se
relaciona con el empleo de adyuvantes y las formulaciones vacunales
resultantes.
El objetivo técnico que se persigue es favorecer
el incremento en la respuesta inmune frente a antígenos fúngicos,
virales, protozoarios, bacterianos o cancerigenos, especialmente
aumentar la inducción de respuesta T citotóxica esencial contra
estos antígenos. Este trabajo conducirá al desarrollo de
formulaciones vacunales terapéuticas o profilácticas.
En este sentido se plantea el uso de
Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes en formulaciones
con antígenos fúngicos, virales, bacterianos, protozoarios o
cancerigenos, insertados en su estructura, conjugados o mezclados
con éstos. Estas formulaciones extenderían la respuesta
preferencial T auxiliadora de tipo 1 (Th1) inducida por los
Proteoliposomas y sus derivados a los antígenos incluidos (Pérez O
et al. Infect Immun. 2001,
69(7):4502-4508), induciendo una respuesta de
linfocitos T citotóxica (CTL) contra dichos antígenos al ser
aplicados por vía mucosal, parenteral o la combinación de
éstas.
Las infecciones por hongos, virus, bacterias o
protozoos intracelulares causan patologías frecuentes en todo el
mundo. Las enfermedades cancerosas son también, un terrible azote
de la humanidad. Estas infecciones y el cáncer de células humanas
implican la producción de gran cantidad de antígenos en el citosol
celular, muchos de los cuales son acarreados hacia la superficie
celular asociados a moléculas del Sistema Mayor de
Histocompatibilidad (MHC) de clase I (Heemels, M.-T. and H. Ploegh,
1995. Generation, translocation, and presentation of MHC class
I-restricted peptides. Annu. Rev. Biochem.
64,463-491; Rock, K.L. 1996. A new foreign policy:
MHC class I molecules monitor the outside world. Immunol. Today 17,
131-137; Jondal, M., R. Schirmbeck, and J. Reimann.
1996. MHC class I restricted CTL responses to exogenous antigens.
Immunity 5:295-302; and Reimann, J. and S. H. E.
Kaufmann. 1997. Alternative antigen processing pathways in
anti-infective immunity. Curr. Opin. Immunol.
9:462-469).
La respuesta inmune fue subdividida
fenotípicamente en celular (Th1) y humoral (Th2). Los patrones
Th1/Th2 se distinguen primeramente por el patrón de citoquinas que
secretan los linfocitos T CD4^{+}: fundamentalmente, IFN\gamma e
IL12 por las Th1 e IL4 e IL5 por las Th2 (Mossman, T. R.,
Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A, and R. L. Coffman.
1986. Two types of murine helper T cells clone. I. Definition
according to profiles of lymphokine activities and secreted
proteins. J. Immunol. 136:2348-2357). Por otra
parte, también es posible valorar el tipo de respuesta inducida
determinando los perfiles de clases y subclases de inmunoglobulinas
séricas característicos de cada tipo de respuesta. Así, en ratones
el patrón Th1 induce preferentemente anticuerpos de la subclase
IgG2a (dependiente de IFN\gamma), mientras que el Th2 induce IgE
y la subclase IgG1 (dependientes de IL4). En humanos el patrón Th1
cursa con la inducción de subclases IgG1 e IgG3 y el Th2 induce la
clase IgE.
Otras citocinas producidas por células no
linfoides se han asociado también a estos patrones, como ocurre con
la IL12 e IL18 asociada con un patrón Th1. Por otro lado, el
IFN\gamma y la IL10 actúan como inhibidores de la respuesta Th2 y
Th1, respectivamente.
Hoy en día se ha extendido esta clasificación
también a los linfocitos T CD8^{+} los que por semejanza en la
producción de citocinas se han clasificado como Tc1 y Tc2. Los
linfocitos T CD8^{+} son los mediadores e inductores fundamentales
de actividad CTL. Estos actúan entonces, no sólo como células
efectoras, sino también como reguladoras produciendo citocinas que
expanden más una respuesta que la otra. Por lo que, la
determinación de los subset de linfocitos T CD4^{+} o T CD8^{+}
presentes en linfoproliferaciones de células mononucleares
periféricas de sujetos inmunizados o de órganos linfoides
secundarios de animales inmunizados, re-estimulados
por un antígeno in vitro, es una medida importante de que
estas dos poblaciones están siendo estimuladas.
Es necesario eliminar las células infectadas con
patógenos intracelulares o las células tumorales. La actividad
citotóxica de los linfocitos T CD8^{+} (CTL) es uno de los
mecanismos inmunes más eficientes para ello. Estos reconocen
antígenos presentados en el contexto del MHC-I y son
capaces de matar las células infectadas a través de la liberación
de perforinas, producción de "granzymes" e interacción de los
mediadores Fas-FasL (O'Hagan D., Mackicham M., and
Singh M. Recent advance in adyuvants for infection disease
Biomolecular Engineering 2001.). La actividad de los CTL es la
respuesta inmune más comúnmente aceptada para determinar la
efectividad de las vacunas contra las infecciones intracelulares
causadas por virus, bacterias o protozoos, así como frente a
tumoraciones.
La actividad CTL satisfactoria puede ser
determinada por cualquier método conocido, tanto indirectos como
directos. Preferiblemente, se combinan los métodos indirectos y
directos. En los indirectos, se determina la capacidad del
Proteoliposoma o sus derivados, con antígenos insertados en su
estructura, conjugados o coadministrados de ser fagocitados,
degradados y presentados en la superficie celular asociados a las
moléculas MHC-I de líneas celulares. Estos se
enfrentan entonces a líneas celulares citotóxicas contra el antígeno
insertado y se determina la muerte celular por métodos radioactivos
o no radioactivos. Otro índice indirecto es la estimulación, por el
Proteoliposoma o sus derivados con antígenos insertados, conjugados
o coadministrados, de linfocitos T CD8^{+} en células
mononucleares periféricas de humanos inmunizados o provenientes de
órganos linfoides secundarios de animales inmunizados,
re-estimuladas in vitro con el antígeno de
interés. La detección de linfocitos T CD8^{+} productores de
IFN\gamma e IL2 en células mononucleares
re-estimuladas in vitro con el antígeno de
interés es otro índice indirecto que puede ser determinado por
Citometría de Flujo o ELISPOT. En este caso se determina
fundamentalmente la producción de IFN\gamma. por los linfocitos T
CD8^{+}. La producción de IL2 por hibridomas de células T
CD8^{+} luego del reconocimiento del antígeno específico en el
contexto de moléculas MHC-I en la superficie de
células presentadoras de antígeno previamente incubadas con el
Proteoliposoma o sus derivados conteniendo el antígeno específico
insertado en sus estructuras, conjugado o coadministrado con ellos,
es otra forma indirecta de evidenciar actividad CTL.
En los directos se inmuniza mamíferos con el
Proteoliposoma o sus derivados y los antígenos de interés,
insertados en su estructura, conjugados o coadministrados y
posteriormente se extraen los órganos linfoides secundarios y se
determina la presencia de actividad CTL contra el antígeno de
interés asociado a MHC-I. El método más antiguo
para detectar actividad CTL antígeno-específica
esta basado en el ensayo de citotoxicidad por liberación de cromo
radiactivo, el cual ha sido diseñado lo mismo para células frescas
(midiendo la actividad efectora CTL) que para líneas CTL (evaluando
reactividad CTL de memoria). En ambos casos las células dianas
expresan los antígenos específicos de interés, lo cual puede
lograrse por varias métodos (infección por virus recombinantes,
"peptide loading" o transfección genética). Más recientemente
tienden a utilizarse epítopes CTL específicos previamente
determinados.
Otro método ex vivo es el ensayo de unión
a tetrámeros, "tetrameric-binding assay"
(TBA). Los complejos tetraméricos de moléculas MHC-I
cargados con epítopes óptimos unen directamente los receptores de
células T CD8^{+} (TCRs) antígeno-especificas
independientemente de su capacidad funcional. Se utilizan
generalmente tetrámeros HLA-A2 unidos al epítope CTL
de interés. El TBA es más exacto y preciso para reflejar el número
de células T CD8^{+} antígeno específicas movilizadas in
vivo pero su capacidad para cuantificar células T CD8^{+}
antígeno-especificas funcionales es limitada.
Por mucho tiempo se consideró a los CTL como el
principal componente de la respuesta celular. Hoy se sabe que a
pesar de que estos son inducidos durante la respuesta Th1, no todas
las respuestas Th1 cursan con la inducción de CTL. Por ello, la
necesidad de buscar adyuvantes que induzcan, además de un patrón
Th1, actividad CTL.
Los adyuvantes son sustancias que potencian la
respuesta inmune específica contra un antígeno provocando una
inducción más rápida de esta y aumentando su duración (Vogel FR.
Dev. Biol. Stand. 1998,92:241-248). Su uso en las
formulaciones vacunales permite reducir la cantidad de antígeno
necesaria, dirigir la respuesta hacia un patrón deseado y disminuir
el número de dosis necesarias.
Entre los sistemas de adyuvantes disponibles que
inducen respuesta Th1 se encuentran:
- 1.
- MF59 (emulsión de aceite en agua microfluidizada de aceite de escualeno). Podda A, Del Giudice G. Expert Rev Vaccines. 2003 Apr;2(2):197-203.
- 2.
- Monofosforil lípido A (MPL®), derivado lipopolisacarídico proveniente de Salmonella minnesota, que contiene 6 ácidos grasos, particularmente el MPL 3-D-O-acetilado (3D-MPL) u otros derivados no tóxicos del lipopolisacárido (LPS) y combinaciones del MPL, preferiblemente el 3D-MPL o derivados no tóxicos del LPS con sales de aluminio.
- 3.
- Fracciones inmunoestimulatorias de Quillaja saponaria: Quil A, incorporada en complejos inmunoestimulatorios (ISCOM®), Complejos de saponinas, colesterol y fosfolípidos (Polakos NK, Drane D, Cox J, Ng P, Selby MJ, Chien D, O'Hagan DT, Houghtan M and Paliard X. J Immunol 2001,166:3589-98).
- 4.
- Partículas de polilactil co-glicolidos (Putney SD and Burke PA, Nat BIOTECHNOL. 1998, 16:153-157).
- 5.
- MPL y saponina, particularmente Saponina glicósido triterpénico aislada de la corteza del árbol Quillaja saponaria Molina (QS21) y 3D-MPL como es revelado en WO 94/00153.
- 6.
- QS21 y colesterol como es revelado en WO 98/33739.
- 7.
- QS21, 33D-MPL y tocoferol emulsionados en agua en aceite como se revela en WO 95/17210 y
- 8.
- Oligonucleótidos CpG, secuencias de dinucleótidos citocina-guanina con citocinas no metiladas, característica sólo del ácido desoxirribonucleico (ADN) bacteriano, como es revelado en WO 96/02555.
Los adyuvantes que inducen CTL en la actualidad
son escasos entre los que se encuentran el MF59, los
Oligonucleótidos CpG, el QS21, el MPL®, los ISCOM® y cocleatos
derivados de lípidos (O'Hagan D., Mackicham M., and Singh M. Recent
advance in adyuvants for infection disease. Biomolecular Engineering
2001 and Edelman Robert. The development and use of vaccine
adyuvant. Molecular Biothecnology 2002. 21:2,
129-148.).
Los Proteoliposomas se han descrito para la
preparación de vacunas profilácticas contra enfermedades
infecciosas por Ruegg CL et al. (Preparation of
proteosome-based vaccines. J Immunological Methods
1990;135:101-109); Lowell et al.
(Proteosome-Lipopeptide Vaccines: Enhancement of
Immunity for Malaria CS Peptides. Science
1988;240:800-2) y también como es revelado en US
No. 5,597,572. En esta última, el núcleo fundamental es el
Proteoliposoma derivado de la membrana externa de Neisseria
meningitidis serogrupo B, cuya estructura particulada, su
contenido de LPS nativos incorporados y no libres, el polisacárido
C, su composición lipídica característica y su adsorción en alúmina,
están relacionadas con su elevada inmunogenicidad y probada
protectogenicidad en humanos.
La vacuna basada en este Proteoliposoma,
VA-MENGOC-BC®, ha sido aplicada en
más de 50 millones de dosis y ha demostrado ser segura, no
reactogénica y eficaz para proteger contra N. meningitidis
serogrupos B y C. Es además, aplicada durante la lactancia de forma
segura y efectiva, donde convierte la
T-independencia del Polisacárido C en un antígeno
T-dependiente (Pérez O. et al. Th1 response
induced by the B component of
VA-MENGOC-BC^{TM} overcomes the
thymus independence of polysaccharide C and primes for memory in
toddler. Biotecnología Aplicada 2002;
19(1-2):54). Esta vacuna induce un patrón
preferencial Th1 caracterizado por la inducción en humanos y
animales de linfoproliferación; anticuerpos IgG
anti-Proteoliposoma; subclases IgG1 en humanos e
IgG2a en ratones; IFN\gamma, IL2 e IL12 en el ámbito de ácido
ribonucleico mensajero (ARNm) y proteínas,
no-inducción de IgE anti- Propteoliposoma ni
incrementos en la IgE total y no-producción de IL4,
IL5 tanto en el ámbito de ARNm como proteico (Pérez O et al.
Infect Immun. 2001, 69(72001):4502-4508).
Los Proteoliposomas y derivados de estos como las VSSP y las
Estructuras cocleares, también se han empleado como adyuvantes como
es revelado en (US 6,149,921 del 2000) y en (Método de obtención de
estructuras cocleares. Composiciones vacunales y adyuvantes basados
en estructuras cocleares y sus intermediarios. OCPI.
2002-0292 del 27/11/02), respectivamente.
La presente invención tiene como objeto el
empleo de los Proteoliposomas bacterianos naturales o modificados
genéticamente, en especial aquellos derivados de N.
meningitidis, así como las Estructuras cocleares derivadas de
éste, como nuevos adyuvantes inductores de CTL. Estos nuevos
adyuvantes resultan de particular importancia contra infecciones
fúngicas, virales, bacterianas y protozoarias (particularmente las
intracelulares), así como enfermedades tumorales.
Por "Proteoliposoma" se entiende que estos
son obtenidos de cepas bacterianas usando cualquier método conocido
como puede ser: su aislamiento sin detergente; un proceso que
incluya detergente (como desoxicolato) o la extracción a partir de
vesículas "bleb" de sobrenadantes de cultivos y
particularmente los revelados en US 5,597,572. Los Proteoliposomas
contienen diferentes Patrones Moleculares Asociados a Patógenos
(PAMP), estructuras moleculares conservadas entre patógenos capaces
de estimular fuertemente al sistema inmunitario.
Por "Estructuras cocleares" se entiende un
adyuvante derivado de los Proteoliposomas que por lo tanto también
contienen PAMP según se refiere en la patente (Método de obtención
de estructuras cocleares. Composiciones vacunales y adyuvantes
basados en estructuras cocleares y sus intermediarios OCPI.
2002-0292 del 27/11/02).
Los mecanismos de protección contra
Neisseria, bacteria Gram negativa extracelular, están
relacionados con la inducción de anticuerpos que median
fundamentalmente las funciones opsonofagocíticas y bactericidas. Por
lo que, no es de esperar que los Proteoliposomas derivadas de ellas
y la infección natural producida por esta bacteria, induzcan
respuestas CTL. Sin embargo, estudios de laboratorio han
demostrado, sorpresivamente, que humanos inmunizados con
VA-MENGOC-BC®, vacuna anti-N.
meningitidis B y C, muestran una respuesta con activación y
proliferación de linfocitos tanto T CD4^{+} como T CD8^{+}
específicos contra el Proteoliposoma, al ser evaluada en células
mononucleares periféricas re-estimuladas in
vitro.
También sorprendente ha sido encontrar que
ratones Balb/c inmunizados con
VA-MENGOC-BC®, con Proteoliposomas o
Estructuras cocleares inducen T CD8^{+} específicos, además de
los conocidos T CD4^{+}.
De igual forma se ha encontrado,
inesperadamente, que la infección por el microorganismo natural,
N. meningitidis serogrupo B, induce respuesta tanto T
CD4^{+} como T CD8^{+} anti- Proteoliposoma, la cual fue
detectada en linfocitos de individuos curados de enfermedad
meningocócica causada por N. meningitidis B.
Fue inesperado que también los ratones
inoculados con N. meningitidis B indujeran respuesta de
células T CD8^{+}.
Se ha encontrado, que tanto en células de
inmunizados con VA-MENGOC-BC® como
prevenientes de individuos curados de enfermedad meningocócica, los
linfocitos T CD4^{+}, y sorprendentemente los T CD8^{+} secretan
IFN7 e IL2 y no IL4 ni IL5 al ser evaluados por Citometría de
Flujo. Este resultado incluye a los linfocitos T CD8^{+} dentro
de las células importantes en la producción de las citocinas
características del patrón de respuesta Th1.
Todas estas evidencias fenotípicas y
moleculares, apuntan hacia la inducción de una respuesta CTL luego
de la infección natural o la inmunización con un Proteoliposoma
proveniente de una bacteria extracelular, lo cual resulta
extremadamente sorprendente.
Otras experiencias sorprendentes se obtuvieron a
partir de la incorporación eficiente de antígenos exógenos como la
Ovalbúmina (Ova) en el Proteoliposoma y sus derivados, aunque sus
capacidades no se restringen a este antígeno. La incorporación de
Ova en el Proteoliposoma indujo, en células dendríticas,
presentación a nivel de MHC clase I y su reconocimiento y activación
por hibridomas de células T CD8^{+}. Estos resultados evidencian
la inducción de una respuesta CTL contra antígenos heterólogos que
puede ser empleada para el desarrollo de nuevas preparaciones
vacunales.
La inserción o conjugación de epitopes CTL
provenientes de Ova fueron incorporados en los Proteoliposomas o
sus derivados y de esta forma se incrementó la respuesta inducida
contra estos epitopes.
También forman parte de la presente invención
Proteoliposomas que pueden expresar altas concentraciones de
antígenos de interés, mediante la manipulación por ingeniería
genética de la cepa productora del Proteoliposoma con el fin de que
exprese "más o menos" cantidad del o de los antígenos
heterólogos deseados.
Por "antígenos de interés" se entiende
aquellos provenientes de hongos, virus, bacterias, protozoos y
cáncer que han demostrado requerir de respuesta CTL para su
eficiente eliminación por el sistema inmune, sin restringirse a los
ya identificados.
Por "más o menos" se entiende en particular
que la cepa exprese más de un 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0.1%
de la cantidad del o los antígenos heterólogos de interés.
Preferiblemente la cepa ingenierizada expresa entre 0.5% y 10% del
antígeno de interés.
El gen codificante del antígeno de interés de la
invención puede ser ingenierizado según lo expresado anteriormente
por técnicas conocidas.
También forma parte de la presente invención la
obtención de diferentes formulaciones vacunales que aprovechan la
capacidad de los Proteoliposomas y las Estructuras cocleares de
inducir respuestas CTL, no descrita con anterioridad.
Antígenos tumor asociados, gangliósidos o
proteínas provenientes de Leishmania fueron incluidos en los
Proteoliposomas o en sus derivados y se demostró la inducción de
respuesta CD8^{+} y producción de IFN\gamma cuando ratones
Balb/c fueron inmunizados y desafiados in vitro con los
respectivos antígenos. También muestran ser efectivas
formulaciones vacunales, donde los antígenos son conjugados a parte
de los Proteoliposomas de la composición vacunal o una vez
conjugados a éstos son transformados en Estructuras cocleares.
Las formulaciones vacunales de la presente
invención pueden ser usadas para proteger un mamífero susceptible
a la infección o tratar enfermedades tumorales por medio de la
administración de dicha formulación vacunal por vía sistémica o
mucosal. Estas aplicaciones pueden incluir inyecciones por rutas
intramusculares, intraperitoneales, intradérmica o subcutánea o
administración mucosal por vía oral/alimentaria, nasal/respiratoria
o tractus genitourinario.
La cantidad de Proteoliposoma o Estructuras
cocleares en cada formulación es seleccionada como la cantidad que
muestra función adyuvante, que siempre es inferior a la empleada en
las vacunas anti-meningocócicas basadas en estas
estructuras, por lo que los efectos secundarios adversos son
inferiores y no son significativos. Esta cantidad variará en
dependencia del antígeno de interés y como éste es incorporado.
Generalmente la cantidad de Proteoliposoma o Estructuras cocleares
en cada dosis estará entre 1 y 50 \mug y más típicamente entre 5
y 25 \mug. La cantidad del antígeno de interés estará en el rango
de 0.1 a 20% de la masa de Proteoliposoma o Estructuras cocleares y
preferiblemente 0.5 a 10%.
El número de dosis dependerá primariamente de si
la formulación vacunal es profiláctica o terapéutica. En la
primera, se aplicarán como máximo tres dosis y en la segunda se
puede llegar hasta 5 dosis. Ambas pueden ser aplicadas en niños
menores de un año, de 2 a 5 años, escolares, adolescentes, adultos y
en la tercera edad.
La novedad de la invención radica primeramente,
en el uso de Proteoliposomas o Estructuras cocleares derivados de
proteínas de la membrana externa de bacterias
Gram-negativas y más particularmente de N.
meningitidis B, como. adyuvantes inductores de actividad
CTL.
Es particularmente novedoso, que la infección
natural con N. meningitidis B, bacteria extracelular, induzca
respuesta de células T CD8^{+}, linfocitos más asociados a la
respuesta citotóxica y que estos produzcan IFN\gamma e IL2,
evidenciando la inducción de actividad CTL, por lo que estos
linfocitos también están potenciando la respuesta Th1 previamente
demostrada.
Otro aspecto novedoso es su aplicación
profiláctica en formulaciones vacunales fúngicas, virales,
bacterianas o protozoarias y su aplicación terapéuticas en sujetos
afectados con tumoraciones malignas en que se desea inducir una
respuesta citotóxica.
Es particularmente novedoso además, la
conjugación o inserción de epítopos citotóxicos a los
Proteoliposomas o Estructuras cocleares, los que incrementan la
respuesta CTL.
Es también novedoso, la posibilidad de empleo de
estas formulaciones por vía mucosal además de por vía parenteral, o
la combinación de estas vías.
Es también novedoso, la ingenierización de las
cepas meningocócicas para producir Proteoliposomas o sus derivados
que expresen antígenos citotóxicos.
\newpage
De forma inesperada se obtiene respuesta CTL
contra Proteoliposomas provenientes de bacterias extracelulares y
sus derivados, las estructuras cocleares, cuando la inducción de
actividad citotóxica sólo estaba circunscrita a gérmenes
intracelulares, tumores o determinados adyuvantes que permitan una
presentación cruzada (cross priming).
También fue inesperado el hallazgo de inducción
de actividad CTL en convalecientes de enfermedad meningocócica o en
portadores de Neisseria, germen extracelular que no debiera
inducir actividad CTL.
Estas actividades se manifestaron por la
inducción de linfocitos CD8^{+}, por la presencia de IFN\gamma e
IL2 en ellos, la presentación de antígenos heterólogos en MHC clase
I de células dendríticas y su reconocimiento y activación de
hibridomas CD8^{+} y la Tisis de células que expresan antígenos
heterólogos.
Los Proteoliposomas y las Estructuras cocleares
son obtenidos a escala industrial en condiciones de Buenas
Prácticas de Producción (GMP, Good Manufacture Practices) en el
Instituto Finlay y contamos con metodologías para la inclusión de
antígenos heterólogos en los mismos.
La solución propuesta tiene las siguientes
ventajas:
El efecto inmunológico logrado por este
preparado permite inducir respuestas CTL por el Proteoliposoma y
las Estructuras cocleares contra los antígenos heterólogos
incorporados en estos, lo que es aplicable; pero no limitado, a
microorganismos intracelulares y a enfermedades tumorales.
El efecto inmunológico de los Proteoliposomas
como vacuna y transitivamente como adyuvante, donde se emplea
menores cantidades, es seguro en niños menores de un año, de 2 a 4
años, en escolares, adolescentes y adultos.
Los Proteoliposomas y las Estructuras cocleares
por la preferencial respuesta celular (Th1) inducida, también
convierten a antígenos T-independientes (conjugados
o incorporados no covalentemente), tales como carbohidratos en
antígenos T-dependientes. Esta propiedad se aplica
también de forma ventajosa a los antígenos de interés de carácter
sacarídicos.
Es útil la flexibilidad de las Estructuras
cocleares para incorporan antígenos particulados, especialmente ADN
induciendo respuesta CTL contra ellos La presente invención será
descrita a través de los siguientes ejemplos específicos.
Para la obtención del Proteoliposoma se realiza
un cultivo de N. meningitidis B o Salmonella typhi y
la biomasa colectada mediante centrifugación se somete a un proceso
de extracción con detergente, enzimas y ultrasonido. El debris
celular es removido mediante centrifugación y el sobrenadante es
sometido entonces a digestión con nucleasas para eliminar los
ácidos nucleicos. El extracto es recuperado mediante
ultracentrifugación, resuspendido en solución con detergente y
purificado del resto de los componentes de bajo y mediano peso
molecular mediante cromatografía de exclusión molecular. El
Proteoliposoma así obtenido contiene menos del 10% de ácidos
nucleicos y menos del 10% de LPS insertado en su estructura; pero
nunca libres. El LPS presente es esencial en desencadenar las
señales de peligro para iniciar la respuesta innata. El producto
final es sometido a un conjunto de controles biológicos y
físico-químicos.
Ratones Balb/c fueron inmunizados con dos dosis
de 25 \mug cada una de Proteoliposoma o Estructuras cocleares,
por vía intramuscular o nasal y espaciadas 14 días, Las células de
bazo fueron tomadas a los 7 días de la segunda dosis y desafiadas
por 4 días con Proteoliposoma. Las células expandidas fueron
tratadas con anticuerpos monoclonales anti-CD4 o
anti-CD8 y posteriormente con una
anti-IgG fluorescente y fueron evaluados por
Citometría de Flujo. La inmunización estimuló tanto los linfocitos T
CD4^{+} como T CD8^{+} anti-Proteoliposoma. 45%
de los linfocitos fueron T CD4^{+} y 40% fueron T CD8^{+}.
Adultos jóvenes fueron inmunizados con dos dosis
de VA-MENGOC-BC® de 50 \mug cada
una por vía intramuscular, espaciadas 6 semanas. Siete días después
de la segunda dosis se tomó sangre y se purificaron, sobre gradiente
de Ficoll-Hipaque, las células mononucleares
periféricas. Estas se enfrentaron por 4 días con Proteoliposoma.
Las células expandidas fueron tratadas con anticuerpos monoclonales
anti-CD4 o anti-CD8 y posteriormente
con una anti-IgG fluorescente y fueron evaluados
por Citometría de Flujo. La inmunización estimuló tanto los
linfocitos T CD4^{+} como los linfocitos T CD8^{+} anti-
Proteoliposoma. 50% de los linfocitos fueron T CD4^{+} y 42%
fueron T CD8^{+}.
Dos meses después del alta de pacientes que
habían padecido enfermedad meningocócica causada por Neisseria
meningitidis B se tomó sangre y se purificaron, sobre gradiente
de Ficoll-Hipaque, las células mononucleares
periféricas. Estas se enfrentaron por 4 días con Proteoliposoma. Las
células expandidas fueron tratadas con anticuerpos monoclonales
anti-CD4. o anti-CD8 y
posteriormente con una anti IgG fluorescente y fueron evaluados por
Citometría de Flujo. Se evidenció proliferación de linfocitos T
CD4^{+} y T CD8^{+}. 47% de los linfocitos fueron T CD4^{+} y
39% fueron T CD8^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Adultos jóvenes fueron inmunizados con dos
dosis de VA-MENGOC-BC® de 50 \mug
cada una por vía intramuscular, espaciadas 6 semanas. Varios meses
después de la segunda dosis se tomó sangre. Estas se enfrentaron
por 27 horas con Proteoliposoma a una concentración de 10 ó 20
\mug/ml. Posteriormente los glóbulos rojos fueron lisados y el
resto celular fue permeabilizado y enfrentado a anticuerpos
monoclonales para la detección de citocinas intracelulares
(IFN\gamma, IL2 o IL5) y marcadores de membrana (CD4, CD8 y
CD69). 3.28% de linfocitos T CD4^{+} y 20.65% de linfocitos T
CD8^{+} fueron activados con 10 \mug/ml de Proteoliposoma,
mientras que 3.86% de T CD4^{+} y 14.11% de T CD8^{+} fueron
activados con 20 \mug/ml de Proteoliposoma. Sin embargo, sólo los
linfocitos T CD8^{+} activados produjeron IFN\gamma e IL2,
aunque en los linfocitos T CD4^{+} activados se detectó también
cierta producción de IL2. Los porcentajes de IFN\gamma
intracelular en los linfocitos T CD4^{+} y T CD8^{+} con 10
\mug/ml fueron 0.35 y 0.89 y con 20 \mug/ml fueron 1.54 y 1.29,
respectivamente; pero sólo de las células productoras de IFN\gamma
estaban activadas el 0.57% con 10 \mug/ml y el 0.87% con 20
\mug/ml de los T CD8^{+}. Los porcentajes de IL2 intracelular
en los linfocitos T CD4^{+} y T CD8^{+} con 10 \mug/ml fueron
1.19 y 1.07 y con 20 \mug/ml fueron 1.18 y 1.6, respectivamente;
pero sólo las células productoras de IL2 estaban activadas el 0.68
y el 0.7% con 10 y 20 \mug/ml, respectivamente de los linfocitos
T CD8^{+}. En el caso de los linfocitos T CD4^{+} sólo bajos
porcientos de producción de IL2 en las células activadas se
detectaron. No se observó producción de IL5 por ninguna de las
subpoblaciones linfocitarias.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos meses después del alta de pacientes que
habían padecido la enfermedad meningocócica causada por
Neisseria meningitidis B se tomó sangre. Estas se enfrentaron
por 27 horas con Proteoliposoma 10 \mug/ml. Posteriormente los
glóbulos rojos fueron lisados y el resto celular fue permeabilizado
y enfrentado a anticuerpos monoclonales para la detección de
citocinas intracelulares (IFN\gamma, IL2 o IL5) y marcadores de
membrana (CD4, CD8 y CD69). Los porcentajes de T CD4^{+} y T
CD8^{+} activados fueron 9.29 y 26.81, respectivamente. Ambos
subset de linfocitos, T CD4^{+} y T CD8^{+}, activados
produjeron IFN\gamma y solo los linfocitos T CD8^{+} produjeron
IL2. Los porcentajes de IFN\gamma intracelular fueron en los
linfocitos T CD4^{+} y T CD8^{+} de 3.46 y 1.36,
respectivamente; pero de éstos solo eran células activadas el 0,65
y el 0.95%, respectivamente. Los porcentajes de IL2 intracelular
fueron en los T CD4^{+} y T CD8^{+} de 0.73 y 0.93,
respectivamente; pero de éstos solo eran células activadas el 0.27
y el 0.73%, respectivamente. No se observó producción de IL5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ovalbúmina (Ova) fue incorporada en el
Proteoliposoma mediante el empleo de detergentes, particularmente
desoxicolato, el cual permitió el desensamblaje de su estructura
Proteoliposomal. La eliminación del detergente y el
re-ensamblaje de la estructura en presencia de Ova
permitieron su incorporación en el Proteoliposoma. La proporción
final de Proteoliposoma:Ova fue de 100:11.2. La estructura
vesicular fue comprobada mediante cromatografía de exclusión
molecular rindiendo perfiles similares del Proteoliposoma sólo y el
del que contenía la Ova. La presencia de Ova fue comprobada por la
técnica SDS-PAGE y su posterior Western Blot
revelado con un anticuerpo policlonal anti-Ova el
cual demostró la presencia de una banda correspondiente a Ova dentro
del perfil proteico del
Proteoliposoma.
Proteoliposoma.
\vskip1.000000\baselineskip
La incorporación de proteínas de promastigotes y
amastigotes de Leishmania fue eficientemente realizada
mediante la inclusión de estas en la solución durante el proceso de
formación de las Estructuras cocleares. La inmunización de animales
con las Estructuras cocleares conteniendo estos antígenos demostró
el incremento de la respuesta anti-Leishmania, así como la
reducción de las induraciones producidas por la infección con este
protozoo. La presencia de esta proteína también fue evidenciada por
la técnica SDS-PAGE seguido de un Western Blot
revelado con anticuerpos anti Leishmania.
\vskip1.000000\baselineskip
Este es descrito en el ejemplo 1.2 de la
patente "Método de obtención de vacunas conjugadas. Composiciones
vacunales" Patente OCPI 2002-0257 de
14/11/02.
\vskip1.000000\baselineskip
Lipopolisacáridos (LPS) de Neisseria
meningifidis B han sido incorporado en diferentes cantidades,
incrementando las concentraciones de éste presentes normalmente en
los Proteoliposomas hasta un 12% con un incremento en la respuesta
inmune obtenida. También se han incorporado LPS de Vibrio
cholerae lo que ha permitido inducir respuesta
anti-LPS de Vibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Células de bazo de animales inmunizados con
Proteoliposomas contendiendo Ova o proteínas de Leishmania
en Estructuras cocleares indujeron respuesta T CD8^{+} y estos
expresaron IFN\gamma al ser evaluados por la técnica de ELISPOT
T. Los conjugados de Polisacárido C a Proteoliposomas indujeron
respuesta de IFN\gamma al ser evaluados por ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pGFP, que contiene el gen de la
proteína verde fluorescente bajo un promotor de expresión en células
superiores (CMVp), fue eficientemente incorporado en Estructuras
cocleares. Las Estructuras cocleares conteniendo dicho plásmido
fueron adicionado a un cultivo de células de la línea L929. La
expresión de la proteína verde fluorescente en el citoplasma
celular fue comprobada mediante microscopia óptica de
florescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron empleados hibridomas de células T
CD4^{+} (OT4H) restringidas para MHC clase II y de células T
CD8^{+} (CD8OVA) restringidas para MHC clase I específicos para
los péptidos de Ova (257-264) y
(265-277), respectivamente. Células Dedríticas (CD)
fueron incubadas por 2 h con PL-Ova o Ova soluble y
luego co-cultivadas con los hibridomas de células
T. Los sobrenadantes fueron colectados luego de 24 h y testados
para detectar producción de IL2 a través de la incorporación de
[3H] timidina por la línea celular CTLL dependiente de IL2. La
producción de IL2 brinda una medida de la activación de los
hibridomas de células T específicos para péptidos de Ova. La Figura
1 muestra que las CD incubadas con PL-Ova pueden
presentar los péptidos de Ova al hibridoma de células T CD4^{+} y
al de T CD8^{+}. Los hibridomas de células T produjeron niveles
de IL2 significativamente mayores cuando fueron estimulados con CD
que habían sido previamente incubadas con PL-Ova en
comparación con CD incubadas sólo con Ova. Las diferencias
significativas entre los niveles de presentación de los péptidos
específicos de Ova en MHC-I y MHC-II
por CD incubadas con PL(Ova) o Ova fueron determinados
usando la Prueba de comparación múltiple de Duncan. De esta forma,
el Proteoliposoma puede liberar antígenos a CD y propiciar una
eficiente presentación antigénica a
células T.
células T.
Figura 1: Figura 1. Células dendriticas pueden
procesar péptidos de Ova incluidos en el Proteoliposoma
(PL-Ova) y presentarlos en MHC-I y
MHC-II DC. Fig. 1A muestra la respuesta del
hibridoma de células T OT4H a CD de ratones C57BL/6
co-incubadas con el Proteoliposoma (PL), Ova o
PL-Ova; Fig. 1B muestra la respuesta del hibridoma
de células T OvaCD8^{+}. La producción de IL-2
por los hibridomas fue cuantificada por incorporación de [^{3}H]
timidina por la línea celular CTLL dependiente de
IL-2. Los datos se presentan como la media \pm DS
de tres experimentos diferentes. CPM, centelleo por minuto.
*significativamente diferente de otros
grupos.
Claims (14)
1. Adyuvantes vacunales caracterizados
por ser un Proteoliposoma o derivados de este que inducen respuesta
CTL.
2. Adyuvantes vacunales según reivindicación 1,
caracterizados porque el Proteoliposoma o sus derivados son
de origen bacteriano.
3. Adyuvantes vacunales según reivindicación 2,
caracterizados porque provienen del género Neisseria
o Salmonella.
4. Adyuvantes vacunales según reivindicación 1,
caracterizados porque el Proteoliposoma o sus derivados
expresan antígenos heterólogos de interés a partir de una cepa
modificada genéticamente.
5. Formulación vacunal caracterizada
porque comprende el o los adyuvantes según las reivindicaciones de
la 1 a la 4, uno o más antígenos, así como excipientes
adecuados.
6. Formulación vacunal según reivindicación 5,
caracterizado porque el antígeno(s) es insertado en
la bicapa lipídica de los Proteoliposomas, estando así presente en
sus derivados.
7. Formulación vacunal según reivindicación 5,
caracterizado porque el antígeno(s) es conjugado al
Proteoliposoma, estando así presente en sus derivados.
8. Formulación vacunal según reivindicación 5,
caracterizado porque el antígeno(s) es
co-administrado con el Proteoliposoma o sus
derivados.
9. Formulación vacunal según reivindicación 5,
caracterizado porque el antígeno(s) se puede
seleccionar del grupo de antígenos provenientes de hongos, virus,
bacterias, protozoos y cáncer y que han demostrado requerir de
respuesta CTL para su eficiente eliminación por el sistema
inmune.
10. Formulación vacunal según reivindicación 5,
caracterizado porque el Proteoliposoma o sus derivados se
encuentran en un rango entre 1 y 50 \mug y particularmente entre
5 y 25 \mug.
11. Formulación vacunal según reivindicación 5,
caracterizado porque el o los antígenos se encuentran en un
rango entre 0.1 a 20% de la masa de Proteoliposoma o sus derivados
y particularmente entre 0.5 a 10%.
12. Formulación vacunal según reivindicaciones
de la 5 a la 11, caracterizado porque la vía de
administración puede seleccionarse del grupo de intramuscular,
intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o vía mucosal por
oral/alimenta-
ria, nasal o tractos genitourinario.
ria, nasal o tractos genitourinario.
13. Uso de la formulación vacunal según
reivindicaciones de la 5 a la 11 para la protección de mamíferos
susceptibles a infecciones y para el tratamiento de enfermedades
tumorales.
14. Esquema de inmunización empleando las
formulaciones según reivindicaciones de la 5 a la 11,
caracterizado porque para lograr un efecto profiláctico se
aplicarán como máximo tres dosis y para lograr un efecto
terapéutico se aplicarán como máximo cinco dosis.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2003-0312 | 2003-12-30 | ||
| CU20030312A CU23420A1 (es) | 2003-12-30 | 2003-12-30 | Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones resultantes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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