KR100219126B1 - 비정형 헤모필루스의 고분자량 표면 단백질들 - Google Patents
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Abstract
발명자들이 고분자량(HMW) 헤모필루스 단백질들의 특성을 더 밝혀내기 위하여 노력하여 원형 비정형 헤모필루스 계통들로부터 두 개의 면역우성의 HMW 단백질들(HMW1, HMW2로 지정됨.)을 코딩하는 유전자들을 시퀀싱하고 발현시키고 클로닝하였으며, 또다른 비정형 헤모필루스 계통으로부터 두 개의 부가적인 면역우성의 HMW 단백질들(HMW3, HMW4로 지정됨.)을 코딩하는 유전자들을 거의 완벽하게 시퀀싱하였고 발현시키고 클로닝 하였다.
그러므로, 본 발명의 한 관점에 따르면, 본 발명은 비정형 헤모필루스 계통의 고분자량 단백질들을 코딩하는 유전자들, 특히 HMW1,HMW2, HMW3, HMW4 단백질을 코딩하는 유전자들을 분리 정제할 뿐만 아니라, 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통에 의한 질병을 예방하는 면역적 능력을 지닌 그러한 단백질의 변형과 조각들을 제공한다. 또 다른 측면에서 본 발명은 이러한 유전자들에 의해 코딩되는 비정형 헤모필루스 인플렌쟈의 고분자량 단백질을 제공한다.
Description
[발명의 명칭]
비정형 헤모필루스의 고분자량 표면 단백질들
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 비정형(non-typeable) 헤모필루스의 고분자량 단백질들에 관한 것이다.
[본 발명의 배경]
비정형 헤모필루스 인플렌쟈들은 알려진 헤모필루스 인플렌쟈 피막 항원들에 대한 반응성이 없다는 것에 의해 정의되는 비-피막성 유기체들이다.
이러한 유기체들은 통상 사람의 상부 호흡기도에 상주하여, 흔히 중이염, 정맥동염, 결막염, 폐렴 등과 같은 감염들의 원인이 된다. 이러한 유기체들은 폴리사카라이드 피막을 가지고 있지 않기 때문에, Hib 박테리아성 피막 폴리사카라이드들에 대한 현재의 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 백신들에 의해 조절되지 않는다. 그러나 비정형 계통들은 살균성 항체들을 유도할 수 있는 표면 항원들을 생산할 수 있다. 주요한 외막 단백질들중 P2와 P6가 사람의 혈청 살균성 활동의 타겟들로 밝혀졌다. 그러나, 특별히 비정형 헤모필루스 계통들안에서 P2 단백질 서열이 일정하지 않다는 것이 밝혀졌다. 따라서, P2에 기초한 백신은 모든 계통의 유기체에 대하여 예방적이지 않다.
베렌캠프등(Barenkamp et al.)에 의해서 사람의 회복기 혈청들의 주요한 타겟들로 밝혀진 고분자량(high-molecular-weight, HMW) 단백질들의 그룹이 밝혀졌다. 일련의 중이(中耳) 분리물들을 관찰한 결과, 대부분의 계통들내에서 하나나 둘의 그러한 단백질들의 존재가 밝혀졌다. 그러나 본 발명에 앞서 그러한 단백질들의 순수한 분리물로서의 단백질들의 구조들이 알려지지 않았다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 HMW1 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열(서열번호 1)이다.
제2도는 HMW1 단백질의 유도된 아미노산 서열(서열번호 2)이다.
제3도는 HMW2 단백질을 코딩하는 유전자의 DNA 서열(서열번호 3)이다.
제4도는 HMW2의 유도된 아미노산 서열(서열번호 4)이다.
제5(a)도는 HMW이나 HWM2 구조유전자들을 함유하는 대표적인 재조합 파아지들의 제한효소지도로, 구조유전자들의 위치는 검은 막대로 표시하고 있다.
제5(b)도는 T7 발현벡터 pT7-7의 제한효소지도이다.
제6도는 뉴클레오타이드 351 내지 4958 (ORF a)를 포함하는(제1도에서와 같이) hmw1 유전자의 유전자 클러스터의 DNA 서열(서열번호 5)뿐만 아니라, ORF b, 뉴클레오타이드 5114-6748과 c 뉴클레오타이드 7062-9011을 포함하는 3' 측면부위내의 두 개의 부가적인 다운스트림 유전자들을 나타낸다.
제7도는 뉴클레오타이드 792 내지 5222 (ORF a)를 포함하는데(제3도에서와 같이) hmw2 유전자의 유전자 클러스터의 DNA 서열(서열번호 6)뿐만 아니라, ORFs b, 뉴클레오타이드 5375-7009와 c, 뉴클레오타이드 7249-9198을 포함하는 3' 측면부위내의 두 개의 부가적인 다운스트림 유전자들을 나타낸다.
제8도는 HMW3 단백질을 코딩하는 유전자의 부분적인 DNA 서열(서열번호 7)이다.
제9도는 MMW4 단백질을 코딩하는 유전자의 부분적인 DNA 서열(서열번호 8)이다.
제10도는 HMW1, HMW2, HMW3, HMW4 단백질들의 유도된 아미노산 서열의 비교표이다.
[발명의 일반적인 설명]
제1도와 제3도에서 각각 보이는 HMW1과 HMW2를 코딩하는 유전자들의 DNA 서열들은 처음 1256 염기쌍이 동일하고 약 80가 일치한다.
제2도와 제4도에서 각각 보이는 두 HMW 단백질들의 유도된 아미노산 서열은 약 70가 일치한다. 더욱이, 코딩된 단백질들은, 백일해균의 사상체 혈구응집소 표면단백질과 항원적으로 관련되어 있다. 백일해균의 사상체 혈구응집소(FHA)에 대한 모노크로날 항체는 고분자량 단백질 둘다를 인식하였다. 이러한 정보는 HMW와 FHA가 유사한 생물학적 기능들을 제공하는 것을 암시한다. HMW1과 HMW2의 유도된 아미노산 서열들은 FHA 단백질의 아미노산 서열과 유사하다. 또한, 이러한 항원적으로 관련된 단백질들은 비정형계통의 헤모필루스 대다수에 의해 생성된다는 사실이 알려져 왔다. HMW1에 의해 발현된 단백질에 대하여 길러진 항혈청들이 HMW2 단백질과 백일해균 FHA 둘다를 인식한다. 본 발명은 백일해균 FHA에 항원적으로 관련되어 있고 천연적으로 또는 재조합으로 얻어질 수 있는 비정형 헤모필루스의 분리 정제된 고분자량 단백질을 포함한다.
비정형 헤모필루스의 알려진 계통의 파아지 유전자 라이브러리는 표준방법들에 의해 마련되었고, HMW들에 대한 많은 양의 항혈청을 사용하여 고분자량 단백질을 발현하는 클론들을 스크린하였다. 많은 수의 반응성이 큰 DNA 클론들은 플라크-정제되고 T7 발현 플라스미드안으로 서브클론되었다. 그들은 모두 4.6kb와 4.4kb의 개방 리딩 프레임들에 의해 코딩되고 125와 120kDa의 분자량을 가진 HMW1과 HMW2로 지정된 두 고분자량 단백질의 어느 하나를 발현하였다.
HMW1이나 HMW2를 발현하는 대표적인 클론들은 더욱더 특성화되고 유전자들은 분리 정제되고 시퀀싱되었다. HMW1의 DNA 서열은 제1도에, 해당되는 유도된 아미노산은 제2도에 나타나 있다. 유사하게, HMW2의 DNA 서열은 제3도에, 해당되는 유도된 아미노산은 제4도에 나타나 있다. 분리된 단백질들의 부분정제와 N-말단 서열분석에 의하면 발현된 단백질들의 서열이 두 HMW1과 HMW2 유전자 생성물들의 전체길이의 잔기 번호 442에서 시작되므로 발현된 단백질들이 잘리워졌다는 사실을 아 수 있다. hmw1과 hmw2 유전자들에 관한 서브클로닝 연구들에 의하면 HMW단백질들의 올바른 프로세싱을 위하여 부가적인 다운스트림 유전자들의 생성물이 필요하였다. 각각 b와 c라고 지정된 두 개의 부가적인 다운스트림 개방 리딩 프레임들(ORFs)(제6도와 제7도 참조)이 hmw1과 hmw2의 유전자의 측면에 접하는 것이 알려져왔다.
b ORF들은 1635 bp 길이이고, hmw1의 경우에 5114 내지 6748 뉴클레오타이드에 뻗어있고, hmw2의 경우에는 5375 내지 7009 뉴클레오타이드에 걸쳐있고, 그들의 유도된 아미노산 서열은 99동일하다. 유도된 아미노산 서열들은 단백질들을 코딩하는 두 유전자들의 유도된 아미노산 서열들의 유사성이 P. mirabilis와 S. marcescens의 용혈소 활성과 분비를 위해 필요하다는 것을 보여준다.
c ORF들은 1950 bp 길이이며, hmw1의 경우에는 7062 내지 9011 뉴클레오타이드에, hmw2의 경우에는 7249 내지 9198 뉴클레오타이드에 뻗었고, 그들의 유도된 아미노산 서열들은 96가 동일하다. hmw1 c ORF 앞에 일련의 9bp의 똑바른 템덤 반복자들이 선행한다. 플라스미드 서브클론들에서 hmw1 b나 c ORF의 방해에 의해 hwm1 구조유전자 생성물의 프로세싱과 분비에 결함이 있게 된다.
두 고분자량 단백질들이 분리정제 되었고 친칠라들의 중이염에 대하여 부분적으로 예방적이며 점착(adhesin)으로서 작용한다는 사실이 알려졌다.
이러한 결과들은 그러한 고분자량 단백질들과 구조적으로 연관된 다른 비정형 계통의 헤모필루스 인플렌쟈를 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 백신들에 있어서의 성분으로 사용될 수 있는 잠재성을 가르킨다.
여기에 제공된 단백질들은 좋은 교차-반응성 항원들이고 대부분의 비정형 헤모필루스 계통들에 존재하기 때문에, 이러한 HMW 단백질들은 보편적인 헤모필루스 백신의 구성성분이 될 수 있다는 것이 명백하다. 심지어, 이러한 단백질들은 비정형 헤모필루스 계통에 의한 중이염, 정맥동염, 기관지염에 대하여 보호적일 뿐만아니라, 수막염에 대한 접합 백신내의 보호적인 Hib 폴리사카라이드들의 캐리어로서 사용될 수도 있다. 이 단백질들은 또한 다른 생물체로부터의 다른 항원들, 합텐들, 폴리시카라이드의 캐리어로 사용되어 그러한 항원들, 합텐들, 폴리사카라이드들에 대한 면역을 유도한다.
비정형 헤모필루스 계통의 다른 고분자량 단백질들(HMW3, HMW4로 지정됨)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열들이 대부분 밝혀졌고 제8도와 제9도에 나타나 있다. 외견상 분자량이 HMW3는 125kDa이고 HMW4는 123kDa이다. 이러한 고분자량 단백질들은 HMW1, HMW2 단백질들과 FHA에 항원적으로 관련되어 있다. MMW3의 서열분석은 약 85, HMW4는 94완성되었으며, 각 유전자의 5'-말단의 짧은 서열들은 분석되어져야 한다.
제10도는 네가지 고분자량 단백질들의 유도된 아미노산 서열들의 다중 서열비교를 포함하고 있다. 이 비교에서 보이는 바와같이, 동일한 펩티드 서열들이 비교전체에 걸쳐 나타나며, HMW3는 HMW1과, HMW4는 HMW2와 더 밀접하게 닮았다. 이 정보는 다양한 비정형 헤모필루스 계통들로부터의 고분자량 단백질들사이에 서열유사성이 상당히 있음을 암시한다.
뿐만아니라, HMW1과 HMW2를 발현할 수 없는 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통들의 돌연변이들이 제조되어, 배양된 사람의 상피세포에 달라붙는지 조사되었다. hmw1과 hmw2 유전자 클러스터들이 E. coli에서 발현되고 생체외 점착에 대해 조사되었다. 그러한 실험들의 결과에 의하면, HMW1과 HMW2는 점착을 매개하고 따라서 점착들(adhesin)인 것이 증명되었고, 이러한 기능이 심지어 다른 헤모필루스 인플렌쟈 표면구조들에서도 존재한다는 것이 밝혀졌다.
고분자량 단백질들의 분리 정제로 발명자들은 보통의 에피토프 맵핑에 의해 주요한 보호적인 에피토프들을 결정하고, 전적으로 합성된 또는 제조합된 백신들에 들어가는 이러한 결정인자들에 해당하는 펩티드들을 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비정형 헤모필루스 인플렌쟈의 고분자량 단백질의 적어도 하나의 보호적인 에피토프에 해당하는 아미노산 서열을 가진 합성 펩티드를 또한 포함한다. 그러한 펩티드들은 고분자량 단백질 부분을 구성하는 길이가 다양하여 직접적으로 또는 접합물의 일부로서 면역을 유도하기 위해서 사용될 수 있으며 따라서 해당 질병들에 대한 예방 백신들을 구성한다.
본 발명은 또한 비정형 헤모필루스 계통들에 의한 질병에 대한 면역적 능력이 유지된 이러한 단백질들의 변형체나 부분들을 또한 제공한다. 변형은 유전자들을 부분삭제시키거나 돌연변이시키고 변경된 유전자들을 발현하여 단백질을 변화시킨다.
[실시예]
비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통 5와 12가 급성 중이염을 앓고 있는 어린이들의 중이액으로부터의 순수한 배양액에 분리되었다. HMW1과 HMW2 단백질들을 코딩하는 유전자들을 제공하는 계통 12로부터의 염색체 DNA가 염색체 DNA의 Sau3A 부분 제한분해들과 슈크로스 크레디언트에서의 분리에 의해 제공되었다. 9 내지 20kbp내의 DNA 조각들을 가진 단편들이 모여졌고 λEMBL3 팔들로의 연결에 의해 라이브러리가 제공되었다. 연결 혼합물들은 생체밖에서 묶여지고 E. coli LE 392의 P2 라이소젠내에서 플레이트-증폭되었다.
플라스미드 서브클로닝 연구들을 위해 대표적인 재조합 파아지로부터의 DNA가 T7 발현 플라스미드 pT7-7로 서브클로닝되는데, 이는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 Φ10와 리보솜-결합부위와 다중 클로닝부위로부터의 10 단백질 위쪽에 T7 유전자를 위한 해독시작부위를 가지고 있다(제5(b)도 참조).
DNA 서열분석이 디데옥시 방법에 의해 수행되었고 HMW1의 두 가닥과 HMW2의 한 가닥이 시퀀스되었다.
웨스턴 이뮤노블랏 분석이 반응성있는 파아지 클론들에 의해 생성된 재조합 단백질들을 인지하기 위해 수행되었다. LE392세포들내에서 길러진 파아지 용해물들과 YT 플레이트들위의 LE392 세포드의 잔디로부터 직접 뽑혀진 플라크들은 전기염동전에 젤 전기염동시료버퍼내에서 용해되었다. SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기염동이 7또는 11폴리아크릴아마이드 변경된 Laemmli 젤들위에서 행해졌다. 단백질들을 니트로셀룰로스시트위로 이동시킨후, 시트들은 고분자량 단백질들에 대한 항체를 많이 함유한 E. coli-흡수된 사람의 혈청시료로 프로브된후에 염기포스파타아제-접합염소의 항-사람의 이뮤노글로불린 G(IgG) 두 번째 항체로 프로브된다. 건강한 어른들의 혈청들은 비정형 헤모필루스 인플렌쟈의 표면에 노출된 고분자량 단백질들에 대한 항체를 많이 가지고 있다. 그러한 하나의 시료가 LE392 세포들로 넓게 흡수된후에 항혈청을 스크리닝하는데 사용되었다. 재조합 플라스미드들로 변형된 E. coli에 의해 생성된 재조합 단백질들을 인지하기 위하여 관심있는 플라스미드들이 E. coli BL21(DE3)/pLysS를 변형시키는데 사용되었다. 변형된 계통들이 1당 50의 암피실린을 함유한 L브로스내의 0.5의 A600으로 배양되었다. 그런다음, IPTG가 1mM에 첨가되었다. 한시간후에, 세포들이 수확되고, 세포들의 초음파분해가 행해졌다. 시료들의 단백질농도들이 바이신콘니닉(bicinchoninic)산 방법에 의해 결정되었다. 100의 전체 단백질을 가진 세포 초음파물들이 전기염동시료버퍼내에 용해되고, SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기염동을 행한후에 니트로셀룰로스로 이동되었다. 니트로셀룰로스는 E. coli-흡수된 어른 혈청 시료와 알칼리 포스파타아제-접합된 염소 항-사람의 IgG 제2항체로 순차적으로 프로브되었다.
동종의 그리고 이종 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통들이 클로닝된 HMW1 유전자(rHMW1)에 의해 코딩되는 단백질에 항원적으로 관련된 고분자량 단백질들을 발현하는지를 결정하기 위해서 웨스턴 이뮤노블랏 분석이 또한 행해졌다. 박테리아성 세포들의 세포 초음파물이 전기염동시료버퍼내에 용해되고, SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기염동한후에 니트로셀룰로스에 이동되었다. 니트로셀룰로스는 폴리크로날 토끼의 rHMW1 항혈청과 알칼리 포스파타아제-접합된 염소 항-토끼 IgG 제2항체로 순차적으로 프로브되었다. 최종적으로, 비정형 헤모필루스 계통들이 백일해균의 사상체 혈구응집소 단백질과 항원적으로 관련된 단백질들을 발현하는지를 결정하기위해서 웨스턴 블랏 분석이 행해졌다. 사상체 혈구응집소를 인식하는 모노크로날 항체 X3C와 쥐의 IgG 항체가 웨스턴 블랏에 의해서 세포 초음파물을 프로브하기 위해 사용되었다. 알칼리 포스파타아제-접합된 염소 항-쥐 IgG 제2항체가 검침을 위해 사용되었다. 재조합 단백질 항혈청을 생성하기 위하여, 상기에 설명된 바와같이 E. coli BL21(DE3)/pLysS가 pHMW1-4를 사용하여 변형되고 재조합 단백질의 발현이 IPTG에 의해 유도되었다. 박테리아세포들의 세포초음파물이 마련되고, 30분동안 10,000×g에서의 원심분리에 의해 부유물과 펠릿조각으로 분리되었다. 재조합 단백질이 덩어리 부분에 분리되었다. 토끼가 덩어리 부분으로부터의 단백질 1mg으로 격주로 피하로 면역되었다. 첫 번째는 프런드의 완전한 면역보강제와 함께 투여되었고, 계속적인 투여는 프런드의 불완전한 면역보강제와 함께 투여되었다. 4번째 투여후에 토끼를 죽였다. 웨스턴 블랏 검정에 사용되거전에, 항혈청은 클로닝 벡터만을 가지고 변형된 숙주의 E. coli 계통의 초음파물을 가지고 광범위하게 흡수되었다.
HMW1과 사상체 혈구웅집소사이의 항원적 결정인자들의 공유를 알아 보기 위해서, ELISA 플레이트들이 각 웰(well)당 4-/의 둘벡코(Dulbecco)의 포스페이트-버퍼식염수 60㎕로 상온에서 2시간동안 코팅되었다. 웰들은 혈청희석물 첨가전에 둘벡코의 포스페이트-버퍼식염수내에서 1소의 혈청 알부민으로 1시간동안 차단되었다. rHMW1 항혈청은 둘벡코의 포스페이트-버퍼식염수내의 1Brij를 가지고 연속적으로 희석되고 상온에서 3시간 동안 배양되었다. 세척된후에 프레이트들은 퍼옥시다아제-접합된 염소 항-토끼 IgG 항체롤 가지고 상온에서 2시간동안 배양되었고 계속해서 0.03H2O2를 함유한 pH4.2의 0.1M 나트륨 사이트레이트(citrate) 버퍼내에서 0.54mg/ℓ 농도의 2.2.'-아지노-비스(3-에틸렌벤즈치아졸린-6-술폰닉산)으로 전개되었다. 흡광도가 자동화된 ELISA 해독기에서 읽혀졌다.
HMW1이나 HMW2를 발현하는 재조합 파아지가 다음과 같이 재생된다. 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통 12 유전자 라이브러리가 고분자량 단백질들에 대한 항체들을 많이 가진 E. coli-흡수된 사람의 혈청시료를 가진 고분자량 단백질들을 발현하는 클론들을 위해 스크린되었다.
많은 반응성이 강한 클론들이 반응성이 약한 클론들과 함께 밝혀졌다. 20개의 반응성이 강한 클론들은 플라크-정제되고 재조합 단백질들의 발현에 대한 웨스턴 블랏에 의해 조사되었다. 반응성이 강한 각 클론들은 HMW1과 HMW2로 지정된 두가지의 고분자량 단백질들중 하나를 발현하였다. HMW1과 HMW2 용해물들내의 주요한 면역반응적인 단백질밴드들이 각각 외견상 분자량 125와 120kDa을 가지고 이동하였다. 주요한 밴드들 뿐만 아니라, 각 용해물들은 더 큰 외견상의 분자량을 가진 부수적인 단백질 밴드들을 함유하였다. HMW2 용해물들내에서 외견상의 분자량 120kDa 이하의 단백질 밴드들은 규칙적으로 관찰되지 아니하며, 아마도 단백질이 분해된 생성물을 나타내는 것으로 여겨진다.
λEMBL3 크로닝 벡터만으로 감염된 LE392의 용해물들은 동일한 혈청시료를 가지고 면역적 스크린닝을 하였을 때 반응이 없었다. 따라서, 관찰된 활성은 교차-반응적인 E.coli 단백질들이나 λEMBL3-코딩된 단백질들 때문이 아니다. 더욱이, 단백질들이 염소의 항-사람의 IgG 접합만과, 보통의 토끼 혈청들과, 또는 많은 건강한 유아들로부터의 혈청과 반응하지 않으므로 재조합 단백질들은 단순히 단순히 비특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린이 아니다.
HMW1이나 HMW2 재조합 단백질들을 발현하는 대표적인 클론들의 성질을 더 밝혔다. HMW1과 HMW2 구조 유전자들을 코딩하는 부분을 포함하여 두 파아지 타입의 제한효소지도가 서로 달랐다. 제5(a)도는 HMW1이나 HMW2 구조 유전자들을 함유하는 대표적인 제조합 파아지의 제한효소지도를 보여준다. 구조 유전자의 위치는 검은 막대로 표시되어 있다. HMW1 플라스미드 서브클론들은 T7 발현 플라스미드 T7-7(제5(a)(b)도)을 사용하여 제조되었다. HMW2 플라스미드 서브클론들도 또한 제조되었는데, 이 나중 서브클론과의 결과들이 HMW1 구조들과의 결과들과 유사하였다.
HMW1 구조 유전자의 근사적인 위치와 전사 방향은 플라스미드 pHMW1(제5a)을 사용하여 초기에 결정되었다. 이 플라스미드는 λHMW1으로부터의 8.5kb BamHI-Sa1I 조각을 BamHI-Sa1I-절단 pT7-7에 삽입함으로써 제조된다. pHMW1을 가지고 변형된 E. coli은 IPTG에 의해 강하게 유도되는 외견상의 분자량이 115-KDa인 면역반응적인 재조합 단백질을 발현하였다. 이 단백질은 부모 파아지에 의해 발현된 125-kDa 주 단백질보다 상당히 작은데 이는 융합 단백질로 발현되어 카르복실 말단에 잘리워진 것을 가르킨다.
구조 유전자의 3'끝의 위치를 더 정확하게 알기 위해서, pHMW1 구조의 3'끝으로부터 삭제해가면서 부가적인 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pHMW1-1은 pHMW1을 PstI로 분해하여 제조되었는데, 결과적인 8.8-kb 조각이 분리되고 다시 연결되었다. 플라스미드 pHMW1-2는 pHMW를 HindIII로 분해하여 제조되었는데, 결과적인 7.5-kb 조각이 분리되고 다시 연결되었다. 플라스미드 pHMW1-1나 pHMW1-2에 의해 변형된 E.coli는 또한 외견상 분자량이 115 kDa인 면역반응적인 재조합 단백질을 발현하였다. 이러한 결과들은 구조 유전자의 3' 끝이 HinIII 부위의 5' 끝이라는 것을 가르킨다.
유전자의 5'끝의 위치를 더 정확하게 알아내기 위해서 플라스미드 pHMW1-4과 pHMW1-7이 제조되었다. 플라스미드 pHMW1-4는 λHMW1으로부터의 5.1kb BamHI-HindIII 조각을 위쪽 3.8-kb EcoRI-BamHI 조각을 함유한 pT7-7 유도된 플라스미드내로 클로닝함으로써 얻어진다. pHMW1-4에 의해 변형된 E. coli는 외견상 분자량이 약 160kDa인 면역반응성이 있는 단백질을 발현하였다. 단백질생성이 IPTG에 의해 유도되기는 하지만, 이러한 변형물의 단백질 생성수준은 상기의 pHMW1-2 변형물들에서 보다 상당히 낮다. 플라스미드 pHMW1-7은 pHMW1-4를 NdeI와 SpeI로 분해함으로써 얻어진다. 이 이중분해에 의해 제조된 9.0-kbp 조각이 분리되고 끝이 잘린후 다시 연결되었다. pHMW1-7에 의해 변형된 E. coli은 또한 외견상 분자량이 160kDa인 면역 반응성이 있는 단백질을 발현하는데 이 단백질은 pHMW1-4 변형물에 의해 발현되는 단백질과 크기가 동일하다. 이 결과는 HMW1 구조유전자의 시작 코돈이 SpeI 부위의 3' 끝인 것을 가르킨다. DNA 서열분석이 이 결과를 확인시킨다.
상기에서 설명한 바와같이, λHMW1 파아지 클론들을 125kDa의 주요한 면역반응적 밴드를 발현하는 반면, 전체길이의 유전자를 함유하는 것으로 믿어지는 HMW1 플라스미드 클론들 pHMW1-4와 pHMW1-7은 약 160kDa의 면역반응성 단백질을 발현하였다. 이러한 크기의 불일치에 대한 한 설명은 서브클로닝과정에서 부가적인 유전자나 HMW1 유전자 생성물의 올바른 프로세싱에 필요한 유전자들이 삭제되었다는 것이다. 이러한 가능성에 접근하기 위해, 플라스미드 pHMW1-14가 제조되었다. 이 구조는 NdeI와 MluI로 pHMW1를 분해하고 pHMW1-4로부터 분리된 7.6kbp NdeI-M1uI를 삽입하여 제조되었다. 이러한 구조는 전체길이의 HMW1 유전자 뿐만아니라 원래의 HMW1 파아지에 존재하는 HMW1 유전자의 DNA 3'을 함유한다. 이 플라스미드에 의해 변형된 E. coli는 부가적인 생성물들과 외견상 분자량이 125와 160kDa인 주요한 면역반응성 단백질들을 발현하였다. 125-와 160-kDa의 밴드들은 HMW1 파아지 용해물들에서 검출된 주요한 그리고 부수적인 면역반응성 밴드들과 동일하였다. 흥미롭게도, pHMW1-14 구조는 유도상황이 아닌때에도 상당양의 단백질을 발현했는데 이는 앞선 구조에서는 관측되지 아니한 상황이다.
125-와160kDa 단백질들사이에 관계는 명확하지 않다. 아래에서 설명될 서열분석에 의하면, HMW1 유전자가 159kDa의 단백질을 코딩하는 것으로 예상된다. 160-kDa의 단백질은 성숙된 125-kDa 단백질의 전구체로 여겨지는데, 변환은 두 아랫쪽 유전자들의 생성물에 달려있다.
HMW1 유전자(제1도)의 서열분석에 의해 뉴클레오타이드 351의 ATG코돈으로 시작하여 뉴클레오타이드 4949에 있는 TAG 정지코돈으로 끝나는 4,608-bp 개방리딩프레임(ORF)이 밝혀졌다. 서열 AGGAG의 잠정적인 리보솜-결합부위는 잠정적인 시작코돈의 10bp 위쪽에서 시작된다. 5개의 다른 프레임내의 ATG 코돈들이 ORF의 시작부위의 250bp내에 위치하지만, 이들 앞에는 전형적인 리보솜 결합부위가 없다. ORF 5' -측면부위는 일련의 직접적인 텐덤 반복자들을 함유하는데 7-bp 서열 ATCTTTC가 16번 반복된다. 이러한 텐덤 반복자들은 잠정적인 시작코돈의 100bp 5'에서 멈춘다. rho-독립적인 전사 터미네이터의 8-bp 반전된 반복특징이 존재하는데 가정된 전사정지위치의 25bp 3'인 뉴클레오타이드 4983에서 시작한다. ORF의 윗쪽과 아랫쪽 3개의 리딩프레임들내에 다중 터미네이션 코돈들이 존재한다. HMW1 유전자(제2도)에 의해 코딩된 유도된 아미노산 서열은 159,000의 분자량을 가지는데, 이는 HMW1-4와 HMW1-7 변형물들에 의해 발현된 단백질들의 외견상의 분자량과 잘 일치한다. 아미노말단의 아미노산 서열은 전형적인 신호서열의 특징들을 보여주지 않는다. pHMW1의 생성에 사용된 BamHI 부위는 1743 내지 1748bp의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. BamHI 부위의 ORF 아랫쪽은 111KDa의 단백질을 코딩하는 것으로 예상되는데, 이는 pHMW1-유도된 융합 단백질의 외견상 분자량으로 예측된 115kDa과 잘 일치한다.
HMW2 유전자의 서열(제3도)은 뉴클레오타이드 352 위치에 ATG 코돈으로 시작되고 뉴클레오타이드 4783 위치에 TAG 정지코돈으로 끝나는 4,431-bp ORF로 구성되어 있다. HMW2 유전자의 ORF의 처음 1,259bp는 HMW1 유전자에서와 동일하다. 그후로는 서열이 달라지는데 전체적으로 80가 일치한다. HMW2 서열의 뉴클레오타이드 93위치의 한 염기의 첨가를 제외하고는, HMW1과 HMW2 유전자들의 5'-측면부위에서 각 시작코돈들로부터 310bp 위쪽이 동일하다. 따라서, HMW2 유전자앞에 HMW1 유전자의 5'에 위치한 동일한 텐덤 반복자와 동일한 잠정적인 리보솜 결합부위가 있다. 잠정적인 전사 터미네이터가 HMW1 ORF의 3'에서 밝혀진 것과 동일하며 뉴클레오타이드 4804에서 시작된다. 두 유전자의 길이의 불일치는 HMW2 서열의 뉴클레오타이드 3839에서 시작되는 186-bp 간격에 의해 설명된다. HMW2 유전자(제4도)에 의해 코딩되는 유도된 단백질의 아미노산 서열은 155,000의 분자량을 가지며 HMW1 유전자의 유도된 아미노산 서열과 71일치한다.
HMW1과 HMW2 유전자의 유도된 아미노산 서열들은 백일해균의 사상체 혈구응집소의 유도된 아미노산 서열과 유사하였다. HMW1-사상체 혈구응집소 서열비교를 위한 초기의 적합화된 TFASTA 스코어들은 87과 186으로 각각 2 워드크기(word size)를 가진다. 비교의 Z 스코어는 45.8이었다. HMW2-사상체 혈구응집소 서열비교를 위한 초기의 접합화된 TFASTA 스코어들은 각각 68과 196이다. 나중 비교의 Z 스코어는 48.7이다. 초기의 접합화된 TFASTA 스코어들과 Z 스코어들은 HMW1과 HMW2 유전자 생성물들과 사상체 혈구응집소사이에 생물학적인 관계가 존재하는 것을 암시한다. HMW1, HMW2, 사상체 혈구응집소 유전자들의 유도된 아미노산 서열을 나열하여 비교해 보면, 세 서열에서 아미노-말단끝에서 유사성이 두드러진다. 예상된 펩티드서열에서 처음 22 아미노산중 12개가 동일하였다. 부가적으로 서열들은 동일한 5개의 아미노산 서열 가지 Asn-Pro-Asn-Gly-Ile와 처음 200 아미노산내에서의 몇 개의 짧은 가지들을 공통적으로 함유하였다.
[실시예 2]
HMW1-사상체 혈구응집소 관계를 더 알아보기 위해서, HMW1-4 재조합 단백질(rHMW1)에 대하여 얻어진 항혈청이 정제된 사상체 혈구응집소을 인식할 수 있는지 실험되었다. rHMW1 항혈청에 의하면 사상체 혈구응집소와의 ELISA의 반응성은 투여량에 달려있다. 미리 면역된 토끼의 혈청이 이 실험에서 최소 반응성을 가졌다. rHMW1 항혈청은 또한 웨스턴 블랏 검침에서 조사되어서 정제된 사상체 혈구응집소와 약하지만 양성반응을 보였다. HMW1 유전자 생성물에 해당하는 천연의 헤모필루스 단백질을 알아내고 HMW1 클로닝된 유전자 생성물과 항원적으로 연관된 단백질들이 다른 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통들에 있어서 어느정도 일반적인가를 알아보기 위해서 헤모필루스 계통들의 패널이 rHMW1 항혈청을 사용한 웨스턴 블랏에 의해 스크린되었다. 항혈청은 HMW1과 HMW2 유전자의 잠정적인 성숙된 단백질 생성물인, 유사한 계통 12의 125와 120kDa의 단백질 밴드를 인식하였다.
상이한 비정형 헤모필루스 계통들을 스크린하는데 사용되었을 때, rHMW1 항혈청은 125개의 역학적으로 관련이 없는 계통들중 75에서 고분자량 단백질들을 인식하였다. 일반적으로, 항혈청이 각 상이한 계통들의 100 내지 150-kDa 범위의 하나 또는 두 개의 단백질 밴드들과 반응함에 있어서 비슷한 패턴을 가지나, 유사한 계통에서 보이는 것과 동일하지 않다.
모노크로날 항체 X3C는 백일해균의 사상체 혈구응집소에 대한 쥐의 IgG항체이다. 이 항체는 백일해균 세포들이 배양중인 중국 햄스터 난소세포들과 HeLa 세포들에 결합하는 것을 방해하고, 사상체 혈구응집소를 정제하여 적혈구의 혈구응집을 방해한다. 이 모노크로날 항체가 상기의 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통들의 동일한 패널에 대해 스크린된 웨스턴 블랏 검정이 수행되었다. 모노크로날 항체 X3C는 재조합-단백질 항혈청에 의해 인식된 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통 12 내의 두 고분자량 단백질을 인식하였다. 뿐만아니라, 모노크로날 항체는 재조합-단백질 항혈청에 의해 인식된 것과 동일한 상이한 비정형 헤모필루스 인플렌쟈의 부분내의 단백질 밴드들을 인식하였다. 때때로, 사상체 혈구응집소 모노크로날 항체는 재조합-단백질 항혈청에 의해 인식되었던 단지 하나나 두 개의 밴드들을 인시고하는 것으로 보인다. 전체적으로, 모노크로날 항체 X3C는 rHMW1 항혈청에 의해 인식된 것과 동일한 고분자량 단백질 밴드들을 인식하는데 그 정도가 본 발명의 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통들의 집합의 35정도이다.
[실시예 3]
HMW1이나 HMW2 발현을 못하는 돌연변이체가 박테리아 유착성에서의 이러한 단백질들의 역할을 조사하기 위해 제조되었다. pHMW1-14(실시예 1, 제5(a)도)가 BamHI로 분해되고 pUC4K로부터의 1.3-kh BamHI조각에 분리된 카나마이신 카셋트에 연결되었다. 결과적인 플라스미드(pHMW1-17)는 XbaI에 의한 분해에 의해 선형화되고, 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통 12내로 전이되고 카나마이신 저항 클론들이 선택된다. 일련의 이러한 클론들의 서던분석에 의하면, HMW1 구조유전자내의 삽입을 가진 것과, HMW2 구조유전자내의 삽입을 가진 것의 변형체들의 두가지 집단이 있음이 밝혀졌다. 각 클래스들로부터 하나의 돌연변이체가 선택되어졌다.
두 단백질을 발현할 수 없는 돌연변이체가 다음의 계획에 의하여 만들어졌다. pHMW1-15내의 HMW1 구조유전자의 3'부위에 위치한 두 EcoRI 부위들사이의 2.1-kb DNA 조각을 삭제한후에 pUC4K로부터의 카나마이신 카셋트가 1.3-kb EcoRI 조각으로서 삽입되었다. 결과적인 플라스미드(pHMW1-26)은 XbaI에 의한 분해에 의해 선형화되고 계통 12내로 전이된후, 다시 카나마이신 저항클론들을 위한 선택이 행해졌다. 이러한 클론들의 대표적인 시료들의 서던분석에 의하면, 8가지 경우중에 7가지에 있어서, 두 HMW1과 HMW2 위치에의 삽입이 일어났다는 것이 밝혀졌다. 그러한 돌연변이중 하나가 선택되어졌다.
의도되는 표현형을 확인하기 위하여, 돌연변이된 계통들이 재조합 HMW1 단백질에 대한 폴리크로날 항혈철을 사용한 웨스턴 블랏 분석에 의해 조사되었다. 부모계통은 125-KD HMW1과 120-KD HMW2로 둘다를 발현하였다. 반면에, HMW2 돌연변이체는 120-KD 단백질 발현을 못하였고, HMW1돌연변이체는 125-KD 단백질을 발현하지 못하였다. 이중 돌연변이체는 두 단백질 모두를 다 발현하지 못하였다.전체 세포용해물과, 외막측면들, 클론 형태등 다른 점에 있어서는 원래의 계통과 돌연변이들이 서로 동일하였다. 전자현미경에 의하면 4가지 계통들중 어느 것도 필리(pili)를 가지지 않았다.
와일드 타입 계통 12의 Chang 상피 세포들에 대한 부착능력이 조사되었다. 그러한 조사에서 박테리아가 접종되어 브로스로 된후 2×109cfu/의 밀도로 배양되었다. 약 2×107cfu가 상피세포 단일층위로 접종되었고 플레이트들은 박테리아와 상피표면의 접촉을 용이하게 하기 위해서 165×g에서 5분간 약하게 원심분리하였다. 5CO2내의 37℃에서 30분동안 배양한후에 단일층은 부착되지 않은 유기체를 제거하기 위해서 PBS로 5번 헹구어지고 플라스틱 지지대로부터 분리하기 위하여 PBS내 트립신-EDTA로 처리되었다. 내용물은 흔들어지고, 희석액들은 고체매개물에 씌워져서 단일층당 부착된 박테리아의 수를 산출한다. 부착백분율은 단일층은 부착된 cfu의 수를 접종된 cfu수로 나누어서 계산한다.
아래의 표 1(명세서의 후단에 표시됨)에서 나타난 바와같이, 이 계통은 접종된 것의 90가 단일층에 결합하여 상당히 효율적으로 부착한다. HMW1을 발현하는 돌연변이체의 부착은 상당히 효율적이며 와일드타입계통과 견줄만하다. 반면에, HMM1을 발현하지 않고 HMW2을 발현하는 돌연변이체의 부착은 와일드타입에 비해 15배 정도 감소하였다. 이중 돌연변이(HMW1/HMW2)에 의한 부착은 더 감소되는데 와일드타입에 비하면 50배, HMW1 돌연변이체에 비하면 3배가 감소되었다. 전체를 고려해 보았을 때, 이러한 결과들은 HMW1 단백질과 HMW2 단백질이 모두 Chang 상피 세포들에 대한 부착에 영향을 미친다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, 이러한 세포라인에 대한 적절한 부착은 HMW2가 아닌 HMW1을 필요로 한다는 것이다.
[실시예 4]
플라스미드 pHMW1-16과 pHMW1-17(실시예 3)과 실시예 3에서 설명된 바와같이, 계통 12에 적용된 아래와 같은 절차를 사용하여 카나마이신 유전자를 hmw1-유사(hmw3으로 지정됨)위치에 삽입된 제1돌연변이, hmw2-유사(hmw4로 지정됨) 위치에 삽입된 제2돌연변이, 두 위치에 다 삽입된 제3돌연변이의 세가지 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통 5 돌연변이들이 분리되었다. 예상되는 바와같이, 웨스턴블랏 분석에 의하면 카나마이신 카셋트가 hmw1-유사위치에 삽입된 돌연변이체는 HMW3 125-KD 단백질의 발현을 상실한 반면, hmw2-유사 위치에 삽입된 돌연변이체는 HMW4 123-KD 단백질 발현을 못하였다. 이중 삽입에 의한 돌연변이는 두 고분자량 단백질을 발현시킬 수 없었다.
아래의 표 1에서 보이는 바와같이, 와일드 타입 계통 5는 단일층당 80의 접종량이 부착되는 높은 수준의 부착성을 보였다. HMW2-유사 단백질을 발현시킬 수 없는 돌연변이체에 의한 부착도 역시 높다. 반면에, HMW1-유사 단백질을 발현할 수 없는 돌연변이체에 의한 부착은 와일드타입에 비하여 5배 정도 감소하였으며, 이중 돌연변이에 의한 부착은 심지어 더 감소되었다(약 25배). 김사-염색된(Giemsa-stained) 시료들의 조사들이 이러한 관찰들을 확인시킨다. 계통 5의 결과들은 계통 12와 HMW1과 HMW2 단백질들에 의한 결과들을 확인시킨다.
[실시예 5]
HMW1과 HMW2 단백질의 부착기능을 확인하고 다른 헤모필루스 인플렌쟈 표면 구조들과 별개의 HMW1과 HMW2의 효과를 조사하기 위해서, hmw1과 hmw2 유전자 클러스터가 각각 플라스미드 pHMW1-14와 pHMW2-21을 사용하여 E. coli DH5α에 도입되었다. 대조군으로 클로닝백터, pT7-7가 또한 E. coli DH5α안으로 전이되었다. 웨스턴 블랏 분석에 의하면, hmw1 유전자들을 함유하는 E. coli DH5α는 125kDa의 단백질을 발현하였고, hmw2 유전자들을 함유한 동일한 계통은 120-kDa의 단백질을 발현하였다. pT7-7를 함유하는 E. coli DH5α는 재조합 HMW1에 대한 항혈청과 반응하지 않았다. 전자현미경에 의하면, 어떠한 E. coli 계통들에서도 필리(pili)나 다른 표피부속물들이 없다는 것이 밝혀졌다.
E. coli 계통들에 의한 부착이 정량화되어 와일드타입 비정형 헤모필루스 인플렌쟈 계통 12에 의한 부착과 비교되었다. 아래의 표 2에서 보이는 바와 같이, 벡터만을 함유하는 E. coli DH5α는 계통 12 값의 1이하이다.
반면에, hmw1 유전자 클러스터를 함유하는 E. coli DH5α는 계통 12에 필적할만한 부착수준들을 보여주었다. hmw2 유전자들을 함유한 E. coli DH5α에 의한 부착은 계통 12에 의한 부착보다 약 6배 낮으나, pT7-7만을 가진 E. coli DH5α에 의한 부착보다 20배 증가하였다. 이러한 결과들은 HMW1과 HMW2 단백질들이 독립적으로 Chang 결막세포들에 대한 부착을 매개할 수 있다는 것을 가르킨다. 이러한 결과들은 실시예 3과 4에서 보고된 헤모필루스 인플렌쟈 돌연변이체에서의 결과와 일치하며, Chang 상피세포에 있어서 HMW1이 HMW2보다 더 효과적으로 접착물이라는 것을 나타낸다.
pT7-7, pHMW1-14, pHMW2-21을 함유한 E. coli HB101에 의한 실험들은 DH5α 유도체들에서 얻어진 결과들을 확인시킨다(표 2 참조).
[실시예 6]
HMW1과 HMW2가 비정형 헤모필루스 인플렌쟈(NTHI) 계통 12로부터 아래와 같이 분리정제되었다. 얼려진 저장배양으로부터의 비정형 헤모필루스 박테리아를 초콜렛판에 줄무늬로 놓은 후에 5CO2의 인큐베이터내에서 37℃로 밤새 길러졌다. 10/의 각 헤민과 NAD가 보충된 뇌심장 융합(BHI) 브로스의 스타터 배양 50에 초콜렛 판위에서 길러진 배양을 주입하였다. 스타터 배양은 광학밀도(O.D-600nm)가 0.6 내지 0.8에 도달할 때까지 길러지고, 스타터 배양내의 박테리아는 각각 8 내지 10씩 BHI가 보충된 6개의 500플라스크에 주입되었다. 박테리아는 500플라스크내에서 O.D.가 1.5 또는 그 이상 되도록 5 내지 6시간동안 더 길러진다. 배양들은 10,000rpm에서 10분동안 원심분리되었다.
박테리아덩어리들은 0.5M Nacl, 0.01M Na2EDTA, 0.31M Tris, 50μM 1.10-페난쓰롤린, pH 7.5의 추출용액 250에 다시 분산되었다. 세포들은 초음파로 처리되지 않거나, 다른 방식으로 파괴되지 않았다. 재분산된 세포들은 60분동안 0℃ 얼음위에 놓여졌다. 재분산된 세포들은 대부분의 손상되지 않은 세포들과 세포파편들을 제거하기 위해서 4℃에서 10분간 10,000rpm으로 원심분리되었다. 부유물이 모아지고 4℃에서 100,000xg로 60분동안 원심분리되었다. 부유물이 재수집되고 0.1M 나트륨 포스페이트, pH6.0에 대해서 4℃에서 밤새 투석되었다.
시료는 투석중에 용액으로부터 침전된 불용성 파편들을 제거하기 위해서 4℃에서 10분간 10,000rpm으로 원심분리되었다. 부유물은 0.01M 나트륨 포스페이트, pH6으로 미리 평형된 10CM 세파로스 칼럼에 적용되었다. 이 칼럼에 적용시킨후에, 0.01M 나트륨 포스페이트로 칼럼을 세척하였다. 단백질들은 0.01M Na 포스페이트, pH6내의 0-0.05M kcl 그렌디언트를 사용하여 칼럼으로부터 상승되었고, 부분들은 젤 조사를 위해 수집되었다. 칼럼부분들의 코마시(Coomassie) 젤들이 그러한 부분들이 고분자량 단백질들을 함유하는지를 알아보기 위해 수행되었다. 고분자량 단백질들을 함유한 부분들이 모여지고 젤 여과 칼럼에 시료를 적용하기 위해 1 내지 3로 농축되었다. 세파로스 CL-4B 젤 여과 칼럼이 포스페이트-완충된 식염수, pH7.5로 평형되었다. 농축된 고분자량 시료들이 젤 여과 칼럼에 적용되고 칼럼부분들이 수집되었다. 코마시(Coomassie) 젤들이 고분자량 단백질을 함유한 칼럼부분들을 알아내기 위해서 수행됐다. 고분자량 단백질들을 함유한 칼럼부분들이 모여졌다.
단백질들은 유사한 계통에 의한 실험적인 중이염에 대하여 예방적인지를 결정하기 위해 시험되었다.
친칠라들이 프런드의 면역보강제와 함께 40의 HMW1-HMW2 단백질 혼합물을 한달에 한번씩 3회 피하로 주입되었다. 최종 주입후 한달후에 동물들은 NTHI 계통 12의 300cfu의 접종으로 도전을 받았다.
5대조군 동물중에서는 5 동물이 감염되었음에 비하여 10 면역된 동물중에는 5 동물이 감염되었다. 감염된 동물들에서, 도전 7일후 중이액의 기하학적 평균 박테리아수가 대조군에서는 7.4×106이고 면역된 동물에서는 1.3×105이었다.
면역에 따르는 혈청항체양은 감염된 동물과 감염되지 않은 동물에 있어서 필적하였다. 그러나, 면역화된 동물에서의 감염은 HMW 단백질 발현에서 박테리아 하향-조절의 외형과 일정하게 관련되어 있고, 이는 면역학적 압력에 대응하는 박테리아 선택을 암시한다.
이 데이터가 면역후의 보호가 완벽하지 않다는 것을 보여주더라도, 이 데이터는 HMW 부착 단백질들이 다성분 NTHI 백신을 구성할 수 있는 보호적인 중요한 항원이 될 가능성이 있음을 암시한다.
[실시예 7]
HMW1으로부터 많은 합성펩티드들이 유도되었다. 항혈청들이 이러한 펩티드들에 대해 길러졌다. 펩티드 HMW1-P5에 대한 항혈청이 HMW1을 인식하는 것으로 밝혀졌다. HMW1의 아미노산 1453 내지 1481을 덮는 펩티드 HMW1-YP5는 서열 VDEVIEAKRILEKVKDLSDEEREALAKLG(서열 번호 9)을 가지며 제10도에서 1498 내지 1576 염기들을 나타낸다.
이러한 결과는 DNA 서열과 유도된 단백질이 올바른 리딩프레임에서 해석되도 그 서열로부터 면역원적인 펩티드들이 생산된다는 것을 증명한다.
[명세서의 요약]
본 발명은 비정형 헤모필루스의 고분자량 단백질들과 그러한 단백질과 동일한 것들과 그러한 단백질을 함유한 백신들을 코딩하는 유전자들을 제공한다. 본 발명의 범위내에서 수정들이 가능하다.
Claims (7)
- 하기 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이며, 어느형에도 속하지 않는 인플렌쟈균주의 고분자량 단백질을 코드화한 유전자로, 분리 및 정제된 유전자.(a) 하기 DNA서열을 가지던가,하기 유도아미노산 서열을 코딩한,HMW1 단백질을 코딩한 유전자,(b) 하기 DNA서열을 가지던가,하기 유도아미노산 서열을 코딩한,HMW2 단백질을 코딩한 유전자,(c) 하기 부분DNA서열을 가지던가,하기 유도아미노산 서열을 코딩한,HMW3 단백질을 코딩한 유전자,(d) 하기 DNA서열을 가지던가,하기 유도아미노산 서열을 코딩한,HMW4 단백질을 코딩한 유전자.
- 하기 (a) 내지 (b)로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이며, 어느형에도 속하지 않는 인플렌쟈균주의 고분자량 단백질을 코드화한 구조유전자의 뉴클레오타이드 서열과, 상기 구조유전자에 의해 완전히 코드화된 유전자산물을 효과적으로 표현하기 위한 부유전자의 적어도 하나의 하류 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 유전자 클러스터로, 정제 및 분리된 유전자 클러스터. (a) HMW1 단백질 및 두 개의 하류 액세서리 유전자를 코딩하고 있으며, 동시에 하기 DNA서열을 가지는 DNA서열.(b) HMW2 단백질 및 두 개의 하류 액세서리 유전자를 코딩하고 있으며, 동시에 하기 DNA서열을 가지는 DNA서열.
- HMW1, HMW2, HMW3 및 HMW4 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 형에도 속하지 않는 인플렌쟈균의 고분자량 단백질로서, 청구항 20에 기재된 유전자에 의해 코딩하는 있는 것.
- 제3항에 있어서, 분자량 125kDa를 가지는, HMW1인 고분자량 단백질.
- 제3항에 있어서, 분자량 120kDa를 가지는, HMW2인 고분자량 단백질.
- 항원, 합텐 또는 다당류에 링크시켜, 상기 항원, 헵텐 또는 다당류에 대한 면역반응을 유도시키기 위한 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 단백질로 이루어지는 공역체.
- 제6항에 있어서, 상기 다당류가 인플렌쟈균b형에 대하여 방어효과를 가지는 다당류인 공역체.
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