JPS60248623A - 緑膿菌感染に対してワクチン活性を有するリポ糖蛋白ｐｓｃ―ａおよび緑膿菌ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の目的） 本発明は、緑肩菌から得られる緑艮菌感染に対して防御
活性を有するリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａに関する。

緑騰ｌ（以下、シー−トモナス・アエルギノーサという
ことがある）は、本来弱毒性の病原菌として知られてい
るが、近年の抗生物質の大量投与による菌交代性増殖の
結果と相まって、他の細菌感染症とは反対に緑鼻菌感染
による症例の増加が目立つようになって来ている。

緑亀菌感染症の特徴は、基礎疾患として感染抵抗力の低
下した患者に発病しやすいことで、いわゆる日和見感染
症の代表的疾患にあげられている。感染抵抗力の低下し
た患者とは、具体的には癌患者、免疫抑制療法下の患者
、移植患者、熱傷患者および新生児などである。

また、重曹による感染症は、いったん発病すると全身感
染症にひろがる傾向が強（、さらに予後が不良のため、
今日では細菌感染症の中で最も治療の困難な感染症の１
つとされるに至っている。

この緑慝菌感染症が難治性であるのは、重曹がこれまで
常用されて来た抗生物質のほとんどすべてに対して高度
耐性を示すことに加えて、近年開発された緑亀菌にある
程度抗菌力を示す抗生物質に対しても耐性となり易く、
こうした抗生物質による薬剤療法では十分な治療効果が
得られない症例がしばしば出現することも見逃せない大
きな理由である。

こうした緑東菌感染症に対する抗生物質゛療法の限界に
立って、宿主側の緑艮菌処理能力の増強をめざして、緑
東菌菌体成分による感染防御剤すなわち、ワクチンの開
発に関するいくつかの試みがこれまでになされて来てい
る。

例えば、１３種類以上ある血清型別特異抗原の表在抗原
（血清型別特異抗原）をそれぞれ精製して混合した全血
清型苗に有効な緑市菌多価ワクチアＰＥＶ−０１（’Ｌ
ａｎｃｅｔ　ＩＩ　：９７７、１９７９）は、熱傷患者
等を対象とする臨床応用が試みられ緑鼻菌、菌血症等の
予防に有効であることが報告されている。

しかしながら、この多価ワクチンは、緑東菌の血清型別
抗原を１０数種混合するという繁雑さばかりでなく構成
成分である血清型別特異抗原は緑處菌細胞表層にある、
いわゆるＯ抗原で、あり、内毒素と呼ばれるリボ多糖体
から構成されているため、強い発熱性などの局所および
全身性の副作用が無視出来ないという問題点が指摘され
ている。

一方我国では重量らによって緑癒菌の血清学的共通抗原
としてタンパク質を主成分とするＯＥＰが分離されこの
ＯＥＰが動物実験で各血清型別緑膿菌に共通の感染防御
抗原としてワクチン効果を示すことが知られている（　
Ｊｐｎ　Ｊ、　Ｅｘｐ、故ｄ；４７．３９３−４０２．
１９７７　）。

しかしながら重量らは、生体に感染する緑朱菌の病原性
には強い株と弱い株があり一定でないことから、新しい
ワクチンは緑聰菌の増殖抑制のみにとどまらず緑膿菌の
産生する有毒代謝産物を中和するものでな（ではならな
いとの考えのもとに、ＯＥＰ単用による感染防御では不
十分であり、ＯＥＰにさらに緑處菌から調製したプロテ
アーゼトキソイド、エラスターゼトキソイドあるいはエ
クソトキシントキソイドを加えた６種あるいは４種混合
ワクチンを調製し臨床治験を実施しているが、一部に有
効例の指摘があるものの未だ実用化される段階に至って
いない。

また、その他の緑東菌ワクチンとして血清型別の菌に特
異的な作用を示すといわれるリボゾームワクチン、粘膜
表面への吸着に着目した線毛ワクチンあるいは菌の動き
を止めるといわれる鞭毛ワクチンなどが知られている力
瓢これらは未だいずれも実験段階の域を脱していない。

したがって、現在なお実用性のあるすぐれた線菌感染に
対するワクチンの出現が待望されているといって過言で
ない。

しかるに、本発明者らはかねてより単剤で緑賑菌感染に
対して強力な防御能を発揮する緑太菌の全血清型菌に共
通に作用する新しい感染防御抗原を追求して来たが、そ
の過程において緑艮菌の全血清型菌に共通に反応するモ
ノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマの作
成に成功し、当該モノクローナル抗体に対応する緑靭菌
菌体成分が緑基菌のいずれの血清型菌の感染に対しても
高い感染防御能を有することを初めて見い出した。

すなわち本発明者らは、緑珠菌で免疫したマウスの　細
胞とマウスミエローマ細胞との細胞融合による抗緑憲菌
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマの作成研究にお
いて、緑珠菌の全血清型菌に対して共通に反応するモノ
クローナル抗体産生ハイプリドーマ株（以下Ｃ−Ａｂ産
生ハイプリドーマという）の作成に成功した。さらに、
このＣ−Ａｂ産生ハイブリドーマの産生するモノクロー
ナル抗体（以下Ｃ−Ａｂという）に対応する緑λ菌の菌
体成分をＣ−Ａｂを固定化したアフィニティヵラム等を
用いて分離精製した結果、得られたＣ−Ａｂと反応する
本発明物質の緑瓢菌の共通抗原成分がリポ糖蛋白からな
る全く新規な物質であることならびに該物質が動物実験
で緑未菌の各種血清型菌に対してすぐれた感染防御能を
示しかつ極めて毒性が低いものであることを見い出し、
本発明物質をＰＳＣ−Ａと命名し、本発明を完成するに
至った。

以下、本発明物質を単に本物質又はＰ　Ｓ　Ｃ−Ａと称
することが多い。

本発明は、緑Ｉ感染に対して防御活性を有するリポ糖蛋
白ＰＳＣ−Ａに関し、さらに詳細には緑弊菌より得られ
る感染防御活性を有するリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａに関し、
そしてその製法および緑癒菌感染防御剤に関するもので
ある。

さらＫ、本発明は、緑疼菌菌体を破砕して遠心分離して
得られる無細胞抽出液から、リポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａに対
して特異的な親和性を有するモノクローナル抗体を固定
化したアフィニティカラムを用いて、単離精製すること
を特徴とする緑珠菌感染に対して防御活性を有するリポ
糖蛋白ＰＳＣ−Ａの製造法に関する。

さらに、本発明は、リポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａをイ効成分と
する緑島、菌感染防御剤に関するものである。

また、本発明の目的は、緑島菌から単離されるリポ糖蛋
白ＰＳＣ−Ａを有効成分とする緑ス菌感染に対する防御
斉１を動物ならびにヒトのワクチン療法に提供すること
にある。

（本発明の構成） つぎに本発明について具体的に説明する。

本発明に用いられる緑纂菌は血清学的分類法に従って例
示すると第１表の通りである。緑秦菌の分類固定に関し
ては昨今異論がなしとはしないが、本発明では、使用緑
朱菌の分類を緑４菌研究会主催の型別検討委員会の決定
（１９７５年）による血清学的分類に従うものとし、こ
の分類に基づ（Ａ−Ｍ群に属する菌株はすべて本発明に
述べる緑艮菌の血清型菌の対象になる。

なお、本発明では緑を菌の分類法として型別検討委員会
の決定による血清学的分類を現時点での最善のものと判
断してそれに従っているが、将来において新分類基準が
採択されることを考慮した場合、本発明の緑１１ｍとは
本物質ＰＳＣ−Ａを感染防御抗原てして保有する細菌菌
株すべてがその対象になると言える。

したがって本発明の対象菌株は、上記Ａ　−Ｍ群に属す
るものあるいはこの分類基準に従って分類しうるものの
みに限定されるものではない。

緑艮菌から本発明のＰＳＣ−Ａを本発明の方法により単
離する場合、第１表の菌株のいずれを用いてもかまわな
いが、経験的にはシュードモナス・アエルギノーサｌＩ
Ｄ１１５０、Ｆ４８５Ｂ−５２、Ｎ−１０（以上Ｅ型）
、シュードモナス・アエルギノーサＡＴＣＣ１’０１４
５．ｌＩＤ１０２０（以上Ｇ型）、シュードモナス・ア
エルギノーサｌＩＤ１０１０、　ＣｈｉｂａＮ−５５２
２（以上■型）などが好適な菌株として挙げられる。

なお、第１表に例示したＡ−Ｍ群に属する緑剪−菌の菌
株のうち、ＩＩＤ株は東京大学医科学研究所に保存され
ており第三者に自由に分譲される。

第１表 ｌＩＤ５００４ Ｃ〃　ｌＩＤ１０３７ Ｄ　ｌＩＤ１００４ Ｅ　ｌＩＤ１１３０．Ｆ−４８５８−５２，Ｎ−１０゜
Ａ１０３ Ｆ　ｌＩＤ１００６．　Ｃｈｉｂａ１４９５Ｇ　ｌＩＤ
１０２０．　ＡＴＣＣ１０１４５，ＣｈｉｂａＮ−３１
８４，Ｐ２８ ＨｌＩＤ１００９ Ｉ　ｌＩＤｌ０ＩＯ，ＣｈｉｂａＮ−３５２２Ｊ　ｌＩ
Ｄｌ０ＩＩ Ｋ　ｌＩＤ１０１２ １、　ｉ　Ｉ　Ｄｌ　ｏ　ｉ　４ Ｍ　１ＩＤ５０１＆ まに、本発明の製造方法であるアフィニティ力ラムに組
み込みｐ　Ｓ　Ｃ−Ａの単離精製に用いるＰＳＣ−Ａに
特異的な親和性を有するモノクローナル抗体Ｃ−Ａｂの
調製法ならびにＣ−Ａｂの性質は、試験例１に示す通り
である。

試験例１　モノクローナル抗体Ｃ−Ａｂの調製とその性
質 モノクローナル抗体産生・・イブリドーマの作成はに８
ｈｌｅｒ、　Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎらの公知の方法に準じ
て行なった。１−なわち、シュードモナス・アエルギノ
ーサｌＩＤ１１３０（Ｅ型）の０３％ホルマリン処理菌
体をフロイントの不完全アジ−パントでエマルジョンと
し、１週おきに計５回ＢＡＬＢ／Ｃ雌雄マウスの腹腔内
に投与して免疫した後、最終免疫の４日後のマウスの　
細胞５Ｘ１０８個とＮ５−１マウスミ工ローマ細胞５Ｘ
１０７個との５０％ポリエチレングリコール存在下にお
ける細胞融合によって得られたノ・イブリドーマを９６
穴ウエル平底プレートに分注しＨＡＴ　（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジン含有）を添加した１
０％牛脂児血清カロダルベノ＝Ｉ　ＭＥＭ培地で５％Ｃ
Ｏ２存在下３７℃で培養した。ノ・イブリドーマの増殖
を認めたウェルについて培養上清の抗緑艮菌モノクロー
ナル抗体の存在の有無を酵素免疫測定法であるドノトイ
ムノパインデイングアソセイ法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１９．１４２−１．４７
．１９８２．以下ＤＩＢＡ法という）で測定した。ＤＩ
ＢＡ法は９６穴ウエルＵ底マルチプレートを用い、１ド
ツト当り０．４μ２００．５％ホルマリン処理緑叡菌の
全菌体を抗原として固定したメンブランフィルタ−（３
，，１＋ｍ角）と上記の培養上清１００μｔを室温で６
０分、ついでパーオキシダーゼ標識ウザギ抗マウスイム
ノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製）と３０分反応後クロ
ルナフトールを基質として発色させ、抗原を固定したメ
ンブランフィルタ−上に肉眼観察で発色を認めたものを
抗体産生が陽性と判定した。

培養上清にモノクローナル抗体産生が認められたハイプ
リドーマはさらに限界希釈法でクローニングを行ない、
モノクローンになったノ・イブリドーマはフラスコで増
殖させた後、免疫抑制剤プリスタン（アルドリッチ社）
処置ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹先内に移植し得られたマウ
ス腹水カラフロティンへ−セファロース（ファルマシア
社）のアフィニティカラムを用いてモノクローナル抗体
を精製した。かくして得られた種々の抗緑膿菌モノクロ
ーナル抗体産生ハイプリドーマの中から、本発明者らは
緑幕菌のすべての血清型菌と共通に反応するモノクロー
ナル抗体Ｃ−Ａｂを産生ずるＣ−Ａｂ産生ハイブリドー
マを見い出した。このｃ−ＡｂのグロブリンクラスはＩ
ｆＧであり、またＤＩＢＡ法によるＣ−Ａｂの緑東菌の
血清型・菌に対する反応性を例示すると第２表の通りと
なり、Ｃ−Ａｂはいずれの血清型菌ともはｙ等しい親和
性を示したが、緑幕菌以外の細菌とは反応しなかった。

また、Ｃ−Ａｂは緑癒菌Ｅ型菌由来の内毒素（リポ多糖
体、シェードモナス・アエルギノーサＮ−１０株よりモ
リノン法により自家調製）およびＯＥＰ　（シー−トモ
ナス・アエルギノーサＮ−１０株より重量らの方法で自
家調製）とも反応しなかった。したがってこのことは本
発明物質ＰＳＣ−Ａはこれらの物質とは免疫学的に異な
る性質をもつことを示している。

上述の試験例１に示すＣ−Ａｂは詳細を後述するように
緑腋菌から本発明物質ＰＳＣ−Ａを簡便かつ高収率に製
造するに際して不可欠な精製手段になるが、通常アフィ
ゲル−１０（バイオラド社）　ヤＢｒ　ＣＮ−セファロ
ース（ファルマシア社）等の担体に固定化して用いるの
が好適である。

なお、本発明のＰＳＣ−Ａの製造に用いる抗体は試験例
１０Ｃ−Ａｂのみに限定するものではな（、ＰＳＣ−Ａ
に特異的な親和性を有する抗体であれば本発明の方法に
適合する。例えば後述の実施例１〜６で単離されたＰＳ
Ｃ−Ａで新たに免疫された動物あるいはＰＳＣ−Ａでｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ刺激された動物またはヒト由来の抗ＰＳ
Ｃ−Ａ抗体産生性のＢリンパ系細胞とミエローマ細胞と
の間で細胞融合により形成されるハイプリドーマあるい
は抗Ｐ　Ｓ　Ｃ−Ａ抗体産生能を持つヒトのＢリンパ系
細胞にＥＢウィルスを感染させて継代培養可能な増殖型
に変異させた細胞がそれぞれ産生ずるＰＳＣ−Ａに特異
的な親和性を有するモノクローナル抗体あるいはそれら
の抗体混合物さらにはＰＳＣ−Ａ免疫動物の血清から得
た抗ＰＳＣ−Ａポリクローナル抗体も本発明の製造方法
に適合するものである。

つぎに、本発明物質のＰＳＣ−Ａを得るための基本的な
製造法について述べる。Ｐ　Ｓ　Ｃ−Ａの取得に用いる
緑東菌菌株は前述の通りであり、緑東菌の培養方法や菌
体の破砕方法は、通常の方法に従ってよい。培地は、市
販のハートインツユジョンブロス、プレインハートイン
フュージョンプロス（栄研化学製）、肉エキスペプトン
培地あるいは自家調製の不問らの合成培地（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　８３．７１１−’＋　８
．１９７８　）が用いられる。特に不問らの合成培地は
培地成分として高分子の蛋白質などを含まないため、菌
体成分への培地混入の影響がない点で好適である。

培養温度や培地のＰＨは使用した緑叛菌が生育する範囲
であればよいが温度は２５°Ｃ−３７°Ｃ，ＰＨ６５〜
８５０間で培養するのが好ましい。培養は好気的条件で
行なうのがよ（、例えば振とう培養もしくは培養槽内で
の通気攪拌培養を行なえばよい。培養時間は緑（両画体
中のＰＳＣ−Ａの収量に影響するので１０時間〜７２時
間の範囲で適宜選択すればよいが通常は１６〜２４時間
が好ＥＥ　Ｌい。例えば不問らの合成培地（ＰＨ７，４
）で３７’Ｃ，２０時間娠と５培養することにより良好
な緑象菌培養物が得られ、これを遠心分離またはｉｒＡ
して菌体を得ることが出来る。この時菌体を少量のホル
マリンで処理して死菌体として回収することも可能であ
る。得られた菌体は水好ましくは適当な緩衝液と充分混
合し氷冷しながらダイノミル（ＤＹＮＯＭＩＬＬ）　あ
るいはフレンチプレスなどにより菌体を破砕して破砕菌
体懸濁液を得る。この懸濁液をデカンテーションならび
に遠心して本発明物質ＰＳＣ−Ａを含む無細胞抽出液を
得るが、このときの遠心分離の条件は、未破砕菌体、部
分的に破砕された菌体、細胞壁不溶性画分等を沈渣とし
て除去出来る通常の遠心力でよく、たとえばろ９．ＤＤ
ＤＸ５’３０分間遠心してその上清を取得する。なお、
上述の緑東菌を機械破砕して破砕菌体懸濁液を得るに際
して、通常菌体成分の抽出に用いられるＴｒｉｔｏｎＸ
−１００などの界面活性剤やＥＤＴＡなとのキレート試
薬を少量緩衝液中に共存させるとｐ　ｓ　ｃ−への抽出
率を一層向上させることが出来る。

また、本発明における無細胞抽出液とは破砕菌体懸濁液
から遠心分離により未破砕菌体、部分的に破砕された菌
体、不溶性の細胞壁画分等を出来る限り除いたＰＳＣ−
Ａを含む両分のことである。無細胞抽出液からＰＳＣ−
Ａを得るには無細胞抽出液をイオン交換クロマトカラム
やゲル濾過カラムに付して分画精製？ることも可能であ
るが、本発明の製造法に従いＰＳＣ−Ａに特異的な親和
性を有するモノクローナル抗体、例えばＣ−Ａｂを固定
化したアフィニティ力ラムに無細胞抽出液を付してＰ　
Ｓ　Ｃ−Ａの単離精製を行なうのが簡便かつ高収率であ
る。またＣ−Ａｂで代表されるＰＳＣ−Ａの単離精製に
用いるｐｓｃ−Ａに特異的な親和性を有するモノクロー
ナル抗体は前述のようにアフィゲルやＣＮＢｒ−セファ
ロース等の適当な担体に固定化して用いるのが好適であ
る。無細胞抽出液を付したアフイニティカラムは、ＰＨ
６〜８程度の中性域の緩衝液で十分洗浄して該固定化モ
ノクローナル抗体に結合しないＰＳＣ−Ａ以外のきょう
雑物を溶出させた後、通常抗原−抗体反応物の解離に用
いられる低ＰＨ域の緩衝液例えば５０ｍＭグリシン−Ｈ
Ｃｔ緩衝生理食塩液（ＰＨ６，０）を流入してモノクロ
ーナル抗体に結合したＰ　Ｓ　Ｃ−Ａを解離溶出させる
ことが出来る。得られた溶出液はＰＨを中性に調整した
後蒸留水に対して透析を行ない、さらに凍結乾燥するこ
とにより単離精製された本発明物質のＰＳＣ−Ａ原末が
得られる。

なお、緑寒菌の培養ろ液については通常生菌培養物とし
て菌体を取得する限りにおいては培養Ｐ液中のＰＳＣ−
Ａの濃度は無視し得るものであるが、長時間培養などで
増殖した菌体が死滅したり自己消化などを起して菌体か
らＰＳＣ−Ａが培養Ｐ液に多量移行した場合は培養Ｐ液
を遠心分離して得られる上澄液を前述のＰＳＣ−Ａに対
して特異的な親和性を有するモノクローナル抗体を固定
化したアフィニティカラムに直接付すことにより精製Ｐ
ＳＣ−Ａを回収することが可能である。

また、前述の無細胞抽出液を付したアフィニティカラム
からＰＳＣ−Ａ以外のきよう雑物を効果的に溶出除去す
るには、中性域の緩衝液にＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏなどの
界面活性剤を少量添加してカラムを洗浄することも推奨
される。

つぎに実施例１において精製して得られた本発明物質Ｐ
ＳＣ−Ａについて生物物理化学的性質を調べた結果を示
す。

なお、実施例２および実施例３で得られたＰＳＣ−人も
同様の性質を示している。

本物質リボ糖蛋白Ｐ　Ｓ　Ｃ−Ａの生物物理化学的性質
： （１）分子量 １５．０ＤＤ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法による） なお、下記条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）においてクマシブリリアントプルーＲ２５０で
染色される単一バンドを示す。

Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ条件　結果 ＰＨ９，５７％ゲル　Ｒｆ＝０．８６ ＰＨ９，５１０％ゲル　Ｒ，？”＝０．８０ＰＨ９，５
１２％ゲル　Ｒｆ＝０．７８（２）蛋白質、糖およびヘ
キンサミン含量蛋白質含量％ｌ：２７．０（ローリ−変
法、牛血清アルブミン標準） ２４．０（プロティンパインディ ングアノセイ法、牛血溝アル ブミン標準） ５５０（加水分解によるニンヒ ビリン比色法、牛血清アルブ ミン標準） 糖含量（至）：３．０〜５．０（フェノール硫酸法、グ
ルコース標準） ヘキソサミン含量層：１０以下（ロンドル・モルガン法
、グルコサミン標 準） （３）脂質含量ｆｆｉニア、０〜１［１，（Ｉｆ（プリ
フψダイエルの変法） 但し、本発明物質のクロロホルム・メタ／−ル抽出物（
プリン・ダイエルの変法）をシリカケルＴＬＣにより石
油エーテル：エーテル：酢酸（８０：２０二１）で展開
し、５０％硫酸加熱反応により発色させるとき、呈色を
原点に認める。

（４）性状、溶解性 淡黄色粉末であり、水、生理食塩液およびリン酸緩衝液
に可溶である。水に対する溶解度ハ１＋ｖ／−以上であ
る。メタノール、エーテル、ヘキサンおよびクロロホル
ムにはほとんど溶けない。

（５）呈色反応 ローリ−・フォリン反応、ニンヒドリン反応、フェノー
ル硫酸反応、アンスロン硫酸反応は陽性。エルシンモル
ガン反応は陰性。

（６）等電点 ｐｌ＝３．８〜４．２（等電点電気泳動法）（７）安定
性 中性の水溶液中で、室温において２４時間以−Ｆ安定で
ある。

（８）紫外部吸収スペクトラム 第１図に示す通り２７２　ｎｎ〕附近に極太吸収を示す
。

（９）酵素活性 カゼイ／およびコラーゲンに対する分解活性を示さない
。

（ＩＮ？性 １）マウス結合繊由来培養細胞株のＬ細胞に対して本発
明物質１０μ２／−で、また正常マウス　由来培養白血
球細胞に対して本発明物質２μ！ｉ′／ｒｎｌでそれぞ
れ２４時間培養するとき直接細胞障害作用を示さない。

１１）生理食塩液に溶解した本発明物質またはフロイン
トの不完全アジュバントあるいは完全アジ−パントに懸
濁した本発明物質はいずれもマウス免疫するとマウス血
清中に緑豚菌と反応する液性抗体が出現する。

１１１）本発明物質に対して特異的な親和性を有するマ
ウスモノクローナル抗体は公知の緑巻菌共通抗原ＯＥＰ
および緑東菌内毒素（リボ多糖体）と反応しない。

本発明物質を縁巻菌感染に対する防御剤として用いる場
合は、注射剤の型で用いるのが好ましい。本発明物質は
単独あるいは通常用いられる添加剤、賦型剤を加えて液
剤あるいは同時溶解型の凍結乾燥製剤として適用可能で
ある。また、本発明物質は水中油滴型あるいは油中水滴
型のエマルジョンとして、さらには人工的に調製可能な
リン脂質、コレステロール等から構成されるリボゾーム
の中に封入するかあるいはりポゾームの膜の外表面上に
突起物として固着させることによっても適用可能である
。

本発明物質の用量、投与経路は適宜選択されるが用量は
体重Ｋｇあたり０．００１ないし１０ｍ７が好ましく、
投与経路は皮内、皮下、静脈内、腹内投与が可能である
。

本発明物質はマウスやモルモットに対して免疫すると、
血清中に高単位に緑勝菌に対する液性抗体の産生を誘導
するといういわゆるワクチンが具備すべき抗原特性を有
している。

さらに、本発明物質は動物における緑蓼菌感染に対して
強い防御活性を示す。例えば本発明物質の投与により免
疫されたマウスでは、各種血清型の緑豚菌の致死量感染
に対しても感染死を免かれ生存するという劇的な感染防
御効果が認められる。

一方、本発明物質の急性毒性はマウスに対する静脈内投
与による体重に９あたりの５０％致死量Ｌｌ）５０値が
５ｑ／Ｋｒ以上であることから低毒性であり、ワクチン
療法に好適である。また、特許請求の範囲に示したよう
に本発明物質は動物の細胞に対しても比較的高濃度にも
か匁わらず直接細胞障害作用を示さないことは本物質の
１つの有利な特性と言える。

以上の種々の知見から本発明物質ＰＳＣ−Ａｔま緑幕菌
感染に対する防御剤として極めて有用なものと考えられ
る。

、−、−、−、−！ｔａｘｎｏｌｌＪ＋ＭＭ４１１ｍｌ
＆ｂ＄−１ｍ！ＩｔＩｆｆＦｈまた本発明の緑葵、菌感
染に対する防御剤としての有用性を試験例により示１′
。

実施例１　血清型Ｅ型の緑１菌からの本発明物質の製造 グルタミン酸ナトリウム　２０１ グリセリン　５グ Ｍｆ８０４　・７Ｈ２００，１？ ＫＨ２Ｐ　Ｏ４０，５５９ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０５６ｆ Ｃａ　（ＮＯ８）２　・４Ｈ２０１７，２６ｍｆＦｅＳ
Ｏ４・７Ｈ２０’　５０μｓ’ 水を加えて１ｔにし、Ｐ　Ｉ−１７，４にアンモニア水
で調整する。

シュードモナス・アニル、￥／−サｌＩＤ１１３Ｄ（Ｅ
型）を普通寒天培地で３７℃１夜培養し増殖した菌体を
生理食塩液に懸濁しその０．５ｍを上記組成の不問らの
合成培地１５０−を含む坂ロフラスコに接種し６７℃で
１６時間振と５培養した。

培養後板ロフラスコ１本当り１．２＋ｉのホルマリンを
加えて充分混合し室温に１時間放置した。ついで培養液
を遠心分離（１２ＤＯＯＸｆ　３０分間）して菌体を集
め、さらに生理食塩液と蒸留水で洗浄処理と遠心分離を
繰返し湿菌体２９ｆを得た。

この湿菌体を２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００および１０
ｍＭＥＤＴＡを含む２０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−Ｈｃ
ｚ緩衝液（ＰＨ８，０）１２０−に懸濁した後氷冷下Ｄ
ＹＮＯ−ＭＩＬＬ　（ビーズｏ１ｍｉｏ）で６分間破砕
した。この菌体破砕懸濁液は一静置後−ヒ澄液をデカン
テーションにより集め、残渣に上記緩衝液２８０−を加
えてよく攪拌して静置し再びその上澄液をデカンテーシ
ョンにより集めた。デカンテーションにより集めた上澄
液はプールし遠心分離処理（３９００ＤＸ２７）０分間
）して遠心上清約４００１ｎＩ！、を得た。この遠心上
清をアフィゲル−１０（バイオラド社製）を担体として
固定化した本発明物質ｐｓｃ−Ａに対して特異的な親和
性を有するモノクローナル抗体Ｃ−Ａｂを詰めたアフィ
ニティカラム（サイズｌＯ１０Ｘ６０、アフィゲル−１
０１ｍ１に対してＣ−Ａｂ１５＋ｖ結合）に付し、０．
５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００を陰む２　ＤｍＭ　Ｔｒ
ｉｑ−ＨＣ７緩衝液（ＰＨ８，０）　５０ｍ１．２０ｍ
Ｍ　Ｔｒ１５−ＨＣｔ緩衝液（ＰＩ（８，０）５０ｒｎ
１．で１−次カラムを洗浄した後最終的に５０ｍＭグリ
シ７−ＨＣｔ緩衝緩衝生理液塩液ＰＩ−ｆ３．０　）　
３０ｍｌで溶出させた。得られた溶出液は１Ｎ炭酸水素
ナトリウム水溶液で中和後、蒸留水に対して４℃で２４
時間透析を行ない、ついで透析内液を凍結乾燥して本発
明物質ＰＳＣ−Ａ原末を２，０■得た。

実施例２　血清型Ｇ型の緑膿菌からの本発明物質の製造 シュードモナス・アエルギノーサＡＴＣＣ１０１４５（
Ｇ型）を実施例１と同様に不問らの合成培地でろ７℃２
０時間振と５培養し、培養液をホルマリン処理後遠心−
洗浄処理し２て湿菌体２８６１を得た。この湿菌体を実
施例１と全く同一条件でＤＹＮＯ−Ｍ、ＩＬＬによる破
砕、デカンテーションによる上澄液の採集、プールした
上澄液の遠心処理による遠心上清の採集、遠心上清のア
フィニティカラムへの流入および２種類の緩衝液による
洗浄、グリシンーＨＣ１緩衝生理食塩液による溶出、溶
出液の中和、透析および凍結乾燥を順次行ない本発明物
質ＰＳＣ−Ａ３．２〜を得た。

実施例ろ　血清型■型の緑鼻〜菌からの本発明物質の製
造 ンコードモナス・アエルギノーサｌＩＤ１０１０（■型
）を実施例１と同様に不問らの合成培地で６７′し２０
時間振と５培養し、培養液をホルマリン処理後遠心−洗
浄処理を行ない湿菌体ろ０５７を得た。この湿菌体を実
施例１０１０倍のスケールで以下全く同様に処理操作を
行ない、最終的に本発明物質ＰＳＣ−Ａの凍結乾燥品２
８ｍＦを得た。

実施例４　液剤： 実施例２で得たＩ）ＳＣ−Ａｌ■を１０−の生理食塩液
に溶解し、ニュクリボア−ＮＯ２０（ヌクリボア社製）
を用いて無菌濾過した。得られたＦ液を１ｒｎｌずつバ
イアル瓶に無菌的に分注して本発明物質の液剤を得た。

実施例５　凍結乾燥製剤： 実施例ろで得たＰＳＣ−Ａ１０■を１０艷の注射用蒸留
水に溶解し、次に５００〜のマンニトールを加えて溶解
した後ニークリボアーＮＯ２Ｏを用いて無菌濾過した。

得られた原液を１ｍ７！ずつ無菌的にバイアル瓶に分注
した後凍結乾燥して本発明物質の凍結乾燥製剤を得た。

実施例６　エマルジョン剤： 実施例６で得たＰＳＣ−Ａｌ〜を０．５ｍｌの生理食塩
液に溶解し、次にノルマルパラフィン液とアラセ＃　（
Ａｒ１ａｃｅｌんＡｔ１ａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｉ　Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉｅｓ製）の８．５：１．５の混液０．５ｒ
ｎＩ！、を加えて連結注射針を用いて油中水型のエマル
ジョンを得た。

（本発明の効果） 試験例２ 本発明物質のマウスにおける抗原特性 フロイントの不完全アジ−パントと実施例１および２で
得た本発明物質ＰＳＣ−Ａの生理食塩液溶解液をそれぞ
れ等骨混ぜ油中水型のエマルジョンを作成した。

生後８週やのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ雌性マウス１群５匹に
上記本発明物質のエマルジョンを１週間間隔で２回免疫
（１回あたり本発明物質１０μ２／マウス腹取内投与）
し、最終免疫の４日後にマウスから採血しその血清の抗
緑惠菌抗体価を試験例１に述べたＤＩＢＡ法により測定
した。結果は第６表の通りで、本発明物質の免疫により
血清中に高い抗体価が検出された。なお非免疫マウスで
はほとんど抗体価が検出されなかった。

試験例３　本発明物質の緑幕菌感染に対する防御活性（
その１） 試験例２に示した２種類の本発明物質のエマルジョンを
生後８遅々のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス１群５匹に１週間
間隔で２回免疫（１回あたり本発明物質１０μグ／マウ
ス腹欣内投与）し、最終免疫の１週間後に緑鼻菌を感染
させた。感染線菌はシー−トモナス・アエルギノーサＰ
Ａ１０３（Ｅ型）およびＰ２Ｂ　（Ｇ型）の２株とし、
それぞれ・・−トインフユージョン寒天培地（栄研化学
製）に−夜培養後集菌し生理食塩液にて希釈した後５％
ムチンを加え、マウス−匹あたり約５ＬＤｓｏ量を腹胤
内へ接種した。

なお対照群は本発明物質のかわりに生理食塩液のみ投与
した。

緑東菌感染後７日日に生存マウス数を調べて結果をまと
めた。結果は第４表の通りで、本発明物質に感染防御活
性が認められた。

第４表 試験例４　本発明物質の緑朦菌感染に対する防御活性（
その２） 実施例３で得た本発明物質ＰＳＣ−Ａを、生理食塩液に
溶解し生後８週　のＢＡ、ＬＢ／Ｃ雌性マウス１群５匹
に１週間間隔で４回免疫（１回あたり本発明物質２０μ
ｍ／マウス皮下投与）シ、最終免疫の５日後にシュード
モナス・アエルギノーサＰＡ１０３ＣＥ型）およびＰ２
８（Ｇ型）の２菌床をそれぞれ感染させた。感染菌は試
験例６と同様に調製したものをマウス１匹あたり約５Ｌ
Ｄ５０量を腹狡内に接種した。なお対照群は本発明物質
のかわりに生理食塩液のみ投与した。

緑癒菌感染後７日日に生存マウス数を算定した。

結果は第５表の通りで、本発明物質に感染防御活性が認
められた。

第５表 試験例５　急性毒性： １群６匹の生後５週＋ＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウスに生理食
塩液に溶解した実施例６０本発明物質を静脈内投与した
。同様に、大腸菌のＬＰＳ（シグマ社製リポ多糖体、血
清タイプＮｏ０１１１：８４）も静脈内投与した。投与
後２４時間後観察しその結果から本発明物質の静脈内投
与における５０％致死用量ＬＤ５ｏを推定した。Ｌ　Ｄ
ｓｏは第６表の通りで、本発明物質は、ＬＰＳと全（異
なり低い挿性を示した。

第６表

【図面の簡単な説明】

図面は本発明物質の紫外部吸収スペクトラムを示す。 特許出願人　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １緑暮菌感染に対して防御活性を有する下記の生物物理
   化学的性質を示すリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａ。 （１）分子量 １５．０００ （２）蛋白質、糖およびヘキソサミン含量蛋白質含量例
   ：２４〜５５ 糖含量開：６．０〜５．０ ヘキソサミン含量層：１０以下 （３）脂質含量（へ）ニア０〜１０．０（４）性状、溶
   解性 淡黄色粉末であり、水、生理食塩液およびリン酸緩衝液
   に可溶である。水に対する溶解度は１■／−以上である
   。メタノールエーテル、ヘキサンおよびクロロホルムに
   はほとんど溶けない。 （５）呈色反応 ローリー−フォリン反応、ニンヒドリン反応、フェノー
   ル硫酸反応、アンスロン硫酸反応は陽性。エルシンモル
   ガン反応は陰性。 （６）等電点　ｐＩ−３，８〜４．２（等電点電気泳動
   法）（７）安定性 中性の水溶液中で、室温において２４時間以上安定であ
   る。 （軸紫外部吸収スペクトラム ２７２　ｎｍ附近に極大吸収を示す。 （９）酵素活性 カゼインおよびコラーゲンに対する分解活性を示さない
   。 ｏ０特性 １）マウス結合繊由来培養細胞株のＬ細胞に対して本発
   明物質１０μ２／−で、また正常マウス　由来培養白血
   球細胞に対 して本発明物質２μ９／ｒｎ１．でそれぞれ２４時間培
   養するとき直接細胞障害作用を 示さない。 １１）生理食塩液に溶解した本発明物質またはフロイン
   トの不完全アジュバントあ るいは完全アジュバントに懸濁した本 発明物質はいずれもマウスに免疫する とマウス血清中に緑膿菌と反応する液 性抗体が出現する。 １１１）本発明物質に対して特異的な親和性を有ｆるマ
   ウスモノクローナル抗体は公 知の縁態菌共通抗原ＯＥＰおよび緑迄菌内毒素（リポ多
   糖体）と反応しない。 ２、緑膿菌より得られたものである特許請求の範囲第１
   項記載のリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａ。 ６緑億菌菌体を破砕して遠心分離して得られる無細胞抽
   出液からリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａに対して特異的な親和性
   を有する抗体を固定化したアフィニティカラムを用いて
   単離精製することを特徴とする緑１菌感染に対して防御
   活性を有するリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａの製造法。 ４、リポ糖蛋白ＰＳ、Ｃ−Ａを有効成分とする緑λ菌感
   染防御剤。 ５、リポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａが緑床菌菌体より得られたも
   のである特許請求の範囲第４項記載の緑籐菌感染防御剤
   。