JPH0631319B2 - 緑膿菌感染に対してワクチン活性を有するリポ糖蛋白ｐｓｃ―ａおよび緑膿菌ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の目的） 本発明は、緑膿菌から得られる緑膿菌感染に対してワク
チン活性を有するリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａに関する。 緑膿菌（以下、シュードモナス・アエルギノーサという
ことがある）は、本来弱毒性の病原菌として知られてい
るが、近年の抗生物質の大量投与による菌交代性増殖の
結果と相まって、他の細菌感染症とは反対に緑膿菌感染
による症例の増加が目立つようになって来ている。 緑膿菌感染症の特徴は、基礎疾患として感染抵抗力の低
下した患者に発病しやすいことで、いわゆる日和見感染
症の代表的疾患にあげられている。感染抵抗力の低下し
た患者とは、具体的には癌患者、免疫抑制療法下の患
者、移植患者、熱傷患者および新生児などである。 また、本菌による感染症は、いったん発病すると全身感
染症にひろがる傾向が強く、さらに予後が不良のため、
今日では細菌感染症の中で最も治療の困難な感染症の１
つとされるに至っている。 この緑膿菌感染症が難治性であるのは、本菌がこれまで
常用されて来た抗生物質のほとんどすべてに対して高度
耐性を示すことに加えて、近年開発された緑膿菌にある
程度抗菌力を示す抗生物質に対しても耐性となり易く、
こうした抗生物質による薬剤療法では十分な治療効果が
得られない症例がしばしば出現することも見逃せない大
きな理由がある。 こうした緑膿菌感染症に対する抗生物質療法の限界に立
って、宿主側の緑膿菌処理能力の増強をめざして、緑膿
菌菌体成分による感染防御剤すなわち、ワクチンの開発
に関するいくつかの試みがこれまでになされて来てい
る。 例えば、１３種類以上ある血清型別緑膿菌の表在抗原
（血清型別特異抗原）をそれぞれ精製して混合した全血
清型菌に有効な緑膿菌多価ワクチンＰＥＶ−０１（Ｌａ
ｎｃｅｔＩＩ；９７７，１９７９）は、熱傷患者等を対
象とする臨床応用が試みられ緑膿菌、菌血症等の予防に
有効であることが報告されている。 しかしながら、この多価ワクチンは、緑膿菌の血清型別
抗原を１０数種混合するという繁雑さばかりでなく構成
成分である血清型別特異抗原は緑膿菌細胞表層にある、
いわゆるＯ抗原であり、内毒素と呼ばれるリポ多糖体か
ら構成されているため、強い発熱性などの局所および全
身性の副作用が無視出来ないという問題点が指摘されて
いる。 一方我国では本間らによって緑膿菌の血清学的共通抗原
としてタンパク質を主成分とするＯＥＰが分離されてこ
のＯＥＰが動物実験で各血清型別緑膿菌に共通の感染防
御抗原としてワクチン効果を示すことが知られている
（Ｊｐｎ Ｊ．Ｅｘｐ，Ｍｅｄ；４７，３９３−４０
２，１９７７）。 しかしながら本間らは、生体に感染する緑膿菌の病原性
には強い株と弱い株があり一定でないことから、新しい
ワクチンは緑膿菌の増殖抑制のみにとどまらず緑膿菌の
産生する有毒代謝産物を中和するものでなくてはならな
いとの考えのもとに、ＯＥＰ単用による感染防御では不
十分であり、ＯＥＰにさらに緑膿菌から調製したプロテ
アーゼトキソイド、エラスターゼトキソイドあるいはエ
クソトキソイドを加えた３種あるいは４種混合ワクチン
を調製し臨床治験を実施しているが、一部に有効例の指
摘があるものの未だ実用化される段階に至っていない。 また、その他の緑膿菌ワクチンとして血清型別の菌に特
異的な作用を示すといわれるリボゾームワクチン、粘膜
表面への吸着に着目した線毛ワクチンあるいは菌の動き
を止めるといわれる鞭毛ワクチンなどが知られている
が、これらは未だいずれも実験段階の域を脱していな
い。 したがって、現在なお実用性のあるすぐれた緑膿菌感染
に対するワクチンの出現が待望されているといって過言
でない。 しかるに、本発明者らはかねてより単剤で緑膿菌感染に
対して強力な防御能を発揮する緑膿菌の全血清型菌に共
通に作用する新しい感染防御抗原を追求して来たが、そ
の過程において緑膿菌の全血清型菌に共通に反応するモ
ノクローナル抗体を産生するマウスハイブリードの作製
に成功し、当該モノクローナル抗体に対応する緑膿菌菌
体成分が緑膿菌のいずれの血清型菌の感染に対しても高
いワクチン活性を有することを初めて見い出した。 すなわち本発明者らは、緑膿菌で免疫したマウスの脾細
胞とマウスミエローマ細胞との細胞融合による抗緑膿菌
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製研究にお
いて、緑膿菌の全血清型菌に対して共通に反応するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ株（以下Ｃ−Ａｂ産
生ハイブリドーマという）の作製に成功した。さらに、
このＣ−Ａｂ産生ハイブリドーマの産生するモノクロー
ナル抗体（以下Ｃ−Ａｂという）に対応する緑膿菌の菌
体成分をＣ−Ａｂを固定化したアフィニティカラム等を
用いて分離精製した結果、得られたＣ−Ａｂと反応する
本発明物質の緑膿菌の共通抗原成分がリポ糖蛋白からな
る全く新規な物質であることならびに該物質が動物実験
で緑膿菌の各種血清型菌に対してすぐれたワクチン活性
を示しかつ極めて毒性が低いものであることを見い出
し、本発明物質をＰＳＣ−Ａと命名し、本発明を完成す
る至った。 以下、本発明物質を単に本物質又はＰＳＣ−Ａと称する
ことが多い。 本発明は、緑膿菌感染対してワクチン活性を有するリポ
糖蛋白ＰＳＣ−Ａに関し、さらに詳細に緑膿菌より得ら
れるワクチン活性を有するリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａに関
し、そしてその製法および緑膿菌ワクチン組成物に関す
るものである。 さらに、本発明は、緑膿菌菌体を破砕して遠心分離して
得られる無細胞抽出液から、リポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａに対
して特異的な親和性を有するモノクローナル抗体を固定
化したアフィニティカラムを用いて、単離精製すること
を特徴とする緑膿菌感染に対して防御活性を有するリポ
糖蛋白ＰＳＣ−Ａの製造法に関する。 さらに、本発明は、リポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａを有効成分と
する緑膿菌ワクチン組成物に関するものである。 また、本発明の目的は、緑膿菌から単離されるリポ糖蛋
白ＰＳＣ−Ａを有効成分とする緑膿菌感染に対するワク
チン組成物を動物ならびにヒトのワクチン療法に提供す
ることにある。 （本発明の構成） つぎに本発明について具体的に説明する。 本発明に用いられる緑膿菌血清学的分類法に従って例示
すると第１表の通りである。緑膿菌の分類同定に関して
は昨今異論がなしとはしないが、本発明では、使用緑膿
菌の分類を緑膿菌研究会主催の型別検討委員会の決定
（１９７５年）による血清学的分類に従うものとし、こ
の分類に基づくＡ〜Ｍ群に属する菌株はすべて本発明に
述べる緑膿菌の血清型菌の対象になる。 なお、本発明では緑膿菌の分類法として型別検討委員会
の決定による血清学的分類を現時点での最善のものと判
別してそれに従っているが、将来において新分類基準が
採択されることを考慮した場合、本発明の緑膿菌とは本
物質ＰＳＣ−Ａをワクチンとして保有する細菌株すべて
がその対象になると言える。 したがって本発明の対象菌株は、上記Ａ〜Ｍ群に属する
ものあるいはこの分類基準に従って分類しうるもののみ
に限定されるものはない。 緑膿菌から本発明のＰＳＣ−Ａを本発明の方法により単
離する場合、第１表の菌株のいずれを用いてもかまわな
いが、経験的にはシュードモーナス・アエルギノーサＩ
ＩＤ１１３０、Ｆ４８５９−５２，Ｎ−１０（以上Ｅ
型）、シュードモナス・アエルギノーサＡＴＣＣ１０１
４５，ＩＩＤ１０２０（以上Ｇ型）、シュードモナス・
アエルギノーサＩＩＤ１０１０，ＣｈｉｂａＮ−３５２
２（以上Ｉ型）などが好適な菌株として挙げられる。 なお、第１表に例示したＡ〜Ｍに属する緑膿菌の菌株の
うち、ＩＩＤ株は東京大学医科学研究所に保存されてお
り第三者に自由に分譲される。 また、本発明の製造方法であるアフィニティカラムに組
み込みＰＳＣ−Ａの単離精製に用いるＰＳＣ−Ａに特異
的な親和性を有するモノクローナル抗体Ｃ−Ａｂの調製
法ならびにＣ−Ａｂの性質は、試験例１に示す通りであ
る。 試験例１ モノクローナル体Ｃ−Ａｂの調製とその性質 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製はＫｈ
ｌｅｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの公知の方法に準じて行な
った。すなわち、シュードモナス・アエルギノーサＩＩ
Ｄ１１３０（Ｅ型）の０．３％ホルマリン処理菌体をフ
ロイントの不完全アジュバントでエマルジョンとし、１
週おきに計５回ＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウスの腹腔内に投与
して免疫した後、最終免疫の４日後のマウスの脾細胞５
×１０^８個とＮＳ−１マウスミエローマ細胞５×１０^７
個との５０％ポリエチレングリコール存在下における細
胞融合によって得られたハイブリドーマを９６ウエル平
底プレートに分注しＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジン含有）を添加した１０％牛胎児血
清加ダルベッコＭＥＭ培地で５％ＣＯ_２で存在下３７℃
培養した。ハイブリドーマの増殖を認めたウエルについ
て培養上清の抗緑膿菌モノクローナル抗体の存在の有無
を酵素免疫測定法であるドットイムノバインディングア
ッセイ法（Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ１１９，１４２−１４７，１９８２，以下ＤＩＢＡ
法という）で測定した。ＤＩＢＡ法は９６ウエルＵ底マ
ルチプレートを用い、１ドット当り０．４μｇの０．３
％ホルマリン処理緑膿菌の全菌体を抗原として固定した
メンブランフィルター（３．１ｍｍ角）と上記の培養上
清１００μｌを室温で３０分、ついでパーオキシダーゼ
標識ウサギ抗マウスイムノグロプリン抗体（ＤＡＫＯ社
製）と３０分反応後クロルナフトールを基質として発色
させ、抗原を固定したメンブランフィルター上に肉眼観
察で発色を認めたものを抗体産生が陽性と判定した。 培養上清にモノクローナル抗体産生が認められたハイブ
リドーマはさらに限界希釈法でクローニングを行ない、
モノクローンになったハイブリドーマはフラスコ増殖さ
せた後、免疫抑制剤プリスタン（アルドリッチ社）処置
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に移植し得られたマウス腹
水からプロテインＡ−セファロース（ファルマシア社）
のアフィニティカラムを用いてモノクローナル抗体を精
製した。かくして得られた６株の抗緑膿菌モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマの中から、本発明者らは緑膿
菌のすべての血清型菌と共通に反応するモノクローナル
抗体Ｃ−Ａｂを産生するＣ−Ａｂ産生ハイブリドーマ１
株を見い出した。このＣ−ＡｂのグロプリンクラスはＩ
ｇＧであり、またＤＩＢＡ法によるＣ−Ａｂの緑膿菌の
血清型菌に対する反応性を例示すると第２表の通りとな
り、Ｃ−Ａｂはいずれの血清型菌ともほヾ等しい親和性
を示したが、緑膿菌以外の細菌とは反応しなかった。ま
た、Ｃ−Ａｂは緑膿菌Ｅ型菌由来の内毒素（リポ多糖
体、シュードモナス・アエルギノーサＮ−１０株よりモ
リソン法により自家調製）およびＯＥＰ（シュードモナ
ス・アエルギノーサＮ−１０株より本間らの方法で自家
調製）とも反応しなかった。したがってこのことは本発
明物質ＰＳＣ−Ａはこれらの物質と免疫学的に異なる性
質をもつことを示している。 上述の試験例１に示すＣ−Ａｂは詳細を後述するように
緑膿菌から本発明の物質ＰＳＣ−Ａを簡便かつ高収率に
製造するに際して不可欠な精製手段になるが、通常アフ
ィゲル−１０（バイオラド社）やＢｒＣＮ−セファロー
ス（ファルシア社）等の担体に固定化して用いるのが好
適である。 なお、本発明のＰＳＣ−Ａの製造に用いる抗体は試験例
１のＣ−Ａｂのみに限定するものではなく、ＰＳＣ−Ａ
に特異的な親和性を有する抗体であれば本発明の方法に
適合する。例えば後述の実施例１〜３で単離されたＰＳ
Ｃ−Ａで新たに免疫された動物あるいはＰＳＣ−Ａでｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ刺激された動物またはヒト由来の抗ＰＳ
Ｃ−Ａ抗体産生性のＢリンパ系細胞とミエローマ細胞と
の間で細胞融合により形成されるハイブリドーマあるい
は抗ＰＳＣ−Ａ抗体産生能を持つヒトのＢリンパ系細胞
にＥＢウイルスを感染させて継代培養可能な増殖型に変
異させた細胞がそれぞれ産生するＰＳＣ−Ａ特異的な親
和性を有するモノクローナル抗体あるいはそれらの抗体
混合物さらにはＰＳＣ−Ａ免疫動物の血清から得た抗Ｐ
ＳＣ−Ａポリクローナル抗体も本発明の製造方法に適合
するものである。 つぎに、本発明物質のＰＳＣ−Ａを得るための基本的な
製造方法について述べる。ＰＳＣ−Ａの取得に用いる緑
膿菌株は前述の通りであり、緑膿菌培養方法や菌体の破
砕方法は、通常の方法に従ってよい。培地は、市販のハ
ートインフュジョンプロス、プレインハートインフュー
ジョンプロス（栄研化学製）、肉エキスペプトン培地あ
るいは自家調製の本間らの合成培地（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｙ，８３，７１１−１８，１９７８）が用いら
れる。特に本間らの合成培地は培地成分として高子の蛋
白質などを含まないため、菌体成分への培地混入の影響
がない点で好適である。 培養温度培地のＰＨは使用した緑膿菌が生育する範囲で
あればよいが温度は２５℃〜３７℃、ＰＨ６．５〜８．
５の間で培養するのが好ましい。培養は好気的条件で行
なうのがよく、例えば振とう培養もしくは培養槽内での
通気撹拌培養を行なえばよい。培養時間は緑膿菌体中の
ＰＳＣ−Ａの収量に影響するので１０時間〜７２時間の
範囲で適宜選択すればよいが通常は１６〜２時間が好ま
しい。例えば本間らの合成培地（ＰＨ７．４）で３７℃
２０時間振とう培養することにより良好な緑膿菌培養が
得られ、これを遠心分離または過して菌体を得ること
が出来る。この時菌体を少量のホルマリンで処理して死
菌体として回収することも可能である。得られた菌体は
水好ましくは適当な緩衝液と充分混合し氷冷しながらダ
イノミル（ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ）あるいはフレンチプレ
スなどにより菌体を破砕して破砕菌体懸濁を得る。この
懸濁液をデカンテーションならびに遠心して本発明物質
ＰＳＣ−Ａを含む無細胞抽出液を得るが、このときの遠
心分離の条件は、未破砕菌体、部分的破砕された菌体、
細胞壁不溶性画分等を沈渣として徐去出来る通常の遠心
力でよく、たとえば３９，０００×ｇ３０分間遠心して
その上清を取得する。なお、上述の緑膿菌を機械破砕し
て破砕菌体濁液を得るに際して、通常菌体成分の抽出に
用いられるＴｒｉｔｏｏＸ−１００などの界面活性剤や
ＥＤＴＡなどのキレート試薬を少量の緩衝液中に共存さ
せるとＰＳＣ−Ａの抽出率を一層向上させることが出来
る。 また、本発明における無細胞抽出液とは破砕菌体懸濁液
から遠心分離により未破砕菌体、部分的に破砕された菌
体、不溶性の細胞壁画分等を出来る限り除いたＰＳＣ−
Ａを含む画分のことである。無細胞抽出液からＰＳＣ−
Ａを得るには無細胞抽出液をイオン交換クロマトカラム
やゲル過カラムに付して分画精製することも可能であ
るが、本発明の製造方法に従いＰＳＣ−Ａに特異的な親
和性を有するモノクローナル抗体、例えばＣ−Ａｂを固
定化したアフィニティカラムに無細胞抽出液を付してＰ
ＳＣ−Ａの単離精製を行なうのが簡便かつ高収率であ
る。またＣ−Ａｂで代表されるＰＳＣ−Ａの単離精製に
用いるＰＳＣ−Ａに特異的な親和性を有するモノクロー
ナル抗体は前述のようにアフィゲルやＣＮＢｒ−セファ
ロース等の適当な担体に固定化して用いるのが好適であ
る。無細胞抽出液を付したアフィニティカラムは、ＰＨ
６〜８程度の中性域の緩衝液で十分洗浄して該固定化モ
ノクローナル抗体に結合しないＰＳＣ−Ａ以外のきよう
雑物を溶出させた後、通常抗原−抗体反応物の解離に用
いられる低ＰＨ域の緩衝液例えば５０ｍＭグリシン−Ｈ
Ｃｌ緩衝生理食塩液（ＰＨ３．０）を流入してモノクロ
ーナル抗体に結合したＰＳＣ−Ａを解離溶出させること
が出来る。得られた溶出液はＰＨを中性に調整した後蒸
留水に対して透析を行ない、さらに凍結乾燥することに
より単離精製された本発明物質のＰＳＣ−Ａが得られ
る。 なお、緑膿菌の培養液について通常生菌培養物として
菌体を取得する限りにおいては培養液中のＰＳＣ−Ａ
の濃度は無視し得るものであるが、長時間培養などで増
殖した菌体が死滅したり自己消化などを起して菌体から
ＰＳＣ−Ａが培養液に多量移行した場合は培養液を
遠心分離して得られる上澄液を前述のＰＳＣ−Ａに対し
て特異的な親和性を有するモノクローナル抗体を固定化
したアフィニティカラムに直接付すことにより精製ＰＳ
Ｃ−Ａを回収することが可能である。 また、前述の無細胞抽出液を付したアフィニティカラム
からＰＳＣ−Ａ以外のきよう雑物を効果的に溶出除去す
るには、中性域の緩衝液にＴｒｉｔｏＸ１００などの界
面活性剤を少量添加してカラムを洗浄することも推奨さ
れる。 つぎに実施例１において精製して得られた本発明物質Ｐ
ＳＣ−Ａについて生物物理化学的性質を調べた結果を示
す。 なお、実施例２および実施例３で得られたＰＳＣ−Ａも
同様の性質を示している。 本物質リポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａの生物物理化学性質： （１）分子量 １５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法による） なお、下記条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）においてクマジーブリリアントブルーＲ２５０
で染色される単一バンドを示す。 （２）蛋白質、糖およびヘキソサミン含量 蛋白質含量（％）：２７．０（ローリー変法、牛血清ア
ルブミン標準） ２４．０（プロティンバインディングアッセイ法、牛血
清アルブミン標準） ５５．０（加水分解によるニンヒドリン比色法、牛血清
アルブミン標準） 糖含量（％）：３．０〜５．０（フエノール硫酸法、グ
ルコース標準） ヘキソサミン含量（％）：１．０以下（ロンドル・モル
ガン法、グルコサミン標準） （３）脂質含量（％）：７．０〜１０．０（プリフ・ダ
イエルの変法） 但し、本発明物質のクロロホルムメタノール抽出物（プ
リフ・ダイエルの変法）をシリカゲルＴＬＣにより石油
エーテル：：エーテル：酢酸（８０：２０：１）で展開
し、５０％硫酸加熱反応により発色させるとき、呈色を
原点に認める。 （４）性状、溶解性 淡黄色粉末であり、水、生理食塩液およびリン酸緩衝液
に可溶である。水に対する溶解度は１ｍｇ／ｍ以上で
ある。メタノール、エーテル、ヘキサンおよびクロロホ
ルムにはほとんど溶けない。 （５）呈色反応 ローリー・フォリン反応、ニンヒドリン反応、フェノー
ル硫酸反応、アンスロン硫酸反応は陽性。エルソンモル
ガン反応陰性。 （６）等電点 ｐＩ＝３．８〜４．２（等電点電気泳動法） （７）安定性 中性の水溶液中で、室温において２４時間以上安定であ
る。 （８）紫外部吸収スペクトラム 第１図に示す通り２７２ｍｍ附近に極大吸収を示す。 （９）酵素活性 カゼインおよびコラーゲンに対する分解活性を示さな
い。 （１０）特性 ｉ） マウス結合織由来培養細胞株のＬ細胞に対して本
発明物質１０μｇ／ｍで、また正常マウス脾由来培養
白血球細胞に対して本発明物質２μｇ／ｍでそれぞれ
２４時間培養するとき直接細胞障害作用を示さない。 ｉｉ） 生理食塩液に溶解した本発明物質またはフロイ
ントの不完全アジュバントあるい完全アジュバントに懸
濁した本発明物質いずれもマウス免疫するとマウス血清
中に緑膿菌と反応する液性抗体が出現する。 ｉｉｉ） 本発明物質に対して特異的な親和性を有する
マウスモノクローナル抗体は公知の緑膿菌共通抗原ＯＥ
Ｐおよび緑膿菌内毒素（リポ多糖体）と反応しない。 本発明物質を緑膿菌感染に対するワクチン組成物として
用いる場合は、注射剤の型で用いるのが好ましい。本発
明物質は単独あるい通常用いられる添加剤、賦型剤を加
えて液剤あるいは用時溶解型の凍結乾燥製剤として適用
可能である。また、本発明物質は水中油適型あるいは油
中水滴型のエマルジョンとして、さらには人工的に調製
可能なリン脂質、コレステロール等から構成されるリポ
ゾームの中に封入するかあるいはリポゾームの膜の外表
面上に突起物として固着させることによっても適用可能
である。 本発明物質の用量、投与経路は適宜選択されるが用量は
体重Ｋｇあたり０．００１ないし１０ｍｇが好ましく、
投与経路は皮内、皮下、静脈内、腹腔内投与が可能であ
る。 本発明物質マウスやモルモットに対して免疫すると、血
清中に高単位に緑膿菌に対する液性抗体の産生を誘導す
るといういわゆるワクチンが具備すべき抗原特性を有し
ている。 さらに、本発明物質は動物における緑膿菌感染に対して
強いワクチン活性を示す。例えば本発明物質の投与によ
り免疫されたマウスでは、各種血清型の緑膿菌の致死量
感染に対しても感染死を免がれ生存するという劇的なワ
クチン活性が認められる。 一方、本発明物質の急性毒性はマウスに対する静脈内投
与による体重Ｋｇあたりの５０％致死量ＬＤ５０値が５
ｍｇ／Ｋｇ以上であることから低毒性であり、ワクチン
療法に好適である。また、特許請求の範囲に示したよう
に本発明物質は動物の細胞に対しても比較的高濃度にも
かゝわらず直接細胞障害作用を示さないことは本物質の
１つの有利な特性と言える。 以上の種々の知見から本発明物質ＰＳＣ−Ａは緑膿菌感
染に対するワクチン組成物として極めて有用なものと考
えられる。 以下に本発明物質の製造法を実施例により、また本発明
の緑膿菌感染に対するワクチン組成物としての有用性を
試験例により示す。 実施例１ 血清型Ｅ型の緑膿菌からの本発明物質の製造 グルタミン酸ナトリウム ２０ｇ グリセリン ５ｇ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．５５ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ５．６ｇ Ｃａ（ＮＯ_３）_２・４Ｈ_２Ｏ １７．２６ｍｇ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ５０μｇ 水を加えて１にし、ＰＨ７．４にアンモニア水でで調
整する。 シュードモナス・アエルギノーサＩＩＤ１１３０（Ｅ
型）を普通寒天培地で３７℃１夜培養し増殖した菌体を
生理食塩液に懸濁しその０．５ｍを上記組成の本間ら
の合成培地１５０ｍを含む坂口フラスコに接種し３７
℃で１６時間振とう培養した。 培養後坂口フラスコ１本当り１．２ｍのホルマリンを
加えて充分混合し室温に１時間放置した。ついで培養液
を遠心分離（１２０００×ｇ３０分間）して菌体を集
め、さらに生理食塩液と蒸留水で洗浄処理と遠心分離を
繰返し湿菌体２９ｇを得た。 この湿菌体を２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００および１０ｍＭ
ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ緩衝液ＰＨ
８．０）１２０ｍ懸濁した後氷冷下ＤＹＮＯ−ＭＩＬ
Ｌ（ビーズ０．１ｍｍφ）で３分間破砕した。この菌体
破砕懸濁液は静置後上澄液をデカンテーションにより集
め、残渣に上記緩衝液２８０ｍを加えてよく撹拌して
静置し再びその上澄液をデカンテーションにより集め
た。デカンテーションにより集めた上澄液はプールし遠
心分離処理（３９０００×ｇ３０分間して）遠心上清澄
約４００ｍを得た。この遠心上清をアフィゲルー１０
（バイオラド社製）を担体として固定した本発明物質Ｐ
ＳＣ−Ａに対して特異的な親和性を有するモノクローナ
ル抗体Ｃ−Ａｂを詰めたアフィニティカラム（サイズ１
０×６０ｍｍ、アフィゲル−１０１ｍに対してＣ−Ａ
ｂ１５ｍｇ結合）に付し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１０
０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ緩衝液（ＰＨ８．
０）５０ｍ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ緩衝液（Ｐ
Ｈ８．０）５０ｍで順次カラムを洗浄した後最終的に
５０ｍＭグリシン−ＨＣ緩衝生理食塩（ＰＨ３．０）
３０ｍで溶出させた。得られた溶出液は１Ｎ炭酸水素
ナトリウム水溶液で中和後、蒸留水に対して４℃で２４
時間透析を行ない、ついで透析内液を凍結乾燥して本発
明物質ＰＳＣ−Ａ原末を２．０ｍｇ得た。 実施例２ 血清型Ｇ型の緑膿菌からの本発明物質の製造 シュードモナス・アエルギノーサＡＴＣＣ１０１４５
（Ｇ型）を実施例１と同様に本間らの合成培地で３７℃
２０時間振とう培養し、培養液をホルマリン処理後遠心
−洗浄処理して湿菌体２８．３ｇを得た。この湿菌体を
実施例１と全く同一条件でＤＹＮＯ−ＭＩＬＬによる破
砕、デカンテーションによる上澄液の採集、プールした
上澄液の遠心処理による遠心上澄の採集、遠心上清のア
フィニティカラムへの流入および２種類の緩衝液による
洗浄、グリシーンＨＣ緩衝生理食塩液による溶出、溶
出後の中和、透析および凍結乾燥を順次行ない本発明物
質ＰＳＣ−Ａ３．２ｍｇを得た。 実施例３ 血清型Ｉ型の緑膿菌からの本発明物質の製造 シュードモナス・アエルギノーサＩＩＤ１０１０（Ｉ
型）を実施例１と同様に本間らの合成培地で３７℃２０
時間振とう培養し、培養液をホルマリン処理後遠心−洗
浄処理を行ない湿菌体３０５ｇを得た。この湿菌体を実
施例１の１０倍のスケール以下全く同様に処理操作を行
ない、最終的に本発明物質ＰＳＣ−Ａの凍結乾燥品２８
ｍｇを得た。 実施例４ 液剤： 実施例２で得たＰＳＣ−Ａ１ｍｇを１０ｍの生理食塩
液に溶解し、ニュクリポア−Ｎ０２０（ヌクリポア社
製）を用いて無菌過した。得られた液を１ｍずつ
バイアル瓶に無菌的に分注して本発明物質の液剤を得
た。 実施例５ 凍結乾燥製剤： 実施例３で得たＰＳＣ−Ａ１０ｍｇを１０ｍの注射用
蒸留水に溶解し、次に５００ｍｇのマンニトールを加え
て溶解した後ニュクリポア−Ｎ０２０を用いて無菌過
した。得られた液を１ｍずつ無菌的にバイアル瓶に
分注した後凍結乾燥して本発明物質の凍結燥製剤を得
た。 実施例６ エマルジョン剤： 実施例３で得たＰＳＣ−Ａ１ｍｇを０．５ｍの生理食
塩液に溶解し、次にノルマルパラフィン液とアラセル
（Ａｒｌａｃｅｌ Ａ．Ａｔｌａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）の８．５：１．５の混液
０．５ｍを加えて連結注射針を用いて油中水型のエマ
ルジョンを得た。 （本発明の効果） 試験例２ 本発明物質のマウスにおける抗原特性 フロイントの不完全アジュバントと実施例１および２で
得た本発明物質ＰＳＣ−Ａの生理食塩液溶解液をそれぞ
れ等量混ぜ水型のエマルジョンを作製した。 生後８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス１群５匹に上記本
発明物質のエマルジョンを１週間間隔で２回免疫（１回
あたり本発明物質１０μｇ／マウス腹腔内投与）し、最
終免疫の４日後にマウスから採血しその血清の抗緑膿菌
抗体価を試験例１に述べたＤＩＢＡ法により測定した。
結果は第３表の通りで、本発明物質の免疫により血清中
に高い抗体価が検出された。なお非免疫マウスではほと
んど抗体価が検出されなかった。 試験例３ 本発明物質の緑膿菌感染に対するワクチン活
性（その１） 試験例２に示した２種類の本発明物質のエマルジョンを
生後８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス１群５匹１週間間
隔で２回免疫（１回あたり本発明物質１０μｇ／マウス
腹腔内投与）し、最終免疫の１週間後に緑膿菌を感染さ
せた。感染緑 菌はシュードモナス・アエルギノーサＰ
Ｍ１０３（Ｅ型）およびＰ２８（Ｇ型）の２株とし、そ
れぞれハートインフュージョン寒天培地（栄研化学製）
に一夜培養後集菌し生理食塩液にて希釈した後５％ムチ
ンを加え、マウス一匹あたり約５ＬＤ_５０量を腹腔内へ
接種した。 なお対照群は本発明物質のかわりに生理食塩液のみ投与
した。 緑膿菌感染後７日目に生存マウス数を調べて結果をまと
めた。結果は第４表の通りで、本発明物質にワクチン活
性が認められた。 試験例４ 本発明物質の緑膿菌感染に対するワクチン活
性（その２） 実施例３で得た本発明物質ＰＳＣ−Ａを、生理食塩液に
溶解した生後８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス１群５匹
に１週間間隔で４回免疫（１回あたり本発明物質２０μ
ｇ／マウス皮下投与）し、最終免疫の５日後にシュード
モナス・アエルギノーサＰＡ１０３（Ｅ型）およびＰ２
８（Ｇ型）の２菌株をそれぞれ感染させた。感染菌は試
験例３と同様に調製したものをマウス１匹あたり約３Ｌ
Ｄ_５０量を腹腔内に接種した。なお対照群は本発明物質
のかわりに生理食塩液のみ投与した。 緑膿菌感染後７日目に生存マウス数を算定した。 結果は第５表の通りで、本発明物質ワクチン活性が認め
られた。 試験例５ 急性毒性： １群６匹の生後５週令ＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウスに生理食
塩液に溶解した実施例３の本発明物質を静脈投与した。
同様に、大腸菌のＬＰＳ（シグマ社製リポ多糖体、血清
タイプＮｏ０１１１：Ｂ４）も静脈投与した。投与後２
４時間後観察しその結果から本発明物質の静脈内投与お
ける５０％致死用量ＬＰ_５０を推定した。ＬＤ_５０第６
表の通りで、本発明物質は、ＬＰＳと全く異なり低い毒
性を示した。

【図面の簡単説明】

図面は本発明物質の紫外部吸収スペクトラムを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】緑膿菌に対するワクチン活性を有する下記
   の生物物理化学的性質を示すリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａ。 （１）分子量 １５，０００ （２） 蛋白質、糖およびヘキソサミン含量 蛋白質含量（％）：２４〜５５ 糖含量（％）：３．０〜５．０ ヘキソサミン含量（％）：１．０以下 （３）脂質含量（％）：７．０〜１０．０ （４）性状、溶解性 淡黄色粉末であり、水、生理食塩液およびリン酸緩衝液
   に可溶である。水に対する溶解度は１ｍｇ／ｍ以上で
   ある。メタノール、エーテル、ヘキサンおよびクロロホ
   ルムにはほとんど溶けない。 （５）呈色反応 ローリー・フォリン反応、ニンヒドリン反応、フェノー
   ル硫酸反応、アンスロン硫酸反応は陽性。エルソンモル
   ガン反応は陰性。 （６）等電点 ｐＩ＝３．８〜４．２（等電点電気泳動
   法） （７）安定性 中性の水溶液中で、室温において２４時間以上安定であ
   る。 （８）紫外線吸収スペクトラム ２７２ｎｍ付近極大吸収を示す。 （９）酵素活性 カゼインおよびコラーゲンに対する分解活性を示さな
   い。 （１０）特性 ｉ） マウス結合組織由来培養細胞株のＬ細胞に対して
   本発明物質１０μｇ／ｍで、また正常マウス脾由来培
   養白血球細胞に対して本発明物質２μｇ／ｍでそれぞ
   れ２４時間培養するとき直接細胞障害作用を示さない。 ｉｉ） 生理食塩液に溶解した本発明物質またはフロイ
   ントの不完全アジュバントあるいは完全アジュバントに
   懸濁した本発明物質はいずれもマウスに免疫するとマウ
   ス血清中に緑膿菌と反応する液性抗体が出現する。 ｉｉｉ） 本発明物質に対して特異的な親和性を有する
   マウスモノクローナル抗体は公知の緑膿菌共通抗原ＯＥ
   Ｐおよび緑膿菌内毒素（リポ多糖体）と反応しない。
2. 【請求項２】緑膿菌より得られたものである特許請求の
   範囲第１項記載のリポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａ。
3. 【請求項３】緑膿菌菌体を破砕して遠心分離して得られ
   る無細胞抽出液からリポ糖蛋白に結合する抗体を固定化
   したアフィニティカラムを用いて単離精製することを特
   徴とする緑膿菌に対するワクチン活性を有するリポ糖蛋
   白ＰＳＣ−Ａの製造法。
4. 【請求項４】リポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａを有効成分とする緑
   膿菌に対するワクチン組成物。
5. 【請求項５】リポ糖蛋白ＰＳＣ−Ａが緑膿菌より得られ
   たものである特許請求の範囲第１項記載のワクチン組成
   物。