ES2282992T3

ES2282992T3 - Vacuna para cepa de haemophilus influenzae no tipificable.

Info

Publication number: ES2282992T3
Application number: ES95302996T
Authority: ES
Inventors: Gary Warren Zlotnick
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1994-05-05
Filing date: 1995-05-02
Publication date: 2007-10-16
Anticipated expiration: 2015-05-02
Also published as: CA2148563A1; IL113595A; FI952144A0; FI952144A; PT680765E; KR950031108A; US5770213A; KR100366482B1; IL113595A0; EP0680765B1; AU704882B2; DK0680765T3; NO951750L; JP2009051859A; NO951750D0; USRE37741E1; CA2148563C; EP0680765A1; DE69535422T2; JP4236215B2

Abstract

Proteína P5 nativa sustancialmente pura de la membrana externa de una cepa bacteriana de Haemophilus influenzae.

Description

Vacuna para cepa de Haemophilus influenzae no tipificable.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la proteína de la membrana externa de P5 nativa de la cepa bacteriana de Haemophilus influenzae, y a anticuerpos dirigidos contra la proteína P5. La invención se refiere asimismo a un método para aislar la proteína P5, y a una composición de vacuna para uso en el tratamiento de la infección por de Haemophilus influenzae.

Antecedentes de la invención

Las cepas de Haemophilus influenzae se dividen en dos grupos, tipificables y no tipificables. Las cepas que presentan una cápsula conocida se tipifican mediante una reacción serológica de la cápsula con antisueros de referencia. Actualmente, los tipos a-f se han identificado como tipificables. Las cepas que no presentan una cápsula, y que no reaccionan con ninguno de los antisueros de referencia, son no tipificables.

Las infecciones por Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) están implicadas en varios estados mórbidos, incluyendo otitis media, sinusitis, y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. El tipo b de Haemophilus influenzae (Hib) es la causa principal de meningitis y de otras infecciones invasivas en niños menores de cuatro años. Los anticuerpos dirigidos contra el polisacárido de la cápsula del organismo son bactericidas, opsónicos in vitro y protectores en animales experimentales y en seres humanos. Como se usa aquí, opsónico se define como preparación de la superficie de microorganismos de forma que pueden ser captados más fácilmente por fagocitos. Aunque se han producido vacunas seguras y eficaces para la prevención de la enfermedad por Haemophilus influenzae de tipo B, todas las vacunas se basan en la producción de anticuerpos frente a la cápsula de polisacárido que está fuera de la pared celular en las bacterias. Las cepas NTHi de las cepas de Haemophilus influenzae carecen, por definición, de cápsula. Por lo tanto, los anticuerpos contra la cápsula no serán eficaces previniendo las infecciones por NTHi.

Es de interés caracterizar las proteínas de membrana externas de las bacterias de Haemophilus influenzae, y evaluar su potencial como vacunas. Munson et al., (J. Clin. Invest, 72:677-684 (1983)) dieron a conocer la purificación y caracterización de P2, una de las principales proteínas de la membrana externa de las cepas de Haemophilus influenzae. Los investigadores encontraron que la proteína P2 está presente en concentraciones elevadas, se purifica fácilmente, e induce anticuerpos protectores en ratones. Se piensa que la proteína P5 está asociada con la capa proteínica de la membrana externa, y se extrajo previamente mediante solubilización con dodecilsulfato de sodio (SDS) y fraccionamiento con un disolvente orgánico. (Coulton et al. Can. J. Microbiology. 20:280-287 (1983). Sin embargo, se ha sugerido que el uso de SDS puede desnaturalizar las proteínas en ciertas circunstancias.

Munson y Granoff (American Society of Microbiology, Infection and Immunity Vol. 49, nº 3 (p. 544, (1985)) han dado a conocer la caracterización parcial de las proteínas P5 y P6. Los resultados indicaron que, mientras que el complejo de pared celular de P6 provocó anticuerpos en ratones que tuvieron actividad protectora en el modelo de rata lactante, P5 no produjo antisuero que fuese protector en ratas lactantes, ni sus antisueros reaccionaron con la superficie de las bacterias mediante inmunofluorescencia que tuvieron actividad de inmunofluorescencia in vitro. Basándose en estos hallazgos, los expertos en la técnica concluyeron que P5 no fue un candidato a vacuna para la prevención de la enfermedad provocada por el tipo b de Haemophilus influenzae.

Munson et al. (Infection and Immunity, 61:4-017-4020 (1993)), han dado a conocer la clonación y expresión, en E. coli, de la proteína P5. Sin embargo, la proteína así producida estaba principalmente en forma desnaturalizada, y se pensó que no estaba correctamente plegada.

Un objetivo de la presente invención consiste, por lo tanto, en proporcionar proteína P5 nativa esencialmente pura de la membrana externa de bacterias de Haemophilus influenzae, anticuerpos dirigidos contra la proteína P5, y una composición de vacuna para uso en el tratamiento de cepas infecciosas de Haemophilus influenzae.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para purificar proteína P5 de la membrana externa de bacterias de Haemophilus influenzae y que produzca proteína que se puede usar para producir anticuerpos activos. De este modo, P5 se puede usar para producir una vacuna para las cepas de NTHi y de tipo b de Haemophilus influenzae. La invención se puede comprender de forma más completa haciendo referencia a los dibujos y a la descripción detallada siguientes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1: proporciona un gel de dodecilsulfato de sodio (SDS) de proteínas P5 no tipificables y de tipo B purificadas. El doblete en la línea 1 representa las formas modificadas por calor y no modificadas por calor de la proteína P5.

La Figura 2: proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína P5 purificada, que es capaz de provocar un anticuerpo bactericida.

La Figura 3: proporciona los títulos del punto final de Elisa de células completas generados a partir de antisueros de conejo dirigidos contra P5 de NTHi.

La Figura 4: proporciona títulos del punto final de Elisa de células completas generados a partir de antisueros de ratón dirigidos contra P5 de NTHi.

La Figura 5: proporciona la actividad bactericida del antisuero de P5 a partir de P860295 contra varias cepas diferentes de Haemophilus no tipificables.

Descripción detallada de la forma de realización preferida

La presente invención se refiere a una proteína P5 nativa purificada de la membrana externa de bacterias de Haemophilus influenzae no tipificables. La proteína P5 es una proteína de membrana externa, modificable por calor, de 28-35 KDa, con regiones tanto conservadas como variables.

La proteína P5 tiene varias propiedades que la hacen (y péptidos y proteínas que tienen epítopos de la proteína P5) especialmente valiosa para la vacunación contra Haemophilus influenzae no tipificable. Como se usa en este documento, epítopo se define como una región de un antígeno a la que se une la región variable de un anticuerpo. La mayoría de los antígenos tienen un gran número de epítopos, y por lo tanto un antisuero polivalente contra el antígeno contendrá un gran número de anticuerpos diferentes, siendo capaz cada anticuerpo de unirse a un epítopo diferente sobre el antígeno. Contrariamente a los informes publicados en la técnica anterior, la proteína P5 es capaz de provocar anticuerpos que reaccionan con la superficie de las bacterias, y que son bactericidas. La proteína se ha purificado mediante, y se ha demostrado que induce, una respuesta inmunitaria contra diferentes cepas de Haemophilus influenzae no tipificable.

Los péptidos o proteínas de la presente invención tienen un epítopo común con la proteína P5, y de este modo reaccionan de forma inmunológicamente cruzada con ella. Pueden incluir fragmentos u oligopéptidos que contienen epítopos de la proteína P5. Como se usa en la presente memoria, los oligopéptidos se definen como cadenas poliméricas de unas pocas unidades monómeras que se repiten. Se ha determinado la secuencia de aminoácidos N-terminal de la proteína P5, y se muestra en SEC ID nº:1. Los péptidos y proteínas de la presente invención comprenden cualquier péptido o proteína que tiene por lo menos una porción de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2, o cualesquiera secuencias biológicamente equivalentes. Las secuencias alteradas incluyen secuencias en las que los restos de aminoácidos funcionalmente equivalentes están sustituidos por restos dentro de la secuencia que dan como resultado un cambio imperceptible. Por ejemplo, uno o más restos de aminoácidos dentro de la secuencia se pueden sustituir por otro aminoácido de polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración imperceptible. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y glutámico.

Los péptidos y proteínas de la presente invención también incluyen fragmentos u oligopéptidos que tienen epítopos de la proteína P5 representados dentro de la secuencia, o cualesquiera análogos de tales fragmentos o epítopos. Además, cualquiera de los péptidos y proteínas se puede modificar para la conjugación con otras moléculas, por ejemplo mediante la unión de grupos de acoplamiento, tales como los aminoácidos cisteína y lisina, u otros grupos enlazantes.

Como se describe con detalle a continuación, la proteína P5 y los péptidos y proteínas de la presente invención son útiles en muchas formas diferentes (por ejemplo, solos o en mezclas) en vacunas. Para estos fines, los péptidos y proteínas se producen mediante aislamiento a partir de Haemophilus influenzae, o mediante síntesis química, o potencialmente mediante métodos de biotecnología tales como la expresión recombinante en diversas células hospedantes.

La proteína P5 nativa se purifica a partir de Haemophilus influenzae mediante un procedimiento de extracción diferencial con detergentes. El procedimiento no implica el uso de agentes desnaturalizantes y agentes reductores tales como dodecilsulfato de sodio y 2-mercaptoetanol, respectivamente, que pueden destruir epítopos antigénicos importantes de la proteína, y que no se aceptan ampliamente como seguros para la administración a seres humanos.

El procedimiento supone obtener en primer lugar componentes de la membrana externa de las células de Haemophilus influenzae. Los componentes de la membrana externa se pueden preparar a partir de una fracción de membrana celular total. Las fracciones de membrana total se preparan típicamente mediante sedimentación diferencial después de la disgregación de las células de Haemophilus influenzae por métodos tales como ultrasonidos, trituración, o expulsión a partir de una prensa francesa u otro dispositivo de homogeneización. La fracción de membrana total se fracciona entonces en membranas internas y externas mediante sedimentación por gradiente de densidad, o mediante solubilización diferencial de los constituyentes de la membrana interna con ciertos detergentes tales como polioxietilenoctilfenol (Triton X-100^{TM}) o la sal sódica de N-lauorilsarcosina (sarcosilo). En la forma de realización preferida, los componentes de la membrana celular externa se preparan mediante solubilización diferencial de membranas internas en 0,1-2% (p/v) de Triton X-100 en 100 mM de HEPES-NaOH 1 mM de MgCl_{2}, pH 7,4. Esta extracción se realiza típicamente dos veces.

Como fuente alternativa de componentes de la membrana externa, es útil un medio de cultivo de células de Haemophilus influenzae. El medio contiene componentes desprendidos (denominados "ampollas") de la membrana externa de las bacterias. Véase Loeb, M.R. (1987) Infection and Immunity 55 (11):2612-2618.

La solubilización de la proteína P5 a partir del complejo de la membrana externa-pared celular se logra entonces mediante una solubilización diferencial en tres etapas. En la primera etapa, se usa una disolución acuosa de 0,1-10%, típicamente 0,1-2% (p/v) de dodecilsulfobetaína (Zwittergent^{TM} 3-14), para eliminar las proteínas de la membrana externa. Preferiblemente, se usa una disolución al 1%, y la extracción se realiza habitualmente 2-3 veces. Tras las extracciones con Zwittergent^{TM} 3-14 y con NaCl 0,5 M, la proteína P5 se solubiliza con sarcosilo al 1% en 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de Na_{2}EDTA. Los extractos se ajustan a Zwittergent^{TM} 3-14 al 1% en el mismo tampón, y se dializan contra un exceso de 10 veces de Zwittergent^{TM} 3-14 al 1% en 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de Na_{2}EDTA (3 X), durante 24 horas. El extracto dializado se hace pasar entonces a través de una columna de intercambio aniónico (DEAE) y una columna de intercambio catiónico (S) conectadas en tándem. Las columnas se separan, y la columna S se eluye con un gradiente salino creciente en el mismo tampón que contiene el Zwittergent, la proteína P5 purificada se eluye como un único pico según se analiza mediante SDS-PAGE (Figura 1).

La proteína P5 purificada mediante este método está sustancialmente libre de endotoxina bacteriana, y es adecuada para la administración a seres humanos. La preparación purificada de la proteína P5 se formula entonces sola como una composición farmacéutica, por ejemplo como una vacuna contra Haemophilus influenzae, o en mezcla con adyuvantes y/o con antígenos de otros organismos implicados en la otitis media o en otras enfermedades. Si se desea, la proteína se fragmenta mediante técnicas químicas o enzimáticas estándares, para producir segmentos antigénicos.

Los péptidos y proteínas de la presente invención se pueden sintetizar químicamente según la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº:1, o variaciones de esta secuencia como se describe anteriormente. Son útiles cualesquiera de las químicas estándares para la síntesis en fase sólida o líquida de péptidos y proteínas. La síntesis química puede ser particularmente adecuada para la producción de oligopéptidos que contienen epítopos de la proteína P5.

La experiencia con anticuerpos dirigidos contra el polisacárido capsular de Haemophilus influenzae muestra que la capacidad de los anticuerpos para exterminar las bacterias en ensayos in vitro está estrechamente correlacionada con la capacidad para provocar una respuesta inmunitaria protectora en lactantes humanos (Fedea et al., J. Infect. Dis., 160, 999-1004 (1989)).

Los anticuerpos contra la proteína P5, provocados como respuesta a los péptidos y proteínas de la presente invención, se ensayan usando sistemas similares de ensayos in vitro, para demostrar la capacidad para exterminar las células de Haemophilus influenzae. Estos resultados muestran una correlación similar con el potencial de la proteína P5 para provocar una respuesta inmunitaria protectora, y para servir en una vacuna para lactantes, niños y adultos humanos.

Un sistema de ensayo bactericida mediado por el complemento in vitro (Musher et al., 1983, Infect. Immun. 39:297-304; Anderson et al., 1972, J. Clin. Invest. 51:31-38), que se ha usado previamente para medir la actividad bactericida de anticuerpos frente a PRP y lipopolisacárido (LPS) contra Haemophilus influenzae, es útil para determinar si un anticuerpo dirigido contra un péptido o proteína particular, o su fragmento, tiene actividad bactericida contra Haemophilus influenzae no tipificable.

Los péptidos y proteínas de la presente invención son útiles como inmunógenos en vacunas subunitarias, para la vacunación contra Haemophilus influenzae no tipificable. Las vacunas son útiles para prevenir o reducir la susceptibilidad a otitis media aguda y a otras enfermedades provocadas por cepas no tipificables del organismo, generalmente para vacunar niños o adultos contra la otitis media, o a niños que tengan riesgo de contraer otitis media u otras enfermedades (por ejemplo, niños con antecedentes familiares de infección del oído).

Los péptidos y proteínas de la presente invención se formulan como vacunas univalentes y polivalentes. Como se usa en este documento, las vacunas univalentes se definen como de un solo componente, y las vacunas polivalentes se definen como de múltiples componentes.

La propia proteína P5 se usa tal como se produce o aísla mediante los métodos descritos anteriormente, o mezclada con otros antígenos.

Los péptidos o proteínas de la presente invención se administran como vacunas subunitarias polivalentes en combinación con otros antígenos de Haemophilus influenzae.

Como se ha mencionado, los péptidos y proteínas que tienen epítopos de la proteína P5 suscitan anticuerpos bactericidas que actúan sinérgicamente exterminando Haemophilus influenzae con anticuerpos dirigidos contra otras proteínas de la membrana externa de Haemophilus influenzae. De este modo, en una forma de realización de la invención, la proteína P5 se administra conjuntamente con otras proteínas de la membrana externa de Haemophilus influenzae (o péptidos o proteínas que tienen sus epítopos), para lograr una actividad bactericida sinérgica. Las proteínas de membrana externa particularmente preferidas de Haemophilus influenzae son la lipoproteína de la membrana externa asociada a peptidoglicanos (PAL) y la lipoproteína PCP de Haemophilus influenzae, descritas por Deich, P.A. et al. (1988) J. Bacteriol. 170(2):489-498.

Para la administración combinada con epítopos de otras proteínas de la membrana externa, el péptido de la proteína P5 se administra separadamente, como una mezcla o como un conjugado o como un péptido o proteína de fusión genética. Por ejemplo, la PAL y PCP, o cualesquiera proteínas, péptidos o epítopos derivados de ellas, se administran como una mezcla o como un conjugado o fusión con una proteína P5 o con un péptido o proteína derivado de la proteína P5. El conjugado se forma mediante técnicas estándares para el acoplamiento de materiales proteinosos. La proteína P5, o cualesquiera péptidos o proteínas derivados, se puede usar conjuntamente con antígenos de otros organismos (por ejemplo, encapsulados o no encapsulados, bacterias, virus, hongos y parásitos). Por ejemplo, la proteína P5 es útil conjuntamente con antígenos de otros microorganismos implicados en la otitis media o en otras enfermedades. Estos incluyen Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, grupo A, Staphylococcus aureus, el virus sincitial respiratorio y Branhemella catarrhalis.

Al formular las composiciones de vacuna con el péptido o proteína, solo o en las diversas combinaciones descritas, el inmunógeno se ajusta hasta una concentración apropiada, y se formula con cualquier adyuvante de vacunas adecuado. El inmunógeno también se puede incorporar en liposomas, o se puede conjugar con polisacáridos y/o con otros polímeros para uso en una formulación de vacuna.

Las vacunas de la presente invención se administran a seres humanos o animales en una variedad de vías. Éstas incluyen las vías de administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral e intranasal.

El péptido y las proteínas de la presente invención también se administran como una vacuna atenuada. Para este fin, se preparan microorganismos recombinantes que expresan los péptidos o proteínas. El receptor de la vacuna se inocula con el microorganismo recombinante que se multiplica en el receptor, expresa el péptido o proteína de la proteína P5, y suscita una respuesta inmunitaria de Haemophilus influenzae. Los vectores de vacunas atenuadas preferidos son los poxvirus tales como el virus de la vacuna (Paoletti y Panicali, patente U.S. nº 4.603.112) y las cepas atenuadas de Salmonella (Stocker, patente U.S. nº 4.550.081).

Las vacunas atenuadas son particularmente ventajosas debido a que conducen a un estímulo prolongado que puede conferir inmunidad sustancialmente de larga duración. Cuando la respuesta inmunitaria es protectora contra la infección subsiguiente por Haemophilus influenzae, la propia vacuna atenuada se puede usar en una vacuna preventiva contra Haemophilus influenzae.

Las vacunas atenuadas polivalentes se preparan a partir de un único microorganismo recombinante, o a partir de unos pocos microorganismos recombinantes que expresan diferentes epítopos de Haemophilus influenzae (por ejemplo, otras proteínas de la membrana externa tales como PAL y PCP, o sus epítopos). Además, se pueden incorporar en la vacuna epítopos de otros microorganismos patógenos. Por ejemplo, un virus de la vacuna se puede manipular mediante ingeniería genética para que contenga secuencias codificantes para otros epítopos además de aquellos de Haemophilus influenzae. Tal virus recombinante se puede usar como el inmunógeno en una vacuna polivalente. Como alternativa, se puede formular como una vacuna polivalente una mezcla del virus de la vacuna u otros virus, que expresan cada uno un gen diferente que codifica diferentes epítopos de las proteínas de la membrana externa de Haemophilus influenzae y/o epítopos de otros organismos que provocan una enfermedad.

Otra vacuna de la presente invención es una vacuna con un virus inactivado. Las vacunas inactivadas están "muertas" en el sentido de que su capacidad infecciosa ha sido destruida, habitualmente mediante tratamiento químico (por ejemplo, tratamiento con formaldehído). De forma ideal, la capacidad infecciosa del virus se destruye sin afectar a las proteínas que portan la inmunogenicidad del virus. A fin de preparar vacunas inactivadas, se hacen crecer en cultivo grandes cantidades del virus recombinante que expresa los epítopos deseados, para proporcionar la cantidad necesaria de antígenos pertinentes. Para la formulación de vacunas "polivalentes", es útil una mezcla de virus inactivados que expresan diferentes epítopos. En ciertos casos, estas vacunas inactivadas "polivalentes" son preferibles frente a la formulación de la vacuna atenuada, debido a las dificultades potenciales que surgen de la interferencia mutua de los virus atenuados administrados juntos. En cualquier caso, el virus inactivado o la mezcla de virus se formula en un adyuvante adecuado, a fin de potenciar la respuesta inmunológica frente a los antígenos. Los adyuvantes adecuados incluyen: sustancias tensioactivas, por ejemplo hexadecilamina, ésteres de octadecil-aminoácidos, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietilpropandiamina), metoxihexadecilglicerol, y polioles plurónicos; poliaminas, por ejemplo pirano, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol; péptidos, por ejemplo dipéptido muramílico, dimetilglicina, tufsina; emulsiones de aceites; y geles minerales, por ejemplo hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc.

Los péptidos y proteínas de la presente invención también son útiles para producir anticuerpos policlonales para uso en inmunoterapia pasiva contra Haemophilus influenzae. Se prefiere la inmunoglobulina humana debido a que la inmunoglobulina heteróloga puede provocar una respuesta inmunitaria perjudicial frente a sus componentes inmunógenos extraños. Los antisueros policlonales se obtienen a partir de individuos inmunizados con los péptidos o proteínas en cualquiera de las formas descritas. Después, la fracción inmunoglobulínica se enriquece. Por ejemplo, las inmunoglobulinas específicas para epítopos de la proteína P5 se enriquecen mediante técnicas de inmunoafinidad empleando los péptidos o proteínas de la presente invención. El anticuerpo se absorbe específicamente a partir de los antisueros sobre un inmunoadsorbente que contiene los epítopos de la proteína P5, y después se eluye del inmunoadsorbente como una fracción enriquecida de la inmunoglobulina.

Además, para la detección de Haemophilus influenzae en diversos tejidos o fluidos corporales de pacientes, se pueden usar, como sondas en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos que tienen la secuencia nucleotídica del gen que codifica la proteína P5, o cualesquiera secuencias nucleotídicas que se hibridan con ella. Las sondas se pueden usar en cualquier tipo de ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, incluyendo: transferencias southern (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:508); transferencias nothern (Thomas et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-05); transferencias de colonias (Grunstein et al., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961-65), etc. Las condiciones de restricción de la hibridación se pueden variar dependiendo de los requisitos del ensayo.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Purificación de P5

Los extractos proteínicos de P5 se obtienen tanto de las cepas NTHi como de Hib mediante extracción diferencial con detergentes de las membranas externas. Después de las extracciones con octilglucósido, Zwittergent 3-14 y 0,5 M de NaCl, la proteína P5 se solubiliza con sarcosilo al 1% en 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de Na_{2}EDTA. Los extractos se ajustan a Zwittergent^{TM} 3-14 al 1% en el mismo tampón, y se dializan contra un exceso de 10 veces de Zwittergent^{TM} 3-14 al 1% en 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de Na_{2}EDTA (3 X), durante 24 horas. El extracto dializado se hizo pasar entonces a través de una columna de intercambio aniónico (DEAE) y una columna de intercambio catiónico (S) en tándem. Las columnas se separaron, y la columna S se eluyó con un gradiente salino creciente en el mismo tampón que contiene el Zwittergent. La proteína P5 purificada se eluye como un único pico según se analiza mediante SDS-PAGE (Figura 1).

Ejemplo 2 Digestión con proteasa, aislamiento del péptido, y secuenciación de la proteína

Se usan directamente P5 de NTHi y P5 de Hib purificadas para determinar la secuencia de aminoácidos N-terminal (Figura 2). La secuencia total de la proteína de NTHi se determina obteniendo péptidos solapantes mediante digestión con proteasa que utiliza varias proteasas incluyendo endopeptidasas Lys-C, Arg-C, Glu-C, papaína, tripsina y quimiotripsina. También se usa bromuro de cianógeno para romper la proteína, en los restos de metionina, para crear grandes fragmentos. Los péptidos se aíslan usando cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC) de microcalibre, y las secuencias se determinan mediante un secuenciador de proteínas. El alineamiento de los péptidos utiliza péptidos solapantes y homología con la proteína OmpA de E. coli (Figura 2).

Ejemplo 3 Ensayo de ELISA de células completas

Se preparan células completas de Haemophilus influenzae fijadas en formalina procedentes de varias cepas diferentes a partir de células de fase semi-log que se hacen crecer hasta OD_{490} = 1,0 en medios BHI-XV. Las células se lavaron dos veces en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (7 mM de NaHPO_{4}-7H_{2}O, 2 mM de KH_{2}PO_{4}, 2 mM de KCl, 137 mM de NaCl, pH 7,4), después se resuspendieron en PBS con formalina al 0,3%, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1-2 horas. La formalina se eliminó lavando las células en PBS y resuspendiendo las células en PBS hasta una concentración final OD_{620} = 0,2. Después se añadieron setenta y cinco microlitros de células a los pocillos de placa de microtitulación, y se secaron toda la noche a 37ºC. Las placas se bloquearon con PBS-Tween 20 al 0,1%, durante una hora, y se lavaron en un lavador de microplacas. Se añadieron a los pocillos cien microlitros de antisuero diluido en disolución salina tamponada con fosfato que contiene 0,15 mM de CaCl_{2}, 0,5 mM de MgCl_{2}, gelatina al 1% y Tween-20 al 0,3% (PCM-GT), y las placas se incubaron a 37ºC durante dos horas. Después de lavar, los anticuerpos unidos se detectaron con anti-(IgG + IgM) de ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (TAGO), diluido en PBS, Tween-20 al 0,05%, gelatina al 0,1%, durante una hora a 37ºC. Las células se lavaron nuevamente, y las placas se desarrollaron con una disolución de 1 mg/ml de fosfato de p-nitrofenilo (SIGMA) en dietanolamina, durante treinta minutos. La reacción se paralizó tras la adición de NaOH 3 N. Las placas se leen en un lector a OD_{450}, referencia OD_{620}. Los datos de ELISA de células completas para el antisuero de P5 de conejo y de ratón se muestran en las Figuras 3 y 4, respectivamente.

Ejemplo 4 Ensayo bactericida

Las células procedentes de varias cepas diferentes de Haemophilus influenzae se hicieron crecer toda la noche en medios BHI-XV. Se prepararon los siguientes cultivos frescos diurnos a partir de una dilución 1:10 de un lote durante toda la noche, y se hicieron crecer hasta OD_{490} = 1,0. Durante el crecimiento celular, se preadsorbió una fuente de complemento, suero de ternera precalostral, con células P860295 durante una hora. Las células se peletizaron entonces lejos del complemento, y el complemento preadsorbido se filtró de forma estéril a través de un filtro de 0,2 \mum, y se almacenó en hielo antes del uso. Todo el antisuero cribado en este ensayo se inactivó por calor a 56ºC durante 15 minutos, para eliminar la actividad del complemento, y se diluyó 1:5 en PCM, seguido de diluciones subsiguientes de dos veces que se preparan en placas de microtitulación estériles de 96 pocillos. Las células bacterianas, que se hacen crecer hasta una OD_{410} = 1,0, se diluyen 1:100.000 en PCM que contienen la fuente de complemento a una dilución de 1:5. Se añaden 15 microlitros de esta mezcla a las diluciones en serie de antisuero, y se dejan incubar las placas durante cuarenta y cinco minutos a 37ºC. Después de esto, se colocan diez microlitros de cada reacción en placas en BHI-XV. Después de la incubación durante toda la noche a 37ºC, las colonias se cuentan para determinar los títulos bactericidas (el recíproco de la dilución más elevada de antisuero capaz de exterminar más del 50% de bacterias, según se compara con controles de sueros preinmunitarios). Los datos bactericidas con respecto a P5 se representan en la Figura 5.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Zlotnick Dr., Gary W.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna para cepa de Haemophilus influenzae no tipificable

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 1

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

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(A): DESTINATARIO: American Cyanamid Company

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(B): CALLE: One Cyanamid Plaza

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(C): CIUDAD: Wayne

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(D): ESTADO: New Jersey

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL: 07470-8426

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(v): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-MAR-1994

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): ABOGADO/INFORMACIÓN DEL AGENTE:

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(A): NOMBRE: Harrington, James J

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DE CASO: 32.144

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: 201/831-3246

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(B): FAX: 201/831-3305

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 338 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: desconocido

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(D): TOPOLOGÍA: desconocido

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº:1:

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1

Claims

1. Proteína P5 nativa sustancialmente pura de la membrana externa de una cepa bacteriana de Haemophilus influenzae.

2. Proteína P5 nativa sustancialmente pura de la membrana externa de una cepa bacteriana de Haemophilus influenzae según la reivindicación 1, que se puede obtener mediante un procedimiento de purificación que comprende la extracción diferencial con detergentes, no desnaturalizante, de células de Haemophilus influenzae.

3. Proteína según la reivindicación 2, en la que dicho procedimiento de purificación comprende extraer una preparación de compuestos de la membrana externa de dichas células con una disolución acuosa de la sal sódica de N-lauroil-sarcosina, que comprende:

(a): extraer un resto insoluble que comprende la proteína P5 con una disolución acuosa de sulfobetaína;

(b): solubilizar el resto insoluble de la etapa (a) con N-lauroil-sarcosinato;

(c): dializar el resto de la etapa (b) con sulfobetaína;

(d): hacer pasar el extracto dializado a través de una columna de intercambio aniónico y de una columna de intercambio catiónico;

(e): eluir la proteína P5 a partir de una columna de intercambio catiónico adecuada, y

(f): recuperar la proteína P5 esencialmente pura a partir de una columna de intercambio catiónico tras la elución.

4. Proteína P5 según la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos se proporciona en SEC ID nº:1, o cualquier secuencia modificada de la misma, en la que los restos de aminoácidos se han añadido, insertado, sustituido o suprimido sin quitar mérito a las propiedades bactericidas u opsónicas, o ambas, de la proteína, en la que la proteína suscita anticuerpos bactericidas contra Haemophilus influenzae en un huésped.

5. Método para asilar y purificar la proteína P5 a partir de una membrana externa de Haemophilus influenzae después de extraer una preparación de compuestos de la membrana externa con una disolución acuosa de la sal sódica de N-lauroil-sarcosina, comprendiendo el método mejorado:

(c): dializar el resto de la etapa (b) con sulfobetaína;

6. Composición de vacuna que comprende una cantidad inmunógena de proteína P5 nativa sustancialmente pura de Haemophilus influenzae según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, y un adyuvante opcional.

7. Composición de vacuna según la reivindicación 6, que comprende además por lo menos un antígeno adicional o uno o más organismos.

8. Composición de vacuna según la reivindicación 7, en la que el organismo es una bacteria, virus, parásito u hongo.

9. Composición de vacuna que comprende un conjugado de antígeno compuesto de proteína P5 nativa sustancialmente pura según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugada con un antígeno de un organismo o un epítopo o epítopos del mismo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, y un adyuvante opcional.

10. Composición de vacuna según la reivindicación 9, en la que el organismo es Haemophilus influenzae.

11. Cantidad inmunógena de proteína P5 nativa sustancialmente pura de Haemophilus influenzae según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso para inmunizar contra Haemophilus influenzae.

12. Uso de una cantidad inmunógena de proteína P5 nativa sustancialmente pura de Haemophilus influenzae según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la preparación de un medicamento para inmunizar contra Haemophilus influenzae.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que la proteína tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº:1, o cualquier secuencia modificada de la misma, en la que los restos de aminoácidos se han añadido, insertado, sustituido o suprimido sin quitar esencialmente mérito a las propiedades bactericidas u opsónicas, o ambas, de la proteína.

14. Uso según la reivindicación 12 ó 13, en el que la proteína se administra conjuntamente con por lo menos algún otro antígeno de Haemophilus influenzae.

15. Cantidad inmunógena de proteína P5 nativa sustancialmente pura de Haemophilus influenzae derivada de un agente etiológico de otitis media, sinusitis o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, para uso para prevenir, reducir la susceptibilidad a, o tratar la otitis media aguda, la sinusitis o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

16. Uso de una cantidad inmunógena de proteína P5 nativa sustancialmente pura de Haemophilus influenzae derivada de un agente etiológico de otitis media, sinusitis o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, en la preparación de un medicamento para prevenir, reducir la susceptibilidad a, o tratar la otitis media aguda, la sinusitis o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.