CN102657856A - 一种细菌传递的双交叉保护疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种细菌传递的迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉保护疫苗。交叉保护疫苗为质粒pDKS10转化大肠杆菌DH5α获得的重组菌株。本发明所得疫苗对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌感染分别有83％和75％的保护效率。

Description

一种细菌传递的双交叉保护疫苗

技术领域

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种细菌传递的迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉保护疫苗。 

背景技术

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)分别为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，二者皆为重要的养殖鱼类病原菌，其宿主范围涵盖多种海水和淡水鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、罗非鱼、美国红鱼等。在我国，由迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌引起的疫病暴发流行给多种养殖鱼类产业造成了严重的经济损失。除了鱼类外，迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌皆为动物感染性病原，能够感染人类和其它陆生动物。目前，分别针对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的单一性疫苗在国际上已多有报道，但是尚无能够同时针对这两种病原的交叉保护疫苗。 

发明内容

本发明目的在于提供一种细菌传递的交叉保护疫苗。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种交叉保护疫苗，交叉保护疫苗为质粒pDKS10转化大肠杆菌DH5α获得的重组菌株。 

交叉保护疫苗的应用，所述疫苗在制备具有预防和治疗迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉疫苗制剂中的应用。将所述质粒pDKS10转化入大肠杆菌DH5α得重组菌株经LB培养基培养至OD₆₀₀为0.8-1后溶于PBS。 

本发明具有如下优点： 

1.制备简单。本发明的疫苗只需简单的常规细菌培养，无需任何提取、纯化过程。 

2.交叉保护效应。本发明疫苗能够同时保护鱼类抵抗迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌感染，且保护效应分别高达83％和75％。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。 

实施例1 

1)质粒pEADnaK的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，51℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，61℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用“天根生化科技(北京)有限公司”DNA产物纯化试剂盒纯化后与载体pEASY-E2(购自于“北京全式 金生物技术有限公司”)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养18小时，挑取一个转化子，提取质粒，即为pEADnaK。 

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；所述菌株TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，保藏时间2008年1月9日。 

所述引物为F1：5’-CCCGGGATGGGTAAAATCATTGGTATCGA-3’和R1：5’-CCCGGGTTTTTTATCTTTCACTTCTTCGAA-3’。 

2)质粒pDKS10的构建：以海豚链球菌G26为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，49℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，61℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。 

同时将质粒pBT3用NdeI/EcoRV酶切回收3.4kb片段。所述质粒pBT3构建过程参见Zhang WW，Sun K，Cheng S，Sun L.Characterization of DegQ_Vh，a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain.Appl Environ Microbiol 2008；74：6254-62。 

将上述回收片段和纯化的PCR产物用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素(Ap，50ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBTSia10。将质粒pBTSia10和上述实施例的质粒pEADnaK分别用EcoRV和SmaI酶切，回收4kb和1.9kb片段，将其用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含Ap(50ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pDKS10。 

所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1984，分类命名为海豚链球菌(Streptococcus iniae)，保藏时间2007年3月22日。 

所述引物为F2：5’-CCCGGGATGGGTAAAATCATTGGTATCGA-3’和R2：5’-GATATCTCCTCCGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’。 

实施例2 

疫苗的构建：将质粒pDKS10按照Hanahan方法(Sambrook and Russell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)转化入大肠杆菌DH5，得菌株DH5α/pDKS10；将DH5α/pDKS10在含Ap(50ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，提取质粒，经测序发现该质粒即为质粒pDKS10，说明菌株DH5α/pDKS10确实含有pDKS10。菌株DH5α/pDKS10即为对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌有交叉保护作用的疫苗菌株。作为对照，将质粒pBT3按照同样方法转化入大肠杆菌DH5，得菌株DH5α/pBT3，即为对照菌株。 

实施例3 

疫苗的应用：步骤1)疫苗制备液的制备。将上述所得疫苗菌株DH5α/pDKS10和对照菌株DH5α/pBT3在LB液体培养基中培养至OD₆₀₀为0.8-1，而后将培养液离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其分别悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁸cfu/ml，即为疫苗制备液和对照液。 

步骤2)疫苗的接种。将120条牙鲆(每条重约12.2g)随机分为4组，每组30条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)的对照液。 

步骤3)迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德华氏菌TX1和海豚链球菌G26至OD₆₀₀为0.9，然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体。将迟缓爱德华氏菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为4x10⁶cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液；将海豚链球菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁸cfu/ml，即为海豚链球菌悬液。 

步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，用上述步骤3)的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2)的C和D组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，5条；B组，29条；C组，6条；D组，24条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)： 

RPS＝100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故DH5α/pDKS10针对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的免疫保护效率分别为83％和75％。 

由此得出DH5α/pDKS10对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌具有良好的交叉免疫保护效应。 

Claims (3)

1.一种交叉保护疫苗，其特征在于：交叉保护疫苗为质粒pDKS10转化大肠杆菌DH5α获得的重组菌株。

2.一种权利要求1所述的交叉保护疫苗的应用，其特征在于：所述疫苗在制备具有预防和治疗迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的交叉疫苗制剂中的应用。

3.按权利要求2所述的交叉保护疫苗的应用，其特征在于：将所述质粒pDKS10转化入大肠杆菌DH5α得重组菌株经LB培养基培养至OD₆₀₀为0.8-1后溶于PBS。