CN102614526A - 一种交叉保护性dna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种针对鳗弧菌和海豚链球菌的交叉保护性DNA疫苗。DNA疫苗为真核重组表达质粒pISO。制备方法所述重组质粒pISO，将质粒pBSOU和质粒pISi10分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化大肠杆菌DH5α，得质粒pISO。本发明所述DNA疫苗pISO对鳗弧菌和海豚链球菌分别有83％和82％的免疫保护效率。

Description

一种交叉保护性DNA疫苗
技术领域
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种针对鳗弧菌和海豚链球菌的交叉保护性DNA疫苗。 
背景技术
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)分别为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，二者皆为重要的养殖鱼类病原菌，其宿主范围涵盖多种海水和淡水鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、罗非鱼、美国红鱼等。在我国，由鳗弧菌和海豚链球菌引起的疫病暴发流行给多种养殖鱼类产业造成了严重的经济损失。除了鱼类外，鳗弧菌和海豚链球菌皆为动物感染性病原，能够感染人类和其它陆生动物。目前，分别针对鳗弧菌和海豚链球菌的单一性DNA疫苗在国际上已有报道，但是尚无能够同时针对这两种病原的交叉保护性DNA疫苗。 
发明内容
本发明目的在于提供一种细菌传递的交叉保护疫苗。 
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 
一种交叉保护性DNA疫苗为真核重组表达质粒pISO。 
所述重组质粒pISO，将质粒pBSOU和质粒pISi10分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化大肠杆菌DH5，得质粒pISO。 
交叉保护性DNA疫苗的制备方法，所述重组质粒pISO，将质粒pBSOU和质粒pISi10分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化大肠杆菌DH5，得质粒pISO。 
所述质粒pISi10，以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pBS-T连接，连接液转化入大肠杆菌DH5，得质粒pISi10； 
所述质粒pBSOU，以鳗弧菌VA68为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，得质粒pBSOU。 
具体为： 
1)质粒pISi10的构建：以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接4-6小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)的LB培养基上培养18-24小时，得质粒pBSS10； 
将质粒pBSS10和质粒pID2分别用SmaI和EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含安 卡青霉素的LB固体培养基上培养24小时，即为质粒pISi10； 
2)DNA疫苗pISO的构建：以鳗弧菌VA68为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接4-6小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)的LB培养基上培养18-24小时，得质粒pBSOU； 
将质粒pBSOU和质粒pISi10分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为DNA疫苗pISO； 
所述引物F1为5’-CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3’，R1为5’-CTCGAGCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’；所述引物为F2为5’-CCCGGGACCACCATGAACAAAACTCTGATTG-3’，R2为5’-CCCCGGGAGAAGTCGTAACGTAGACCT-3’。 
交叉保护性DNA疫苗的应用，所述DNA疫苗在制备具有预防和治疗鳗弧菌和海豚链球菌的交叉疫苗制剂中的应用。 
本发明具有如下优点：本发明疫苗能够同时保护鱼类抵抗鳗弧菌和海豚链球菌感染，且保护效应分别高达83％和82％。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。 
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法： 
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。 
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Pres s 2001)； 
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。 
实施例1 
交叉保护性DNA疫苗pISO的构建 
步骤1)质粒pISi10的构建：以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，50℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，62℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与载体pBS-T(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接4-6小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素(Ap，100ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pBSS10。将pBSS10和质粒pID2(pID2构建过程参见Hu YH，Sun L.A bivalent Vibrio  harveyi DNA vaccine induces strong protection in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus).Vaccine 2011；29：4328-33)分别用SmaI和EcoRV酶切，分别回收0.5kb和6kb片段，将二者用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pISi10。 
所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1984，分类命名为海豚链球菌(Streptococcus iniae)，保藏日期2007年3月22日。 
所述引物为F1：5’-CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3’和R1：5’-CTCGAGCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’。 
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水。 
步骤2)DNA疫苗pISO的构建：以鳗弧菌VA68为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，55℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，65℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。PCR产物纯化后与天根载体pBS-T于室温连接4-6小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pBSOU。将pBSOU和上述质粒pISi10用SmaI酶切，分别回收1kb和6.5kb片段，将二者用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为DNA疫苗pISO。 
所述鳗弧菌VA68购于美国ATCC(American type culture collection)，编号68554，分类名为Vibrio anguillarum。 
所述引物为F2：5’-CCCGGGACCACCATGAACAAAACTCTGATTG-3’和R2：5’-CCCCGGGAGAAGTCGTAACGTAGACCT-3’。 
实施例2 
DNA疫苗的应用 
步骤1)疫苗制备液。将上述所得DNA疫苗质粒pISO在PBS中稀释至终浓度为150μg/ml，即为疫苗制备液。 
步骤2)疫苗的接种。将100条牙鲆(每条重约11.3g)随机分为4组，每组25条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别腹腔注射100ul PBS。 
步骤3)鳗弧菌和海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养鳗弧菌VA68和海豚链球菌G26至OD600为0.9，然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体。将鳗弧菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为4x107cfu/ml，即为鳗弧菌悬液；将海豚链球菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为1x108cfu/ml，即为海 豚链球菌悬液。 
步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的鳗弧菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，用上述步骤3)的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2)的C和D组鱼，每条鱼的注射量为100u l。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，3条；B组，18条；C组，3条；D组，17条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)： 
RPS＝100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故DNA疫苗pISO针对鳗弧菌和海豚链球菌的免疫保护效率分别为83％和82％。 
由此得出DNA疫苗pISO对鳗弧菌和海豚链球菌具有良好的交叉免疫保护效应。 
Figure IDA0000142963210000011

Claims (6)

1.一种交叉保护性DNA疫苗，其特征在于：DNA疫苗为真核重组表达质粒pISO。
2.按权利要求1所述的交叉保护性DNA疫苗，其特征在于：述重组质粒pISO，将质粒pBSOU和质粒pISi10分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化大肠杆菌DH5，得质粒pISO。
3.一种权利要求1所述的交叉保护性DNA疫苗的制备方法，其特征在于：所述重组质粒pISO，将质粒pBSOU和质粒pISi10分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化大肠杆菌DH5，得质粒pISO。
4.按权利要求3所述的交叉保护性DNA疫苗的制备方法，其特征在于：所述质粒pISi10，以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pBS-T连接，连接液转化入大肠杆菌DH5，得质粒pISi10；
所述质粒pBSOU，以鳗弧菌VA68为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T连接，连接液转化入大肠杆菌DH5，得质粒pBSOU。
5.按权利要求3或4所述的交叉保护性DNA疫苗的制备方法，其特征在于：
1)质粒pISi10的构建：以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接4-6小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)的LB培养基上培养18-24小时，得质粒pBSS10；
将质粒pBSS10和质粒pID2分别用SmaI和EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5后在含安卡青霉素的LB固体培养基上培养24小时，即为质粒pISi10；
2)DNA疫苗pISO的构建：以鳗弧菌VA68为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接4-6小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)的LB培养基上培养18-24小时，得质粒pBSOU；
将质粒pBSOU和质粒pISi10分别用SmaI酶切，酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5后在含安卡青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为DNA疫苗pISO；
所述引物F1为5’-CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3’，R1为5’-CTCGAGCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’；所述引物为F2为5’-CCCGGGACCACCATGAACAAAACTCTGATTG-3’，R2为5’-CCCCGGGAGAAGTCGTAACGTAGACCT-3’。
6.一种权利要求1所述的交叉保护性DNA疫苗的应用，其特征在于：所述DNA疫苗在制备具有预防和治疗鳗弧菌和海豚链球菌的交叉疫苗制剂中的应用。
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