CN103497243B - 一种鱼类高迁移率族蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎高迁移率族蛋白及其应用。高迁移率族蛋白为半滑舌鳎高迁移率族蛋白，由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。本发明的高迁移率族蛋白能够显著抑制病毒和细菌感染。

Description

一种鱼类高迁移率族蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎高迁移率族蛋白及其应用。
背景技术
High mobility group box B2（HMGB2）是高迁移率族蛋白（High mobilitygroup protein）家族的成员。高迁移率族蛋白是一种高度保守的非组蛋白类DNA结合蛋白，其分子量约为24kDa。HMG蛋白广泛存在于真核细胞中，具有维持核小体结构和调节基因转录的功能，近来发现它是炎性反应强有力的促炎因子。HMG既可以从凋亡细胞中释放到胞外，也可以被IL-1β,TNF-α,IFN-γ等激活的细胞分泌到胞外。胞外HMG蛋白可以调节多种免疫和炎症反应，比如激活炎症细胞，刺激细胞因子的产生和细胞增殖。HMG蛋白可激活DC细胞并诱导DC细胞成熟，使其在外周组织获得的外源性抗原提呈给未致敏T细胞，从而启动免疫反应。同时HMG蛋白也通过激活巨噬细胞从而释放一系列炎性因子引起炎症反应。因此HMG蛋白是免疫系统中一种关键的细胞因子。
发明内容
本发明目的在于提供一种半滑舌鳎高迁移率族蛋白HMGB2及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种鱼类高迁移率族蛋白，高迁移率族蛋白为半滑舌鳎高迁移率族蛋白，由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。
鱼类高迁移率族蛋白的制备方法：
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与经SwaI酶切后的质粒pET259用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为含SEQ ID No.1中氨基酸序列所示的质粒pEHMGB2；质粒经纯化，即得到由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示；
所述F1为5’-GATATCATGACAAAGGACCCTAATAGACC-3’；R1为5’-GATATCTTCATCATCGTCATCATCAT-3’。
鱼类高迁移率族蛋白的应用：所述序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的高迁移率族蛋白可用于制备抗细菌或病毒的药物。
所述细菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)；所述病毒为细胞肿大病毒（megalocytivirus）。
本发明具有如下优点：本发明的高迁移率族蛋白HMGB2能够显著抑制鱼类病原性细菌和病毒侵染。
附图说明
图1为本发明实施例提供的经纯化的高迁移率族蛋白HMGB2蛋白电泳检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001）。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
本发明的核因子45为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No.1为：
MTKDPNRPRGKTSSYAFFVATCREEHKKKHPGTSVNFSEFSKKCSERWKTKSGKEKGKFE
ELAKNDKVRYEREMKTYVPPKGAKKGKKEKDPNAPKRPPSAFFVFCSDHRPRIKEEHPGI
SIGEIAKKLGELWSTQSSKDKAPYEAKAAKLKEKYEKEVAAYRAKSGTGKSDAGKKSGPG
RPPKKAEPADDDDDDDDDEEEDDDDDDDDDDE
（a）序列特征：
●长度：212
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：蛋白质
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：半滑舌鳎
结构特点：该蛋白含有两个HMG box结构域（氨基酸7－79和94－164）。
实施例2
重组高迁移率族蛋白的制备：
1）质粒pEHMGB2的构建：
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增高迁移率族蛋白基因。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,55℃60s,72℃60s,5个循环后改为94℃40s,60℃60s,72℃60s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将载体pET259（pET259构建过程参见Zheng W,Hu Y,Zhang M,Sun L.Analysisof the expression and antioxidative property of a peroxiredoxin6from Scophthalmus maximus.Fish Shellfish Immunol.2010;29(2):305–311.）用SwaI酶切后回收5.4kb片段，将其与上述纯化的PCR片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（30ug/ml）的LB培养基培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为质粒pEHMGB2。
所述LB液体培养基组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGACAAAGGACCCTAATAGACC-3’；R1为5’-GATATCTTCATCATCGTCATCATCAT-3’。
2）重组高迁移率族蛋白的表达纯化
将上述的质粒pEHMGB2用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)（购自于“天根生化科技有限公司”，北京），在含有卡那霉素（30ug/ml）的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取一个转化子，将其命名为BL21/pEHMGB2。将BL21/pEHMGB2于含有卡那霉素（30ug/ml）的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有卡那霉素（30ug/ml）的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为0.3mM的isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，30℃继续以转速160rpm摇动培养4-6h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清液。将上清液采用蛋白亲和层析柱His Trap HP Columns（亲和层析过程中的洗脱液在产品说明书中有详细描述）（购于美国GE Healthcare公司）回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测（8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h），发现其分子量与高迁移率族蛋白相同，即为重组高迁移率族蛋白（参见图1）。
所述裂解液为终浓度的10mM NaH2PO4、10mM Tris和8M尿素,pH8.0。
实施例3
重组高迁移率族蛋白的应用
步骤1）蛋白注射
将上述实施例2步骤2）的重组高迁移率族蛋白在PBS中稀释至200ug/ml，即为高迁移率族蛋白稀释液。将20半滑舌鳎（重约11.6g）随机分为4组，每组5条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射0.1ml高迁移率族蛋白稀释液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别注射100ul PBS。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8%NaCl,0.02%KCl,0.358%Na2HPO4.12H2O,0.024%NaH2PO4，余量为水。
步骤2）细菌和病毒悬液制备
在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TX1至OD600为0.8,然后离心（5000g，4℃，10min），收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x107cfu/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。
所述迟缓爱德华氏菌TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330，保藏日期2008.1.21，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。
将细胞肿大病毒RBIV-C1（具体制备方法见Zhang M,Xiao Z,Hu Y,SunL.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege),in China.Aquac Res.2012;43:556–64）于PBS中稀释至1x106copies/ml，即为病毒悬液。
步骤3）攻毒感染
在上述步骤1）注射后4h，将A和B组的每条鱼注射50ul上述步骤2）的迟缓爱德华氏菌悬液，将C和D组的每条鱼注射50ul上述步骤2）的病毒悬液。在感染后第6h，取A和B组鱼肾脏组织；在感染后第5d，取C和D组组鱼肾脏组织。将A和B组鱼的组织在2ml PBS中匀浆，将100ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30℃培养48h，计算出现的菌落数。利用DNA提取试剂盒（购于天根生化科技(北京)有限公司”）从C和D组鱼组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量（具体方法见上述参考文献）。结果表明A组鱼的细菌数（6.9x103）显著（P<0.01）低于B组鱼的细菌数（1.7x104）；C组鱼的病毒数（1.1x106）显著（P<0.01）低于D组鱼的病毒数（4.1x106）。
这些结果表明，所获高迁移率族蛋白HMGB2能够显著增强鱼类抵抗细菌和病毒的侵染。

Claims (3)

1.一种鱼类高迁移率族蛋白，其特征在于：高迁移率族蛋白为半滑舌鳎高迁移率族蛋白，由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。
2.一种权利要求1所述鱼类高迁移率族蛋白的制备方法，其特征在于：
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物纯化后与经SwaI酶切后的质粒pET259用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，质粒经表达纯化，即得到由序列表SEQ IDNo.1中的氨基酸序列所示的鱼类高迁移率族蛋白；
所述F1为5’-GATATCATGACAAAGGACCCTAATAGACC-3’；R1为5’-GATATCTTCATCATCGTCATCATCAT-3’。
3.一种权利要求1所述鱼类高迁移率族蛋白的应用，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的高迁移率族蛋白可用于制备抗细菌或病毒的药物；
所述细菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)；所述病毒为细胞肿大病毒(megalocytivirus)。
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