CN102240398A - 一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法。其疫苗抗原为由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。本发明的亚单位疫苗的应用不需商业佐剂，只需配以简单的氢氧化铝佐剂即可获得高免疫效应。

Description

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法

技术领域

本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法。

背景技术

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)为革兰氏阴性杆菌，属于爱德华氏菌属。近年来大量报道表明，迟缓爱德华氏菌是一种重要的鱼类病原菌，能够感染多种海水和淡水鱼类，包括牙鲆、鲤鱼、鳗鱼、鲶鱼、大菱鲆、罗非鱼等，由此对水产养殖业造成严重经济损失。除了水生动物外，迟缓爱德华氏菌还能感染人类，引起胃肠炎、肌肉坏死等病症。目前，尚无针对迟缓爱德华氏菌的商业化疫苗，迟缓爱德华氏菌病防治主要依赖抗生素类药物的使用。由于抗生素应用所带来的各种不良后果，其使用已在国际上受到限制。在这种情况下，迟缓爱德华氏菌病的非抗生素控制研究，包括疫苗研发，具有重要意义。亚单位疫苗是一种常见的疫苗形式，这种疫苗通常为病原体的一个蛋白成分，能够诱发特异性强的免疫反应。亚单位疫苗的缺点是其自身诱发的免疫保护效应较低；对于纯化的蛋白质性亚单位疫苗而言，通常需要配以佐剂才能达到理想的免疫效应。由于商业佐剂使用成本较昂贵，因此如何解决佐剂问题也是亚单位疫苗应用所必须考虑的问题。

发明内容

本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗：其疫苗抗原为由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。其抗原为转化了重组质粒pETOH的大肠杆菌表达的重组蛋白。

所述重组质粒pETOH，以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F3/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSOH；将质粒pBSOH用NdeI/XhoI双酶切回收0.5kb，同时将质粒pBT258用NdeI/XhoI双酶切回收4.6kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH；

所述引物为F3：5’-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3’和R1：5’-CGATATCCTCGAGTATAACCTGTTTCAATACTTGA-3’。

迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备：

1)质粒pETOH的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F3/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSOH；将质粒pBSOH用NdeI/XhoI双酶切回收0.5kb，同时将质粒pBT258用NdeI/XhoI双酶切回收4.6kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH；

所述引物为F3：5’-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3’和R1：5’-CGATATCCTCGAGTATAACCTGTTTCAATACTTGA-3’；

2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将质粒pETOH转化大肠杆菌BL21(DE3)，得转化子BL21/pETOH；将BL21/pETOH于含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入新鲜的LB液体培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG并于37℃继续培养4-5h，然后在菌液中加入裂解液，室温摇动1-2小时；将菌液离心，回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的亚单位疫苗蛋白。

将上述得到亚单位疫苗蛋白在PBS中稀释至250ug/ml，而后将稀释的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。

所述佐剂为将5％(质量比)NaOH和5％(质量比)Al₂(SO₄)₃以2∶5体积比混合，将混合物离心后悬浮于PBS中至0.2mg/ml。

本发明具有如下优点：

1.高保护效应。本发明所得疫苗保护效应可达83％。

2.应用时无需配以商业化佐剂。本发明的铝佐剂制备异常简单，造价低廉，并且具有高效免疫增强作用，故可替代商业化佐剂。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的亚单位疫苗(泳道2)。图1：泳道1为蛋白分子量标准。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗抗原为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示(参见序列表1)。

序列表1

MSLTQLGDGKEFKVKKWLYAAGLGVAMAVSANVQAAEKIAVVNVASVFQQLPQRDAVAKQLESEFKGRATELQGMERDLQ

GKMQRLQRDASTMKASERTKMEKEIAAQRETFARKAQAFEQDNRRRQMEERNKLLSRIQDAVRSVAKDKGYDMVIDANAV

AYPQSSDDITAQVLKQVI

(a)序列特征：

●长度：178

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：迟缓爱德华氏菌TX1

(f)特异性名称：OmpH

结构特征：该蛋白含有1个OmpH功能域(氨基酸25-178)和两个α螺旋(分别由氨基酸24-48和52-147构成)。

实施例2

迟缓爱德华氏菌疫苗表达载体的构建方法：

1)质粒pETOH的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F3/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，50℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，60℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBSOH。将质粒pBSOH用NdeI/XhoI双酶切回收0.5kb，同时将质粒pET258用NdeI/XhoI双酶切回收4.6kb片段。所述质粒pET258构建过程参见ZhangW，SunK，Cheng S，SunL.Characterization of DegQ_Vh，a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain.Appl EnvironMicrobiol 2008；74：6254-62。将上述回收两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；所述菌株TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。

所述引物为F3：5’-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3’和R1：5’-CGATATCCTCGAGTATAACCTGTTTCAATACTTGA-3’。

2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化

将上述步骤1)的质粒pETOH用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，而后筛选抗卡那霉素的转化子，挑取一个转化子，将其命名为BL21/pETOH。将BL21/pETOH于含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml新鲜的含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃继续以转速160rpm摇动培养4-5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用His Trap HP Columns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25-30min，随后15v/cm电压下电泳2-2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)。将纯化的蛋白经N端测序分析，证实其为具有序列表SEQ ID No1中的氨基酸序列的亚单位疫苗抗原蛋白。同时该蛋白含有1个OmpH功能域(氨基酸25-178)和两个α螺旋(分别由氨基酸24-48和52-147构成)。

所述裂解液为终浓度的10mM NaH₂PO₄、10mM Tris和8M尿素，pH8.0。

实施例3

迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的应用

步骤1)佐剂及疫苗混合液的制备。

佐剂制备：将5％(质量比)NaOH和5％(质量比)Al₂(SO₄)₃以2∶5体积比混合，将混合物以10,000g离心5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至0.2mg/ml。

疫苗混合液制备：将上述实施例2纯化的疫苗蛋白在PBS中稀释至250ug/ml；将稀释后的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.358％Na₂HPO₄.12H₂O，0.024％NaH₂PO₄，余量为水。

步骤2)疫苗的免疫应用。将90条牙鲆(每条重约10g)随机分为3组，每组30条。将这3组分别命名为A，B和C组。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)的疫苗混合液。A组即为试验组。将B组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)的PBS；将C组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1)的佐剂。B和C组即为对照组。

步骤3)迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TX1至OD₆₀₀为0.7，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁷cfu/ml。

步骤4)亚单位疫苗免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2)的3组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。14天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，5条；B组，30条；C组，30条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：

RPS＝100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)

根据此公式算出亚单位疫苗的免疫保护效率为83.3％。因此，所得亚单位疫苗能够高效地保护牙鲆抵御迟缓爱德华氏菌侵染。

Claims (6)

1.一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于：其疫苗抗原为由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。

2.按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于：其抗原为转化了重组质粒pETOH的大肠杆菌表达的重组蛋白。

3.按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于：所述重组质粒pETOH，以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F3/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSOH；将质粒pBSOH用NdeI/XhoI双酶切回收0.5kb，同时将质粒pBT258用NdeI/XhoI双酶切回收4.6kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH；

所述引物为F3：5’-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3’和R1：5’-CGATATCCTCGAGTATAACCTGTTTCAATACTTGA-3’。

4.一种按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备，其特征在于：

1)质粒pETOH的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F 3/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSOH；将质粒pBSOH用NdeI/XhoI双酶切回收0.5kb，同时将质粒pBT258用NdeI/XhoI双酶切回收4.6kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH；

所述引物为F3：5’-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3’和R1：5’-CGATATCCTCGAGTATAACCTGTTTCAATACTTGA-3’；

2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将质粒pETOH转化大肠杆菌BL21(DE3)，得转化子BL21/pETOH；将BL21/pETOH于含有Kn的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入新鲜的LB液体培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG并于37℃继续培养4-5h，然后在菌液中加入裂解液，室温摇动1-2小时；将菌液离心，回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的亚单位疫苗蛋白。

5.按权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备，其特征在于：将上述得到亚单位疫苗蛋白在PBS中稀释至250ug/ml，而后将稀释的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。

6.按权利要求5所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备，其特征在于：所述佐剂为将5％(质量比)NaOH和5％(质量比)Al₂(SO₄)₃以2∶5体积比混合，将混合物离心后悬浮于PBS中至0.2mg/ml。

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