CN1202905A - 副流感病毒糖蛋白和疫苗 - Google Patents
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Abstract
血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)糖蛋白共分离和共纯化自1型副流感病毒(PIV-1)和3型副流感病毒(PIV-3)。HN和F糖蛋白单独分离和纯化自2型副流感病毒(PIV-2)。配制成疫苗的糖蛋白具有高度免疫原性并且保护相关的动物模型抗副流感感染。含有PIV-3HN和F糖蛋白的疫苗在成年人和儿童中是安全的并具有免疫原性。含有IPV-1、PIV-2和PIV-3的HN和F糖蛋白的三价疫苗产生能够中和每种病毒的免疫反应。
Description
发明领域
本发明涉及副流感病毒(PIV)糖蛋白、包括这种蛋白和多价疫苗组合物的制备方法。
发明背景
人类呼吸道合胞体病毒A和B亚型(RSV A & B)和1、2和3型人副流感病毒(PIV-1、2、3)感染为发达国家婴幼儿和儿童急性下呼吸道感染最为常见的原因。仅在美国,每年近5百万儿童将感染副流感病毒。作为婴幼儿支气管炎和肺炎的主要致病因素,PIV-3仅次于RSV。据估计在美国,由于PIV-1和2的感染,每年约有600,000名6岁以下儿童患喉-气管-支气管炎(哮吼)(croup)并且约有1,000名婴幼儿可能由于PIV-3的感染而死亡。约10~15%细支气管炎和肺炎住院治疗病人可归因于PIV-3的感染,导致美国每年1千4百多万名婴幼儿遭受临床上显著的PIV-3感染(参考文献.1-在通篇申请书中,参考了括号中不同的参考文献以更为详细地描述本发明涉及的领域状态。每次引用的完整文献信息见说明书的结尾、紧邻权利要求的前面。在此引入这些参考文献内容供本发明参考)。PIV-3感染的那些个体中,1%到2%将需要住院治疗并且有些儿童将会死亡。PIV-3感染的峰值年龄在2~4月龄而PIV-相关的哮吼峰值年龄为9~24月龄。副流感病毒的重复感染很常见,PIV-3最常出现。
目前,能够保护婴幼儿和少年儿童免受此类病毒感染的安全而有效的疫苗还没有能得到。因此,开发有效的流感疫苗具有优先必要性。
抗副流感病毒感染的活体病毒疫苗和糖蛋白亚单位的开发研究正在努力进行。以福尔马林失活的PIV1、2、3型疫苗的临床试用结果表明该疫苗不是有效的疫苗(参考文献.2、3、4)。以福尔马林失活的RSV疫苗临床试用表明不仅该疫苗在保护RSV感染中是无效的而且许多后来感染RSV的种痘者遭受更为严重的疾病之后,进一步开发化学失活的疫苗被搁浅。大多数副流感病毒疫苗研究集中于候选PIV-3疫苗(参考文献.5),报导PIV-1和PIV-2的工作显著较少。最近针对PIV-3疫苗的方法包括使用密切相关的牛副流感病毒3型和通过该病毒的感冒适应(cold-adaptation)而产生毒性减弱的病毒。
另一种针对3型副流感病毒疫苗开发的方法是集中于表面糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)蛋白的亚单位方法(参考文献.10,11,12)。HN抗原,一种典型的II型糖蛋白,既显示血细胞凝集反应又显示神经氨酸酶活性并负责病毒向含有唾液酸的宿主细胞受体吸附。I型F糖蛋白介导病毒包膜(envelope)与细胞膜的融合以及病毒在细胞之间的传播。最近已证实HN和F糖蛋白是膜融合所必需的。F糖蛋白合成为无活性的前体(F),进而被蛋白水解切割成二硫键连接的F2和F1部分。虽然PIV-1、2和3的HN和F蛋白结构上类似,但它们抗原性却不同。抗一种PIV型的HN和F蛋白的中和抗体没有交叉保护。因此,有效的PIV亚单位疫苗必需含有来自三种不同类型副流感病毒的HN和F糖蛋白。抗两者之一糖蛋白的抗体在体外有中和反应。对婴幼儿中中和抗体效价水平和对PIV-3感染的抗性之间的直接相关性进行了观察。3型副流感病毒的天然亚单位疫苗研究了两种表面糖蛋白的保护性。一般地,糖蛋白用非离子去污剂从病毒中提取并用凝集素亲和或免疫亲和层析方法进一步纯化。然而,这两项技术均不可完全适用于在所有条件下疫苗的大规模制备。在小型动物保护模型中(仓鼠和棉鼠),证明以糖蛋白的免疫阻止了活体PIV-3的感染(参考文献.13,14,15,16,17)。也用重组DNA技术制备PIV-3的HN和F糖蛋白。已用杆状病毒表达系统和通过用牛痘病毒及腺病毒重组子在昆虫细胞中制备HN和F糖蛋白(参考文献.18,19,20,21,22)。在杆状病毒表达系统中,既表达全长形式又表达截短形式的PIV-3糖蛋白以及嵌合的F-HN融合蛋白。已证实在小型动物模型中重组蛋白是具有保护性的(见WO 91/00104,USAN 07/773,949,1991年11月29日提交,并转让给受让人)。
副流感病毒感染可导致严重的疾病。提供纯化的PIV糖蛋白和用于从天然病毒中它们的纯化方法而用作免疫原性制剂中的抗原,免疫原性制剂包括疫苗、其它抗原或免疫原的载体,并产生诊断性试剂,这都将是优越的。
发明概述
本发明提供了疫苗级细胞系(VERO细胞)中PIV-3的制备、发酵收获物中病毒的纯化、纯化的病毒中HN和F糖蛋白的提取以及不用包括免疫亲和或凝集素亲和步骤而其纯化HN和F糖蛋白至或大于约85%的纯度。特别地,凝集素亲和步骤可导致配体渗滤(leaching)到产物中。
此外,还首次提供了用于分离和纯化PIV-1和PIV-2的HN和F糖蛋白的方法及包括分离和纯化的PIV-1、PIV-2和PIV-3 HN和F糖蛋白混合物的免疫原性组合物。
分离纯化的HN和F糖蛋白无致热性、无免疫增强性,并且基本上无血清和细胞系污染物。分离纯化的糖蛋白具有免疫原性,无任何感染性的PIV和其它危险因子。
因此,本发明的一个方面中,提供了分离纯化的1型副流感病毒(PIV-1)血凝素-神经氨酸酶(HN),通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其一般具有约70到约80kDa的表观分子量,及其保留有糖蛋白免疫学特性的片段或类似物。
在本发明的另一方面中,提供了分离纯化的1型副流感病毒(PIV-1)融合(F)糖蛋白,通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其一般具有F1多肽亚单位的约45到55kDa的表观分子量,及其保留有糖蛋白免疫学特性的片段或其类似物。
本发明进一步方面提供了基本上由血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白所组成的共分离和共纯化的1型副流感病毒(PIV-1)糖蛋白的混合物,一般具有约70到约80kDa的表观分子量并且融合(F)糖蛋白具有F1多肽亚单位45到约55kDa的表观分子量,其中的分子量由还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以测定。这种混合物优选至少约75%的纯度。
在本发明的另一方面,还提供了2型副流感病毒(PIV-2)分离纯化的血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白,通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其一般具有约75到约85kDa的表观分子量,或其保留有所述糖蛋白免疫学特性的片段或类似物。HN糖蛋白可基本上无PIV-2融合(F)糖蛋白地加以分离并且优选至少约65%的纯度。
本发明还有一方面提供了分离纯化的2型副流感病毒(PIV-2)融合(F)糖蛋白,通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其一般具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量,或其保留有所述糖蛋白免疫学特性的片段或类似物。F糖蛋白可基本上不含PIV-2HN糖蛋白地加以分离并优选至少约80%的纯度。
在本发明的另一方面,还提供了共分离和共纯化的3型副流感病毒(PIV-3)非变性糖蛋白的混合物,它不含凝集素且基本上由血凝素神经氨酸酶(HN)糖蛋白所组成,其一般具有约70到约75kDa的表观分子量并且融合(F)糖蛋白具有约45到约50kDa的表观分子量,其中的分子量由还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以测定。该混合物优选至少约75%的纯度。
本发明也包括多价的免疫原性组合物,其包括PIV-1、PIV-2和PIV-3的糖蛋白。因此,在本发明的另一方面中,提供了免疫原性的组合物,包括免疫有效量的:(a)副流感病毒1型(PIV-1)血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白,一般具有约70到约80kDa的表观分子量;(b)1型副流感病毒(PIV-1)融合(F)糖蛋白,一般具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量;(c)2型副流感病毒(PIV-2)血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白,一般具有约75到约85kDa的表观分子量;(d)2型副流感病毒(PIV-2)融合(F)糖蛋白,一般具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量;(e)3型副流感病毒(PIV-3)糖蛋白,一般具有约70到约80kDa的表观分子量;和(f)3型副流感病毒(PIV-3)融合(F)糖蛋白,一般具有F1多肽亚单位约45到55kDa的表观分子量;或保留所述糖蛋白免疫学特性的糖蛋白(a)到(f)中任何一个独立的片段或类似物;其中的分子量由还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以测定。
PIV-1和PIV-3的HN和F糖蛋白优选提供为共分离和共纯化的糖蛋白混合物并且PIV-2的HN和F糖蛋白优选提供为单独分离纯化的糖蛋白。
这里提供的免疫原性组合物可配制成具有预选量每种糖蛋白的疫苗用于体内施用到宿主,它可以是灵长类,尤其是人类宿主,从而赋予对PIV-1、PIV-2和PIV-3导致疾病的保护。
本发明的免疫原性组合物可配制成微粒、胶囊、ISCOM或脂质体制品。免疫原性组合物可与定向分子结合使用,该定向分子用于运输到免疫系统特定细胞或粘膜表面。一些定向分子包括在WO 92/17167(Biotech Australia pty.Ltd.)中描述的菌株B12(strain B12)和细菌毒素片段,和在美国专利No.5,194,254(Barber等)中描述的单克隆抗体。免疫原性组合物可进一步包括至少一种其它免疫原性或免疫刺激物质,这可以是至少一种佐剂。
至少一种佐剂可选自磷酸铝、氢氧化铝、QS21、Quil A、其衍生物及成分、ISCOM基质、磷酸钙、氢氧化钙、氢氧化锌、糖脂类似物、氨基酸的十八烷基酯、胞壁酰二肽、polyphosphazene和脂蛋白以及其它佐剂以诱导Th1反应。
这里提供的免疫原性组合物可配制成包括至少一种其它的免疫原,其可方便地包括RSV A型和/或B型的人呼吸道合胞体病毒(RSV)蛋白。然而,其它的免疫原,如来自衣原体、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎、白喉类毒素、破伤风类毒素、流行性感冒、嗜血杆菌、百日咳、肺炎球菌、分枝杆菌、肝炎A、莫拉克斯氏菌的免疫原可掺入到组合物中。
本发明进一步延伸到从副流感病毒中共纯化和共分离HN和F糖蛋白以及单独纯化和分离HN和F蛋白。
本发明的另一方面提供了通过向宿主中施用免疫有效量的这里提供的免疫原性组合物而在其中产生免疫反应的方法。优选地,免疫原性组合物配制成用于体内施用到宿主的疫苗并且施用到包括人的宿主赋予对由PIV-1、PIV-2和PIV-3所导致疾病的保护。免疫反应可以是体液或细胞介导的免疫反应。
在其另一方面,本发明提供了制备用于保护由副流感病毒(PIV)感染所导致疾病的疫苗的方法,包括施用这里提供的免疫原性组合物到测试宿主以测定其成分的相对量和其施用频率以赋予对PIV-1、PIV-2和PIV-3所导致病毒的保护;和根据所述的测定量和施用频率以适于施用到治疗宿主的形式配制免疫原性组合物。治疗的宿主可以是人。
本发明的进一方面提供了检测在样品中与副流感病毒(PIV)糖蛋白产生特异反应的抗体的存在,包括下面的步骤:
(a)将样品与这里提供的免疫原性组合物接触以制备包括副流感病毒糖蛋白和存在于样品中与其特异反应的任何所述抗体的复合物;和
(b)测定复合物的产生。
在本发明的进一方面,还提供了检测在副流感病毒(PIV)糖蛋白样品中存在的方法,包括下面的步骤:
(a)以这里提供的免疫原性组合物免疫受试者,以制备对PIV-1、PIV-2和PIV-3 HN和F糖蛋白特异性的抗体;
(b)将样品与抗体接触以制备包括存在于样品中的任何PIV糖蛋白和糖蛋白特异性抗体的复合物;和
(c)检测复合物的产生。
本发明的进一方面提供了用于检测样品中与副流感病毒起糖蛋白特异反应的抗体存在的诊断试剂盒,包括:
(a)这里提供的免疫原性组合物;
(b)用于将免疫原性组合物与样品接触以制备包括副流感病毒糖蛋白和存在于样品中任何所述抗体复合物的方法;和
(c)用于测定复合物产生的方法。
本发明也提供了用于检测样品中副流感病毒(PIV)糖蛋白存在的诊断试剂盒,包括:
(a)对PIV-1、PIV-2和PIV-3的HN和F糖蛋白特异性的抗体;
(b)将抗体与样品接触以制备包括PIV糖蛋白和PIV糖蛋白特异性抗体复合物的方法;和
(c)检测复合物产生的方法。
在本发明的另一方面,提供了制备对副流感病毒(PIV)糖蛋白特异性单克隆抗体的方法,包括:
(a)施用这里提供的免疫原性组合物到至少一只小鼠中以制备至少一只免疫小鼠;
(b)从该至少一只免疫小鼠中取出B-淋巴细胞;
(c)将来自该至少一只免疫小鼠的B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,因而制备杂交瘤;
(d)克隆产生选择性抗-PIV糖蛋白抗体的杂交瘤;
(e)培养产生抗-PIV糖蛋白抗体的克隆;和
(f)从培养物中分离抗-PIV糖蛋白抗体。
本发明的进一方面中提供了制备共分离和共纯化的1型副流感病毒(PIV-1)糖蛋白混合物的方法,包括在培养基中培养PIV-1、从培养基中分离培养的病毒、溶解分离病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)包膜糖蛋白;和共分离和共纯化溶解的包膜糖蛋白。
共分离和共纯化可受以下因素影响,包括从溶解包膜糖蛋白的离子交换层析中收集含HN和F糖蛋白的流出物(flow-through);将流出物上样到羟基磷灰石基质,并且从羟磷灰石基质中选择性地共洗脱HN和F糖蛋白。选择性洗脱的HN和F糖蛋白可通过切向流超滤进一步浓缩。共分离和共纯化可进一步选择性地共沉淀HN和F糖蛋白、分离共沉淀的HN和F糖蛋白并且重新溶解分离的HN和F糖蛋白。
本发明的另一方面提供了制备分离纯化的2型副流感病毒(PIV-2)单个糖蛋白的方法,其包括在培养基中培养PIV-2;从培养基中分离培养的病毒;溶解分离病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)包膜糖蛋白;以及分离纯化至少一种溶解的包膜糖蛋白。
单独分离纯化溶解的包膜糖蛋白。这种单独的分离和纯化可受以下因素影响,包括当HN糖蛋白留在离子交换介质中时从溶解包膜糖蛋白的离子交换层析中收集含F糖蛋白的流出物;将收集的流出物应用到羟基磷灰石基质并收集含F-糖蛋白的流出物,从羟基磷灰石基质流出物中选择性地去除用于溶解步骤中的去污剂以提供分离纯化的F糖蛋白,和从离子交换基质中洗脱HN糖蛋白以提供分离纯化的HN糖蛋白。通过以包括Benzonase(TM)核酸酶的处理可从分离纯化的HN糖蛋白中去除核酸污染物。分离纯化的HN糖蛋白可应用于凝胶过滤介质并且随后可从其中收集HN糖蛋白以分离HN糖蛋白与其它分子量的污染物。或者,分离纯化的HN糖蛋白可应用于羟基磷灰石基质以将HN糖蛋白结合到基质上并且随后从其中洗脱HN糖蛋白。分离纯化的F和HN糖蛋白可随后通过切向流超滤加以浓缩。
本发明还包括制备共分离和共纯化3型副流感病毒(PIV-3)糖蛋白的方法,其包括在培养基中培养PIV-3、从培养基中分离培养的病毒、溶解分离病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)包膜糖蛋白以及共分离和共纯化无凝集素的溶解糖蛋白。
共分离和共纯化可受以下因素影响,包括当允许污染物流过(passthrough)介质时上样HN和F糖蛋白于第一次离子交换介质中。从第一次离子交换介质中共洗脱HN和F糖蛋白以分离HN、糖蛋白与其它分子量的污染物。当允许污染物穿越第二次离子交换介质时将共洗脱的HN和F糖蛋白应用到第二次离子交换基质中。随后从其中共洗脱HN和F糖蛋白以提供共分离和共纯化的HN和F糖蛋白。共洗脱的HN和F糖蛋白可通过切向流超滤加以浓缩。
本发明的优点包括:
-分离纯化的PIV-1、PIV-2和PIV-3 HN和F糖蛋白
-含有这种糖蛋白的多价免疫原性组合物
-分离这种糖蛋白的方法
-用于PIV和受其感染宿主鉴定的诊断试剂盒。
附图简述
从下面对附图的描述将对本发明有进一步的理解,其中:
图1为根据本发明特定实施方案从1、2和3型副流感病毒中纯化血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)糖蛋白方法的流程图;
图2(a)为通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的1型副流感病毒HN和F糖蛋白的分析;
图2(b)为通过免疫印迹分析对纯化1型副流感病毒HN糖蛋白的分析并且检测是用抗-PIV-1 HN抗体;
图2(c)为通过免疫印迹分析对纯化1型副流感病毒F融合蛋白的分析并且检测是用抗-PIV-1F抗体;
图3(a)为通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化2型副流感病毒HN糖蛋白的分析;
图3(b)为通过免疫印迹分析对纯化2型副流感病毒HN糖蛋白的分析并且检测是用抗PIV-2HN抗体;
图3(c)为通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化2型副流感病毒F蛋白的分析;
图3(d)为通过免疫印迹分析对纯化2型副流感病毒F糖蛋白的分析并且检测用抗-PIV-2F抗体;
图4(a)为通过在还原条件下的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白的分析;
图4(b)为用HN和F特异性抗体通过对在还原条件下SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白的免疫印迹检测对纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白的分析;
图4(c)为通过在非还原条件下的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白的分析;
图4(d)为用HN和F特异性抗体通过对非还原条件下SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白的免疫印迹检测对纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白的分析;
图5(a)显示在纯化1型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫的小鼠中抗-HN抗体反应;
图5(b)显示在纯化1型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫的小鼠中抗-F抗体反应;
图5(c)显示纯化1型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫的小鼠血清的PIV-1中和效价;
图6(a)显示在纯化1型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫的仓鼠中抗-HN抗体反应;
图6(b)显示在纯化1型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫的仓鼠中抗-F抗体反应;
图6(c)显示纯化1型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫的仓鼠血清的PIV-1中和效价;
图7显示用约1∶1比例混合的单独纯化2型副流感病毒HN和F糖蛋白混合物免疫的小鼠血清的PIV-2中和效价;
图8显示在用多种比例混合的单独纯化2型副流感病毒HN和F糖蛋白混合物免疫的小鼠中的抗-HN抗体反应;
图9显示在用多种比例混合的单独纯化2型副流感病毒HN和F糖蛋白混合物免疫的小鼠中的抗-F抗体反应;
图10(a)显示用多种比例混合的单独纯化2型副流感病毒HN和F糖蛋白混合物免疫小鼠血清的PIV-2中和效价;
图10(b)显示用多种比例混合的单独纯化2型副流感病毒HN和F糖蛋白混合物免疫的小鼠血清的PIV-2血细胞凝集抑制(HAI)效价;
图11(a)显示在纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫小鼠中的抗-PIV3反应;
图11(b)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫小鼠血清的血细胞凝集抑制效价;
图11(c)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫小鼠血清的PIV-3中和效价;
图12(a)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫豚鼠中的抗-PIV3反应;
图12(b)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫豚鼠血清的血细胞凝集抑制效价;
图12(c)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫豚鼠血清的PIV-3中和效价;
图13(a)显示在纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫的仓鼠中的抗-PIV-3抗体反应;
图13(b)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫仓鼠血清的血细胞凝集-抑制效价;
图13(c)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫小鼠血清的PIV-3中和效价;
图13(d)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫并以活体PIV-3感染仓鼠鼻冲洗液和肺灌洗液中PIV-3的滴度;
图14(a)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫棉鼠血清的血细胞凝集-抑制效价;
图14(b)显示纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫棉鼠血清的PIV-3中和效价;
图14(c)显示在纯化3型副流感病毒HN和F糖蛋白免疫并以活体PIV-3感染棉鼠中PIV-3肺滴度;
图15(a)显示包括1、2和3型副流感病毒HN和F糖蛋白的三价疫苗免疫的小鼠血清的PIV-1中和效价;
图15(b)显示包括1、2和3型副流感病毒HN和F糖蛋白的三价疫苗免疫的小鼠血清的PIV-2中和效价;和
图15(c)显示包括1、2和3型副流感病毒HN和F糖蛋白的三价疫苗免疫小鼠血清的PIV-3中和效价。
发明详述
如上面所述,本发明包括共分离和共纯化的PIV-1病毒HN和F糖蛋白。在针对PIV-1的图1中可见,将该病毒培养于疫苗级细胞系中,如VERO细胞中并收获培养的病毒。发酵可在胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶存在下完成。
过滤病毒收获物且然后一般用对所需分子量截断且透滤的膜以切向流超滤进行浓缩。病毒收获物浓缩产物可被离心并且去除上清液。然后将离心沉淀物用去污剂提取,例如,通过在含有去污剂如非离子性去污剂包括TRITON X-100的提取缓冲液中重新悬浮沉淀物至最初收获浓缩物体积来溶解HN和F糖蛋白。
离心去除不溶性蛋白后,通过层析方法纯化HN和F糖蛋白提取物。提取物可首先应用于离子交换层析柱如TMAE-fractogel柱,该柱被平衡以允许HN和F糖蛋白流过而不纯物被保留于柱中。
其次,流过的液体可上样到羟基磷灰石柱上,该柱被平衡以允许结合HN和F糖蛋白到基质上并允许污染物流过此柱。用适当的洗脱剂从柱中共洗脱结合的HN和F糖蛋白。可进一步处理得到的HN和F糖蛋白共纯化溶液以增加其纯度。
洗脱液首先可通过用截断所需分子量的膜的切向流超滤加以浓缩。过滤物可与所需分子量,如约6000到8000的聚乙二醇接触以沉淀糖蛋白。离心去除上清液后,沉淀物可重悬于PBS中并透析以去除聚乙二醇。最后,可无菌过滤PIV-1 HN和F糖蛋白的透析溶液。无菌过滤溶液可吸附到明矾上。
如果必要,聚乙二醇沉淀和重悬纯化步骤可在纯化操作的早期完成。
沿着图1所示流程,从PIV-2病毒中回收PIV-2 HN和F糖蛋白作为单独的蛋白。培养和收获病毒以后,以与PIV-1相同的方式提供病毒收获浓缩物。病毒收获浓缩物可与聚乙二醇接触以沉淀病毒悬液。离心去除上清液后,在再次离心和去除上清液之前将沉淀物重悬于尿素溶液中。
重悬沉淀物并且将得到的尿素洗过的病毒悬液与去污剂接触以溶解细胞体中的PIV-2 HN和F糖蛋白。离心后,回收上清液以进一步纯化糖蛋白且去除不溶性蛋白。
上清液可应用于离子交换层析柱,如TMAE-fractogel柱,其被适当平衡以允许F糖蛋白流过柱而HN蛋白留在柱中,因而有效地分离两种蛋白,然后单独对其处理。
离子交换柱的流出液可上样于羟基磷灰石基质,其被适当地平衡以允许F糖蛋白流过该柱而将污染物留于柱中。然后将流出液应于进一步的离子交换柱,其被平衡以允许F糖蛋白留在柱中而污染物流过该柱。
然后可从柱中洗脱F-糖蛋白以提供纯化的PIV-2F糖蛋白溶液。可用所需分子量截断的膜通过切向流超滤浓缩洗脱液。浓缩的F-糖蛋白溶液可被无菌过滤。
在适当条件下从离子交换柱中洗脱PIV-2的HN糖蛋白。然后洗脱液可流过凝胶过滤柱,如Sephacryl S-300柱以分离HN糖蛋白与其它分子量的污染物。可用羟基磷灰石柱代替Sephacryl柱。
可用柱中洗脱HN糖蛋白以提供纯化的PIV-2 HN糖蛋白溶液。洗脱液可通过用所需分子量截断膜的切向流超滤加以浓缩。浓缩的HN-糖蛋白溶液可被无菌过滤。
沿着图1中统一显示的流程从PIV-3病毒中共分离和共纯化PIV-3 HN和F糖蛋白。于疫苗品种细胞系中培养病毒并用单次或多次收获来收获培养的病毒。这种多次收获可以,例如,在感染后4、7和10天进行。
可通过超滤浓缩病毒收获物。浓缩的病毒收获物可进行最初的纯化操作,例如,通过凝胶过滤层析、聚乙二醇沉淀或cellufine sulfate层析。然后可将纯化的病毒进行去污剂提取以溶解HN和F糖蛋白。
PIV-3的HN和F糖蛋白溶解后,可将上清液上样到离子交换柱如Cellufine sulfate层析柱。该柱被平衡以允许糖蛋白结合到柱上而允许污染物流过。同样地,可用TMAE-fractogel柱代替Cellufine sulfate柱。两种柱也可在连续的纯化步骤中结合使用。
从柱中共洗脱HN和F糖蛋白以提供共纯化的糖蛋白溶液。此溶液可通过用对所需分子量截断和透滤的膜的切向流超滤加以浓缩。浓缩的糖蛋白制品可无菌过滤并吸附到柱上。
纯化的HN和F糖蛋白可以是同型和异型寡聚体的形式,包括二聚体、四聚体和更高的种类。
PIV糖蛋白制品没有显示任何危险剂、血吸附(hemadsorbing)剂或活体病毒的迹象。
本发明延伸到这样的副流感病毒的HN和F糖蛋白,即其在抗由副流感病毒感染所致的疾病的疫苗中作为药物的活性成分。本发明也延伸到这样的药物疫苗组合物,即其含有副流感病毒HN和F糖蛋白和任选的药物上可接受的载体和/或稀释剂。
在进一方面,本发明提供了用于药物疫苗组合物制备的副流感病毒HN和F糖蛋白的使用,该组合物用于抗由副流感病毒感染所致疾病的免疫。
1.疫苗制品和使用
适于用作疫苗的免疫原性组合物可从这里公开的PIV-1、PIV-2和/或PIV-3的免疫原性HN和F糖蛋白加以制备。优选地,抗原物质被广泛透析以去除不需要的小分子量分子并且/或被冻干用于更容易地配制到所需的载体中。免疫原性组合物引发免疫反应,从而产生包括抗-F和抗-HN的抗PIV抗体。这种抗体可以为病毒中和性的。
包括疫苗的免疫原性组合物可制成可注射的产品,如液体溶液、悬液或乳液。活性免疫原性成分或成分可与药物上可接受的与其相容的赋形剂混合。这种赋形剂可包括水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇及其组合。免疫原性组合物和疫苗可进一步含有辅助性物质,如加湿或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂以增强其效应。免疫原性组合物和疫苗可通过皮下或肌肉内注射而在肠道外施用。或者,根据本发明形成的免疫原性组合物可以在粘膜表面导致免疫反应的方式配制和运输。因此,免疫原性组合物可通过,例如,鼻或口腔(胃内)途径施用到粘膜表面。或者,其它形式的施用包括栓剂和口腔制剂可以是合乎需要的。对于栓剂、结合剂和载体可包括,例如,polyalkalene乙二醇或三酰基甘油酯。这种栓剂可从含有约0.5到约10%,优选约1到2%范围的活性成分的混合物中形成。口腔制剂可包括常用的incipients如,药物级的糖类、纤维素和碳酸镁。这些组合物可采取溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉末的形式且含有约1%到95%的活性剂,优选约20到约75%的活性剂。
免疫原性制品和疫苗以与剂量配方相容的方式,并且以将是治疗上有效的、具有保护性和免疫原性的量施用。待施用的量依赖于待治疗的受试者,包括,例如,个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度,且如果必要,还包括产生细胞介导免疫反应的能力。需施用活性成分的准确量依赖于医生的判断。然而,合适的剂量范围可由本领域的技术人员容易地测定且每次免疫可为微克级的活性成分。最初施用和增强剂量的合适用药制度也是可变的,但可包括最初施用接着是随后的施用。该剂量也可依赖于施用途径并且将随宿主大小而改变。
根据本发明的免疫原性组合物中活性成分蛋白的浓度一般约1到95%。含有仅一种病原体抗原物质的疫苗为单价疫苗。含有几种病原体抗原物质的疫苗为混合疫苗且也属于本发明。这种混合疫苗含有,例如,来自不同病原体或相同病原体不同品系,或来自不同病原体组合的物质。在上述本发明中,PIV-1、PIV-2和PIV-3的HN和F糖蛋白混合于同一种多价免疫原性组合物中,其中也可含有其它免疫原。
如果抗原与佐剂共同施用可显著提高免疫原性,常用的佐剂含量为磷酸缓冲盐溶液中的0.05到0.1%。佐剂增强抗原的免疫原性但自身不一定具有免疫原性。佐剂可通过以下方式起作用,即将抗原留在施用位点附近以产生位置效应(depot efect)而有利于缓慢、持续释放抗原到免疫系统细胞。佐剂也可吸引免疫系统细胞到抗原位置并刺激该细胞诱发免疫反应。
免疫刺激剂或佐剂已用了许多年以提高宿主对,例如,疫苗的免疫反应。内在的佐剂,如脂多糖,一般为用作疫苗的被杀死或毒性减弱细菌的成分。外源性佐剂为免疫刺激剂,其一般非共价连接到抗原上并且被配制以增强宿主的免疫反应。因此,佐剂被鉴定为增强对肠道外运输抗原的免疫反应。这些佐剂有些是有毒的,然而,且会导致不必要的副作用,使它们不适合用于人类和许多动物。的确,只有氢氧化铝和磷酸铝(统称为明矾)常用作人类和兽医疫苗中的佐剂。明矾在增加抗体对白喉和破伤风类毒素的反应的效率方面已很好地确立且HBsAg疫苗已用明矾作为佐剂。明矾增强HN和F糖蛋白免疫原性的效应已由Ewashyshyn等所显示(参考文献.16)。尽管对有些应用中明矾的用途已很好地确立,但其也具有局限性。例如,明矾对流感种痘是无效的并且不稳定地诱发细胞介导的免疫反应。在小鼠中明矾作为佐剂的抗原诱发的抗体主要为IgG 1同型抗原(isotype),其对于有些疫苗药物的保护可能不是最适宜的选择。
广泛的外源性佐剂可导致对抗原有效的免疫反应。这些佐剂包括与膜蛋白抗原复合的皂角苷(免疫刺激复合物)、具有矿物油的环氧乙烷-环氧丙烷的普卢尼克聚合物(pluronic polymers)、矿物油中杀死的分枝杆菌、弗氏完全佐剂、细菌产物,如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂质A(lipid A)和脂质体。
为了有效诱导体液免疫反应(HIR)和细胞介导的免疫性(CMI),免疫原经常乳化于佐剂中。许多佐剂是有毒的,其诱导肉芽瘤、急性和慢性炎症(弗氏完全佐剂,FCA)、细胞溶解(皂角苷和环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物)和致热(pyrogenicity)、关节炎和前葡萄膜炎(anterior uveitis)(LPS和MDP)。虽然FCA为出色的佐剂并广泛用于研究中,但由于其毒性没有被批准用于人类或兽医疫苗中。
理想佐剂所需的特征包括:(1)无毒性;(2)刺激长时间免疫反应的能力;(3)制备的简单性和长期贮存的稳定性;(4)如果需要,对通过各种途径施用的抗原既诱发CMI又诱发HIR的能力;(5)与其它佐剂的协同;(6)选择性与抗原呈递细胞(APC)群相互作用的能力;(7)特异地诱发适当的TH1或TH2细胞特异性的免疫反应的能力;和(8)选择性地增加抗抗原的适当抗体同型抗原(例如,IgA)水平的能力。
1989年8月8日授权于Lockhoff等的美国专利No 4,855,283(在此引入仅供参考)讲授了作为免疫调节剂或佐剂的糖脂类似物,包括N-糖基酰胺类、N-糖基尿素类(N-glycosylureas)和N-糖基氨基甲酸酯类(N-glycosylcarbamates),其中的每种糖残基中由氨基酸替代。因此,Lockhoff等(美国专利No.4,855,283参考文献.32)报导与天然糖脂显示结构类似性的N-糖脂类似物,如糖鞘脂类和糖甘油酯类,在单纯疱疹病毒疫苗和伪狂犬病毒疫苗中能够诱发强烈的免疫反应。有些糖脂已由长链烷基酰胺(alkylamine)和脂肪酸合成,它们通过异头(anomeric)碳原子与糖直接相连接,以模拟天然脂残基的功能。
授权给Moloney的美国专利No.4,258,029,(已转让给受让人且在此引入仅供参考),讲述了当与破伤风类毒素和福尔马林失活的I、II和III型脊髓灰质炎病毒疫苗复合时,十八烷基酪氨酸盐酸盐(octadecyltyrosine hydrochloride)(OTH)作为佐剂而发挥作用。Nixon-George等(参考文献33)也报导了与重组乙型肝炎表面抗原复合的芳香族氨基酸十八烷酯增强了宿主抗肝炎B病毒的免疫反应。
2.免疫分析
本发明的HN和F糖蛋白在以下方面是有用的,包括作为其抗体产生的免疫原、作为免疫分析的抗原,该免疫分析包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、RIAs和用于抗体检测的本领域已知的其它非酶联抗体结合分析或方法。在ELISA分析中,将选择的HN或F糖蛋白或糖蛋白混合物固定于选择表面,例如,能够结合蛋白的表面如聚苯乙烯微孔板小孔。经冲洗除去不完全吸附的物质后,可将非特异性蛋白,如已知对于测试样品是抗原中性的小牛血清蛋白(BSA)溶液结合到选择表面。此举允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点并且因此降低由非特异性抗血清结合到表面上所导致的背景。
然后将固定表面以有利于免疫复合物(抗原/抗体)形成的方式与待测样品,如临床或生物学物质接触。这可包括用稀释剂,如BSA溶液、牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸缓冲盐(PBS)/吐温溶液稀释样品。然后让样品于如,约25℃到37℃的温度孵育约2到4小时。孵育后,冲洗接触样品的表面以去除非免疫复合的物质。冲洗步骤可包括以溶液,如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液冲洗。测试样品与结合糖蛋白之间形成特异性复合物并冲洗后,可通过将该免疫复合物接触对第一种抗体具有特异性的第二种抗体而检测免疫复合物形成状况(occurrence)甚至产量。如果测试样品为人来源,第二种抗体为对人免疫球蛋白且一般为IgG具有特异性的抗体。为了提供检测手段,第二种抗体可以具有相关活性如这样的酶活性,即,例如,当与适当的生色底物孵育时将产生颜色反应。然后可通过用,例如,分光光度计测量颜色产生程度而完成定量。
上面的内容大致地描述了本发明。通过参照下面的具体实施例可获得更为完整的理解。
描述这些实施例仅仅是为了说明的目的且并不有意限制本发明的内容。形式的改变和等同的替代可以考虑因为不同情况可能会表明或导致更加适宜。虽然这里使用了特定的术语,但这种术语只是为了描述而不是为了限制的目的。
在该内容和这些实施例里使用但没有明确描述的分子遗传学、蛋白生化、病毒学及免疫学方法在科学文献中已充分报导并且本领域的技术人员已很好将其掌握。
实施例实施例1:
此实施例说明了在大型、受控的发酵罐中用微载体小珠上的哺乳动物细胞系制备高效价的PIV-1。
将疫苗级的非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)以105个细胞/mL的浓度加入到含有360g Cytodex-1微载体小珠的150L生物反应器中pH7.2的60~75L CMRL 1969培养基中并搅拌2小时。再添加CMRL 1969以得到150L的总体积。加入胎牛血清(FBS)至终浓度3.5%。加入葡萄糖至3.0g/L的终浓度并且加入谷氨酰胺至0.6g/L的终浓度。控制溶解的氧气(40%)、pH(7.2)、搅拌(40rpm)和温度(37℃)。监测细胞生长、葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺水平。当细胞处于对数期时,通常3~4天达到约1.0-2.5×106个细胞/mL的浓度。从发酵罐中排空培养基并且加入120L pH7.2的CMRL 1969(无FBS)并且搅拌培养物10分钟。发酵罐的排空和填入通常重复一次但也可重复达三次。冲洗细胞后,排空发酵罐并加入含有0.1%(v/v)FBS的50L CMRL 1969。以0.001的感染倍增(multiplicity of infection)(m.o.i)加入PIV-1接种物。如果需要,加入胰蛋白酶以通过F蛋白的蛋白水解断裂而促进有效的感染。再加入具有0.1%FBS的CMRL 1969以得到150L的终体积。于34℃持续孵育4到6天。一般于感染后4天从单一发酵罐中获得一次病毒收获物。也可从一次发酵中获得多次收获物。根据下面的方法收获流体。停止搅拌并让小珠沉降。将病毒培养物流体排入罐中用于进一步处理(见下面的实施例4)。通过组织培养感染性剂量(TCID50)、血细胞凝集(HA)、HN和F抗原的ELISA分析而测量病毒效价从而监测PIV-1生长且结果显示于表1中。实施例2:
该实施例说明了在大型控制的发酵罐中用微载体小珠上的哺乳动物系制备高效价的PIV-2。
将疫苗品种的非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)以105个细胞/ml的浓度加入到150L生物反应器中pH 7.2的60L CMRL 1969培养基中,该反应器中含有360g cytodex-1微载体小珠并搅拌2小时。再加入60LCMRL 1969以得到120L的总体积。加入胎牛血清(FBS)以得到3.5%的浓度。加入葡萄糖至3.0g/L的浓度并且加入谷氨酰胺至0.6g/L的终浓度。控制溶解的氧气(40%)、pH(7.2)、搅拌(36rpm)及温度。监测细胞生长、葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺水平。当细胞处于对数期(通常3-4天)时细胞达到约1.0-2.5×106个细胞/mL的浓度。从发酵罐中排出培养基并且加入60L pH7.2的CMRL 1969(无FBS)且搅拌10分钟。发酵罐的排空和填充通常重复一次但可重复达3次。冲洗细胞后,排空发酵罐并且加入120L含0.1%(v/v)FBS的CMRL 1969。如果需要,也加入胰蛋白酶以通过蛋白水解断裂F蛋白而促进有效的感染。于32℃-37℃持续孵育3到6天。一般感染后4天从单一发酵罐中得到一次病毒收获物。也可获得单一发酵的多次收获物。根据下面的方法收获流体。停止搅拌并让小珠沉降。将病毒培养液排入罐中用于进一步处理(见下面的实施例4)。通过TCID50、血液凝集作用(HA)、整个病毒和F抗原的ELISA分析测量病毒效价而监测PIV-2的生长且结果显示于表2中。实施例3:
该实施例说明了在大型、受控的发酵罐中用微载体小珠上的哺乳动物细胞系制备高度感染性效价的PIV-3。
将疫苗品种的非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)以105个细胞mL的浓度加入到位于150L生物反应器中pH7.2的60L CMRL 1969培养基中,该反应器中含有360g Cytodex-1微载体小珠并搅拌2小时。再加入60L CMRL 1969以得到120L的终体积。加入胎牛血清(FBS)以得到7.0%的终浓度。加入葡萄糖至3.0g/L的终浓度且加入谷氨酰胺至0.6g/L的终浓度。控制溶解的氧气(40%)、pH(7.2)、搅拌(36rpm)和温度(37℃)。监测细胞生长、葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺水平。第4天细胞达到约1.0-1.8×106个细胞/mL的浓度。从发酵罐中排空培养基并且加入100L pH7.2的CMRL(无FBS)并搅拌10分钟。发酵罐的排空和填充常重复一次但可重复达3次。冲洗细胞后,第3次排空发酵罐并加入60L CMRL 1969。以0.001的感染倍增(m.o.i)加入PIV-3接种物。再加入60L pH7.2的CMRL 1969且在相同条件下继续孵育。一般于感染后4、7、10天从单一发酵罐中获得多次病毒收获物。根据下面的方法收获病毒流体。停止搅拌并让小珠沉降。将病毒培养物流体排入罐中用于进一步处理(见实施例4)。再次以120L CMRL 1969培养基填充发酵罐并按上述孵育。通过TCID50、血细胞凝集(HA)和病毒抗原ELISA分析测量病毒效价而监测PIV-3生长且结果显示于表3。病毒蛋白的产量为8-12mg/L。
也可用类似的方法用疫苗品种的人类肺二倍体细胞(MRC-5)制备PIV。实施例4:
该实施例描述了PIV病毒收获物的澄清和浓缩。
对于PIV-1,用一系列死端式过滤器(先1.2μm后0.45μm)过滤病毒收获物。用300 NMWL膜的切向流超滤将澄清的收获流体浓缩40到150倍并以PBS渗滤。整个处理过程的病毒回收通过HA、TCID50和ELISA加以测定。在按下面实施例3-6中所述的进一步纯化之前可将病毒收获物冰冻保存(-20℃或-70℃)。
对于PIV-2,用1μm的死端过滤器过滤病毒收获物(120L)。用300 NMWL膜的切向流超滤将澄清的收获物流体浓缩40-90倍并以PBS透滤。整个处理过程的病毒回收通过HA、TCID50和ELISA分析加以测量且一般大于80%。病毒收获物可被冰冻保存(-20℃或-70℃)至进一步纯化。实施例5:
该实施例描述了PIV-1血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)糖蛋白的纯化。
病毒浓缩物于4℃ 28,000×g离心30分钟。弃上清液且在提取缓冲液中重悬沉淀物至最初收获浓缩物的体积。提取缓冲液由pH7.0的10mM Tris-HCl、150mM NaCl、2%(w/v)Triton X-100所组成。加入Pefabloc至5mM的终浓度。室温搅拌悬液30分钟。通过4℃ 28,000×g离心30分钟澄清含有溶解HN和F糖蛋白的上清液。
以含有0.02%Triton X-100的pH7.0的10mM Tris-HCl,150mM NaCl平衡TMAE-Fractogel柱(10cm×15cm)。将含有溶解HN & F蛋白的Triton X-100上清液(~1mg上样的提取物/mL树脂)直接上样至TMAE-Fractogel柱中。收集加入的总体积加上2倍柱床体积pH7.0的10mM Tris-HCl,150mM NaCl,其中含有0.02%的Triton X-100。用含有0.02%Triton X-100的pH7.0的10mMTris-HCl将含有HN和F的TMAE-Fractogel流出物稀释3倍,
以pH7.0的10mM Tris-HCl,50mM NaCl,0.02%Triton X-100平衡羟基磷灰石柱(10cm×15cm)。上样TMAE流出物后,以2倍柱床体积pH7.0的10mM Tris-HCl,50mM NaCl,0.02%Triton X-100冲洗柱接着以4倍柱床体积pH7.0的5mM磷酸钠,1MNaCl及0.02%Triton X-100冲洗以4倍柱床体积pH7.0的20mM磷酸钠,1M NaCl,0.02%的Triton X-100洗脱蛋白。根据A280收集级份且测量蛋白含量和抗原浓度。
通过用300kDa NMWL膜的切向流超滤浓缩共纯化的HN和F糖蛋白。通过加入10%终浓度的PEG对300kDa过滤物进行PEG沉淀然后于2~8℃搅拌1小时。然后将悬液于4℃28,000×g离心1小时。将沉淀物重悬于PBS中至200-300μg/mL的蛋白浓度。将样品于20℃到25℃搅拌1小时并于4℃在含有0.02%Triton X-100的PBS中透析(6,000至8,000分子量截断(cuf-off))三天。
将透析的HN和F糖蛋白用死端0.2到0.22μm膜的过滤器进行无菌过滤并吸附到磷酸铝上(0.75-3mg/mL终浓度)。实施例6:
该实施例描述了PIV-2血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)糖蛋白的纯化。
通过加入50%的PEG至4%的终浓度并且将混合物于2-8℃孵育1小时而对病毒收获物浓缩产物进行PEG沉淀。然后将悬液于4℃28,000×g离心30分钟并将沉淀物重悬于PBS中2M的尿素中至一半最初的体积。将悬液于20-25℃搅拌1小时且然后于4℃ 28,000×g离心1小时。将沉淀物重悬于pH8.5的10mM Tris-HCl,150mMNaCl缓冲液中至1/10最初体积。然后将样品于-20℃冷冻或立即处理。
向尿素洗过的病毒悬液中加入Triton X-100(10%)至2%的浓度并且于20-25℃搅拌2小时。通过于4℃ 28,000×g离心30分钟澄清含有可溶HN & F糖蛋白的上清液。
以pH 8.5的10mM Tris-HCl,50mM NaCl(其中含有0.01%Triton X-100)平衡TMAIE-Fractogel柱(1.5cm×30cm)。含有可溶HN & F蛋白的Triton X-100上清液(~1mg上样的提取物/mL树脂)以pH8.5的10mM Tris-HCl稀释2倍并直接上样至TMAE-Fractogel柱。收集总体积加上2倍柱床体积的pH8.5的10mM Tris-HCl,50mM NaCl,其中含有0.01%Triton X-100。TMAE-Fractogel流出物含有可溶性的F糖蛋白。以4倍柱床体积pH 8.5的10mMTris-HCl,200mM NaCl,0.01%Triton X-100冲洗TMAE柱。以pH 8.5的10mM Tris-HCl,300mM NaCl,0.01%Triton X-100洗脱HN糖蛋白。
向从TMAE-Fractogel柱得到的富含HN的级份中加入Benzonase并制备1mM MgCl2的混合物。将该混合物室温孵育过夜。
以含有50mM NaCl和0.01%Triton X-100的pH8.5的10mMTris-HCl平衡羟基磷灰石柱(2.5cm×10cm)。将TMAE流出物上样至羟基磷灰石柱并收集UV280吸收的流出物(含有F-糖蛋白)和含有50mM NaCl和0.01%Triton X-100,pH8.5的2倍柱床体积的10mM Tris-HCl。
制备含30mM醋酸钠的羟基磷灰石流出物并上样至以pH5.0的10mM醋酸钠,50mM NaCl,0.01%Triton X-100预平衡的SO3-Fractogel柱。以2倍柱床体积pH5.0的10mM醋酸钠,50mM NaCl,0.01%Triton X-100冲洗柱床。以2倍柱床体积pH5.0的10mM醋酸钠,0.2M NaCl,0.01%Triton X-100进一步冲洗柱床。以4倍柱床体积pH5.0的10mM醋酸钠,1M NaCl,0.01%Triton X-100洗脱F糖蛋白并收集A280吸收峰和2倍柱床体积pH5.0的10mM Tris-HCl,1mM NaCl,0.01%Triton X-100。
填充S-300柱(1.5cm×90cm)并pH7.5的50mM的磷酸钾,0.5M的NaCl,0.01%的Triton X-100平衡。在搅拌的细胞浓缩器(cell concentrator)中于4℃浓缩含有可溶性HN-糖蛋白的TMAE洗脱物以得到约2%S-300柱床体积的终体积并上样至S-300凝胶过滤柱。以pH7.5的50mM磷酸钾,0.5M的NaCl,0.01%的Triton X-100,10%的甘油洗脱柱床并收集具有A280吸收峰(2-4倍柱床体积)含有HN-糖蛋白的级份。
或者,将TMAE洗脱物以pH8.5的10mM Tris-HCl,0.01%Triton X-100稀释5倍并上样至羟基磷灰石柱(5cm×15cm),该柱以pH8.5的10mM Tris-HCl,50mM NaCl,0.01%的Triton X-100平衡过。以4倍柱床体积pH8.5的50mM磷酸钠,0.01%的TritonX-100冲洗柱床。以4倍柱床体积pH8.5的10mM磷酸钠,0.15MNaCl,0.01%Triton X-100洗脱HN-糖蛋白。通过用300kDaNMWL膜的切向流超滤对纯化的HN和F糖蛋白进行超滤。浓缩300kDa的过滤产物并通过用20kDa NMWL膜的切向流超滤浓缩至200-300μg/mL的蛋白浓度,然后在含有0.01%Triton X-100的PBS中渗滤。
浓缩的HN和F糖蛋白于死端0.2-0.22μm膜过滤器上进行无菌过滤并吸附到磷酸铝上(0.75-3mg/mL终浓度)。实施例7:
本实施例描述了PIV-3血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)糖蛋白的纯化。
PIV-3可从每次病毒收获物中单独纯化或合并病毒收获物。通过添加PEG 6000-8000至约2%(w/v)的终浓度并于4℃搅拌约2小时从病毒收获物中沉淀PIV-3。离心收集沉淀物并将沉淀重悬于磷酸盐缓冲中。加入TRITON X-100以达到1%(v/v)的终浓度并将混合物于37℃搅拌1-3小时以提取HN和F糖蛋白。离心去除未溶解的蛋白。大多数HN和F糖蛋白发现于上清液中。
或者,以含有0.25 NaCl,pH 7.5的50mM磷酸缓冲液以2.5ml/每分钟的流速平衡Sephacryl S-500柱(2.5×100cm)。将病毒滞留库(retentate pool)(100ml)上样于柱床并于A280处监测柱床流出液。PIV-3洗脱于缝隙体积中(PIV-3 eluted in the void volume)。也分析级份HA活性并通过SDS-PAGE加以分析。病毒与蛋白污染物获得了良好的分离并具有高的HA活性回复率(>80%)。合并含有PIV-3的级份并按上述进行去污剂提取。
或者,如果感染前细胞冲洗次数增至2到4次,cellufine sulphate可直接用于PIV-3的纯化。以pH7.3的10mM Tris·HCl,0.15MNaCl平衡cellufine柱(10cm×15cm)。将病毒收获浓缩物(上样2.5mg/ml cellufine sulfate)以2mL/分钟的流速上样至柱床。上样之后,以5倍柱床体积的平衡缓冲液冲洗柱床。以含有2%Triton X-100的50mM Tris·HCl,1.5M NaCl洗脱病毒和病毒片段。然后将洗脱池(elution pool)于室温或37℃孵育2-3小时以提取HN & F糖蛋白。离心去除不溶性物质。
以pH7.5的10mM Tris-HCl,0.15M NaCl,0.02%的TritonX-100平衡适当大小的cellufine sulfate柱(~1mg上样的提取物/ml树脂)。通过加蒸馏水或0.02%的Triton X-100将去污剂提取物或TMAE-Fractogel洗脱液的导电率调到约4mS/cm或更小并以50cm/h的线性流速装柱。装柱后,以5倍柱床体积的平衡缓冲液洗柱。以含有1.0MNaCl,0.02%Triton X-100的pH7.5的10mM Tris·HCl洗脱HN和F糖蛋白。收集级份并监测A280处的吸收。合并吸收峰并分析其蛋白含量和HA活性。于cellufine sulfate柱的洗脱级份中回收HN & F糖蛋白。
通过阴离子交换层析进一步纯化富含HN和F的提取物(通过凝胶过滤层析纯化的病毒)或获自cellufine sulfate的HN和F洗脱池。
以含有0.05M NaCl,0.02%Triton X-100的pH7.5的10mMTris·HCl平衡TMAE-Fractogel柱(上样~2.5mg提取物或cellufinesulfate洗脱池/mL树脂)。以蒸馏水将提取物或cellufine sulfate洗脱库的导电率调至小于或等于4mS/cm并将样品以100cm/h的线性流速装柱。样品装柱后,以5倍柱床体积的平衡缓冲液洗柱然后以5倍柱床体积pH7.5的10mM Tris·HCl,0.15M NaCl,0.02%Triton X-100洗柱。以pH7.5的10mM Tris·HCl,0.6M NaCl,0.02%TritonX-100洗脱蛋白。根据A280值收集和合并级份并测量级份中的蛋白浓度和HA活性。
共纯化的HN和F糖蛋白通过用300kDa NMWL膜的切向流超滤加以超滤并以PBS渗滤。合并含有HN和F蛋白的300kDa滤液和渗滤液并用300kDa膜重新浓缩且以PBS渗滤。将浓缩的糖蛋白制品进行0.22μm的无菌过滤并吸附至磷酸铝上(0.75~3mg/mL终浓度)。实施例8:
该实施例说明了通过SDS-PAGE、免疫印迹和扫描光密度对PIVHN和F糖蛋白的分析。
将PIV HN和F糖蛋白制品在还原条件下12.5%的SDS-PAGE凝胶或非还原条件下的7.5%SDS-PAGE凝胶上进行电泳。凝胶用考马斯蓝染色。检测到更高分子量形式的HN和F蛋白。用单特异性抗-HN和抗-F血清或单克隆抗体通过免疫印迹分析证实更高分子量的同一性(identity)。存在于制品中HN和F蛋白的总量通过用激光光密度计扫描每泳道并累积相应于HN和F蛋白带峰值处的面积加以测定。这些分析的结果显示于附图中,其中图2(a)到2(c)为PIV-1,图3(a)到3(d)为PIV-2且图4(a)到4(d)为PIV-3。实施例9:
该实施例说明了小鼠中PIV-1 HN和F糖蛋白的免疫原性。
以5只小鼠为1组的各组(CD-1,18-20g)于第0天和第28天以3mg/mL磷酸铝(明矾)为佐剂的0.3、1、3或10μg的PIV-1 HN& F糖蛋白进行腹膜内免疫(0.5mL)。于第0、28和42天采集血液样品。以PBS/明矾免疫的小鼠用作阴性对照。分析血清的抗-HN、抗-F抗体效价和PIV-1特异性中和效价。在所有测试剂量中于第4周和第6周检测到强烈的抗-HN、抗-F和中和抗体反应。结果小结于图5(a)到5(c)。实施例10:
该实施例说明了在仓鼠中PIV-1 HN和F糖蛋白的免疫原性。
以10只仓鼠(golden Syrian,Charles River)为一组的各组在第0天和第28天以3mg/mL磷酸铝(明矾)为佐剂的1或10μg PIV-1HN & F糖蛋白进行肌肉内免疫(0.5mL)。于第0、28和42天采集血样。以PBS/明矾免疫的仓鼠用作阴性对照。分析血清的抗-HN、抗-F效价和PIV-1特异性中和效价。对于所有的测试剂量均在第4周和第6周观察到强烈的抗-HN、抗-F和中和抗体反应。结果小结于图6(a)至6(c)中。实施例11:
该实施例说明了在小鼠中PIV-2 HN和F糖蛋白的免疫原性。
以5只小鼠为一组的各组(CD-1,18-20g)于第0天和第28天以3mg/mL磷酸铝(明矾)为佐剂的0.3、1、3或10μg PIV-2 HN& F糖蛋白进行腹膜内免疫(0.5mL)。纯化的PIV-2 HN和F糖蛋白以1∶1的比例混合(如,10μg剂量将含有5μg HN和5μg F)。于第0、28和42天采集血样。以PBS/明矾免疫的小鼠用作阴性对照。分析血清的抗-HN、抗-F效价和PIV-2特异性中和效价。对于所有的测试剂量均在第4和第6周检测到PIV-2中和抗体反应。结果小结于图7中。实施例12:
该实施例说明了在小鼠中不同HN∶F比例的PIV-2 HN和F糖蛋白的免疫原性。
以5只小鼠为一组的各组(CD-1,18-20g)于第0天和第28天以3mg/ml磷酸铝(明矾)为佐剂的0.1、1或10μg PIV-2 HN &F糖蛋白进行腹膜内免疫(0.5mL)。对于每种剂量的糖蛋白,测试了1∶1、1∶2和1∶5的HN∶F比例。于第0、第28和第42天采集血样。以PBS/明矾免疫的小鼠用作阴性对照。分析血清的抗-HN、抗-F效价和PIV-2特异性中和效价。没有考虑在1或10μg剂量中存在的HN和F蛋白酶的比例,所有的制剂于第4及第6周在免疫动物中诱发较高的抗-HN、抗-F和PIV-2特异性中和抗体的效价。结果小结于图8到10。实施例13:
该实施例说明了在小鼠中PIV-3 HN和F糖蛋白的免疫原性。
小鼠(18-20g,CD1,Charles River)以磷酸铝为佐剂(每剂量1.5mg)的0.5ml 1、3、10和20μg剂量的PIV-3 HN和F糖蛋白进行腹膜内免疫。为了阳性对照,小鼠以活体PIV-3(105TCID50)进行鼻内免疫并且为了阴性对照,小鼠以1.5mg/0.5mL磷酸铝进行免疫。五周后以相同剂量的吸附到磷酸铝上的蛋白对动物进行增强免疫。于第0、35和49天采集血样。测量免疫血清中血细胞凝集抑制(HAI)、中和及抗-PIV-3 ELISA效价。高效价的抗-PIV-3、HAI和中和抗体存在于在第5和第7周以1、3、10或20μg剂量免疫动物的血清中。结果显示于图11(a)到11(c)中。实施例14:
该实施例说明了在豚鼠中PIV-3 HN和F糖蛋白的免疫原性。
豚鼠(300g,Buchberg)以磷酸铝为佐剂(1.5mg)的1、3、10和20μg剂量的PIV-3 HN和F糖蛋白进行肌肉内免疫(0.5ml)。以105 TCID50活体PIV-3鼻内免疫的动物用作阳性对照且仅以佐剂免疫的(1.5mg磷酸铝/0.5ml)动物用作阴性对照。4周后以磷酸铝中相同剂量对动物进行增强免疫。于第0、14、28、46和56天采集血样并且测量血清中HI、NT和抗-PIV-3 ELISA的效价。增强注射后,在任何分析的任何剂量之间的效价中没有显著的差异。这些结果显示于图12(a)到12(c)中。实施例15:
该实施例说明了PIV-3 HN和F糖蛋白在仓鼠中诱发保护性免疫性反应的能力。
仓鼠(雌性,4-6周龄)以磷酸铝为佐剂(1.5mg)的1、3、10或20μg剂量的共纯化PIV-3 HN和F制品进行肌肉内免疫(0.5ml)。于第28天以磷酸铝中相同剂量对动物进行增强免疫。以PIV-3(105TCID50)鼻内免疫的动物用作阳性对照且以磷酸铝免疫(1.5mg/0.5ml)的动物用作阴性对照。于第0和28天采集血样。测量第4周放血血清中的HI、NT和抗-PIV-3 ELISA效价。在所有的剂量中均观察到良好的一级HAI和中和反应(primary HAI and neutralizing response)。第42天,动物鼻内以活体PIV-3(105 TCID50/动物)感染。4天后,宰杀动物。测量支气管肺泡灌洗液(lavages)和鼻洗液的病毒效价。以两种1μg剂量糖蛋白的免疫保护了仓鼠的上下呼吸道免受PIV-3的随后感染。肺部灌洗液和鼻洗液中的病毒效价显著降低(在所有剂量中>3log减少(>3 log reduction at all doses))。这些结果小结于图13(a)到13(d)中。实施例16:
该实施例说明了PIV-3 HN和F糖蛋白制品在棉鼠中诱发保护性免疫反应的能力。
棉鼠(Sigmodon fulviventor,4-6周龄)以磷酸铝为佐剂(1.0mg/剂量)的1μg剂量的共纯化PIV-3 HN & F糖蛋白制品进行肌肉内免疫(0.4ml)。于第28天,将动物放血并以磷酸铝中相同剂量的抗原增强免疫。增强免疫注射后7天,将动物放血并以PIV-3感染。感染后4天,宰杀动物并取出肺。分析血清的血细胞凝集抑制(HAI)效价和中和效价。一次注射HN和F糖蛋白制品诱导强烈的中和及HAI反应。以相同剂量的蛋白对动物增强免疫增强了抗体反应。观察到的效价类似于活体病毒免疫而获得的效价。从免疫动物的肺中没有回收到PIV-3病毒。这些结果小结于图14(a)到14(c)中。实施例17:
该实施例说明了在灵长类中PIV-3 HN和F糖蛋白制品的免疫原性。
年轻的雄性成年Cynomologous猕猴(4-5kg)以含有50μg PIV-3 HN和F和1.5mg磷酸铝的0.5ml样品进行肌肉内免疫并在6周后以相同的剂量增强免疫。于第0、28、42、56、70、84和112天采集血样。进行血液学和生化测试。通过ELISA测试血清的PIV-3中和及HAI抗体以及抗-HN和抗-F抗体。所有的血液学和生化分析均在正常范围内。免疫动物的血清在所有的测试时间点均具有较高的抗-HN、抗-F、HAI和中和抗体。抗体反应显示于表4中。实施例18:
该实施例说明了3型副流感病毒(PIV-3)疫苗在人类中的临床试用。
进行两次I期人类临床研究以测试一次剂量的PIV-3亚单位疫苗的安全性和免疫原性。两次研究均在得到加拿大联邦健康保护部门研究新药(IND)规则的批准后得以进行的。PIV-3疫苗由吸附到1.5mg磷酸铝上的20μg共纯化HN和F糖蛋白所组成。
第一次研究包括40名健康成年人,其中的20名接受PIV-3疫苗且另20名接受对照疫苗。第二次研究包括40名24至36月龄的健康儿童,其中的23名接受PIV-3且另17名接受对照疫苗。跟踪所有的研究对象7到8个月。在儿童中的研究包括在整个扩展跟踪期内对呼吸感染的积极监视(active surveillance)。两次研究均为双盲性的。
每次种痘后分析局部及系统反应的安全性。在最初72小时内对PIV-3疫苗的反应是短暂而次要的且结果列于表5(a)和5(b)中。
用HN-及F-特异性ELISAs、HAI及病毒中和分析测定血清抗体的水平。结果位于下表6中并显示3型副流感病毒亚单位疫苗的受试者通过所有成年人的测试及儿童中的HAI、抗-F ELISA、抗-HNELISA而测得其具有显著更高的种痘后抗体效价。这些结果证明含有疫苗的PIV-3 HN和F糖蛋白在人类中是具有免疫原性的。实施例19:
该实施例说明了含有PIV-1、2和3 HN和F糖蛋白三价疫苗在小鼠中的免疫原性。
以5只小鼠为1组的各组(CD-1,18-20g)于第0天和第28天以3mg/ml磷酸铝(明矾)为佐剂的0.3、1、3或10μg PIV-1、2和3 HN & F糖蛋白混合物(即对于10μg剂量指10μg PIV-1糖蛋白、10μg PIV-2糖蛋白及10μg PIV-3糖蛋白)进行腹膜内免疫(0.5mL)。纯化的PIV-2 HN和F糖蛋白以1∶1比例混合(如,10μg的剂量将含有5μg HN和5μg F),而PIV-1和PIV-3的HN和F制品由于它们的共纯化而未被调整。于第0、28和42天采集血样。以PBS/明矾免疫的小鼠用作阴性对照。分析血清抗所有三种PIV型的特异性中和效价。于第4周观察抗这3型副流感病毒中每型的温和(moderate)中和抗体反应并且对于所有的测试剂量均于第6周观察到强烈的中和反应。结果小结于图14(a)到14(c)中。实施例20:
该实施例说明了HN和F糖蛋白制品在吸附到磷酸铝上后的稳定性。
PIV-3 HN和F糖蛋白贮存在于6℃且于3、6、9、15及18个月后进行测试。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析及小鼠中的免疫原性测试来评价其稳定性。观察到典型的抗-HN和抗-F抗体结合的SDS-PAGE。没有观察到聚集、沉淀或降解的迹象。
CD1小鼠以0.5mL吸附到磷酸铝上的PIV-3 HN和F糖蛋白进行腹膜内免疫。在每个时间点测试几种剂量的糖蛋白。小鼠的免疫原性数据小结于表6。在6℃贮存18个月后没有观察到免疫原性显著的改变。
公开小结
小结该公开,本发明提供了从1、2和3型副流感病毒分离纯化的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)糖蛋白、制备该样品的方法及其在免疫原性组合物和诊断实施方案中的使用。特别地,含有PIV-1、PIV-2和PIV-3的HN及F糖蛋白的三价疫苗产生能够中和每种病毒类型的免疫反应。在本发明范围内的修改是可能的。
表1发酵罐中PIV-1 HN和F糖蛋白的产量
样品 | 体积(L) | HA单位/5μl | %HA回收 | LogTCID50/ml | ELISAμg/ml | %ELISA回收 | ||
HN | F | HN | F | |||||
收获物过滤物浓缩物 | 1501501 | 25612832768 | 10050>100 | 8.78.210.3 | 2.852.29260.55 | 0.340.2225.24 | 10076 | 10076 |
收获物过滤物浓缩物 | 1501501 | 16161024 | 10010043 | 8.79.011.2 | 6.025.03567.74 | 0.800.6964.87 | 10075 | 10049 |
收获物过滤物浓缩物 | 1501501 | 646416384 | 100100>100 | 8.58.310.1 | 3.733.67227.18 | 0.440.4333.85 | 10041 | 10052 |
收获物过滤物浓缩物 | 1501501 | 25651232768 | 100>10043 | 8.88.710.3 | 5.135.10382.4 | 0.550.5440.6 | 10050 | 10050 |
收获物过滤物浓缩物 | 1501501 | 256512131072 | 100>100>100 | 8.78.710.7 | 4.8310.21398.21 | 0.311.0228.87 | 10026 | 10019 |
收获物过滤物浓缩物 | 1501501 | 25625616384 | 10010043 | 7.06.79.5 | 3.753.38313.8 | 0.420.37745.2 | 10062 | 10080 |
收获物过滤物浓缩物 | 1501501 | 25625632768 | 10010085 | 8.38.010.7 | 0.650.6442.3 | 0.040.042.91 | 10044 | 10049 |
收获物过滤物浓缩物 | 1501501 | 25612816384 | 1005085 | 9.09.011.0 | 5.474.54479.917 | 0.420.4255.2 | 10070 | 10088 |
表2发酵罐中PIV-2 HN和F糖蛋白
样品 | 体积(L) | HA单位/50μl | %HA 回收 | Log TCID50/ml | ELISAμg/ml | |
全病毒 | F | |||||
收获物过滤物浓缩物 | 1201202.15 | 16161024 | 100100>100 | 8.27.78.8 | 6488 | |
收获物过滤物浓缩物 | 1201202.05 | 16162048 | 100100>100 | 8.38.29.5 | 2263 | |
收获物过滤物浓缩物 | 1201202.1 | 881024 | 100100>100 | 8.07.89.8 | 3351 | |
收获物过滤物浓缩物 | 1201202.6 | 16161024 | 100100>100 | 7.87.59.5 | 4552 | |
收获物过滤物浓缩物 | 1201201.7 | 8161024 | 100100>100 | 8.38.010.0 | 3988 | |
收获物过滤物浓缩物 | 1201201.4 | 84512 | 1005075 | 7.87.89.7 | 3281 | 78.8 |
收获物过滤物浓缩物 | 1201201.8 | 44512 | 100100>100 | 7.88.09.7 | 3039 | 66.27 |
收获物过滤物浓缩物 | 1201201.8 | 44512 | 100100>100 | 7.77.79.8 | 5806 |
表3PIV-3发酵罐数据小结
样品 | 体积me(L) | HA单位/50μl | %HA回收 | LogTCID50/ml | ELISAμg/ml | %ELISA回收 |
收获物过滤物浓缩物 | 901402.6 | 256256262144 | 100155>100 | 8.88.710.5 | --17.9881.1 | --10091.4 |
收获物过滤物浓缩物 | 951002.0 | 512512262144 | 100105>100 | 8.77.810.0 | --15.5956.2 | --100123 |
收获物过滤物浓缩物 | 90902.3 | 25612816384 | 10050>100 | 8.37.59.8 | --8.6446.3 | --100133 |
收获物过滤物浓缩物 | 1001002.8 | 51251216384 | 10010089.6 | 9.79.710.5 | --30.51181.2 | --100109 |
收获物过滤物浓缩物 | 1001002.4 | 2561288192 | 1005076.8 | 8.58.510.3 | --15.7496.6 | --10076 |
收获物过滤物浓缩物 | 1101102.6 | 128644096 | 1005075.6 | 8.78.210.0 | --12.8521.1 | --10098.6 |
表4猕猴中PIV-3 HN & F糖蛋白的免疫原性
天数 | 中和效价 | 血细胞凝集抑制效价 | 抗-HNELISA效价 | 抗-F ELISA效价 |
0 | <10 | 40 | 350 | 260 |
28 | 5120 | 5120 | 37000 | 25500 |
42 | 2560 | 2560 | 21200 | 11300 |
56 | 640 | 1280 | 15600 | 12000 |
70 | 320 | 1280 | 18500 | 14300 |
84 | 320 | 320 | 12500 | 10000 |
112 | 320 | 320 | 10000 | 7800 |
表5(a)24和72小时成年人反应
反应 | 24小时PIV-3(n=20) | 72小时PIV-3(n=19)+ |
局部发红肿胀不适 | 5%085%* | 0016% |
全身发热喉痛充血咳嗽头痛疲倦恶心呕吐疼痛/不适痒医学咨询其它问题 | 0010%020%15%5%05%000 | 5%11%16%5%16%32%005%5%00 |
表5(b)种痘PIV-3疫苗第24和72小时后儿童的反应
+ 于72小时以外收集一个对象的数据*p=0.08,卡方(Yates corrected)n种痘对象的数目
反应 | 24小时PIV-3(n=23) | 72小时PIV-3(n=23) |
局部发红肿胀不适 | 009%* | 004% |
全身充血咳嗽喉痛疹烦恼啼哭较少活动呕吐腹泻颤抖发作医学咨询其它问题 | 000017%13%9%04%000 | 9%9%4%013%13%9%4%9%000 |
表6PIV-3疫苗在人类中的免疫原性
几何平均效价 | ||||||||
抗-HN | 抗-F | HAI | NA | |||||
之前 | 之后 | 之前 | 之后 | 之前 | 之后 | 之前 | 之后 | |
成年人 | 2.56 | 7.25 | 3.0 | 12.05 | 152.02 | 1420.25 | 123.41 | 415.88 |
儿童 | 0.97 | 5.69 | 0.90 | 3.12 | 53.83 | 398.98 | 11.84 | 59.71 |
表7 吸附于磷酸铝上PIV-3 HN和F糖蛋白的稳定性
SE=标准误 nd=未测定*动物于注射后5周放血
贮存时间(月) | 剂量(μg) | HI效价log2(HI/5)±SE | NT效价log2(NT/5)±SE | 抗-PIV-3 ELISA效价log2(EIA/100)±SE |
0* | 0.3 | 6.0±1.1 | 2.3±1.2 | 7.8±1.8 |
1.0 | 8.9±1.2 | 3.6±1.2 | 9.6±1.3 | |
3.0 | 8.3±0.9 | 4.2±1.2 | 10.2±13 | |
10.0 | 9.0±0.6 | 5.1±0.7 | 10.8±1.1 | |
3* | 1.0 | 7.2±0.4 | 4.8±0.7 | 9.4±0.8 |
3.0 | 7.4±1.4 | 5.0±0.9 | 11.0±1.3 | |
10.0 | 7.0±0.6 | 5.4±0.8 | 11.0±0.0 | |
20.0 | 8.6±0.8 | 6.0±0.0 | 11.4±0.8 | |
6 | 0.3 | 6.2±1.2 | 3.2±1.0 | 10.2±0.8 |
1.0 | 6.6±0.5 | 4.0±1.0 | 10.6±0.8 | |
3.0 | 7.1±0.5 | 4.5±0.9 | 11.0±0.9 | |
10.0 | 7.1±1.4 | 4.9±0.9 | 11.4±0.8 | |
9 | 0.3 | 7.6±1.3 | 3.1±0.9 | 9.7±0.9 |
1.0 | 7.9±0.9 | 3.8±1.0 | 10.0±1.0 | |
3.0 | 8.6±1.9 | 4.6±1.4 | 10.8±1.1 | |
15 | 0.3 | 7.7±1.4 | 4.0±2.3 | nd |
1.0 | 8.9±0.7 | 5.7±1.3 | nd | |
3.0 | 6.9±3.7 | 6.1±1.1 | nd | |
18 | 0.3 | nd | 3.5±1.4 | 8.6±3.2 |
1.0 | nd | 4.0±1.5 | 9.8±3.2 | |
3.0 | nd | 5.9±0.7 | 12.0±1.0 |
参考文献1 Katz,S.L.具有优越性的新疫苗开发。1卷.华盛顿:国家出版社.(1985)385-396页。2 Fulginiti,V.A.,Eller,J.J.,Sieber,O.F.,Joyner,J.W.,Minamitani,M.和Meiklejohn,G.(1969)美国流行病学杂志.89(4),435-448。3 Chin,J.,Magoffin,R.L.,Shearer,L.A.,Schieble,J.H.和Lennette,E.H.(1969)美国流行病学杂志.89(4),449-463。4 Jensen,K.E.,Peeler,B.E.和Dulworth,W.G(1962)免疫学杂志.
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Claims (53)
1.分离纯化的1型副流感病毒(PIV-1)血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白,或其保留所述糖蛋白免疫学特性的片段或类似物。
2.权利要求1的糖蛋白,通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其具有约70到约80kDa的表观分子量。
3.分离纯化的1型副流感病毒(PIV-1)融合(F)糖蛋白,或其保留所述糖蛋白免疫学特性的片段或类似物。
4.权利要求3的糖蛋白,通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量。
5.共分离共纯化的1型副流感病毒(PIV-1)糖蛋白混合物,基本上由血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白及融合(F)糖蛋白所组成。
6.权利要求5的糖蛋白混合物,其中所述的HN糖蛋白具有约70到约80kDa的表观分子量且F糖蛋白具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量,其中的表观分子量通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳加以测定。
7.至少约70%(重量)纯度的权利要求5的混合物。
8.分离纯化的2型副流感病毒(PIV-2)血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白,或者其保留所述糖蛋白免疫学特性的片段或类似物。
9.权利要求8的糖蛋白,通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其具有约75到约85kDa的表观分子量。
10.权利要求8的糖蛋白,其基本上不含2型副流感病毒(PIV-2)融合(F)糖蛋白。
11.至少具有约65%(重量)纯度的权利要求10的糖蛋白。
12.分离纯化的2型副流感病毒(PIV-2)融合(F)糖蛋白或者其保留所述糖蛋白免疫学特性的片段或类似物。
13.权利要求12的糖蛋白,通过还原条件下十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量。
14.权利要求12的糖蛋白,其基本上不含2型副流感病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白。
15.至少具有约80%(重量)纯度的权利要求14的糖蛋白。
16.共分离和共纯化的非变性3型副流感病毒(PIV-3)糖蛋白混合物,无凝集素且基本上由血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白和融合(F)糖蛋白所组成。
17.权利要求16的糖蛋白混合物,其中所述的HN糖蛋白具有约70kDa到约80kDa的表观分子量且所述的F糖蛋白具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量,其中的分子量由还原条件下通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以测定。
18.至少具有约70%(重量)纯度的权利要求16的混合物。
19.免疫原性组合物,包括免疫有效量的:
(a)1型副流感病毒(PIV-1)血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白;
(b)1型副流感病毒(PIV-1)融合(F)糖蛋白;
(c)2型副流感病毒(PIV-2)血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白;
(d)2型副流感病毒(PIV-2)融合(F)糖蛋白;
(e)3型副流感病毒(PIV-3)血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白;
(f)3型副流感病毒(PIV-3)融合(F)糖蛋白;
(g)(a)至(f)中至少一种F和/或HN糖蛋白的同源和/或异源寡聚体,包括其二寡体;或者保留所述糖蛋白免疫学特性的任何一个所述糖蛋白的相应片段或类似物。
20.权利要求19的免疫原性组合物,其中所述的PIV-1 HN糖蛋白具有约70到约80kDa的表观分子量,所述的PIV-1F糖蛋白具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量,所述的PIV-2 HN糖蛋白具有约75到85kDa的表观分子量,所述的PIV-2F糖蛋白具有F1多肽亚单位约45到55kDa的表观分子量,所述的PIV-3 HN糖蛋白具有约70到约80kDa的表观分子量,且所述的PIV-3F糖蛋白具有F1多肽亚单位约45到约55kDa的表观分子量,其中的分子量通过还原条件下的十二烷基聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)加以测定。
21.权利要求19的组合物,其中所述的PIV-1 HN和F糖蛋白作为所述糖蛋白的共分离和共纯化的混合物提供且所述的PIV-3 HN和F糖蛋白作为所述糖蛋白共分离和共纯化的混合物提供。
22.权利要求19的免疫原性组合物,以预选(preselected)量的每种所述糖蛋白配制成疫苗用于体内施用到宿主以赋予对由PIV-1、PIV-2和PIV-3导致疾病的保护。
23.权利要求22的免疫原性组合物,其被配制成微粒、胶囊、ISCOM或脂质体制品。
24.权利要求22的免疫原性组合物,其与用于运送至免疫系统特定细胞或粘膜表面的定向分子结合使用。
25.权利要求24的免疫原性组合物,其进一步包括至少一种其它免疫原性或免疫刺激性物质。
26.权利要求24的免疫原性组合物,其中的至少一种其它免疫刺激性物质为至少一种佐剂。
27.权利要求26的免疫原性组合物,其中至少一种佐剂选自磷酸铝、氢氧化铝、QS21、Quil A或其衍生物或其组分、磷酸钙、氢氧化钙、氢氧化锌、糖脂类似物、氨基酸的十八烷基酯、胞壁酰二肽、脂蛋白、polyphosphazene、ISCOM基质、ISCOPRP、DC-chol及DDBA。
28.权利要求27的免疫原性组合物,其中的宿主为灵长类。
29.权利要求28的免疫原性组合物,其中的灵长类为人类。
30.权利要求19的免疫原性组合物,其进一步包括至少一种其它的免疫原。
31.权利要求30的免疫原性组合物,其中所述的至少一种其它的免疫原包括来自A和/或B型RSV的人呼吸道合胞体病毒(RSV)蛋白。
32.在宿主中产生免疫反应的方法,包括向其中施用免疫有效量的权利要求19的免疫原性组合物。
33.权利要求32的方法,其中所述的免疫原性组合物配制成疫苗用于体内施用到宿主且所述的用药赋予宿主对由PIV-1、PIV-2和PIV-3导致疾病的保护。
34.检测样品中与副流感病毒(PIV)糖蛋白起特异性反应抗体存在的方法,包括以下步骤:
(a)将样品与权利要求19的免疫原性组合物接触以制备包括副流感病毒糖蛋白和存在于样品中与其起特异性反应的任何所述抗体的复合物;和
(b)检测复合物的产生。
35.检测样品中副流感病毒(PIV)糖蛋白存在的方法,包括以下步骤:
(a)以权利要求19的免疫原性组合物免疫受试者以制备对PIV-1、PIV-2和PIV-3 HN和F糖蛋白特异性的抗体;
(b)将样品与抗体接触以制备包括存在于样品中任何PIV糖蛋白和所述糖蛋白特异性抗体的复合物;和
(c)检测复合物的产生。
36.诊断试剂盒,用于检测样品中与副流感病毒(PIV)糖蛋白起特异性反应抗体的存在,包括:
(a)权利要求19的免疫原性组合物;
(b)用于将免疫原性组合物与样品接触以制备包括副流感病毒糖蛋白和存在于样品中任何所述抗体的复合物的方法;和
(c)用于检测复合物产生的方法。
37.用于检测样品中副流感病毒(PIV)糖蛋白的存在的诊断试剂盒,包括:
(a)对PIV-1、PIV-2和PIV-3 HN和F糖蛋白特异性的抗体;
(b)用于将抗体与样品接触以制备包括PIV糖蛋白和PIV糖蛋白-特异性抗体复合物的方法;和
(c)用于检测复合物产生的方法。
38.制备疫苗的方法,该疫苗用于抗由副流感病毒(PIV)导致的疾病,包括:
施用免疫原性的权利要求19组合物至测试宿主以测定其组分的相对量和其施用频率以赋予对由PIV-1、PIV-2和PIV-3导致疾病的保护;和
根据所述检测量和施用频率以适于施用到待治疗宿主的形式配制免疫原性组合物。
39.权利要求38的方法,其中的待治疗宿主是人类。
40.制备 副流感病毒(PIV)糖蛋白特异性单克隆抗体的方法,包括:
(a)施用免疫原性的权利要求19组合物到至少一只小鼠以制备至少一只免疫小鼠;
(b)从至少一只免疫小鼠中取出B-淋巴细胞;
(c)将来自该至少一只免疫小鼠的B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,从而制备杂交瘤;
(d)克隆产生选择性抗-PIV糖蛋白抗体的杂交瘤;
(e)培养产生抗-PIV糖蛋白抗体的克隆;和
(f)从培养物中分离抗-PIV糖蛋白抗体。
41.制备共分离和共纯化1型副流感病毒(PIV-1)糖蛋白混合物的方法,其包括:
在培养基中培养PIV-1;
从培养基中分离培养的病毒;
溶解分离病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)包膜糖蛋白;和
共分离和共纯化溶解的包膜糖蛋白。
42.权利要求41的方法,其中所述的共分离和共纯化通过以下步骤完成:
从溶解包膜糖蛋白的离子交换层析中收集含HN和F糖蛋白的流出液(flow-through);
将流出液上样到羟基磷灰石基质上;和
从羟基磷灰石基质中选择性地共洗脱HN和F糖蛋白。
43.权利要求42的方法,其中选择性共洗脱的HN和F糖蛋白通过切向流超滤加以纯化。
44.权利要求41的方法,其中所述的共分离和共纯化进一步包括选择性共沉淀HN和F糖蛋白、分离共沉淀的HN和F糖蛋白及重新溶解分离的HN和F糖蛋白。
45.制备分离纯化的2型副流感病毒(PIV-2)单个糖蛋白的方法,其包括:
在培养基中培养PIV-2;
从培养基中分离培养的病毒;
溶解分离病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)包膜糖蛋白;以及
分离和纯化至少一种溶解的包膜糖蛋白。
46.权利要求45的方法,其中所述的溶解包膜糖蛋白单独地分离和纯化。
47.权利要求46的方法,其中所述的单独分离和纯化通过以下步骤完成:
从溶解包膜糖蛋白的离子交换层析中收集含有F-糖蛋白的流出液而HN糖蛋白被留在离子交换介质中;
将收集到的流出液应用于羟基磷灰石基质并收集含有F-糖蛋白的流出液;
选择性地从羟基磷灰石基质流出液中去除在溶解步骤中使用的去污剂以提供分离纯化的F糖蛋白;
从离子交换介质中洗脱HN糖蛋白以提供分离纯化的HN糖蛋白。
48.权利要求47的方法,其中所述的分离纯化HN糖蛋白应用于凝胶过滤介质以分离HN糖蛋白与其它分子量的污染物。
49.权利要求47的方法,其中所述的分离纯化HN糖蛋白应用于羟基磷灰石基质以结合HN糖蛋白至基质上并且随后从其中洗脱HN糖蛋白。
50.权利要求47的方法,其中的分离纯化F和HN糖蛋白通过切向流超滤单独纯化。
51.制备共分离共纯化的3型副流感病毒(PIV-3)糖蛋白的方法,其包括:
在培养基中培养PIV-3,
从培养基中分离培养的病毒,
溶解分离病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合(F)包膜糖蛋白,以及
共分离和共纯化无凝集素的溶解糖蛋白。
52.权利要求51的方法,其中所述的共分离和共纯化通过以下步骤完成:
将HN和F糖蛋白上样到第一种离子交换介质而允许污染物流过介质,
从第一种离子交换介质中共洗脱HN和F糖蛋白,
将共洗脱的HN和F糖蛋白上样到第二种离子交换介质,后者位于一定离子强度的溶液中,即该离子强度使共洗脱的HN和F结合而允许污染物流过第二种离子交换介质;以及
从第二种离子交换介质中洗脱HN和F糖蛋白。
53.权利要求52的方法,其中收集的流出物通过切向流超滤加以纯化。
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