ES2206507T3

ES2206507T3 - Metodo de purificacion de necrotoxina producida por bordetella.

Info

Publication number: ES2206507T3
Application number: ES95921113T
Authority: ES
Inventors: Toru Kawai; Toshihiro Ushijima; Kozo Takase; Hideo Fujikawa
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2015-06-07
Also published as: CN1130225C; EP0773030B8; DE69535964D1; EP0773030A1; EP1297845A3; ATE248603T1; DK0773030T3; EP1297845B1; EP0773030A4; EP0773030B1; WO1995034322A1; JP2006342175A; ES2326793T3; JP3884066B2; DE69531690T2; DE69531690D1; US6124432A; CN1494922A; CN1279978C; CN1154655A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION RECLAMA Y PROPORCIONA UN METODO PARA PREPARARA TOXINA DERMONECROTICA, UN TOXOIDE MEJORADO DE TOXINA DERMONECROTICA PRODUCIDO POR BORDETELLA Y UNA MEZCLA TOXOIDE QUE INCLUYE DICHO TOXOIDE MEJORADO DE TOXINA DERMONECROTICA PRODUCIDA POR BORDETELLA Y UN TOXOIDE DE TOXINA DERMONECROTICA PRODUCIDA POR PASTEURELLA. SE HA MEJORADO UN METODO PARA PURIFICAR PARCIALMENTE LA TOXINA DERMONECROTICA QUE SUPONE EL PONER EN CONTACTO UNA SOLUCION QUE CONTIENE TOXINA DERMONECROTICA CON UN GEL CROMATOGRAFICO SULFATADO POR UNA SULFATACION DIRECTA O UN GEL CROMATOGRAFICO AL QUE SE UNE COVALENTEMENTE UNA MOLECULA SULFATADA PARA CONSEGUIR DE ESTA FORMA LA TOXINA DERMONECROTICA ABSORBIDA EN EL GEL, Y ELUDIR LA TOXINA DERMONECROTICA ABSORBIDA DEL GEL. TAMBIEN SE FACILITA UN TOXOIDE OBTENIDO DE TOXINA DERMONECROTICA PRODUCIDA POR BORDETELLA, DICHA TOXINA DERMONECROTICA SE PREPARA MEDIANTE EL METODO REFERIDO PARA PURIFICAR PARCIALMEMENTE LA TOXINA DERMONECROTICA, Y UNA MEZCLA TOXOIDE PREPARADA MEDIANTE LA MEZCLA DE DICHOS TOXOIDES Y UN TOXOIDE DE TOXINA DERMONECROTICA PRODUCIDA MEDIANTE PASTEURELLA TOXIGENICA, DICHA MEZCLA TOXOIDE ES SEGURA U EFECTIVA PARA PREVENIR LA RINITIS ATROFICA EN LOS CERDOS.

Description

Método de purificación de necrotoxina producida por Bordetella.

Campo técnico de la invención

La presente especificación se refiere a un medicamento para la profilaxis de enfermedades infecciosas porcinas. Más concretamente, la presente especificación tiene que ver con un toxoide perfeccionado de toxina dermonecrótica producida por Bordetella, una mezcla de toxoides constando de dicho toxoide y de un toxoide de toxina dermonecrótica producida por Pasteurella. La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar dicho toxoide.

Antecedentes de la invención

La rinitis atrófica (de ahora en adelante mencionada también como "RA") es una enfermedad crónica respiratoria porcina que tiene una infectividad sumamente potente, siendo los síntomas principales la atrofia de concha, hipoplasia, epistaxis, retorcimiento del hocico e inducción de otras enfermedades respiratorias, y otros. Se sabe que esta enfermedad está causada por una Bordetella bronchiseptica toxigénica (de ahora en adelante mencionada también como "Bb") y una Pasteurella multocida toxigénica (de ahora en adelante mencionada también como "Pm"), las cuales infectan la mucosa del tracto respiratorio superior. La Bb posee hemaglutinina y fimbrias como factor de adherencia y, de este modo, se une fácilmente a la mucosa nasal mientras que la Pm no tiene tal factor de adherencia y, por lo tanto, difícilmente coloniza por sí misma. De acuerdo con esto, para el establecimiento de una infección por Pm, es necesario un factor de predisposición que cause una lesión en la mucosa nasal, dicho factor siendo típicamente Bb. Se sabe que los factores patológicos implicados en la causa de lesión en la mucosa nasal son una citotoxina traqueal y una toxina dermonecrótica. En una infección experimental, se infecta un cerdo con Bb y, varios días después, seguido por infección intranasal con Pm, para causar una RA grave como se observa en una granja de campo.

La Bordetella incluye B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica, B. avium, y otras, las cuales producen una diversidad de substancias biológicamente activas. La toxina dermonecrótica Bb (de ahora en adelante mencionada también como "TBb") es una de tales substancias, y está producida por cualquier Bordetella. Se descubrió que la TBb, teniendo actividades biológicas tales como actividad necrótica hemorrágica, actividad para causar atrofia de concha, actividad para causar hipoplasia, actividad letal, actividad vasoconstrictora en el músculo liso, actividad para causar la interrupción de la circulación sanguínea local, actividad para causar atrofia esplénica, actividad para inhibir la producción de anticuerpos y otras, juega un papel importante en la Bordetelosis. Además, se descubrió que la TBb también juega un papel importante en la formación de un foco neumónico en lechones [Roop II, R. M. y col., Infect. Immun., 55, págs. 217-222 (1987)].

Por otra parte, una parte de la Pasteurella multocida o una parte de la Pasteurella atípica producen toxina dermonecrótica Pm (de ahora en adelante mencionada también como "TPm"). Se descubrió que la TPm, teniendo actividades biológicas tales como actividad necrótica hemorrágica, actividad para causar atrofia de concha, actividad para causar hipoplasia, actividad letal, actividad para causar la interrupción de la circulación sanguínea local, actividad para causar atrofia esplénica y otras, juega un papel importante en el comienzo de la enfermedad por la Pm toxigénica. Además, se descubrió que la TPm está estrechamente relacionada con la formación de un foco neumónico en cerdos mediante la Pm toxigénica [Iwatsu, S. y Sawada, T.; Jpn. J. Vet. Sci., 50, págs. 1.200-1.206 (1988)]. Aunque ambas TBb y TPm no son secretadas dentro de un medio de cultivo sino que se acumulan dentro de células bacterianas, son liberadas fuera de las células bacterianas, en un sobrenadante de cultivo, debido a la bacteriolisis después de un cultivo de larga duración. En el proceso in vivo, la toxina dermonecrótica se liberó fuera de las células bacterianas debido a la bacteriolisis, afectando al cuerpo viviente.

Bajo las circunstancias mencionadas anteriormente, todavía no queda claro el papel de la toxina dermonecrótica en la protección en el cuerpo viviente y, para aclarar el mecanismo de la protección, existe la necesidad de desarrollar un procedimiento para la preparación a gran escala de toxina dermonecrótica, y para desarrollar un toxoide de toxina dermonecrótica para su uso en la profilaxis de la enfermedad. Sin embargo, ha sido difícil purificar toxina dermonecrótica debido a sus propiedades, esto es, la inestabilidad al calor, la autoaglutinación fácilmente originada a medida que proceden los procesos de purificación, la formación de un complejo con substancias derivadas de células bacterianas tales como lípidos, proteínas ácidas, substancias hidrófobas, etc. Además, puesto que la TBb y la TPm no interreaccionan inmunológicamente entre sí a pesar de su semejanza en actividades biológicas, ha sido conveniente, con la mayor seriedad, desarrollar una mezcla de toxoides TBb-TPm que sea segura y eficaz desde el punto de vista de la industria veterinaria y de reproducción de cerdos.

Hasta ahora, un procedimiento conocido para purificar parcialmente toxina dermonecrótica, a partir de una solución conteniendo toxina dermonecrótica bacteriana, especialmente a partir de un extracto celular bacteriano de Bordetella, incluye un proceso que utiliza cromatografía de intercambio iónico [Kume, K. y col., Infect. Immun., 52 (4), págs. 370-377 (1986)]. Sin embargo, este proceso demuestra, desventajosamente, escasa reproducibilidad. También se conoce un proceso para purificar parcialmente toxina dermonecrótica, el cual utiliza diálisis, una ultracentrifugación por gradiente de sacarosa, y una cromatografía por filtración en gel [Endoh, M. y col., Microbiol. Immunol., 30, (7), págs. 659-673 (1986)]. Sin embargo, este proceso muestra también, desventajosamente, escasa reproducibilidad y, además, no proporciona un suficiente grado de purificación a pesar de las muchas etapas.

Otro ejemplo incluye un proceso que utiliza un tratamiento con un agente eliminador de ácidos nucleicos, cromatografía de intercambio aniónico, y cromatografía por adsorción sobre hidroxiapatito [Horiguchi, Y. y col., Microbiol. Pathogen., 6, págs. 361-368 (1989)]. Sin embargo, este procedimiento es también desventajoso porque requiere un reactivo caro, un agente eliminador de ácidos nucleicos, y supone muchas etapas. También hay un procedimiento que utiliza un agente eliminador de ácidos nucleicos, diálisis, y cromatografía de intercambio catiónico [Horiguchi, Y. y col., FEMS Microbiol. Letters, 66, págs. 39-44 (1990)]. Aunque este procedimiento muestra alta reproducibilidad y puede proporcionar toxina dermonecrótica con pureza relativamente alta, también requiere, desventajosamente, un reactivo caro como en el procedimiento anterior.

Todavía otro ejemplo es un proceso que utiliza precipitación de un electrolito y cromatografía de afinidad por ligando de colorante [Zhang Y. L. y Sekura R. D., Infect. Immun., 59, (10), págs. 3.754-3.759 (1991)]. Aunque este proceso muestra una alta reproducibilidad, proporciona, desventajosamente, un grado de purificación insuficiente.

Las vacunas para RA inactivadas reportadas hasta aquí incluyen tres tipos, esto es, una vacuna inactivada sencilla para Bb, una vacuna inactivada sencilla para Pm, y una vacuna inactivada combinada para Bb/Pm, cada una habiendo sido estudiada o puesta en uso práctico.

Una vacuna inactivada para Bb incluye una constando de bacterias muertas inactivada con formalina, glutaraldehído, etc., complementada con gel de aluminio o un adyuvante oleoso [Goodnow, R.A., Vet. Med. Small Anim. Clin., 72, págs. 1.210-1.212 (1977); Nakase, Y. y col., Proc. Int. Pig Vet. Soc. Congr., 8, (1976); Giles, C.J. y Smith, I.M., Vet. Bull. (Londres), 53, págs. 327-338 (1983)]. También se descubrió que una proteína de 68 kDa, que está presente en la membrana externa de la Bb y tiene actividad de adenilato ciclasa, exhibe actividad profiláctica contra la rinitis atrófica [Montaraz, J.A. y col., Infect. Immun., 47, págs. 744-755 (1985)]. También se conoce una vacuna de componentes constando de hemaglutinina fibrosa, producida por Bb, como componente principal [Hansen, G.R. y col.; In Atrophic rhinitis in pigs (Ed. Peterson, K.B. y Nielsen, N.C.), Communication of the European Communities, Luxemburgo, págs. 89-97 (1983), y Ohgitani, T. y col., Vaccine, 9, págs. 653-658 (1991)]. También se ha informado de que no es eficaz una vacuna complementada con toxina dermonecrótica para proporcionar una antitoxina [Soderlind, O. y Bergstrom, G., Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr., pág. 175 (1984); Marel, C.M. von der y col., Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr., pág. 170 (1984)].

Por otra parte, una vacuna inactivada simple para Pm incluye toxoide Pm [Pedersen, K.B. y Barfod, K., Nord. Vet. Med., 31, págs. 293-302 (1982), Foged, N.T. y col., Vet. Rec., 125, págs. 7-11 (1989)], la cual ha sido estudiada o puesta en uso práctico.

Una vacuna inactivada combinada para Bb/Pm incluye (1) una mezcla de Bb muertas con bacterias tipo PmD muertas productoras de TPm, la cual mezcla esta adicionalmente complementada con bacterias no productoras de PmT, o una mezcla de Bb y toxoide TPm [Barfod, K. y Pedersen, K.B., Nord. Vet. Med., 36, págs. 337- 345 (1984); Baalsrud, K.J., Acta Vet. Scand., 28, págs. 305-311 (1987); de Jong, M.F. y col., Vet. Quart., 9, págs. 49-59 (1987); Kobisch, M. y Pennings, A., Vet. Rec., 124, págs. 57-61 (1989)], con el fin de profilaxis de únicamente RA; (2) una mezcla de Bb muerta con bacterias tipo PmD muertas productoras de TPm y bacterias tipo PmA muertas [Ostle, A.G. y col., Vet. Med., págs. 772-775 (1986)], con el fin de profilaxis de RA y neumonía; y (3) una mezcla de Bb muerta con bacterias tipo PmA muertas, Erysipelothrix insidiosa muertas y toxoide TPm [Jayappa, H. y col., Int. Pig Vet. Soc. Congr., pág. 44 (1988)], con el fin de profilaxis de otras enfermedades así como RA y neumonía, habiendo sido puesta en uso práctico cualquiera de (1) a (3).

Puesto que la TBb juega un importante papel en la atrofia de concha y la formación de focos neumónicos por infección con Bb, Zoop II, R.M. y col. han indicado la necesidad de toxoide TBb [Infect. Immun., 55, págs. 217-222 (1987)]. Sin embargo, nunca se refieren a una combinación de toxoides TBb y TPm. Chanter, N. y col., han propuesto que es más eficaz una combinación de toxoide TPm con la importante toxina de Bb puesto que la lesión en la mucosa nasal porcina, inducida por la actividad cooperativa de TBb y TPm, proporciona entornos favorables a la propagación de Bb y Pm [Res. Vet. Sci., 47, págs. 48-53 (1989)].

Sin embargo, todavía no ha sido perfeccionada con éxito la producción de un anticuerpo neutralizador de TBb con una vacuna que conste de una fracción teniendo actividad TBb [Soderlind, O. y Bergstrom, G. von der y col., Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr., pág. 175 (1984); Marel, C.M. von der y col., Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr., pág. 170 (1984)]. Por otra parte, Nakai y col. revelaron que la producción de un anticuerpo neutralizador se intensifica en cerdos y ratones con un toxoide TBb sumamente purificado [The 111th Japan Veterinary Society, resumen de la conferencia, pág. 183 (1991)]. Sin embargo, tampoco se refieren a una combinación de dicho toxoide TBb y toxoide TPm.

Revelación de la invención

Los presentes inventores han estudiado, con la mayor seriedad, para averiguar un método para purificar eficazmente toxina dermonecrótica producida por bacterias de la especie Bordetella bronchiseptica y, por consiguiente, han encontrado (1) que se puede obtener fácilmente una toxina dermonecrótica parcialmente purificada, con un contenido reducido de endotoxina, con un relativamente alto índice de recuperación, conduciendo una cromatografía en una solución conteniendo toxina dermonecrótica, que consta de las etapas:

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(1) equilibrar el gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa, o el gel cromatográfico al que está unida covalentemente un molécula sulfatada, o un gel cromatográfico compuesto de un polímero natural o sintético de alto peso molecular al que está unido un grupo sulfopropilo, tratando previamente el gel con un tampón teniendo un pH 7 a 9 y una conductividad eléctrica específica fija oscilando entre 3 y 20 mS/cm,

(2) poner en contacto la solución que contiene toxina dermonecrótica de Bordetella bronchiseptica con el gel de adsorción que tiene un grupo sulfato como ligando, o el gel de adsorción sulfatado mediante sulfatación directa, bajo condiciones de pH 7 a 9, una temperatura de 0 a 30ºC, y una conductividad eléctrica específica fija oscilando entre 3 y 20 mS/cm,

(3) lavar el gel de adsorción con un tampón, que tiene pH 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica fija oscilando entre 3 y 20 mS/cm, antes de la elución de la toxina dermonecrótica del gel, y

(4) elucionar la toxina dermonecrótica del gel utilizando un tampón teniendo pH 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica de más que un intervalo fijo de 3 a 20 mS/cm hasta 130 mS/cm.

Aquí se describe también un toxoide, el cual no es parte de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra un cromatograma en una etapa de un método para purificar toxina dermonecrótica según la presente invención.

La Fig. 2 muestra un cromatograma en una etapa de un método para purificar toxina dermonecrótica según la presente invención.

La Fig. 3 muestra un cromatograma en una etapa de un método para purificar toxina dermonecrótica según la presente invención.

La Fig. 4 muestra los resultados del análisis de una fracción de toxina dermonecrótica obtenida mediante un método para purificar toxina dermonecrótica según la presente invención.

La Fig. 5 muestra los resultados de un ensayo de potencia, en ratones, de un toxoide obtenido según la presente invención.

La Fig. 6 muestra los resultados de un ensayo de eficacia, en una cerda embarazada, de un toxoide obtenido según la presente invención.

La Fig. 7 muestra los resultados del estudio en la línea de protección de un anticuerpo neutralizador de TBb.

Mejor forma de llevar a cabo la invención

La presente invención proporciona un método para purificar parcialmente toxina dermonecrótica, el cual comprende el poner en contacto una solución conteniendo toxina dermonecrótica con un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa, o con un gel cromatográfico al que está unido covalentemente una molécula sulfatada, o con un gel cromatográfico compuesto de un polímero natural o sintético de alto peso molecular al que está unido un grupo sulfopropilo, para, de ese modo, fabricar la toxina dermonecrótica adsorbida sobre el gel, seguido por la elución de la misma a partir del gel, bajo las condiciones elaboradas en las reivindicaciones adjuntadas. El toxoide TBb derivado de TBb obtenido mediante dicho método, y una mezcla de toxoides que se prepara mezclando dicho toxoide TBb con un toxoide derivado de TPm, producido por Pm toxigénica, pueden ser utilizados para profilaxis de la rinitis atrófica en cerdos.

Una solución conteniendo toxina dermonecrótica, como la utilizada aquí como materia de partida, incluye un extracto celular bacteriano de Bordetella bronchiseptica. La materia de partida de la presente invención también incluye un extracto de células en donde el TBb se expresa mediante una técnica de ingeniería genética. Un extracto preferido utilizado aquí es un extracto celular bacteriano de Bb. La Bb se cultiva de una manera habitual mediante un cultivo en agar en medio Bordet-Gengou, medio Macconkey, y otros, o mediante un cultivo fijo, un cultivo en agitación, o un cultivo rotatorio de aireación en un medio líquido tal como un medio de peptona [Horiguchi, Y. y col., Microb. Pathogen., 6, págs. 361-368 (1989)], medio Cohen-Willer, medio Stenner-Scholte, y otros. El cultivo bacteriano en medio agar es suspendido en un tampón de inicio de un gel de éster de sulfato de celulosa, utilizando una varilla Conradi, etc. El cultivo bacteriano en medio líquido, después de recuperar células bacterianas mediante centrifugación, es suspendido en un tampón de inicio de un gel de éster de sulfato de celulosa.

La suspensión obtenida de células bacterianas puede ser purificada mediante el método de Kume, K. y col. [Infect. Immun. 52 (4), págs. 370-377 (1986)], mediante el método de Endoh, M. y col. [Microbial. Immunol., 30 (7), págs. 659-673 (1986)], mediante el método de Horiguchi, Y. y col. [Microbial. Pathogen., 6, págs. 361-368 (1988) o FEMS Microbiol. Letters, 66, págs. 39-44 (1990)], mediante el método de Zhang Y.L. y Sekura R.D. [Infect. Immun., 59 (10), págs. 3.754-3.759 (1991)], o mediante una cromatografía de adsorción utilizando un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa, tal como un gel de éster de sulfato de celulosa, o un gel cromatográfico al cual está unida covalentemente una molécula sulfatada. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención, la suspensión es purificada mediante cromatografía de adsorción utilizando un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa, o un gel cromatográfico al cual está unida covalentemente una molécula sulfatada bajo condiciones seleccionadas.

La suspensión de células bacterianas se somete a una sonicación, un tratamiento enzimático, un prensado, una repetición de congelación-descongelación, etc., para homogeneizar las células, y se eliminan los detritus celular por centrifugación o filtración por membrana. De este modo, el extracto bacteriano obtenido es sometido directamente, o después de un pretratamiento adicional para purificación vía el empleo de un agente eliminador de ácidos nucleicos, una precipitación del electrolito, ultracentrifugación, etc., a un método de la presente invención. De acuerdo con el método de la presente invención, no es siempre necesario el pretratamiento pero, en su lugar, el extracto celular bacteriano puede ser sometido directamente a cromatografía de adsorción utilizando un gel de adsorción que tenga una molécula sulfatada como ligando, o un gel de adsorción sulfatado mediante sulfatación directa para, de ese modo, hacer el procedimiento bastante sencillo y adecuado.

Como se utiliza aquí, un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa, o un gel cromatográfico al cual está unida covalentemente una molécula sulfatada, son ejemplificados como sigue:

"Un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa", como se utiliza aquí, significa un gel cromatográfico (por ejemplo, celulosa) en donde el gel mismo es sulfatado directamente por reacción con un agente sulfatante tal como ácido clorosulfónico, anhídrido sulfúrico en presencia de un disolvente orgánico tal como piridina, vía, por ejemplo, un enlace éster, incluyendo típicamente un gel de éster de sulfato de celulosa en donde el éster de sulfato es introducido dentro de una celulosa globular compuesta de una celulosa cristalina o una celulosa con parte cristalina y con parte no cristalina. El éster de sulfato de celulosa obtenido conserva la configuración de la materia de partida, es insoluble en un disolvente acuoso, es excelente en estabilidad física y, por eso, es adecuado para su uso como gel cromatográfico. Estas celulosas de partida están ya disponibles comercialmente, por ejemplo, como Avicel (fabricada por Asahi Kasei Kogyo K.K.), Cellulofine GC-15, GH-25, GC-100, GC-200 (fabricada por Chisso Corporation), y otras. La celulosa de partida puede ser sulfatada mediante los métodos mencionados anteriormente, o está disponible comercialmente alguna celulosa sulfatada como, por ejemplo, "Sulfated Cellulofine" (fabricada por Chisso Corporation).

"Un gel cromatográfico al cual está unida covalentemente una molécula sulfatada", como se utiliza aquí, significa un gel cromatográfico compuesto de un polímero natural de alto peso molecular tal como una celulosa reticulada, un dextrano reticulado o un gel de agarosa reticulado, o un polímero sintético de alto peso molecular tal como un polímero de vinilo hidrófilo, o copolímero de estireno-divinilbenceno, al que está unido covalentemente heparina, un glucosaminoglicano altamente sulfatado, o grupo sulfopropilo, una clase de alquilo sulfatado, mediante un procedimiento con CNBr, etc., incluyendo muchos productos disponibles comercialmente. Un gel cromatográfico al cual está unida covalentemente heparina incluye "Heparin Sepharose CL-6B" (Pharmacia), "Affigel Heparin Gel" (Bio-Rad), "Heparin Cellulofine" (Seikagaku Kogyo K.K.), y otros. Un gel cromatográfico al cual está unido covalentemente un colorante azul incluye "Affigel Blue Gel" (Bio-Rad), "AF-blue Toyopearl" (Toso K.K.), "Blue Cellulofine" (Seikagaku Kogyo K.K.), y otros. Un gel cromatográfico al cual está unido covalentemente un grupo sulfopropilo incluye "SP-Sephadex" (Pharmacia), "SP-Toyopearl 650M" (Toso K.K.), y otros.

La purificación y recolección de toxina dermonecrótica a partir de una solución conteniendo toxina dermonecrótica, especialmente un extracto celular bacteriano de Bordetella, utilizando un gel de adsorción que tiene un grupo sulfato como ligando, o un gel de adsorción sulfatado mediante sulfatación directa, se lleva a cabo de la manera siguiente. Aunque la presente invención se ilustra mediante el empleo de un gel de éster de sulfato de celulosa como forma de realización preferible, también se puede utilizar cualquier otro gel bajo condicione similares.

Previamente se equilibra un gel de éster de sulfato de celulosa con un tampón que tenga en torno a pH neutro (pH 7 a 9) y una conductividad eléctrica específica apropiada, esto es, estando estandarizado para lavado y elución en una cromatografía en gel (generalmente 3 a 20 mS/cm, más generalmente 5 a 20 mS/cm, aunque puede variar hasta cierto punto dependiendo de la clase de gel), por ejemplo, tampón de fosfato 0'02M complementado con cloruro sódico 0 a 0'2M, y se somete luego a un procedimiento de adsorción de la toxina dermonecrótica. Se puede conducir una serie de procedimientos de purificación, tal como la adsorción de la toxina dermonecrótica en un gel de éster de sulfato de celulosa, lavado del gel, elución de la toxina dermonecrótica, etc., de una manera industrialmente habitual tal como un proceso por lotes o un proceso en columna. Cuando se emplee un proceso por lotes, se pone un éster de sulfato de celulosa en un extracto celular bacteriano de Bordetella y se agita lentamente la mezcla a una temperatura de 0 a 30ºC, a un intervalo de pH de 7'0 a 9'0, durante unos 10 a 60 minutos, para, de ese modo, hacer que se adsorba la toxina dermonecrótica sobre el éster de sulfato de celulosa. En este caso, el éster de sulfato de celulosa es convenientemente concentrado o diluido antes del procedimiento de adsorción, para que la conductividad eléctrica específica del extracto celular bacteriano de Bordetella caiga dentro del intervalo mencionado anteriormente, generalmente 3 a 20 mS/cm, o menos.

Después de que se complete la adsorción, se carga la mezcla del extracto y el gel en un filtro, y se conduce la filtración con succión para separar el gel del filtrado. Al gel separado se vierte un tampón apropiado que tenga el intervalo fijado anteriormente de conductividad eléctrica específica (generalmente alrededor de 3 a 20 mS/cm) y un pH de 5 a 10, por ejemplo tampón de fosfato 0'02M complementado con cloruro sódico 0'1M, para lavar el gel con succión. Después, al gel se vierte un tampón apropiado que tenga un pH de 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica mayor del anterior intervalo fijado y, generalmente, menor de 130 mS/cm (un intervalo preferible es, por ejemplo, alrededor de 22 a 46 mS/cm), por ejemplo un tampón de fosfato complementado con cloruro sódico 0'2M a 0'5M, para elucionar la toxina dermonecrótica adsorbida.

Cuando se emplee un proceso en columna, las condiciones de la materia de partida, el tampón para lavado y el tampón de elución pueden ser similares a las del proceso por lotes. Se recomienda que se ajuste la velocidad de paso de los tampones en torno a 10 ml/cm^{2}/hr hasta 500 ml/cm^{2}/hr.

El método para purificación según la presente invención permite la adsorción específica de la toxina dermonecrótica en una solución conteniendo toxina dermonecrótica, proporciona un grado de purificación de la toxina dermonecrótica tan alto como varias decenas hasta 110 veces, y muestra una buena recuperación de toxina dermonecrótica, el 40% al 100%. La endotoxina, la cual es responsable de efectos secundarios tales como fiebre o choque y está contenida en gran cantidad en un extracto de homogenado celular bacteriano junto con toxina dermonecrótica, no es adsorbida sobre el gel de éster de sulfato de celulosa y, de ese modo, reducida a 1/30 hasta 1/800. La toxina dermonecrótica purificada obtenida muestra tanto como 4 x 10^{5} hasta 3 x 10^{6} MND/mg de proteína de actividad específica, y forma una banda principal en una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

Como se mencionó antes, según el método de la presente invención se puede obtener una toxina dermonecrótica deseada, a partir de una solución de partida conteniendo toxina dermonecrótica, con buen rendimiento y pureza, los procedimientos son bastante sencillos, y el adsorbente cromatográfico utilizado para la purificación puede ser preparado o está disponible a bajo coste, siendo dicho adsorbente sumamente excelente desde el punto de vista económico, sin deterioro después de ser utilizado reiteradamente. Por consiguiente, el método de la presente invención es un método totalmente excelente para la producción industrial de toxina dermonecrótica. Además, el método de la presente invención puede ser también utilizado en combinación con la cromatografía de intercambio catiónico convencional, la cromatografía por filtración en gel, etc., para aumentar adicionalmente la pureza para, de ese modo, proporcionar resultados más excelentes que los obtenidos mediante métodos convencionales.

La toxina dermonecrótica purificada mediante el método de la presente invención es transformada en un toxoide que está privado de la actividad de la toxina, aunque conservando la inmunogenicidad por tratamiento con un reactivo químico. La transformación de la toxina dermonecrótica en un toxoide puede ser conducida de una manera habitual, por ejemplo, utilizando formalina [Nakai, T. y col., Infec. Immun., 46, págs. 429-434 (1984)] o utilizando glutaraldehído [Endoh, M. y col., Microbiol. Immunol., 30, págs. 659-673 (1986)], etc. Para inducir inmunidad humoral administrando dicho toxoide en el cuerpo viviente, se administra conjuntamente un adyuvante. Un adyuvante ejemplar a utilizar incluye gel de aluminio, adyuvante oleoso, saponina, etc. Dicho toxoide muestra una inmunogenicidad superior que la de una fracción de toxina dermonecrótica no purificada, y es también bastante segura, las cuales son confirmadas por los datos en los Ejemplos como se describe abajo.

La toxina dermonecrótica parcialmente purificada, obtenida mediante el método de la presente invención, tiene una alta pureza y está privada de la mayor parte de la endotoxina y, por eso, es útil para preparar una vacuna para animales. Además, cuando la pureza de la toxina dermonecrótica parcialmente purificada sea aumentada adicionalmente empleando el método de la presente invención en combinación con los procedimientos de purificación convencionales, puede ser utilizada también para preparar diversos reactivos o medicamentos, o incluso para preparar vacuna de Bordetella bronchiseptica para humanos.

En la mayoría de los casos de infección natural con Bb, no aparece un anticuerpo neutralizador de TBb pero aumenta, en gran proporción, un anticuerpo aglutinador de bacterias, el cual ha sido utilizado para diagnosis serológica de esta enfermedad. Según la medición del presente inventor, únicamente dos cerdos (0'6%) en una granja (2'1%) fueron detectados positivos para anticuerpo neutralizador de TBb, entre 327 cerdos en 48 granjas en 15 prefecturas donde sucedió RA. Las vacunas muertas de TBb convencionales aumentan el anticuerpo aglutinador de bacterias, para interferir la diagnosis. Sin embargo, cuando adicionalmente se aumenta la pureza del TBb combinando el método de purificación de la presente invención con los procedimientos de purificación convencionales, se puede preparar un toxoide que proporcione un anticuerpo neutralizador pero que no aumente el anticuerpo aglutinador de bacterias. Una vacuna o toxoide que permita la distinción serológica entre un anticuerpo inducido por la vacuna y un anticuerpo inducido por la infección se llama "vacuna marcadora". Por ejemplo, en granjas libres de patógenos específicos (LPE), si por alguna casualidad ocurriera una infección por Bb mientras se utiliza el toxoide de la presente invención para la prevención de RA, se pueden detectar los cerdos infectados midiendo el anticuerpo aglutinador de bacterias.

Otro aspecto de la presente especificación describe una mezcla de toxoides constando de toxoide TBb, preparado según el método de purificación de la presente invención, y un toxoide de toxina dermonecrótica producido por Pasteurella.

Para TPm, como se utiliza aquí, un extracto celular bacteriano Pm de partida incluye un extracto celular bacteriano de Pm toxigénica o de Pasteurella atípica [Kamp, E.M.I.E. y col., Vet. Rec., 126, págs. 434-437 (1990)]. Alternativamente, una materia de partida de la presente invención también incluye un extracto de células donde el TPm está expresado mediante una técnica de ingeniería genética. Un extracto preferido utilizado aquí es un extracto celular bacteriano de Pm toxigénica el cual se cultiva, de una manera habitual, mediante un cultivo fijo, un cultivo en agitación, o un cultivo rotatorio de aireación en un medio líquido tal como medio de infusión Corazón, caldo de tripticasa-soja, medio Luria-Betani, medio de infusión Carne [de Jong, M.F. y Akkermans, J.P.W.M., Vet. Quart.., 8, págs. 294-214 (1986)] o mediante un cultivo en agar tal como medio dextrosa almidón, medio agar sangre, medio YPC [Namioka, S. y Murata, M., Cornell Vet., 51, págs. 498-507 (1961)], y otros. El cultivo bacteriano en un medio agar es suspendido en un tampón Tris, etc., utilizando una varilla Conradi, etc. Después de recuperar células bacterianas por centrifugación, el cultivo bacteriano en un medio líquido es suspendido en un tampón adecuado para la siguiente etapa de purificación. La suspensión de células bacterianas es sometida a sonicación, un tratamiento enzimático, un prensado, una repetición de congelación-descongelación, etc., para homogeneizar las células, y se eliminan los detritus celulares por centrifugación o filtración por membrana.

Se purifica el extracto celular mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad preparada con un anticuerpo que identifica TPm, y otras. Alternativamente, se puede utilizar el sobrenadante obtenido después del cultivo de Pm toxigénica, en un medio líquido durante 24 a 65 horas, como materia de partida para purificación o sometido directamente a un proceso para reducir toxicidad.

La fracción de toxina así preparada es sometida a un proceso de destoxicación por tratamiento con formalina, glutaraldehído, etc. Después de la terminación de la destoxicación, el tampón es reemplazado con un salino tamponado con fosfato mediante diálisis, etc., y a eso se añade un adyuvante. Un ejemplo de adyuvante que se pueda utilizar incluye gel de aluminio, adyuvante oleoso, saponina, y otros, Se puede preparar una mezcla de toxoides mezclando una solución de un antígeno, a una concentración de dos veces la de la vacuna sencilla complementada con un adyuvante, con una cantidad equivalente de solución de otro antígeno a una concentración dos veces la de la vacuna sencilla complementada con un adyuvante.

La mezcla de toxoides obtenida según la presente invención no es únicamente bastante segura sino que también logra que ambos anticuerpos neutralizadores de TBb y TPm permitan, de ese modo, la protección de cerdos de la atrofia de concha o hipoplasia debidas a ambas toxinas.

El toxoide TBb y la mezcla de toxoides obtenida según la presente invención, cuando son inyectados intramuscularmente a una cerda embarazada, dos veces en un intervalo de 2 a 6 semanas, al menos una semana antes del parto, protegen a su progenie de infección vía un anticuerpo materno proporcionado por el calostro. Para la administración posterior, es suficiente una única inoculación de toxoide de la presente invención, antes del parto, para el establecimiento de la inmunidad. Para el caso de granjas con infección grave de RA, el toxoide puede ser también eficazmente inyectado intramuscularmente en lechones de no menos de 7 días de edad, dos veces en un intervalo de 2 a 6 semanas, para permitir, de ese modo, la protección directa.

La presente invención está ilustrada más detalladamente mediante las Preparaciones y Ejemplos siguientes.

Ejemplos Preparación 1

Se añade gota a gota ácido clorosulfónico (117 g) a piridina (600 ml), a una temperatura de no más de 0ºC, y se agita la mezcla. Después de la adición gota a gota, se calienta la mezcla hasta 65 a 70ºC. A eso se añade Cellulofine GC-15 (80 g; fabricada por Chisso Corporation) y se agita la mezcla para reacción a 65 a 70ºC durante 3 horas. Después de la terminación de la reacción, se enfría la mezcla y se añade una solución acuosa al 10% de hidróxido sódico para neutralizar gradualmente la mezcla. Se separa el gel por filtración y se lava suficientemente con salino tamponado con fosfato 0'01M, para producir un gel de éster de sulfato de celulosa.

Preparación 2

Se añade gota a gota ácido clorosulfónico (117 g) a piridina (600 ml), a una temperatura de no más de 0ºC, y se agita la mezcla. Después de la adición gota a gota, se calienta la mezcla hasta 65 a 70ºC. A eso se añade Avicel para cromatografía (80 g; celulosa microcristalina, fabricada por Asahi Kasei Kogyo K.K.) y se mantiene la mezcla a 65-70ºC durante 4 horas mientras se agita. Después de la terminación de la reacción, se enfría la mezcla y se añade una solución acuosa al 10% de hidróxido sódico para neutralizar la mezcla. Se separa el gel por filtración y se lava suficientemente con salino tamponado con fosfato 0'01M, para producir un gel de éster de sulfato de celulosa cristalina.

Preparación 3

Se añade gota a gota ácido clorosulfónico (82 g) a piridina (500 ml), a una temperatura de 0 a 5ºC, y se agita la mezcla. Después de la adición gota a gota, se calienta la mezcla hasta 65 a 70ºC. A eso se añade Cellulofine GC-25 (80 g; fabricada por Chisso Corporation) y se agita la mezcla para reacción a 65 a 70ºC durante 4 horas. Después de la terminación de la reacción, se enfría la mezcla y se añade gradualmente una solución acuosa al 10% de hidróxido sódico para neutralizar la mezcla. Se separa el gel por filtración y se lava suficientemente con salino tamponado con fosfato 0'01M (pH 7'2), para producir un gel de éster de sulfato de celulosa.

Ejemplo 1 Elución por gradiente en columna

Se rellenó una columna (50 mm de d.i. x 200 mm) con un éster de sulfato de Cellulofine GC-15 preparado como en la Preparación 1 y equilibrado con tampón de fosfato 0'02M (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor de 3 mS/cm). A la columna se aplicó un extracto celular (200 ml) de cepa S611 de Bb. Y después, la columna fue lavada con el tampón anterior para separar mediante lavado los detritus. Luego, se llevó a cabo una elución por gradiente con tampón de fosfato (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor de 3 a 46 mS/cm) complementado con cloruro sódico 0 a 0'5M, para dar una fracción conteniendo toxina dermonecrótica con 9'1 mg de proteína total. El índice de recuperación de toxina dermonecrótica fue del 39'6%, y el grado de purificación (actividad específica de la fracción de toxina dermonecrótica purificada/actividad específica del extracto de homogenado celular bacteriano) fue tan alto como 32'1.

Ejemplo 2 Elución por etapas en columna

Se rellenó una columna (252 mm de d.i. x 210 mm) con un éster de sulfato de Cellulofine GC-15 preparado como en la Preparación 1 y equilibrado con tampón de fosfato 0'02M (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor de 3 mS/cm). A la columna se aplicó un extracto celular de cepa S611 de Bb (29 a 35 g de proteína total). Y después, la columna fue lavada con tampón de fosfato 0'02M (pH 7'8 a 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor de 3 a 17 mS/cm) complementado con cloruro sódico 0 a 0'15M, para separar mediante lavado los detritus. Luego, la toxina dermonecrótica fue elucionada con un tampón de fosfato (pH 7'5 a 7'7; conductividad eléctrica específica alrededor de 30 a 46 mS/cm) complementado con cloruro sódico 0'3 a 0'5M, para dar una fracción conteniendo toxina dermonecrótica con 0'2 a 1'1 g de proteína total. Como se muestra en la Tabla 1, el índice de recuperación de toxina dermonecrótica fue del 76 al 100%, y el grado de purificación (actividad específica de la fracción de toxina dermonecrótica purificada/actividad específica del extracto de homogenado celular bacteriano) fue tan alto como 22 a 114, con la endotoxina siendo reducida al 0'1 a 3%.

(Tabla pasa a página siguiente)

1

Ejemplo 3 Elución por gradiente en columna de Heparina-Sefarosa

Se rellenó una columna (25 mm de d.i. x 140 mm) con Heparin Sepharose CL-6B (Pharmacia) y se equilibró con tampón de fosfato 0'02M (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor de 3 mS/cm). A la columna se aplicó un extracto celular de cepa S611 de Bb (420 mg de proteína total). Y después, la columna fue lavada con el anterior tampón para separar mediante lavado los detritus. Luego, se llevó a cabo una elución por gradiente con un tampón de fosfato (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor de 3 a 46 mS/cm) complementado con cloruro sódico 0 a 0'5M, para dar una fracción conteniendo toxina dermonecrótica con 24 mg de proteína total. El índice de recuperación de toxina dermonecrótica fue del 40'8%, y el grado de purificación (actividad específica de la fracción de toxina dermonecrótica purificada/actividad específica del extracto de homogenado celular bacteriano) fue tan alto como 7'0. En la Tabla 2 se muestran los resultados analíticos.

Ejemplo 4 Elución por gradiente en columna de SP-Toyopearl 650M

Se rellenó una columna (50 mm de d.i. x 140 mm) con SP-Toyopearl (fabricado por Toso K.K.) y se equilibró con tampón de fosfato 0'02M (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor de 3 mS/cm). A la columna se aplicó un extracto celular de cepa S611 de Bb (631 mg de proteína total). Y después, la columna fue lavada con el anterior tampón para separar mediante lavado los detritus. Luego, se llevó a cabo una elución por gradiente con un tampón de fosfato (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor de 3 a 46 mS/cm) complementado con cloruro sódico 0 a 0'5M, para dar una fracción conteniendo toxina dermonecrótica con 2 mg de proteína total. El índice de recuperación de toxina dermonecrótica fue del 11'5%, y el grado de purificación (actividad específica de la fracción de toxina dermonecrótica purificada/actividad específica del extracto de homogenado celular bacteriano) fue tan alto como 35'5. En la Tabla 2 se muestran los resultados analíticos.

(Tabla pasa a página siguiente)

2

Ejemplo 5 Purificación con alta pureza

Una fracción de gel de éster de sulfato de celulosa para purificación, preparado como en el Ejemplo 1, fue dializada frente a citrato 33 mM/hidrogenofosfato disódico 66 mM/urea 1M (pH 5'0). El dializado (9'1 mg de proteína total) se aplicó a SP- Toyopearl 650M (fabricado por Toso K.K.; 10 mm de d.i. x 80 mm) equilibrado con el mismo tampón, seguido por lavado con el mismo tampón para separar mediante lavado los detritus. Después, se llevó a cabo una elución por gradiente con el anterior tampón, complementado con cloruro sódico 0 a 0'5M, para dar una fracción (fracción SP) conteniendo toxina dermonecrótica (3'1 mg de proteína total). La fracción SP fue purificada adicionalmente mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en una columna G3000 SW (21 mm de d.i. x 600 mm) con gel TSK, equilibrada con tampón de fosfato 50 mM (pH 7'1)/sulfato sódico 0'3M/urea 1M, para dar una fracción (fracción HPLC) conteniendo toxina dermonecrótica (1'3 mg de proteína total). Estos cromatogramas fueron mostrados en las Figs. 1 a 3, respectivamente. En la Tabla 3 y Fig. 4 se muestran los resultados analíticos del extracto de homogenado celular bacteriano y fracciones de toxina dermonecrótica, y en la Tabla 4 se listaron las propiedades de la toxina purificada.

(Tabla pasa a página siguiente)

3

Ejemplo 6 Reducción de toxicidad

Se añadió formalina a cada fracción de toxina dermonecrótica, preparada como en los Ejemplos 1 a 5, y se llevó a cabo la reacción a 37 hasta 40ºC, durante 3 a 14 días, para la reducción de toxicidad. A la fracción de toxina dermonecrótica se añadió 3/100 de equivalente de formalina al 10%, seguido por la misma cantidad al día siguiente, y 2/100 de equivalente en el día después del siguiente día. Después de completar la reducción de toxicidad, la fracción fue dializada frente a un salino tamponado con fosfato.

Ejemplo 7 Adición de adyuvante

A la toxina dermonecrótica destoxificada, preparada como en el Ejemplo 6, se añadió gel de hidróxido de aluminio y un conservante (timerosal o formalina).

Ejemplo 8 Ensayo de potencia en ratones

Cada 0'5 ml del toxoide obtenido en el Ejemplo 7 fue inyectado intraperitonealmente a ratones ddY de 5 semanas de edad, dos veces en un intervalo de 2 semanas. Dos semanas después de la inmunidad final, los ratones fueron desafiados intraperitonealmente con aproximadamente 50 (25 a 100) LD_{50} de toxina dermonecrótica, y se observó la supervivencia durante 7 días. En la Fig. 5 se mostraron los resultados. Hubo una correlación positiva entre la dosis de toxoide y el índice de supervivencia en los ratones.

Ejemplo 9 Ensayo de seguridad en cerdos de cría

La fracción obtenida como en el Ejemplo 2 fue sometida a destoxicación como en el Ejemplo 6. Se preparó el toxoide (2 a 50 \mug/2 ml de dosis), complementado con gel de hidróxido de aluminio, como en el Ejemplo 7, y se inyectó intramuscularmente a cerdos LPE de 10 semanas de edad, dos veces en un intervalo de 3 semanas. No se observó síntomas clínicos o anormalidad en la temperatura corporal, debidos a la inyección, en ninguno de los cerdos puestos a prueba.

Ejemplo 10 Ensayo de eficacia en cerda embarazada

La fracción HPLC obtenida como en el Ejemplo 5 fue sometida a reducción de toxicidad como en el Ejemplo 6. Se preparó el toxoide (25 \mug/2 ml de dosis) complementado con gel de hidróxido de aluminio, como en el Ejemplo 7, y se inyectó intramuscularmente cada 2 ml a una cerda embarazada, dos veces 6 semanas y 3 semanas antes del parto. Las cerdas de control fueron inyectadas con una vacuna placebo. Todas las progenies alimentadas con suficiente calostro fueron desafiadas intranasalmente con 2 x 10^{8} células viables de la cepa S6111 de Bb, a los 3 días de edad, y la mitad de las progenies fueron dos veces desafiadas además, intramuscularmente, con 2.600 MND de toxina dermonecrótica, a las 2 y 3 semanas de edad. En la Tabla 5 se mostró el título obtenido del anticuerpo neutralizador de la toxina dermonecrótica. El título del anticuerpo neutralizador de TBb fue 32 en sangre y 256 en el calostro de la cerda al parir, y el título del anticuerpo materno en la progenie fue 128. El anticuerpo materno continuó siendo positivo durante más de 6 semanas. Una cerda con inyección placebo, y la progenie de la misma, fueron seronegativas. En la Tabla 6 se muestran los resultados de la prueba de desafío. Se detectó atrofia de concha en nueve de los 12 cerdos de control, con una puntuación de + a +++, pero no en el grupo inmunizado. No hubo distinción de la recuperación bacteriana intranasal entre ambos grupos. En cuanto al peso ganado, hubo diferencia entre ambos grupos cuando se desafiaron con toxina dermonecrótica además de bacterias Bb vivas, como se muestra en la Fig. 6. En el primer desafío con toxina dermonecrótica, a las dos semanas de edad, la proporción de peso ganado del grupo de control se redujo a aproximadamente 1/3 de la del grupo inmunizado y, como consecuencia del segundo desafío (a las 3 semanas de edad), murieron todos los cerdos del grupo de control.

TABLA 5

4

TABLA 6

5

a) Número de colonias aparecidas en cultivo de placas untadas con torunda intranasal; -:0,+:\sim 50,++:\sim 100,+++:\sim 200,++++:\sim 200

b) Ensayadas mediante cinco grados (- a ++++); puntuación del hueso turbinazo izquierdo/hueso turbinado derecho.

c) No ensayado

d) Número de días contados desde el segundo desafío con TBb

Ejemplo 11 Ensayo de eficacia en cerdos de cría

La fracción obtenida como en el Ejemplo 2 fue sometida a reducción de toxicidad como en el Ejemplo 6. Se preparó el toxoide (2 a 50 \mug/2 ml de dosis) complementado con gel de hidróxido de aluminio, como en el Ejemplo 7, y se inyectó dos veces intramuscularmente a cerdos LPE de 10 semanas de edad, en un intervalo de 3 semanas. Cuatro semanas después de la inmunidad total, los cerdos fueron desafiados intranasalmente con 2 x 10^{8} bacterias vivas de Bb, y se comprobó el título del anticuerpo neutralizador de toxina dermonecrótica hasta 3 semanas después del desafío. Como se muestra en la Tabla 7, los cerdos de control permanecieron seronegativos para anticuerpo neutralizador de toxina dermonecrótica TBb, incluso después del desafío. Por otra parte, todos los cerdos del grupo inmunizado se transformaron en seropositivos para anticuerpo neutralizador de TBb. Los cerdos inmunizados, inyectados con 2 a 6 \mug/2 ml/dosis de toxoide, mostraron un aumento radical en anticuerpo neutralizador después del desafío, mientras que aquellos inyectados con 20 a 50 \mug/2 ml/dosis no.

Se ha reportado que la toxina dermonecrótica tiene actividad inhibidora de la producción de anticuerpos [Sekiya, K., Microbiol. Immunol., 27, págs. 905- 915 (1983)]. La razón por la que los cerdos de control no muestren aumento en anticuerpo neutralizador después del desafío parece ser debida a la actividad inmunosupresora del TBb producido por las bacterias desafiadoras. Por consiguiente, puesto que el aumento radical en anticuerpo neutralizador en el grupo inmunizado es debido a la protección de la actividad inhibidora de la producción de anticuerpos de TBb, se sugirió que 2 \mug de toxoide TBb es eficaz en cerdos de cría.

TABLA 7

6

a) \mug/2 ml/dosis

b) Cerdos LPE de 10 semanas de edad fueron inyectados intramuscularmente con toxoide TBb, dos veces en las semanas 0 y 3, y desafiados intranasalmente con Bb viva a la semana 7

Preparación 4 Extracto de células bacterianas rotas: toxoide TBb 1

Se cultivó cepa S611 de Bb en medio peptona, en un fermentador con aireación a 37ºC durante 24 horas. Las células bacterianas fueron concentradas por centrifugación y luego rotas mecánicamente. A una solución (fracción de TBb bruta) obtenida después de eliminar los detritus mediante centrifugación o filtración por membrana (tamaño de poro: 0'45 \mum) se añadió formalina, a una concentración final de 0'8%, y se redujo la toxicidad entre 37 y 40ºC durante 7 días. El toxoide obtenido fue dializado frente a un salino tamponado con fosfato. Al producto dializado se añadió gel de hidróxido de aluminio, a 1 mg (como cantidad de aluminio)/ml, para dar toxoide TBb 1.

Preparación 5 Toxoide TBb 2

La fracción de TBb bruta obtenida como en la Preparación 4 fue purificada mediante cromatografía en una columna de gel de éster de sulfato de celulosa. El TBb bruto fue aplicado a un gel de éster de sulfato de celulosa equilibrado con tampón de fosfato 20mM (pH 8'0), y se lavó el gel con el mismo tampón. Se elucionó el TBb a partir de la columna de gel de éster de sulfato de celulosa (7'8 cm de d.i, x 45 cm) con tampón de fosfato 20mM (pH 8'0) complementado con ClNa 1'5M y urea 1M. La fracción elucionada (fracción CS1) fue sometida al procedimiento de destoxicación como en la Preparación 4, y, después de diálisis, se añadió gel de hidróxido de aluminio para dar toxoide TBb 2.

Preparación 6 Toxoide TBb 3

La fracción CS1 obtenida como en la Preparación 5 fue purificada adicionalmente mediante una columna de combinación HW65 (2'64 cm de d.i x 69 cm) y HW75 (2'64 cm de d.i. x 64 cm) con gel TSK. La fracción CS1 fue pasada a través de la columna equilibrada con tampón de fosfato 0'05M (pH 7'2) complementado con sulfato sódico 0'3M y urea 1M, y fraccionada con el mismo tampón, y luego se combinaron las fracciones conteniendo actividad de toxina dermonecrótica. La fracción combinada fue sometida al procedimiento de destoxicación como en la Preparación 4, y, después de diálisis, se añadió gel de hidróxido de aluminio para dar toxoide TBb 3.

Preparación 7 Toxoide TBb 4

La fracción de TBb bruta obtenida como en la Preparación 4 fue purificada mediante cromatografía en una columna de gel de éster de sulfato de celulosa. El TBb bruto fue aplicado a un gel de éster de sulfato de celulosa equilibrado con tampón de fosfato 20mM (pH 8'0) complementado con ClNa 0'1M, y se lavó el gel con el mismo tampón. Se elucionó el TBb a partir de la columna de gel de éster de sulfato de celulosa con tampón de fosfato 20mM (pH 8'0) complementado con ClNa 0'5M. La fracción elucionada (fracción CS2) fue sometida al procedimiento de destoxicación como en la Preparación 4, y, después de diálisis, se añadió gel de hidróxido de aluminio para dar toxoide TBb 4.

Preparación 8 Toxoide TBb 5

La fracción CS2 obtenida como en la Preparación 7 fue purificada adicionalmente mediante una columna de Affi-gel azul (fabricada por Bio-Rad; malla 100-200; 5'0 cm de d.i. x 17 cm). La fracción CS2 dializada frente a tampón Tris 50mM (pH 7'5) fue aplicada a una columna de Affi-gel azul equilibrada con el mismo tampón, y se lavó la columna con tampón Tris 50mM (pH 7'5) complementado con hidrogenofosfato disódico 1M. Después de que la columna fuera lavada además con tampón Tris 50mM (pH 7'5), se elucionó el TBb con tampón Tris 50mM (pH 7'5) complementado con cloruro magnésico 2M y urea 1M. Esta fracción fue sometida al procedimiento de destoxicación como en la Preparación 4, y, después de diálisis, se añadió gel de hidróxido de aluminio para dar toxoide TBb 5.

Preparación 9 Antitoxina TBb

Las fracciones de TBb muy bien purificadas, obtenidas como en los Ejemplos 1 y 5, fueron sometidas al procedimiento de destoxicación como en la Preparación 4, y, después de diálisis, se añadió gel de hidróxido de aluminio para dar toxoide TBb 6. Cada 1 ml de este toxoide fue inoculado, 8 veces durante 3 meses, a cerdos LPE de 27 semanas de edad, para dar antitoxina TBb (título de neutralización, 4'096; título del anticuerpo aglutinador, <20).

Preparación 10 Toxoide TPm

Se cultivaron cepas S70 toxigénicas de Pm tipo D en un caldo infusión Corazón, en un fermentador con aireación a 37ºC durante 24 horas. Las células bacterianas fueron concentradas por centrifugación y luego rotas mecánicamente. Una solución (abreviada como "TPm bruta") obtenida después de eliminar los detritus mediante centrifugación o filtración por membrana (tamaño de poro: 0'45 \mum) fue purificada mediante cromatografía de intercambio aniónico. El TPm bruto fue aplicado al intercambiador aniónico equilibrado con un tampón de fosfato neutro complementado con ClNa 0 a 0'3M o tampón Tris, y se lavó el intercambiador con el mismo tampón. Se elucionó el TPm del intercambiador con el mismo tampón complementado con ClNa 0'4 a 0'5M. Se añadió formalina al 0'4% a esta fracción de TPm parcialmente purificada, y se redujo la toxicidad a 37ºC durante 14 o más días. El toxoide obtenido fue dializado frente a un salino tamponado con fosfato. Al dializado se añadió gel de hidróxido de aluminio, a 1mg de Al/ml, para dar toxoide TPm.

Ejemplo 12 Inmunogenicidad en cobaya de toxoides TBb obtenidos mediante diversos procedimientos de purificación

Cada 0'5 ml de los toxoides TBb con 3.000 MND/ml (actividad antes de la destoxicación), obtenidos como en las Preparaciones 4 a 8, fue inyectado intramuscularmente a cobayas (Hartely, hembra, 5 semanas de edad) en el muslo. Los animales fueron desangrados 28 días después de la inyección, y se comprobó el título del anticuerpo neutralizador de TBb. La medición del anticuerpo neutralizador se llevó a cabo mediante una doble dilución consecutiva de suero inactivado con salino tamponado con fosfato. Al suero diluido se añadió una cantidad igual de TBb (título: 4 MND/0'1 ml), y, después de la reacción durante la noche bajo enfriamiento, cada 0'1 ml de la mezcla fue inyectado subcutáneamente a cobayas. La medición se hizo un día después de la inyección, en donde el título de neutralización indicó una máxima dilución de suero (múltiple dilución del suero), la cual inhibió la reacción dermonecrótica.

Como se muestra en la Tabla 8, los cobayas inyectados con toxoides TBb 1 y 2, teniendo 1'4 x 10^{4} MND/mg de proteína de una actividad específica, permanecieron seronegativos para anticuerpo neutralizador. En el caso de cobayas inyectados con toxoide TBb 3, teniendo 3'7 x 10^{4} MND/mg de proteína de actividad específica, 2 de 3 cobayas fueron seropositivos, y todos los animales se transformaron en seropositivos con inyección de toxoide TBb de más de 7'8 x 10^{4} MND/mg de proteína de actividad específica.

El TBb es idóneo para ser insolubilizado durante la purificación, y tiene propiedades para formar fácilmente un complejo con materiales obtenidos bacterianamente tales como lípidos, proteínas ácidas, etc. [Wordlaw, A.C. y Parton, R., Pharmacol. Ther., 19, págs. 1-53 (1983)]. Por consiguiente, parece que la reducción de estos materiales obtenidos bacterianamente permite más bastante destoxicación, o reduce el enmascaramiento del epítopo(s) inmunogénico en la molécula TBb, a fin de que se intensifique la eficacia de la exposición de antígenos, para aumentar de ese modo la inmunogenicidad del toxoide TBb.

TABLA 8

7

Cada toxoide fue ajustado a 3.000 MND/ml con la adición de gel de hidróxido de aluminio a 1mg de Al/ml.

Ejemplo 13 Línea de protección mediante anticuerpo neutralizador de TBb

Cerdos LPE de dos días de edad fueron inmunizados pasivamente mediante inyección intraperitoneal de 0'2, 1'0, 2'0 ó 20 ml de antitoxina TBb obtenida en la Preparación 10. A los tres días de edad, los cerdos fueron desafiados intranasalmente con 10^{8} UFC de cepa S611 de Bb, y además desafiados intramuscularmente, a los siete días de edad, con el TBb bruto (1.940 MND/cabeza). Como se muestra en la Fig. 7, se observó protección, con un título de anticuerpo neutralizador de TBb de más de 1, frente a la actividad letal del TBb, mientras que fue posible la protección con más de 4 frente a la actividad dermonecrótica.

Ejemplo 14 Línea de protección mediante anticuerpo neutralizador de TPm

El toxoide TPm bruto obtenido como en la Preparación 10 fue emulsificado con una cantidad igual de adyuvante incompleto de Freund. Ocho cerdas LPE embarazadas fueron divididas en un grupo de inmunización, constando de 6 cerdas, y un grupo de control de 2 cerdas. Para el grupo de inmunización, se inyectó intramuscularmente cada 3 ml de toxoide (840 MND/ml), 2 a 5 veces, a cerdos durante el embarazo. Después del parto, la progenie fue alimentada con suficiente calostro y desafiada intramuscularmente, a los 2 ó 9 días de edad, con 20 a 160 MND de TPm bruto. Se observaron los lechones durante 14 días después del desafío, y se examinó la lesión en la concha nasal. Como se muestra en la Tabla 9, se observó la protección, frente a la actividad atrófica del TPm en la concha nasal, en el título del anticuerpo neutralizador de TPm de más de 2, mientras que fue posible la protección frente a la actividad letal incluso a menos de 2.

TABLA 9

8

a) Título del anticuerpo materno en el desafío medido con células de pulmón bovino embrionarias

b) Lechones de 2 ó 9 días de edad fueron desafiados intramuscularmente en el muslo con 20 a 160 MND de TPm

c) Valor medio de la puntuación de atrofia de concha nasal; 0=normal, 1:leve, 2:moderada, 3:grave, 4:sumamente grave

Ejemplo 15 Ensayo de desafió con Bb y Pm en cerdos inmunizados pasivamente con antitoxina TBb

Cerdos LPE de 2 días de edad fueron inmunizados pasivamente mediante inyección intraperitoneal de 20 ml de antitoxina TBb obtenida en la Preparación 10. Los cerdos fueron desafiados intranasalmente, a los 3 y 7 días de edad, con 10^{8} UFC de cepa S611 de Bb y 10^{8} UFC de cepa S70 de Pm tipo D, respectivamente, y se realizó la necropsia a las 6 semanas de edad. Como se muestra en la Tabla 10, se recuperó una gran cantidad de Bb de la mucosa nasal cuando se inmunizó con antitoxina TBb, mientras que la recuperación de Pm fue muy inferior en comparación con el control. La lesión de concha nasal en el grupo de control fue evaluada como grave (+++) a sumamente grave (++++) mientras que, en el grupo inmunizado, un cero fue normal (-) y los otros fueron graves y sumamente graves, demostrando una gran variación de individuo a individuo.

9

La toxina dermonecrótica se produce dentro de las células bacterianas, y se secreta fuera de las células mediante lisis bacteriana. De acuerdo con esto, la antitoxina TBb no puede bloquear la colonización por Bb en la mucosa nasal. Para la colonización por Pm, la Bb debería haber causado previamente la lesión en la mucosa. Como factores producidos por la Bb, causantes de la lesión en la mucosa nasal, el TBb [Elias, B. y col., Jpn. J. Vet. Sci., 52, págs. 677-688 (1990)] y una citotoxina traqueal [Cookson, B.T. y Goldman, W.E., J. Cell. Biochem., 11B (Supl.) pág. 124; Dogal, F. y col., Can. J. Vet. Res., 56, págs. 260-264 (1992)] son los más importantes. Puesto que la citotoxina traqueal tiene actividad para interrumpir el movimiento ciliar traqueal, actividad para destruir células epiteliales ciliares, y actividad para acelerar la secreción mucosa, todas las actividades siendo importantes para la colonización por Pm, la inmunización con antitoxina TBb puede únicamente bloquear parcialmente la colonización por Pm.

Viendo estos hechos, se debería establecer la inmunización frente, como mínimo, el TBb y la citotoxina traqueal para bloquear la colonización por Pm en la mucosa nasal. Sin embargo, el toxoide de citotoxina traqueal dista mucho de uso práctico, produciendo muchos problemas a resolver tales como el establecimiento de un procedimiento para purificación, inmunogenicidad, rendimiento, etc. Por consiguiente, para prevenir los síntomas primarios de la rinitis atrófica mientras se obvia una pérdida económica, una vacuna inactivada para RA debería constar, al menos, de una mezcla de toxoides de toxina dermonecrótica.

Ejemplo 16 Ejemplo de mezcla de toxoides

A los TBbs destoxicados obtenidos como en los Ejemplos 2 y 6 se añadió gel de hidróxido de aluminio, y se agitó la mezcla. Se preparó una solución madre de toxoide TBb ajustando la concentración de TBb de 8.700 hasta 220.0000 MND/ml (equivalente a 2 hasta 50 \mug/ml de proteína de TBb antes de la destoxicación) y la concentración de aluminio de 0'5 hasta 2'5 mg/ml, y añadiendo un conservante.

Se preparó una solución madre de TPm preparando el TPm destoxicado, complementado con gel de hidróxido de aluminio, obtenido como en la Preparación 11, a 3.400 MND/ml (cantidad de toxina antes de la destoxicación) o más, y añadiendo un conservante a eso. El conservante utilizado fue timerosal al 0'01% o formalina al 0'1 hasta 0'4%. Se mezclaron juntas cantidades iguales de la solución madre de TBb y de la solución madre de toxoide TPm, para dar una mezcla de toxoides.

Se inyectó intramuscularmente 2 ml de la mezcla de toxoides en el cuello de cerdos LPE de 9 semanas de edad, dos veces en un intervalo de 3 semanas. Se tomó suero con un lapso de tiempo, y se midieron los títulos de anticuerpo neutralizador de TBb y de anticuerpo neutralizador de TPm. Se midió el título del anticuerpo neutralizador de TPm mediante un ensayo de neutralización utilizando células de pulmón bovinas embrionarias [Rutter, J.M. y Luther, P.D., Vet. Rec., 114, págs. 393-396 (1984)]. La Tabla 11 muestra los títulos de anticuerpos neutralizadores en cerdos, mientras que la Tabla 12 muestra los resultados de un ensayo de titulación en ratones. No se observó distinción en la inmunogenicidad entre cada toxoide simple de TBb y TPm y la mezcla de toxoides cuando se administraron a cerdos y ratones, y la mezcla de toxoides exhibió una respuesta de anticuerpos neutralizadores suficiente para la protección, y fue bastante segura.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 11

10

a) Cada toxoide fue inyectado intramuscularmente en el cuello, a los 0 y 21 días.

TABLA 12

11

El título de neutralización mostrado es el obtenido en el desafío.

Claims

1. Un método para purificar toxina dermonecrótica producida por bacterias de la especie Bordetella bronchiseptica, el cual consta de las etapas:

(1) equilibrar un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa, o un gel cromatográfico al que está unida covalentemente un molécula sulfatada, o un gel cromatográfico compuesto de un polímero natural o sintético de alto peso molecular al que está unido un grupo sulfopropilo, tratando previamente el gel con un tampón teniendo un pH 7 a 9 y una conductividad eléctrica específica fija oscilando entre 3 y 20 mS/cm,

(4) elucionar la toxina dermonecrótica del gel utilizando un tampón teniendo pH 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica de más de un intervalo fijo de 3 a 20 mS/cm hasta 130 mS/cm.

2. El método de la Reivindicación 1, el cual consta de las etapas:

(1) equilibrar un gel de éster de sulfato de celulosa tratando previamente el gel con un tampón que tiene pH 7 a 9 y una conductividad eléctrica específica de 20 mS/cm,

(2) poner en contacto la solución que contiene toxina dermonecrótica de Bordetella bronchiseptica con el gel de éster de sulfato de celulosa bajo condiciones de pH 7 a 9, una temperatura de 0 a 30ºC, y una conductividad eléctrica específica de 20 mS/cm,

(3) lavar el gel de adsorción con un tampón, que tiene pH 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica de 20 mS/cm, antes de la elución de la toxina dermonecrótica del gel, y

(4) elucionar la toxina dermonecrótica del gel utilizando un tampón teniendo pH 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica oscilando entre 22 y 130 mS/cm.

3. El método de la Reivindicación 1, el cual consta de las etapas:

(1) equilibrar un gel cromatográfico unido a heparina tratando previamente el gel con un tampón que tiene pH 7 a 9 y una conductividad eléctrica específica oscilando entre 3 y 5 mS/cm,

(2) poner en contacto la solución que contiene toxina dermonecrótica de Bordetella bronchiseptica con el gel cromatográfico unido a heparina, bajo condiciones de pH 7 a 9, una temperatura de 0 a 30ºC, y una conductividad eléctrica específica oscilando entre 3 y 5 mS/cm,

(3) lavar el gel de adsorción con un tampón, que tiene pH 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica oscilando entre 3 y 5 mS/cm o inferior, antes de la elución de la toxina dermonecrótica del gel, y

(4) elucionar la toxina dermonecrótica del gel utilizando un tampón teniendo pH 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica oscilando entre 3 y 130 mS/cm.

4. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en donde la solución que contiene toxina dermonecrótica de Bordetella bronchiseptica es un extracto celular bacteriano de Bordetella bronchiseptica.

5. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en donde la solución que contiene toxina dermonecrótica de Bordetella bronchiseptica es un cultivo o un extracto de un microorganismo o célula en la que la toxina dermonecrótica de Bordetella bronchiseptica está expresada mediante una técnica de ingeniería genética.