JPH11507210A

JPH11507210A - ヘリコバクター・ピロリ抗原及びワクチン組成物

Info

Publication number: JPH11507210A
Application number: JP8536414A
Authority: JP
Inventors: ビヨリーン，イングリド; スヴエンネルホルム，アン−マリ
Original assignee: アストラ・アクチエボラーグ
Priority date: 1995-06-01
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-06-29
Anticipated expiration: 2016-06-03
Also published as: MY119003A; MX9709194A; NZ303356A; IL122340A0; AR003125A1; NO975490D0; EE9700306A; SK155297A3; US20020168726A1; KR19990022131A; US6025164A; AU703331B2; AU6020596A; CA2222797A1; WO1996038475A1; HUP9901546A2; BR9608627A; TR199701471T1; IS4615A; NO975490L

Abstract

(57)【要約】本発明は、約29キロダルトンの分子量の、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の表面露出抗原を構成する組換えポリペプチドに関する。本発明はさらに、該ポリペプチドをコードする核酸分子並びにかかる核酸分子を含むことからなるベクター及び宿主細胞を提供する。該組換えポリペプチドは、ヘリコバクター・ピロリの診断、並びに、かかる感染に対する防御的免疫応答を誘導し治療及び予防のいずれのための使用にも適するワクチン組成物に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ヘリコバクター・ピロリ抗原及びワクチン組成物技術分野本発明はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)抗原を構成する組換えポリペプチドを提供するもので、該抗原はヘリコバクター・ピロリの分裂（細菌）型及び休止（球状）型のいずれの表面においても発現され、全身性及び局所性（粘膜性）の抗体産生を生ぜしめる。本発明はさらに、該ポリペプチドをコードする核酸分子及びかかる核酸分子を含有するベクター及び宿主細胞を提供する。該組換えポリペプチドはヘリコバクター・ピロリ感染の診断及びかかる感染に防御免疫応答を誘導するワクチン組成物の製造に有用であり、該ワクチン組成物は治療及び予防のいずれの使用にも適している。背景技術グラム陰性バクテリアであるヘリコバクター・ピロリは重要なヒト病原体であり、いくつかの胃十二指腸疾患に関与している。このバクテリアが胃の上皮にコロニーを形成すると、消化性潰瘍の疾患が進行する危険性が著しく増大し、活性型炎症及び進行性慢性胃炎へと導かれる。胃粘膜中でコロニー形成するために、ヘリコバクター・ピロリは多くの発病因子（virulence factor）を使用する。かかる発病因子はいくつかのアドヘシン(a dhesin)を含み、これによりバクテリアは粘液と会合し及び／又は上皮細胞；酸性環境の中和を補助するウレアーゼ；及び粘液をさらに流動的にする蛋白質分解酵素と結合する。全身性及び局所性（粘膜性）の抗体産生を伴う宿主の免疫応答は見かけ上強力であるのにも拘らず、この病原菌は通常、宿主が生きている間胃粘膜中で生存する。この理由はおそらく、同時に誘導される免疫応答が不適切であるか、又は、抗原の誤ったエピトープに向けられているためである。ヘリコバクター・ピロリ感染の病因及び免疫学を理解するために、このバクテリアの抗原構造を特定することは極めて重要である。特に、多くのバクテリア病原菌において主要な発病因子を構成することが示され、ヘリコバクター・ピロリの診断及びワクチン組成物の製造に有用となり得る、（アドヘシンのような）表面露出性かつ分泌性の蛋白質の性状決定の必要性が存在する。ヘリコバクター・ピロリのＮ−アセチルノイラミニルラクトース−結合・原繊維性ヘマグルチニン（N-acetylneuraminyllactose-binding fibrillar hemagglu tinin：NLBH）の20キロダルトン受容体−結合サブユニットをコードする遺伝子h paAのクローニングがEvans et al.(1993)J．Bacteriol．175，674-683により開示されている。ヘリコバクター・ピロリの膜調製物に対するモノクローナル抗体(MAbs)はB li n et al.(1995)J．Clin．Microbiol．33，381-384により開示されてきている。これらのMAbsのうちのひとつでHP30-1:1:6と表示されるものは、完全なバクテリア表面に露出しアドヘシンのような性質を有することが示された30キロダルトンの蛋白質と反応した。ストレスや脅威を受けると、ヘリコバクター・ピロリ細胞は、細菌型から球状型へと変形する。球状型では、ヘリコバクター・ピロリ細胞は抗生物質や他の抗バクテリア剤への感受性がさらに低くなる。状況証拠は、ヘリコバクター・ピロリが、おそらくは水を介してまたは直接感染により、この型で個体間を伝染するであろうことを示している。したがって、効率的なワクチン組成物は、ヘリコバクター・ピロリの球状型及び細菌型いずれに対しても免疫応答を誘導しなければならない。全身性免疫はおそらく、粘膜感染に対する防御において限られた役割しか果たさないので、このワクチン組成物が胃の中で局所的に防御的免疫メカニズムを増進することも重要である。発明の目的本発明の目的は、例えば、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する防御的免疫応答の誘導及びヘリコバクター・ピロリ感染の診断に有用たり得る、ヘリコバクター・ピロリの抗原性ポリペプチドを提供することにある。この目的は表面−露出蛋白質をコードするヘリコバクター・ピロリ遺伝子の組換えクローニングにより達成された。この遺伝子の核酸配列はEvans et al．Journal of Bacteriology， vol.175，674-683（1993）において発表されたhpaA遺伝子の配列に類似している。しかるに、hpaA遺伝子が20キロダルトンの蛋白質をコードすることが報告されたのに対し、驚くべきことに、本発明のＤＮＡ分子は29キロダルトンの分子量のポリペプチドをコードすることが見いだされた。 29キロダルトンのポリペプチドは、ヘリコバクター・ピロリのすべての株において球状型のバクテリアにおいて発現され、宿主において抗体の産生として測定される粘膜性及び全身性免疫応答を誘導できる抗原蛋白質であることが示される。この29キロダルトンのポリペプチドは試験されたすべてのヘリコバクター・ピロリ株で発現し、この蛋白質に対する抗体は通常の他種のヒト内在性バクテリアや胃粘膜を含む選択されたヒト組織と交差反応しない。このように、免疫学的性質を伴い本質的でよく保存されているアドヘシンとして、29キロダルトンポリペプチドはヘリコバクター・ピロリ感染の検出とワクチン組成物の製造に有用であり、この組成物は適切な医薬的処方で与えられた場合にかかる感染に対し防御的又は治療用の免疫応答を誘導する。このように、以下の実験データは、モノクローナル抗体の29キロダルトン蛋白質への結合がヘリコバクター・ピロリのマウスにおけるコロニー形成を完全に阻害する結果となることより、29キロダルトンのヘリコバクター・ピロリ蛋白質が、ヘリコバクター・ピロリのコロニー形成及び／又は感染の持続に重要であることを示す。さらに、29キロダルトンのヘリコバクター・ピロリ蛋白質が、経口免疫原として使用された場合、免疫の１月前にヘリコバクター・ピロリに感染したマウスにおけるヘリコバクター・ピロリのコロニー形成の有意な減少へと結びつく免疫応答の刺激因子として働く。図面の簡単な説明図１：29キロダルトンポリペプチドをコードするヘリコバクター・ピロリの１ .７キロベース断片を含むプラスミドpAE1の制限酵素地図。斜線四角は構造遺伝子の位置を示す。Ｔ３及びＴ７のプロモーター配列の位置は、ベクターを示す黒四角の上方に示される。図２：pS860、pS861、pS862及びpS863のプラスミド地図。黒矢印：lacオペロンプロモーター（Plac）又はバクテリオファージT7RNAポリメラーゼプロモーター（T7プモーター）。灰色矢印：PCRで作られた29キロダルトン遺伝子の5'末端又は3'末端。ターミネーター：T7転写ターミネーター。Ori:pBR322プラスミド複製開始点。図３：BALB／ｃマウスにおけるヘリコバクター・ピロリのコロニー形成に対するモノクローナル抗体の効果。図４：ヘリコバクター・ピロリに感染したBALB／ｃの治療用経口免疫。発明の開示以下の説明を通して、特に以下の実施例において、「標準プロトコール」及び「標準操作」なる術語は、分子クローニング技術の文脈において使用される場合、サムブルークJ.フリッチュE.F.及びマニアチスT.(1989)の「分子クローニング：研究室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク」のような通常の研究室マニュアルに見られるプロトコール及び操作手順として理解される。第１の重要な観点において、本発明は、約29キロダルトンの分子量の、ヘリコバクター・ピロリの表面露出抗原と同一の又は実質的に類似のアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドを提供する。本発明の該表面露出抗原は、例えば、以下の重要な性質を有する。・胃粘膜のコロニー形成に重要なアドヘシンである。・ヘリコバクター・ピロリの分裂（細菌）型及び休止（球状）型のいずれの表面においても発現される。・全身性及び局所性（粘膜性）の抗体産生を生ぜしめる強力な抗原である。・ヘリコバクター・ピロリの試験されたすべての株で保存されている。・ 29キロダルトンポリペプチドに対する抗体は、異なった多くの非ヘリコバクターバクテリア、又は、胃粘膜を含む選択されたヒト組織と交差反応しない。・この29キロダルトンのポリペプチドはリピド化され、ゆえに翻訳後に修飾される。ポリペプチドのこの特徴は、その免疫原性のために及びヘリコバクター・ピロリの表面に適切に露出するために重要である。この分野において、リピド化はバクテリアのリポ蛋白質の免疫学的な性質に対し本質的であり得ることは知られている（Weis J.J．et al.(1994)Infection and Immunity，vol．62，4632-46 36参照）。・これは推定上の発病因子である。ここで「発病因子」とは、胃粘膜の上皮表面へのヘリコバクター・ピロリの粘着及び／又はヘリコバクター・ピロリ感染の確立と維持に特に関与する分子として理解される。好適な形において、該ポリペプチドは、配列表の配列番号２又は配列番号４における位置１−260又は28−260のアミノ酸配列を有する。後に実験の部で記載されるように、配列番号２又は配列番号４における位置１−260は切断されていない蛋白質を表し、一方、位置１−27はシグナル配列を表し28−260は成熟ポリペプチドを表す。配列番号２と配列番号４との唯一の相違は、配列番号２は位置22 においてSer残基を有しているのに対し、配列番号４は同一の位置においてArg残基を有していることである。しかしながら、本発明のポリペプチドは厳密には、配列表の配列番号２又は４における上述の位置と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに限定されない。むしろ本発明は、置換、僅かな欠失、挿入又は逆位のような修飾を担うが、それにも拘らず実質的に本発明の29キロダルトンのポリペプチドの性質を有するポリペプチドを包含する。かかる性質は、哺乳動物種においてヘリコバクター・ピロリに対する粘膜性及び全身性の免疫応答を誘導する能力；アドヘシンのように作用する能力；及びヘリコバクター・ピロリの細菌型及び球状型の両方におけるそのポリペプチドの存在を含む。結果的に本発明には、配列表の配列番号２又は配列番号４における位置１−26 0又は28−260で示されるアミノ酸配列と少なくとも90％の相同性、好適には少なくとも95％の相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、それにも拘らず実質的に本発明の29キロダルトンポリペプチドの生物学的活性を有するポリペプチドが含まれる。本発明には、また、本発明の29キロダルトンポリペプチドの免疫原性エピトープを含むことからなり、哺乳動物宿主においてヘリコバクター・ピロリバクテリアに対する免疫応答を誘導する能力を保持する、少なくとも５アミノ酸の長さのペプチドも含まれる。かかるエピトープは、それ単独か又はそのエピトープが挿入体もしくは免疫学的活性を有する担体ポリペプチドに融合している融合蛋白質の形で表すことができる。このようなエピトープの特定は、29キロダルトンのポリペプチドのさまざまな断片に向けられた、宿主により産生された抗体の存在に基づく。 29キロダルトンのポリペプチドのエピトープに関する構造的な情報を得るひとつの方法は、このポリペプチドに結合するモノクローナル抗体の産生及び性状決定及びその後の、たとえばペプスキャン(Pepscan)分析によるエピトープのマッピングである。モノクローナル抗体は、DeSt．Growth，J．Immunol．Methods，v ol．35，1-21（1980）においてより記載されたような標準的方法により産生することができる。他の観点において、本発明は、上記で定義したポリペプチドをコードする核酸配列を有する、単離、精製された核酸分子を提供する。本発明の好適な形において、該核酸分子は、配列表の配列番号１又は配列番号３と同一のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子である。しかしながら、本発明のＤＮＡ分子は配列番号１又は配列番号３で示される配列に厳密に限定されない。むしろ、本発明は、置換、僅かな欠失、挿入又は逆位のような修飾を担うが、それにも拘らず実質的に本発明の29キロダルトンのポリペプチドの生化学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を包含する。は、ヘリコバクター・ピロリにおいて異常でないことが知られている。配列番号１及び配列番号３の唯一の相違は、配列番号１は位置1458においてＡ残基を有するのに対し配列番号３は同じ位置においてＣ残基を有していることである。本発明には、また、遺伝的コードのため、そのヌクレオチドが配列配列番号１又は３で示されるヌクレオチド配列の縮合物であるＤＮＡ分子も含まれる。64通りのコドンがあるのに対し、天然には20種のアミノ酸しかないので、大部分のアミノ酸は二つ以上のコドンによりコードされている。遺伝的コードの天然の「縮合（degeneracy）」又は「余剰(derundancy)」はこの技術分野でよく知られている。配列表で示されるＤＮＡ配列は、上に記載されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列群の巨大な、しかし決定的なグループにおけるただひとつの例に過ぎないことが正しく評価されなければならない。結果的に、本発明は以下より選択される単離された核酸分子を含む： (ａ) 配列表の配列番号１又は配列番号３における位置796−1572又は874−157 2と同一の又は実質的に類似のヌクレオチド配列を含むことからなる核酸分子； (ｂ) (ａ)において定義された核酸分子のポリペプチド・コード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むことからなり、本発明のポリペプチド又はその機能的に等価の修飾型をコードする核酸分子；及び (ｃ) (ａ)又は(ｂ)において定義されたヌクレオチド配列の遺伝的コードの結果としての縮合物である核酸配列を含むことからなり、本発明のポリペプチド又はその機能的に等価の修飾型をコードする核酸分子。本発明の別の観点は、本発明の核酸分子を含むことからなるベクターである。かかるベクターは、好適には、（ブタペスト条約下寄託番号No. NCIMB 40732で寄託された）プラスミド・ベクターpAE1であり得る。本発明のベクターは、また、本発明の核酸分子を運搬しその発現の調節能を有し得る複製可能な発現ベクターであり得る。この文脈において、「複製可能」なる術語は、ベクターが導入された一定のタイプの宿主細胞においてそのベクターが複製可能であることを意味する。ベクターの例は、バクテリオファージのようなウィルス、コスミド、プラスミド及び他の再結合ベクターである。核酸分子は、この技術分野で知られている標準的な方法でベクター・ゲノムに挿入される。本発明の発現ベクターは、好適にはpAL30:1、pAL30:2、pAL30:3、pAL30:4のいずれかひとつ、さらに好適には、pS863であり得る。本発明には、また、本発明のベクターを含む宿主細胞が含まれる。かかる宿主細胞は、前核細胞、単一真核細胞又は多細胞生物に由来する細胞であり得る。このように、宿主細胞は、例えば、大腸菌細胞のようなバクテリア細胞；サッカロミセス・セルビシエ（Saccaromyces cervisiae）もしくはピッチア・パストリス（Pichia pastoris）のような酵母からの細胞；又は哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞へベクターを導入するために採られる方法は、組換えＤＮＡ法に精通している者によく知られた標準的な方法である。別の観点において、本発明は上記で定義されたポリペプチドの製造方法を提供するものであり、該方法は、該ポリペプチドが生産される条件下で、上記で定義された発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を培養し、そして該ポリペプチドを回収することを含む。細胞を成長させるのに使用される培地は、この目的に適する通常の培地のいずれのものも使用し得る。適切なベクターとしては、上述のベクターのいずれのものも使用し得、適切な宿主細胞は上で並べられた細胞のタイプならばいずれのものも使用し得る。ベクターの構築に採用される方法及びベクターを宿主細胞へ導入するための方法は、かかる目的のために組換えＤＮＡの分野において知られたいずれの方法も使用し得る。この細胞により発現される組換えポリペプチドは、分泌され得、すなわち、細胞のタイプとベクターの組成に依存して細胞膜を通過して輸送される。ポリペプチドが組換え宿主により細胞内で生産される場合、すなわち、細胞により分泌されない場合、超音波処理や破砕（homogenization）のような機械的手段又は精製後の酵素的もしくは化学的手段による細胞の破壊を含むことからなる標準的方法により回収され得る。分泌されるためには、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の前にシグナルペプチドをコードする配列がなければならず、このものの存在により、発現されたポリペプチドが少なくとも有意な割合で培養液へ分泌され回収されるような細胞からのポリペプチドの分泌が確実となる。本発明のさらに別の観点は、治療に使用するため、ヒトを含む哺乳動物におけるヘリコバクター・ピロリ感染の診断に使用するため、及び治療用又は予防用ワクチンとして使用するための本発明のポリペプチドである。本発明の別の重要な観点は、ヒトを含む哺乳動物におけるヘリコバクター・ピロリの細菌型及び／又は球状型に対する防御免疫応答を誘導するためのワクチン組成物である。かかるワクチン組成物は、免疫原エピトープを含むことからなる２９キロダルトンポリペプチドの少なくとも一部、又はヘリコバクター・ピロリ感染に対する防御免疫を誘導する能力を保持する該ポリペプチドの修飾型などの、上で定義されたポリペプチドの免疫学的有効量を含有する。「修飾型」との術語は、翻訳後の修飾、たとえばリピド化されたポリペプチドの形を含むが、これに限定されない。 29キロダルトン蛋白質はリピド化されていると信じられており、下記実施例４を参照されたい。ワクチン組成物は、好適には、薬理学的に許容される担体又は希釈剤、又は予防もしくは治療に使用するための免疫学的活性を有する他の抗原を含有する。整理学的に許容される担体及び希釈剤は当業者によく知られており、リン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline：PBS)、又は、経口ワクチンの場合は、処方に基づきHCO₃-もしくは腸溶皮粉処方が含まれる。ワクチン組成物は、好適には、酸性分泌阻害剤、好適には例えばオメプラゾール(omeprazole)のようなプロトンポンプ阻害剤(proton pumpinhibitors：PPIs) を含むか、同時に投与される。このワクチンは、リポソーム、ISCOM、共キレート剤等の公知のデリバリー・システム(delivery system）(例えば、Ravinovich et al．（1994）Science 265,1401-1404参照)中で処方され得るか、又は、崩壊性（degradable）又は非崩壊性（non-degradable）のポリマーの微小球体に付加されるか含まれ得る。抗原は、弱毒化された生きているバクテリア、ウィルスもしくはファージ、又は、同じ種類の殺されたベクターに付加し得る。以下の実験の部で示されるように、本発明の組成物は、治療又は予防の両方の目的に使用し得る。本発明のワクチン組成物は、好適には、頬、鼻、扁桃、胃、腸（小腸及び大腸）、直腸及び膣の粘膜に例示されるいずれの哺乳動物粘膜にも投与される。粘膜ワクチンは目的に応じて適切なアジュバントと共に投与し得る。ワクチンは、皮下、皮膚内又は筋肉内へ、好適には適切なアジュバントと共に、平行して投与することもできる。 29キロダルトンポリペプチドに対して免疫応答を生ぜしめるための別のアプローチは、「核酸ワクチン投与」又は「裸ＤＮＡ」ワクチン投与として知られるアプローチの使用である。この分野においては、興味の対象の抗原をコードするプラスミドＤＮＡを筋肉へ注射すると、抗原の発現が維持され、免疫応答が産生するとの結果になり得ることが知られている（例えば、上記Ravinovich参照）。非経口、粘膜、又は、ＤＮＡでコートされた微量の金ビーズを投与する「ジーン・ガン(gene-gun)」（Fynan et al.（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,11478-11 482）を介するようないくつかの投与経路が可能である。このように、本発明の核酸分子は適切な真核プロモーターを含むことからなるプラスミド中で発現することができる。この「裸ＤＮＡ」は「ジーン・ガン」を介して筋肉内又は一定の真皮内に注射し得る。発現された蛋白質のエピトープは細胞表面上のＭＨＣ分子により発現され、免疫応答を誘発する。結果的に前のパラグラフにおいて開示された、治療に使用するため特にワクチンとして使用されるための核酸分子とベクターは、本発明の別の観点である。ヘリコバクター・ピロリ感染の治療、予防又は診断のための組成物の製造における、かかる核酸分子とベクターの使用も、本発明の別の観点である。さらに本発明の別の観点は、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療、予防又は診断のための組成物の製造における、上で定義されたポリペプチド、又はヘリコバクター・ピロリ感染に対する防御免疫を誘導する能力を保持する該ポリペプチドの修飾型の使用である。かかる組成物は、特にヘリコバクター・ピロリの細菌型及び／又は球状型に対する防御免疫応答を誘導するワクチン組成物を含む。本発明には、また、ヘリコバクター・ピロリ感染の診断のための製造のための該使用も含まれる。かかる診断キットは、さらに以下に記載される。別の観点において、本発明は、ヒトを含む哺乳動物において、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する防御免疫応答を誘導する方法を提供し、該方法は上で定義したワクチン組成物の免疫学的有効量を該哺乳動物へ投与する工程を含むことからなる。「免疫学的有効量」なる術語は、感染哺乳動物におけるヘリコバクター・ピロリの感染を根絶するか、又は、感受性哺乳動物における感染を阻止する、有意な防御ヘリコバクター・ピロリ応答を誘導する量を意味しようとしている。典型的には、免疫学的な有効量は、経口投与に対しては約１μgから100mg、好適には約10μgから10mgのヘリコバクター・ピロリ抗原、非経口的には約100μg以下のヘリコバクター・ピロリ抗原を含有する。本発明の別の観点は、免疫原エピトープを含むことからなる、29キロダルトンのポリペプチドの部分等の、上で定義されたポリペプチドが使用される工程を少なくともひとつ含むことからなる、ヘリコバクター・ピロリ感染の試験管内の診断方法である。このポリペプチドは、好適には標識され及び／又は固相支持体に結合している。診断方法は、たとえば、(ａ)好適には固相支持体へ結合された該ポリペプチドを哺乳動物より得た体液と接触させ、(ｂ)該ポリペプチドに結合する該体液からの抗体を検出する、工程を含むことからなる。抗体を検出する好適な方法は、この分野でよく知られたELISA(EnzymeLinked immunoabsorbent assay )法である。さらに別の観点において、本発明は、上で例示された診断方法の実施を可能ならしめる因子を含むことからなる、ヒトを含む哺乳動物におけるヘリコバクター・ピロリ感染の検出のための診断キットを提供する。実施例実施例１：ヘリコバクター・ピロリよりの29キロダルトンポリペプチドのクローニング及び発現１.１．バクテリア株、ベクター及び成育条件ヘリコバクター・ピロリ（H．pylori）CCUG178（=NTCC 11637）は、微好気的（microaerophilic）環境においてウマ血液寒天プレート上で成育された。大腸菌株XL1-BlueMRF及びXLOLR(Stratagene，La Jolla，California：以下、「ストラタジーン社」という。)、はクローニング実験の宿主株として使用され、ラムダ感染（lambda infectionに使用される場合は0.2％マルトース及び10mM MgSO₄ が添加されたルリア−ベルタニ・ブロス（Luria-Bertani broth：LB）において成育された。ラムダ発現ベクターZAP Express(登録商標)及びファージミド誘導体pBK-CMVはストラタジーン社より購入した。１.２．ＤＮＡ技術ヘリコバクター・ピロリの染色体ＤＮＡは、10mg／mlのリゾチーム、及び５ng /mｌのDNaseフリーのRNase(Boehringer Mannheim Scandinavia AB，Bromma，Swe den：以下、「ベーリンガー社」という。)を含む50mMトリス−塩酸、pH8.0、25 ％シュクロース、50mME DTAにおいて48時間保温されたプレートから得たバクテリアを懸濁することにより調製した。この懸濁液は37℃で10分間保温された。同量の溶解緩衝液（50mMトリス−塩酸、pH8.0及び62.5mM EDTA中の0.4％トリトンX 100）が添加され、懸濁液は顕著なバクテリアの溶解が起るまで室温で保温された。この懸濁液は、緩衝フェノール(pH8.0)、フェノール／クロロフォルム及びクロロフォルムそれぞれを用いて３工程で抽出された。ＤＮＡは水相から沈殿され、ＴＥ緩衝液（10mMトリス−塩酸、pH8.0；及び１mM EDTA）に溶解された。制限酵素はベーリンガー社より購入し、使用説明書に従い使用した。プラスミド及びラムダＤＮＡはウィザード・キット（Wizard kits：Promega， Madison，Wisconsin）により精製した。配列決定はシーケナーゼ2.0キット（Seq uenase 2.0 kit：Amersham Sweden AB，Solna，Sweden：以下、「アマシャム社」という。）で行った。オリゴヌクレオチドは、Innovagen，Lund，Swedenから購入した。PCRは、Taq DNAポリメラーゼ（ベーリンガー社）を用いて行った。１.３．ヘリコバクター・ピロリ・ゲノム・ライブラリーの構築サイズ範囲２−12キロ塩基対の染色体ＤＮＡは部分的にSau3Aで切断したヘリコバクター・ピロリ17874ＤＮＡから精製し、ストラタジーン社のプロトコールの記載に従いBamHIで切断されたZAP Expressベクター中でクローニングした。試験管内での封入の後、ライブラリーはXL-1Blue MRF株を感染することにより滴定し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）及び５−ブロモ− ４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（X-Gal）を含む指示プレート上に置かれた。ライブラリーの滴定は、85％組換え体について1.2×1 0⁶PFU／mlであった。 29キロダルトンのポリペプチドのプラークの発現は、標準的方法に従い、MAb HP30-1:1:6(ベリンら(1995)J．Clin.Microbiol.33，381-384)を用い免疫学的スクリーニング法により検出した。陽性プラークが単離され、プラークが純品になるまでプレーティング操作とＭＡｂを使用してのスクリーニング操作が繰り返された。ZAP Expressクローンのファージミド型への変換はExAssistプロトコール（ストラタジーン社）を用いて行われた。１.４．イムノブロッティング及びドット・ブロット試験図１に示されるヘリコバクター・ピロリ17874から得られた、クローン化された挿入物を有するプラスミドを含む大腸菌XLOLRの終夜培養液は、50mg／mlのカナマイシンを含有する５ml LB培地中で１：100に希釈された。培養液は600nmのO Dが0.7になるまで37℃で保温された。IPTGが最終濃度が１mMになるように添加され、バクテリアはさらに２時間成育された。IPTGを添加しない成育培養も同時に行われた。培養液は遠心され、容量の1/10に再懸濁された。10μlの懸濁液は同量の２×サンプル・バッファーと混合され、煮沸され、SDS-PAGEで分析された。菌株XLOLRはカナマイシン未添加で同様に成育され、陰性コントロールとして使用された。ヘリコバクター・ピロリ17874のPBS中の懸濁液（600nmのOD＝1.0）が陽性コントロールとして使用された。蛋白質混合液はニトロ・セルロース膜上に固定した後、前に記載された(Boe l in et al．1995)ように、29キロダルトンのポリペプチドに特異的な、1:10に希釈されたＭＡｂ HP30-1:1:6と反応し、結合した抗体はパーオキシダーゼで標識した抗マウスIgGを使用して検出された。フィルターは、過酸化水素基質と４− クロロナフトール・クロモゲン(BioRad Svenska AB ：以下、「バイオラド社」という。）で展開した。ドット・ブロット試験は、上記菌株の終夜培養液を使用して行われた。２μl の懸濁液は、ニトロセルロース・フィルター上にスポット（spot）され、空気中で乾燥され、1:10で希釈されたMAb HP30-1:1:6で１時間保温された。以下の工程はイムノブロッティングで記載されたように実施された。１.５. 分子クローニングヘリコバクター・ピロリ株17874から得て部分的に切断された染色体ＤＮＡはラムダ発現ベクター(ZAP Express)中でクローニングされた。 29キロダルトンのポリペプチドに特異的なMAbを用いての反応で24000プラークをスクリーニングした後、29キロダルトンのポリペプチドを発現する４個のプラークが検出された。陽性プラークが精製され、クローン化された挿入物のサイズは、XbaＩ及びSalＩで切断したＤＮＡ調製物で確かめられた。挿入物のサイズは、 3.7から1.78キロ塩基対であった。４個の陽性プラークよりのpBK-CMVファージミドを生体内で切断した後、制限酵素地図が構築され、ラムダベクター中の挿入物と比較された。ファージミドはラムダベクター中のものと同じサイズの、重複するＤＮＡ−断片を含むことが見いだされた。SmaＩとNheＩを除き、試験された制限酵素のほとんどはクローン化された断片を切断しなかった。さらに分析された、もっとも小さいクローン化1.7断片(pAE1)の制限酵素地図は図１に示される。クローン化された挿入物のひとつはベクター・プロモーターとは逆の方向であった。これらのプラスミドを含む大腸菌株の細胞抽出物全体が MAb HP30-1:1:6を用いたイムノブロッティングで分析された場合、これらはすべてヘリコバクター・ピロリ17874のものと同じ分子量のポリペプチドを発現することが見いだされた。ベクター・プロモーターがIPTGで誘導された場合、29キロダルトンのポリペプチドの発現における相違はまったく見られなかった。このことは、遺伝子がそれ自身のプロモーターにより転写されることを示している。図１に示されるＤＮＡ断片を含む３個のサブクローンが構築され、29キロダルトンのポリペプチドの発現が試験された。いずれのクローンもこのポリペプチドを発現しなかった。XLOLR（pAE1）がドット・ブロット・アッセイ（ベリンら、1995 ）で試験され、ヘリコバクター・ピロリと比較されたが、弱く陽性であることが見出され、このことは発現されたポリペプチドのいくらかが表面に露出することを示唆するものであった。１.６．ＤＮＡ配列の分析 pAE1の11.7キロ塩基対の挿入物及びサブクローンの両方の鎖について、Ｔ３− 及びT7−特異的なプライマーを用い、必要な場合には、標準的プライマーを用いては提供されない配列の領域をカバーする特異的なプライマーを補足して配列決定を行った。コンピューターによる解析により、この配列（配列番号１）は、サブクローニングに用いる制限酵素部位をスパニング（spanning）し、780塩基対のオープン・リーディング・フレーム（open reading frame）を含むことが示された(図１)。推定上のリボソーム結合部位が特定できた(配列番号１の位置782− 785)。このORFは、260アミノ酸で分子量29、126ダルトンのポリペプチドをコードしていた（配列番号２）。アミノ酸配列は27アミノ酸のおそらくはシグナル配列を含むことが見いだされた。配列Leu-Val-Gly-Cys（配列番号２及び４の位置25から28）は、酵素シグナル・ペプチダーゼIIの認識部位とされるコンセンサス配列(Leu-X-Y-Cys)のひとつである。シグナル・ペプチダーゼIIは、プロ・リポ蛋白質のシステイン残基の前のシグナル配列を切断する。このように、シグナル配列の特徴は、29キロダルトン蛋白質はリポ蛋白質であり、かつ成熟蛋白質はアミノ酸28から260を含むことからなることを示している。１.７．大腸菌における組換え29キロダルトン・ポリペプチドの発現組換え29キロダルトン・ポリペプチドは、大腸菌N4830-1において、29キロダルトン・ポリペプチドの全長遺伝子（配列番号１及び３の位置771−1667）を含む発現ベクター構築物より高濃度で産生された。この構築物に使用されたベクターは、強力なλＰLプロモーターを含むpML-LTCBλ7であった（Michael Labens， University of Gothenburg， Swedenより購入）。このベクターは、また、アンピシリン抵抗性を付与するβ− ラクタマーゼ遺伝子を含むことからなる。（コレラ・トキシン及びそのシグナル・ペプチドをコードする）ＬＣＴＢ遺伝子は、ベクター中のλPLプロモーターとターミネーター領域の間に挿入されたが、制限酵素SmaＩ及びHindIIIによりこのベクターより切断された。シグナル配列をも含め、29キロダルトンのポリペプチドをコードする構造遺伝子は、ポリメラーゼ鎖長反応(Polymerase Chain Reaction：PCR)により増幅された。使用されたプライマーは、ATG開始コドンに271塩基対に上流に結合するHP30 N（GGC GTA GAA ATG GAA GCG C；配列番号１及び３の位置522から540に対応）及び開始コドンの855塩基対下流のＤＮＡ断片を認識するHP30C（CCC AAG ATT CAT CAG CCC TTA AAT ACACG；配列番号１及び３の位置1648及び1667に対応）であった。HP30Cプライマーは、PCRにより29キロダルトン・ポリペプチド遺伝子配列に加えられた HindIII切断部位を含んでいた。得られたＰＣＲ産物は1.1キロ塩基対だった。このＤＮＡ断片は、SspＩ及びHindIIIにより切断され、ベクター断片（2.7キロ塩基対）にライゲーションされる0.9キロ塩基対の断片を与えた。現在ではpAL30（3.6キロ塩基対）と呼ばれるベクター構築物は、エレクトロポレーション法（elecroporation）により大腸菌N4830-1中へ形質転換された。４個の陽性クローンが見いだされた(pAL30:１、２、３、４)。組換えポリペプチドの発現を誘導するため、pAL30:1から４を含むＮ4830-1細胞はアンピシリン添加（100μg／ml）の１×LB中で＋30℃（ラムダｃＩリプレッサーはこの温度で転写を阻害する。）で終夜成育された。この終夜培養液のごく一部がアンピシリン添加の５ml１×LB中に接種され、細胞は600nmのODが約0.7になるまで30℃で成育された。温度はその後＋42℃まで上げられ、そこでリプレッサーは不活性化され、さらに２時間保温された。誘導の前後に採られたサンプルは、29キロダルトンのポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体HP30-1:1:6を使用し、14％SDS-PAGEとイムノブロッティングにより分析された。イムノブロッティングで使用された３個の誘導クローン(pAL 30:1、３及び４)はすべて、誘導後に多量の組換えポリペプチドを発現した。非誘導細胞の懸濁液はごくわずかの29キロダルトン・ポリペプチドを含んでいるだけであった。クローンpAL30:1はこれ以降の分析のために選択された。このクローンが29キロダルトン・ポリペプチドをコードする遺伝子を本当に含んでいることを証明するために、このベクターに挿入されている断片の末端が配列決定された。発現ベクターに挿入された配列はクローン化されたPCR断片の予想配列に対応していた。実施例２：さまざまな培養条件における29キロダルトン・ポリペプチドの発現キネティクスヘリコバクター・ピロリの二つの菌株、すなわち、CCUG 17874（研究室株）及びHel 73（最近十二指腸潰瘍の患者より単離された。）が使用された。培養は、シクロデキストリンを添加した血液寒天プレート(blood agar plate)上及びブルセラ・ブロス(Brucella Broth)中で行われた。すべての培養物は、５％のO₂、10 ％CO₂及び85％N₂からなる微好気的環境で保温された。２、４及び７時間後バクテリアが集菌され、PBSで一度洗浄され、以下の分析のために-20℃で保管された。29キロダルトン表面ポリペプチドの発現は、以前大腸菌表面抗原の検出に使用された、このポリペプチドに対する特異的モノクローナル抗体を用いる阻害−EL ISA(ロペズ−ビダル及びスベナホルム、J．Clin．Microbiol．28， 1906-)により分析された。これらの抗体は、免疫電気泳動でも使用された。 CCUG17874が血液寒天プレート上及びブルセラ・ブロス中で７日間培養された場合、約70％のバクテリアが螺旋型から球状型へ変換した。この変換はHel 73細胞では３日後にすでに現れた。阻害−ELISAは、プレート及びブロス培養物の両方から得られたサンプルにおいて、７日間29キロダルトン・ポリペプチドの濃度がほぼ一定であることを示した。このポリペプチドの存在は、免疫電子顕微鏡にて確認された。29キロダルトン・ポリペプチドは、ヘリコバクター・ピロリの球状型においてよく保存されていることが見いだされた。29キロダルトン・ポリペプチドはCCUG17874よりもHel 73においてさらに豊富であることが見いだされた。実施例３：29キロダルトン・ポリペプチドに対する抗体の反応 29キロダルトン・ポリペプチドに対する抗体反応は、十二指腸潰瘍の患者(ｎ＝19)、無症候性ヘリコバクター・ピロリ保持者(ｎ＝18)及び非感染のほぼ同年齢の対照者(ｎ＝20)からの血清及び胃の吸引物において決定された。３種の被験者グループからの血清及び胃の吸引物中の29キロダルトン・ポリペプチドに対する抗体レベルはさまざまなＥＬＩＳＡ法により試験された。感染者の殆どは対照健常人に比較して、血清及び胃の吸引物の両方で、29キロダルトン・ポリペプチドに対する特異的抗体のレベルが有意に高かった。無症候性の保持者における抗体価は、症状のある患者の抗体価に匹敵した。実施例４：［³Ｈ］パルミテートによるポリペプチドの標識 29キロダルトン・ポリペプチドのアミノ酸配列はリポ蛋白質に典型的に起こり得るシグナルペプチドを含んでいたので、放射活性を有するパルミチン酸による蛋白質の標識が調べられた： pAL30:1を欠損するか又は保持する大腸菌N4830-1は50μ／mlのカルベンシリン（carbencillin）を添加されたLB−ブロスにおいて＋30℃で成育された。細胞密度10⁸バクテリア／mlにおいて、[³Ｈ]パルミチン酸（５mCi／ml；Dupont NEN，B oston，MA）が最終濃度50 Ci／mlになるように添加された。温度が＋42℃まで上げられ、培養物はさらに12時間保温された。細胞は遠心で集められ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ溶解緩衝液中で溶解された。電気泳動後、ゲルを Amplify（登録商標：アマーシャム社）に30分間浸し、セロファン・シート間で乾燥し、このゲルを −70℃で36時間Ｘ線フィルムに露光することにより間接撮影に付した。この結果は、29キロダルトン・ポリペプチドがリピド化され、ゆえに翻訳後に修飾されていることを示していた。実施例５：組換え29キロダルトン・ポリペプチドを発現する大腸菌のトリトンX-114による区分 pAL30:1を保持する大腸菌は、50μg／mlのカルベンシリンを添加したLB−ブロス中で＋30℃で成育された。細胞密度10⁸バクテリア／mlにおいて、温度が＋42 ℃まで上げられ、培養物はさらに３時間保温された。細胞は遠心（11,300×ｇ、 10分間、＋４℃）により集められ、細胞ペレット１グラム当り25mlのPBSに再懸濁された。この懸濁液は凍結され、室温で解凍され、25μlのDNAaseＩ（10μg／ μl）が添加された。サンプルは室温で30分間反転により緩やかに振られ、8−12 ℃に冷却され、その後トリトン X-114が添加された(最終濃度0.3％)。３時間＋４℃で緩やかに反転しながら保温した後、不溶性の物質は遠心（18,900×ｇ、10 分間、＋25℃）により集められた。各相はSDS-PAGEにより分析され、29キロダルトン・ポリペプチドの実体は、モノクローナル抗体HP30-1:1:6を使用するウェスタン・ブロッティングにより証明された。この結果は、29キロダルトン・ポリペプチドが界面活性化剤の相に現れることを示唆し、このものがリポ蛋白質であることが証明された。この分野では、膜蛋白質全体が通常は界面活性化剤の相に回収されることが知られている（ボーディアー(1981)J．Biol.Chem.，vol.256，1604-1607）。この実験は、大腸菌に挿入されたプラスミドが29キロダルトン・ポリペプチドを発現し製造し得ることも証明した。ヘリコバクター・ピロリはそれほど早く成育しないので、将来ワクチンを大きなスケールで製造する際にこのことは重要である。実施例６：ヘリコバクター・ピロリ29キロダルトン・ポリペプチドを高レベルで産生するための発現ベクターpS863の構築６.１．pS860の調製 29キロダルトン遺伝子の5'末端に便利な制限酵素部位を作るため、PCR増幅用のふたつの合成オリゴヌクレオチドが合成された。プラスミドpS852（実施例１. ７.に記載されたプラスミドpAL30：1と同一）がPCR増幅の鋳型として使用された。この二つのオリゴヌクレオチドの配列は以下に列挙される。 PCR増幅が行われ、169塩基対の増幅断片がＴＡベクター（メドら、（1991）Bi o／Technology 9,657-663）へライゲーションされた。構築されたプラスミドはp S860と表記された（図２）。構築物の配列はジデオキシ配列決定（Sanger et al.、（1977）Proc．Natl．Acad．Sci.USA 74，5463- 5467）により確認された。６.２．pS861の調製 29キロダルトン遺伝子の3'末端の制限酵素部位を変えるために、PCR増幅用の二つの合成オリゴヌクレオチドが合成された。プラスミドpS852（pAL30:1）はPC R増幅用の鋳型として使用された。二つのオリゴヌクレオチドの配列は以下に列挙される。 PCR増幅が実施され、増幅断片はXmaＩ及びBamHＩで切断され、357塩基対の断片が作られた。この断片はpUC19中でクローン化され、構築されたプラスミドはp S861(図２)と表記された。構築物の配列はジデオキシ配列決定（Sanger et al. 、(1977)Proc．Natl．Acad．Sci．USA74，5463-5467）により確認された。６.３．pS862の調製 29キロダルトン遺伝子の中央部をコードするｃＤＮＡは、プラスミドpS852（p AL30:1）から得る 280塩基対の NheＩ／XmaＩ断片としてゲル電気泳動により単離された。この断片は、pS861からの357塩基対のXmaＩ／BamHＩ断片及びpS861からの4061塩基対のNheＩ／BamHI断片と共にライゲーションされた。６.４．プラスミドpS863の調製その後、795塩基対のNdeＩ及びBamHI制限酵素断片がpS862から単離され、T7ベクターpS637(pET-3a)(Studier，F.W．et al.(1990)Method Enzymol．185，60-89 )からの４キロ塩基対のNdeＩ／BamHＩ断片にライゲーションされた。得られた発現ベクターはpS863と表記された(図２)。実施例７：組換えヘリコバクター・ピロリ29キロダルトンリポ蛋白質の精製７.１．宿主菌株及びバクテリア培養物発現ベクターpS863は以下の大腸菌宿主菌株へ形質転換された；BL21(DE3)；BL 21（DE3）pLysS；及びBL21（DE3）pLysE。発現の実験は、本質的にスツディアらに記載されたように（Method Enzymol．185，60-89，1990）実施された。バクテリアは、50μg／mlのカルベンシリンを含むLB培地(Ausubel，F.M．et al.,(eds. )Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons,New York，199 2）で成育された。加えて、BL21（DE3）pLysS及びBL21（DE3）pLysEが使用された場合、培地には30μg／mlのクロラムフェニコールが加えられた。T7発現システムの誘導のため培養物は約OD_6oo＝0.5の密度まで成育され、誘導用に0.4mMのI PTGが添加された。誘導約180分後この細胞は集められた。もっとも高い発現レベルを与える宿主菌株はBL21（DE3）pLysSであった。７.２．ヘリコバクター・ピロリ29キロダルトンリポ蛋白質の精製プラスミドpS863で形質転換されたBL21（DE3）pLysSの培養物は、上述のように成育され、細胞は遠心で集められ、冷緩衝液(50mMトリス−塩酸、２mM EDTA、 10mM NaCl、pH8.0）に再懸濁された。１グラムのペレット（湿重量）に35mlの緩衝液が加えられた。７.２.１．トリトン X-114抽出リポ蛋白質を抽出するため、トリトンX-114（TX-114）が最終濃度1.5％(v/v) となるように加えられ、懸濁液は０℃で１時間撹拌された。トリトン不溶性の物質は18,900×ｇで10分間の遠心によりペレットにされた。ある場合には、TX-114含有緩衝液の半分量を用いてペレットはさらに抽出された。二度目のTX-114抽出の後、このペレットは捨てられた。 TX-114抽出で得られた上清の相区分（phase partitioning）は、このものを＋ 30℃で15分間、時々混合しながら保温することにより得られた。濁った溶液は＋ 30℃で30分間31,300×ｇで遠心した。下の界面活性化剤の相が集められ、冷緩衝液（50mMトリス−塩酸、２mM EDTA、10mM NaCl、pH8.0）で１％TX-114に希釈された。７.２.２．Ｑ−セファロース、pH8.0 希釈されたTX-114相は、緩衝液（50mMトリス−塩酸、２mM EDTA、10mM NaCl、 0.1％トリトンX-100、pH8.0）で平衡化されたＱ−セファロース・カラム（ファルマシア社）（20ml/3g 細胞ペレット）に供与された。29キロダルトン・リポ蛋白質は、非結合画分として集められた。この画分は、溶液が濁るまで時々混合しながら＋30℃で保温することにより相区分された。二つの相は30℃で30分間、 31,300×ｇでの遠心により分離された。下の界面活性化剤の相が集められ、冷緩衝液（10mMトリス−塩酸、２mM EDTA、pH8.6）で1％TX-114に希釈された。７.２.３．Ｑ−セファロース、pH8.6 希釈されたTX-114−相は、緩衝液(10mMトリス−塩酸、２mM EDTA、pH8.6）で平衡化された100mlのＱ−セファロース・カラム（ファルマシア社）に供与された。非結合画分はTX-114を含んでいた。カラムは緩衝液Ａ(10mMトリス−塩酸、２mM EDTA、0.1％トリトンX-100、pH8.6)で洗浄された。29キロダルトンリポ蛋白質は、緩衝液Ｂ（10mMトリス−塩酸、２mM EDTA、0.1％トリトンX-100、１Ｍ NaCl、pH8.6）を用いる塩濃度勾配により集められた。勾配は以下の通りだった；０−50％Ｂ、40ml；50−100％Ｂ、100ml。29キロダルトンリポ蛋白質は60−7 0％Ｂの間に溶出された。７.２.４．SDS-PAGE及び蛋白質の電気ブロッティングさまざまな精製工程から得られた蛋白質サンプルはサンプル・バッファー（50 mMトリス−塩酸、pH6.8、８％グリセロール、1.6％SDS、４％β−メルカプトエタノール、0.02％ブロムフェノール・ブルー）に溶解され、ノバックス・プレキャスト勾配ゲル(Novax precast gradient gels：４−20％ポリアクリルアミド）又はバイオラド・プレキャスト勾配ゲル（10−20％ポリアクリルアミド）上で分離された。電気泳動ランニング・バッファーは、25mMトリス、192mMグリシン、0 .5％SDS、pH8.3を含んでいた。ゲルは40％メタノール、10％酢酸中の0.1％のクマシー・ブリリアント・ブルーR-250で染色され、10％メタノール、10％酢酸で脱色された。セミ・ドライ電気ブロッティング（Semi-Dry-electroblotting）用のゲルは染色されないが、転写用緩衝液(48mMトリス、38mMグリシン、0.075％ＳＤＳ、20％メタノール)に浸され、蛋白質は、セミ・ドライ電気ブロッティング装置（バイオラド社）により、PVDF膜（Immobilon：登録商標、ミリポア、USA）上に転写された。免疫検出は、初めにTBS(50mMトリス−塩酸、2.5Ｍ NaCl、pH8.2）中の２％ＢＳＡで１時間PVDF膜をブロックし、その後、この膜は、TBS中の１％BSAで１：10に希釈した、29キロダルトンリポ蛋白質に対する特異的なモノクローナル抗体(IgG1)と保温した。TBSによる洗浄工程の後、この膜は、アルカリ・フォスファターゼ−結合抗マウスIgG抗体（ダコパッツ社、デンマーク）と１時間保温した。さらに洗浄した後、この膜は適切な基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・リン酸（５−bromo−４−chloro−３−indolyl phosphate：BCIP）及びニトロブルー・テトラゾリウム (nitroblue tetrazolium：NBT(シグマ社：sigma))とともに展開した。７.２.５．蛋白質濃度及び発熱原性総蛋白質濃度は、ビシンコニニン酸法（bicinchoninic acid metnod：BCA Pro tein Assay．Pierce Chemical Company，USA）により決定された。エンドトキシンの濃度は、色素原性リムルス・アメーバー様細胞・ライゼート（Limulus amebocyte lysate :LAL）試験（LAL COAMATIC:登録商標、Endotoxin ．Endosafe Inc．USA）によりアッセイした。染色されたSDSゲルは、最終調製物の蛋白質不純物の相対量を決定するためにスキャニングされた(BioRad Imager GS-)。この調製物は、＜10％の蛋白質不純物を含んでいた。実施例８：ワクチンとして使用するためのヘリコバクター・ピロリ29キロダルトン蛋白質の分析８.１．材料と方法８.１.１．動物雌のSPF BALB/cは、ボンホルト・ブリーディング・センター（デンマーク）より購入した。これらは、水と食料が自由に供給される通常のマクロロン・ケージ (makrolon cage)で飼われた。この動物は、到着したときに4-6 週齢であった。８.１.２．感染最低１週間の順応期間の後、動物はヘリコバクター・ピロリのタイプ２株(菌株244、当初は十二指腸潰瘍の患者より単離された。）を感染された。この株はマウスの胃によいコロニー形成をすることが早くより判明していた。このバクテリアは、微好気的環境(10％CO₂、５％O₂)で＋37℃で10％の牛胎児血清を添加したブルセラ・ブロスで終夜成育された。この動物は、経口投与量のオペラゾール(400nmol／kg)が与えられ、３−５時間後、ヘリコバクター・ピロリが経口接種された（約10⁸cfu／動物）。感染は、接種２−３週間後、対照動物で調べられた。８.１.３．免疫感作動物は34日間（１日、15日、25日及び35日）に亙り４回免疫感作された。精製抗原は100μg／マウスの投与量、膜蛋白質（MP）は0.5mg／doseの投与量で与えられた。膜蛋白質は、バクテリアをPBSで超音波処理することにより調製した。細胞破片は、処理物を＋４℃、2000回転で５分間遠心することにより除去した。上清は、新しいチューブに移され、＋４℃、2000回転で20分間遠心した。ペレットは回収され、使用するまで−70℃で貯蔵した。アジュバントとして、動物は各々の免疫感作と共に10μg／マウスのコレラ・トキシン（CT）も与えられた。抗原の酸による退化を防ぐための方法として、免疫感作に３−５時間先立って、オペラゾール（400μmol／kg）が動物に経口的に与えられた。動物は最後の免疫感作から４週間後に殺された。８.１.４．受動的防御ヘリコバクター・ピロリがマウスの胃でコロニー形成する能力に対するモノクローナル抗体(MAb)の効果を分析するため、上述の接種の10分前にさまざまな特異性を有するMAbがヘリコバクター・ピロリと混合された。29キロダルトン蛋白質(HP30-1:1:6)、ウレアーゼ(Ure8:1)及び、大腸菌熱安定蛋白質(ST 1:3)に対する各ＭＡｂが使用された。実験で各MAbの等量が使用されるようにMAbが滴定された。マウス当り107のバクテリアが接種に使用された。マウスは接種２週間後に殺された。８.１.５．感染の分析マウスはCO₂と頚部脱臼により殺した。腹部が開かれ、胃が除去された。胃を大きな曲率に沿って切開した後、生理食塩水中で洗浄された。25mm²の面積の腔( antrum)及び本体(corpus)よりの粘膜が個別に外科用小刀でえぐられた。えぐられた粘膜はブルセラ・ブロスに懸濁され、ブラド・スキロ−(Blood Skirrow)プレートに置かれた。プレートは微好気的環境で３−５日間保温され、コロニーの数が計測された。ヘリコバクター・ピロリの同定は、ウレアーゼ及びカタラーゼ試験及び直接顕微鏡観察又はグラム染色により確かめられた。８.２．結果８.２.１．受動的防御それぞれ10匹の動物からなる３個のグループにヘリコバクター・ピロリ株244 とＭＡｂの混合液が与えられ、ひとつのグループはヘリコバクター・ピロリだけが与えられた。MAbとバクテリアの混合液は、マウスに接種する前に10分間反応させられた。使用されたMAbのうち、試験官内でバクテリアに明らかな効果を示したものはなかった。接種２週間後、マウスは殺され、各々のグループについて感染率が決定された(図３)。対照グループのすべてのマウス及びSTMAbを接種されたマウスは感染していた。ウレアーゼのMAbグループにおいて、すべてのマウスは感染していたが、しかし、その程度は対照に比べて有意に低かった。29キロダルトン蛋白質に対する抗体を接種したグループは、感染したマウスはいなかった。８.２.２．治療的免疫感作この研究における動物は、免疫感作の１月前にヘリコバクター・ピロリ株244 で感染された。10個のグループにおけるマウスは、コレラ・トキシン(ＣＴ)単独またはＣＴ及び膜蛋白質、ウレアーゼ又は29キロダルトン蛋白質のいずれかにより免疫感作された。対照動物には使薬(PBS)のみが与えられた。最後の免疫感作から１月後、動物は殺され、CFUが決定された（図４）。すべての対照動物は、CTだけで免疫感作された動物と同じように感染していた。ウレアーゼ及びCT、29キロダルトン蛋白質及びCTでアクティブに免疫感作した動物は、対照に比較してCFU値が有意に減少していた。ウレアーゼで免疫感作したグループ中１匹の動物のみが感染から完全に治癒していた。８.３．結論上記の結論は、29キロダルトン・ヘリコバクター・ピロリ蛋白質の構造に対するMAbの結合がコロニー形成を完全に阻害することより、29キロダルトン・ヘリコバクター・ピロリ蛋白質が感染におけるコロニー形成及び／又は感染の持続に重要であることを示している。さらに、コレラ・トキシンを経口アジュバントとして、経口免疫原としての29 キロダルトン・ヘリコバクター・ピロリ・蛋白質と組み合わせて使用した場合、動物モデルで使用されたヘリコバクター・ピロリのコロニー成を有意な程度減少することにつながる免疫応答の刺激剤として働く。併せて考えると、これらの結果は、ヒトのヘリコバクター・ピロリ感染を治療し、予防するための29キロダルトン・ヘリコバクター・ピロリ蛋白質の経口ワクチン製剤としての使用を強く支持する。微生物の寄託プラスミドpAE１は、ブダペスト条約の下、イギリス国スコットランド．アバディーンのNational Collections of Industrial and Mrine Bacteria（NCIMB）に寄託され、寄託番号NCIMB 40732が付された。寄託日は1995年５月16日である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．約29キロダルトンの分子量の、ヘリコバクター・ピロリの表面露出抗原と同一の又は実質的に類似のアミノ酸配列を有する組換えポリペプチド。２．アミノ酸配列が配列表の配列番号２又は配列番号４における位置１−260又は28−260と同一又は実質的に類似である、請求項１のポリペプチド。３．請求項１のポリペプチドの免疫原エピトープを含むことからなる少なくとも５アミノ酸の長さのペプチド。４．請求項１又は２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離核酸分子。５．(a) 配列表の配列番号１又は配列番号３における位置796−1572又は874−15 72と同一の又は実質的に類似のヌクレオチド配列を含むことからなる核酸分子； (b) (a)において定義された核酸分子のポリペプチド・コード領域に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むことからなり、請求項１若しくは２のポリペプチド又はその機能的に等価の修飾型をコードする核酸分子；及び (c) (a)又は(b)において定義されたヌクレオチド配列の遺伝的コードの結果としての縮重物（degenerate）である核酸配列を含むことからなり、請求項１若しくは２のポリペプチド又はその機能的に等価の修飾型をコードする核酸分子、から選択される単離核酸分子。６．請求項４又は５の核酸分子を含むことからなるベクター。７．プラスミド・ベクターpAE1（NCIMB 40732）である請求項６のベクター。８．請求項４又は５のDNA分子の発現を仲介し得る発現ベクターである請求項６のベクター。９．プラスミド・ベクターpS863である請求項８のベクター。 10．請求項６乃至９のいずれかひとつのベクターを含む宿主細胞。 11．29キロダルトンのヘリコバクター・ピロリの表面露出抗原が生産される条件下で請求項８又は９の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを回収することを含むことからなる、29キロダルトンのヘリコバクター・ピロリの表面露出抗原であるポリペプチドの生産方法。 12．治療に使用するための請求項１乃至３のいずれかひとつのポリペプチド又はペプチド。 13．ヘリコバクター・ピロリ感染の診断に使用するための請求項１乃至３のいずれかひとつのポリペプチド又はペプチド。 14．ワクチンとして使用するための請求項１乃至３のいずれかひとつのポリペプチド又はペプチド。 15．ヘリコバクター・ピロリ感染に対する防御免疫を誘導する能力を保持する請求項１乃至３のいずれかひとつのポリペプチド又は該ポリペプチドの修飾型の免疫学的の有効量と、好適にはこれに加えて薬理学的に許容される担体又は希釈剤を含むことからなるワクチン組成物。 16．ヘリコバクター・ピロリに感染したヒトを含む哺乳動物において治療用ワクチンとして使用される請求項15のワクチン組成物。 17．ヘリコバクター・ピロリによる感染からヒトを含む哺乳動物を防御する予防ワクチンとして使用するための請求項15のワクチン組成物。 18．ヘリコバクター・ピロリ感染に対する免疫防御を誘導する能力を保持する請求項１乃至３のいずれかひとつのポリペプチド又は該抗原の修飾型の、ヘリコバクター・ピロリ感染の治療、予防又は診断のための組成物の製造における使用。 19．ヘリコバクター・ピロリ感染に対する免疫防御を誘導する能力を保持する請求項１乃至３のいずれかひとつのポリペプチド又は該抗原の修飾型の、ヘリコバクター・ピロリ感染の診断キットの製造における使用。 20．ヘリコバクター・ピロリ感染に対する免疫防御を誘導する能力を保持する請求項１乃至３のいずれかひとつのポリペプチド又は該ポリペプチドの修飾型の、ヘリコバクター・ピロリに対する防御的免疫応答の誘導において使用するためのワクチンの製造における使用。 21．請求項15乃至17のいずれかひとつのワクチン組成物の免疫学的有効量を哺乳動物に投与する段階を含むことからなる、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する防御的免疫応答を哺乳動物に誘導する方法。 22．該哺乳動物がヒトである請求項21の方法。 23．好適には標識されるか固相支持体へ結合された、請求項１乃至３のいずれかひとつのポリペプチドが使用される工程を少なくとも一つ含むことからなる、ヘリコバクター・ピロリ感染の試験管内診断の方法。 24．(a) 好適には固相支持体へ結合された該ポリペプチドを哺乳動物より得た体液と接触させ、 (b) 該ポリペプチドに結合する該体液からの抗体を検出する、段階を含むことからなる請求項23の方法。 25．請求項23又は24の方法の実施を可能にする因子を含むことからなるヒトを含む哺乳動物におけるヘリコバクター・ピロリ感染の検出のための診断キット。