RU2195463C2 - Антиген helicobacter pylori и вакцинная композиция - Google Patents
Антиген helicobacter pylori и вакцинная композиция Download PDFInfo
- Publication number
- RU2195463C2 RU2195463C2 RU98100200/13A RU98100200A RU2195463C2 RU 2195463 C2 RU2195463 C2 RU 2195463C2 RU 98100200/13 A RU98100200/13 A RU 98100200/13A RU 98100200 A RU98100200 A RU 98100200A RU 2195463 C2 RU2195463 C2 RU 2195463C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- pylori
- kda
- helicobacter pylori
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 title claims abstract description 10
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 113
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 112
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 111
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 22
- 206010019375 Helicobacter infections Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 13
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 101710106459 29 kDa protein Proteins 0.000 description 11
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 11
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 10
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 7
- 241001590124 Helicobacter pylori 17874 Species 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 5
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-2-{[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfinyl}-1H-benzimidazole Chemical compound N=1C2=CC(OC)=CC=C2NC=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 101150044361 hpaA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 229960000381 omeprazole Drugs 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000233 Signal peptidase II Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710112984 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241001137307 Cyprinodon variegatus Species 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 241001473951 Helicobacter pylori NCTC 11638 Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 229920004011 Macrolon® Polymers 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010065764 Mucosal infection Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 101710090398 Viral interleukin-10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000476 body water Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 208000023652 chronic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000011906 peptic ulcer disease Diseases 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940126409 proton pump inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000000612 proton pump inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и касается рекомбинантного полипептида, представляющего собой поверхностно-проявляющийся антиген Helicobacter pylori с приблизительной молекулярной массой 29 кДа, и фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих указанный антиген. Рекомбинантный полипептид данного изобретения может быть использован для диагностики инфекций Helicobacter pylori, а также для изготовления вакцинных композиций, которые будут элисировать защитный иммунный ответ против указанной инфекции. 4 с. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил.
Description
Изобретение относится к рекомбинантным полипептидам, которые представляют собой антигены Helicobacter pylory; указанные антигены экспрессируются на поверхности как делящихся (бациллярных), так и покоящихся (коккоидных) форм Н. pylori, и вызывают как системное, так и местное (в слизистой оболочке) увеличение синтеза антител. Изобретение, кроме того, относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим вышеуказанные полипептиды, а также векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такие молекулы нуклеиновых кислот. Указанные рекомбинантные полипептиды полезны для диагностики инфекций, вызываемых Н. pylori, и для изготовления вакциннных композиций, которые будут вызывать (элисировать) защитный иммунный ответ против таких инфекций, вышеуказанные вакциннные композиции подходят как для терапевтического, так и для профилактического применения.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Грамотрицательная бактерия Helicobacter pylori является важным патогенным микроорганизмом человека, вовлеченным в несколько гастродуоденальных заболеваний. Колонизация этой бактерией эпителиальной ткани желудка ведет к активному воспалению и к прогрессирующему хроническому гастриту со значительно увеличенным риском развития пептической язвенной болезни.
Грамотрицательная бактерия Helicobacter pylori является важным патогенным микроорганизмом человека, вовлеченным в несколько гастродуоденальных заболеваний. Колонизация этой бактерией эпителиальной ткани желудка ведет к активному воспалению и к прогрессирующему хроническому гастриту со значительно увеличенным риском развития пептической язвенной болезни.
Для того, чтобы колонизировать слизистую оболочку желудка, бактерии Н. pylori используют ряд факторов вирулентности. Такие факторы вирулентности включают в себя несколько адгезинов, с помощью которых бактерия соединяется со слизью и/или связывается с эпителиальными клетками; уреазы, которые помогают нейтрализовать кислотную среду; и протеолитические ферменты, которые делают слизь более жидкой.
Несмотря на очевидный сильный иммунный ответ организма-хозяина на Н. pylori, который сопровождается синтезом как местных (в слизистой оболочке), так и системных антител, патоген сохраняется в слизистой оболочке желудка, обычно в продолжении жизни хозяина. Причина этого, вероятно, заключается в том, что спонтанно индуцированный иммунный ответ либо неадекватен, либо направлен против неправильных эпитопов антигена.
Для того, чтобы понять патогенез и иммунологию инфекций, вызываемых Н. pylori, очень важно определить антигенную структуру этих бактерий. Это необходимо, в частности, для характеристики поверхностно-проявляющихся (подобно адгезинам) и секретирующихся белков, которые у многих бактериальных патогенов, как было ранее показано, составляют основные факторы вирулентности, и которые могут быть полезны для диагностики инфекций Н.pylori и для изготовления вакцинных композиций.
Известно (Evans et al. (1993) J.Bacteriol. 175, 674-683) клонирование гена hpaА, который кодирует 20 кДа рецептор-связывающуюся субединицу N-ацетилнейроаминиллактозо-связывающегося фибриллярного гемагглютинина (NLBH) Н.pylori.
Известны (Bolin et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33, 381-384) моноклональные антитела (MAbs) против мембранных препаратов Н.pylori. Одно из этих моноклональных антител, обозначенное НР30-1:1:6, реагирует с белком 30 кДа, который, как было показано, проявляется на поверхности неповрежденых бактерий и имеет свойства, аналогичные свойствам адгезина.
В стрессовых состояниях или в условиях, угрожающих ее существованию, клетка Н. pylori переходит из бациллярной в коккоидную форму. В коккоидной форме клетка Н. pylori намного менее чувствительна к антибиотикам и другим антибактериальным агентам. Косвенные данные указывают на то, что бактерии Н. pylori могут переноситься между индивидуумами в этой форме, возможно через воду или при прямом контакте. Таким образом, эффективная вакцинная композиция должна вызывать иммунный ответ как на коккоидную, так и на бациллярную формы Н.pylori. Так как системный иммунитет играет, вероятно, только ограниченную роль в защите против инфекций слизистой оболочки, важно также, чтобы вакцинная композиция усиливала защитные иммунные механизмы локально в желудке.
ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача изобретения заключается в получении антигенного полипептида Н. pylori, который может быть полезным среди прочего для того, чтобы вызывать защитный иммунный ответ против инфекции Н.pylori, и для ее диагностики. Эта задача была решена рекомбинантным клонированием гена Н.pylori, который кодирует проявляющийся на поверхности белок. Нуклеотидная последовательность этого гена похожа на известную (Evans et al. (1993), Journal of Bacteriology, vol. 175, 674-683) последовательность гена hpaA. Однако в то время как ген hpaA, как было показано, кодирует белок 20 кДа, в данном случае неожиданно было обнаружено, что молекула ДНК по изобретению кодирует полипептид с молекулярной массой 29 кДа.
Задача изобретения заключается в получении антигенного полипептида Н. pylori, который может быть полезным среди прочего для того, чтобы вызывать защитный иммунный ответ против инфекции Н.pylori, и для ее диагностики. Эта задача была решена рекомбинантным клонированием гена Н.pylori, который кодирует проявляющийся на поверхности белок. Нуклеотидная последовательность этого гена похожа на известную (Evans et al. (1993), Journal of Bacteriology, vol. 175, 674-683) последовательность гена hpaA. Однако в то время как ген hpaA, как было показано, кодирует белок 20 кДа, в данном случае неожиданно было обнаружено, что молекула ДНК по изобретению кодирует полипептид с молекулярной массой 29 кДа.
Полипептид 29 кДа, как было показано, является антигенным белком, который экспрессируется во всех штаммах Н.pylori, a также в коккоидных формах этой бактерии, и который способен индуцировать в организме-хозяине иммунный ответ как в слизистой оболочке, так и системный иммунный ответ, измеряемый как продукция антител. Этот полипептид 29 кДа экспрессируется всеми проверенными штаммами Н. pylori, и антитела, полученные к этому белку, не дают перекрестной реакции с распространенными эндогенными бактериями человека других видов или с отобранными тканями человека, включая слизистую оболочку желудка. Таким образом, будучи существенным, высоко консервативным адгезином с иммуногенными свойствами, полипептид 29 кДа будет полезен как для обнаружения инфекций Н.pylori, так и для изготовления вакцинных композиций, которые в виде соответствующего фармацевтического препарата будут вызывать защитный или терапевтический иммунный ответ против таких инфекций.
Приведенные ниже экспериментальные данные указывают на то, что белок 29 кДа Н. pylori важен для колонизации Н.pylori и/или сохранения инфекции, так как связывание моноклонального антитела для белка 29 кДа приводит к полному ингибированию колонизации Н.pylori у мышей. Кроме того, белок 29 кДа Н.pylori при использовании в качестве орального иммуногена действует как стимулятор иммунного ответа, приводящий к существенному уменьшению колонизации Н. pylori у мышей, которые были инфицированы Н.pylori за месяц до иммунизации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
фиг. 1: Рестрикционная карта плазмиды pAEI, содержащей фрагмент ДНК Н. pylori размером 1,7 тпн, кодирующий полипептид 29 кДа. Заштрихованный прямоугольник указывает положение структурного гена. Расположение Т3 и Т7 промоторных последовательностей показано над черными прямоугольниками, обозначающими вектор.
фиг. 1: Рестрикционная карта плазмиды pAEI, содержащей фрагмент ДНК Н. pylori размером 1,7 тпн, кодирующий полипептид 29 кДа. Заштрихованный прямоугольник указывает положение структурного гена. Расположение Т3 и Т7 промоторных последовательностей показано над черными прямоугольниками, обозначающими вектор.
фиг.2 (а,b,с,d). Карты плазмид pS860, pS861, pS862 и pS863. Черные стрелки: промотор lac-оперона (Plac) или промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Т7 промотор). Закрашенные серым цветом участки: 5'-конец или 3'-конец гена, кодирующего белок 29 кДа, полученные при помощи ПЦР. Терминатор: терминатор Т7-транскрипции. Ori: ориджин репликации плазмиды pBR322.
фиг. 3: Влияние моноклональных антител на колонизацию Н.pylori у мышей линии BALB/c.
фиг. 4: Терапевтическая оральная иммунизация инфицированных Н.pylori мышей линии BALB/c.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В тексте данного описания, в частности в приведенных ниже примерах, под терминами "стандартные протоколы" и "стандартные процедуры" при их использовании в контексте методов молекулярного клонирования, понимаются те протоколы и процедуры, которые можно найти в любом традиционном лабораторном руководстве (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
В тексте данного описания, в частности в приведенных ниже примерах, под терминами "стандартные протоколы" и "стандартные процедуры" при их использовании в контексте методов молекулярного клонирования, понимаются те протоколы и процедуры, которые можно найти в любом традиционном лабораторном руководстве (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, Т. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
В первом важном аспекте данного изобретения предлагается рекомбинантный полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную или по существу схожую с поверхностно-проявляющимся антигеном Helicobacter pylori с молекулярной массой примерно 29 кДа.
Указанный поверхностно-проявляющийся антиген по изобретению обладает, среди прочих, следующими важными свойствами:
- он является адгезином, который важен для колонизации слизистой оболочки желудка;
- он экспрессируется на поверхности как делящихся (бациллярных), так и покоящихся (коккоидных) форм Н.pylori;
- он является сильным антигеном, вызывающим увеличение как системной, так и местной (в слизистой оболочке) продукции антител;
- он сохраняется во всех проверенных штаммах Н.pylori;
- антитела к полипептиду 29 кДа не дают перекрестной реакции с целым рядом различных бактерий, не принадлежащих к роду Helicobacter, или с отобранными тканями человека, включая слизистую оболочку желудка;
- полипептид 29 кДа является липидизированным и, следовательно, пост-трансляционно модифицированным полипептидом. Эта особенность полипептида может иметь значение для его иммуногенности и для его надлежащего проявления на поверхности Н. pylori. Из уровня техники известно, что липидная модификация может быть существенной для иммунологических свойств бактериальных липопротеинов (Weis, J.J. et al. (1994) Infection и Immunity, vol. 62, 4632-4636);
- он является предполагаемым фактором вирулентности, в результате чего под термином "фактор вирулентности" должна подразумеваться молекула, специфически вовлеченная в прилипание Н.pylori к эпителиальной поверхности слизистой оболочки желудка и/или в установление и поддержание инфекции, вызываемой Н.pylori.
- он является адгезином, который важен для колонизации слизистой оболочки желудка;
- он экспрессируется на поверхности как делящихся (бациллярных), так и покоящихся (коккоидных) форм Н.pylori;
- он является сильным антигеном, вызывающим увеличение как системной, так и местной (в слизистой оболочке) продукции антител;
- он сохраняется во всех проверенных штаммах Н.pylori;
- антитела к полипептиду 29 кДа не дают перекрестной реакции с целым рядом различных бактерий, не принадлежащих к роду Helicobacter, или с отобранными тканями человека, включая слизистую оболочку желудка;
- полипептид 29 кДа является липидизированным и, следовательно, пост-трансляционно модифицированным полипептидом. Эта особенность полипептида может иметь значение для его иммуногенности и для его надлежащего проявления на поверхности Н. pylori. Из уровня техники известно, что липидная модификация может быть существенной для иммунологических свойств бактериальных липопротеинов (Weis, J.J. et al. (1994) Infection и Immunity, vol. 62, 4632-4636);
- он является предполагаемым фактором вирулентности, в результате чего под термином "фактор вирулентности" должна подразумеваться молекула, специфически вовлеченная в прилипание Н.pylori к эпителиальной поверхности слизистой оболочки желудка и/или в установление и поддержание инфекции, вызываемой Н.pylori.
В предпочтительной форме указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность, соответствующую положениям аминокислот 1-260, или 28-260 в последовательностях SEQ ID NO: 2 или 4, указанных в Списке последовательностей. Как описано далее в экспериментальном разделе, предполагается, что положения 1-260 в SEQ ID NO:2 и 4 представляют нерасщепленный белок, в то время как положения 1-27 представляют сигнальную последовательность, а положения 28-260 представляют зрелый полипептид. Единственное различие между SEQ ID NO:2 и 4 заключается в том, что SEQ ID NO:2 имеет Ser-остаток в положении 222, в то время как SEQ ID NO:4 имеет в том же самом положении Аrg-остаток.
Однако полипептид по изобретению не должен строго ограничиваться полипептидом с аминокислотной последовательностью, идентичной с вышеупомянутыми положениями аминокислот в SEQ ID NO:2 или 4 из Списка последовательностей. Скорее изобретение охватывает полипептиды, имеющие модификации типа замен, маленьких делеций, вставок или инверсий, но которые тем не менее обладают по существу свойствами полипептида 29 кДа по изобретению. Такие свойства включают в себя способность вызывать иммунный ответ в слизистой оболочке, а также системный иммунный ответ против Н.pylori у млекопитающего-хозяина; способность действовать как адгезин; присутствие полипептида как в бациллярных, так и коккоидных формах Н.pylori.
Следовательно, изобретение охватывает полипептиды, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности, показанной в положениях 1-260, или в положениях 28-260 в SEQ ID NO:2 или 4 в Списке последовательностей, которые тем не менее обладают по существу биологическими активностями полипептида 29 кДа по изобретению.
Изобретение охватывает также пептиды с длиной по меньшей мере 5 аминокислот, которые содержат иммуногенный эпитоп полипептида 29 кДа по изобретению и сохраняют способность вызывать в хозяине-млекопитающем иммунный ответ против бактерии Н. pylori. Такой эпитоп (эпитопы) может быть представлен один или в виде слитых белков, где эпитоп слит с инертным или иммунологически активным полипептидом-носителем. Идентификация этих эпитопов может быть основана на присутствии синтезируемых хозяином антител к различным сегментам полипептида 29 кДа.
Один из способов получения структурной информации относительно эпитопов полипептида 29 кДа заключается в продуцировании и характеристике моноклональных антител, связывающихся с полипептидом, с последующим картированием эпитопов, например, при помощи метода Pepscan. Моноклональные антитела могут быть получены стандартными методами (De St. Groth (1980) J. Immunol. Methods, vol. 35, 1-21).
В другом аспекте изобретения предлагается выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, как он определен выше. В предпочтительной форме изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, идентичную последовательностям SQE ID NO:1 или 3 из Списка последовательностей. Однако молекула ДНК по изобретению не должна быть строго ограничена последовательностью, показанной как SEQ ID NO:1 или 3. Изобретение скорее охватывает молекулы ДНК, имеющие модификации типа замен, небольших делеций, вставок или инверсий, которые тем не менее кодируют полипептиды, обладающие по существу биохимической активностью полипептида 29 кДа по изобретению. Специалистам в данной области известно, что замены оснований А на G и Т на С, которые не влияют на аминокислотную последовательность, не являются необычными в Н. pylori. Единственное различие между SEQ ID NO:1 и 3 заключается в том, что SEQ ID NO: 1 имеет в положении 1458 остаток А, в то время как SEQ ID NO:3 имеет в том же самом положении остаток С.
В данное изобретение включаются также молекулы ДНК, нуклеотидные последовательности которых из-за генетического кода являются вырожденными относительно нуклеотидных последовательностей, обозначенных как SEQ ID NO:1 или 3. Так как имеется 64 возможных кодона, но только 20 природных аминокислот, большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном. Это естественная "вырожденность" или "избыточность" генетического кода, хорошо известна специалистам в данной области. Таким образом, должно быть очевидно, что последовательность ДНК, показанная в Списке последовательностей, является только одним примером из большой, но определенной группы последовательностей ДНК, которые будут кодировать описанный выше полипептид.
Следовательно, данное изобретение включает в себя выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из:
(а) молекул нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидную последовательность, которая идентична или существенно схожа с положениями 796-1572 в SEQ ID NO:1 или 3 в Списке последовательностей соответственно;
(б) молекул нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с нуклеотидной последовательностью, комплементарной кодирующей полипептид области молекулы ДНК, как она определена в (а), которая кодирует полипептид по изобретению, или его функционально эквивалентную модифицированною форму; и
(в) молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, которая является вырожденной как результат генетического кода относительно нуклеотидной последовательности, как она определена в (а) или (б), и которая кодирует полипептид по изобретению, или его функционально эквивалентную модифицированную форму.
(а) молекул нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидную последовательность, которая идентична или существенно схожа с положениями 796-1572 в SEQ ID NO:1 или 3 в Списке последовательностей соответственно;
(б) молекул нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с нуклеотидной последовательностью, комплементарной кодирующей полипептид области молекулы ДНК, как она определена в (а), которая кодирует полипептид по изобретению, или его функционально эквивалентную модифицированною форму; и
(в) молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, которая является вырожденной как результат генетического кода относительно нуклеотидной последовательности, как она определена в (а) или (б), и которая кодирует полипептид по изобретению, или его функционально эквивалентную модифицированную форму.
Еще один аспект изобретения составляет вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению. Такой вектор может предпочтительно быть плазмидным вектором рАЕ1 (депонирован согласно Будапештскому Соглашению под регистрационным номером NCIMB 40732).
Вектор по изобретению также может быть реплицирующимся вектором экспрессии, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению и способен обеспечивать ее экспрессию. В настоящем контексте термин "реплицирующийся" означает, что вектор способен к репликации в том типе клеток-хозяев, в которые он был введен. Примерами векторов являются вирусы, например бактериофаги, космиды, плазмиды и другие рекомбинационные векторы. Молекулы нуклеиновой кислоты встраиваются в геномы векторов при помощи стандартных методов, известных специалистам. Вектор экспрессии согласно изобретению предпочтительно может быть любым из векторов pAL30:l, pAL30:2, pAL30: 3, pAL30:4 или, более предпочтительно, вектором рS863.
В изобретение входит также клетка-хозяин, наследующая вектор по изобретению. Такой клеткой-хозяином может быть прокариотическая клетка, одноклеточный эукариотический организм или клетка, полученная из многоклеточного организма. Таким образом, клеткой-хозяином может быть, например, бактериальная клетка, такая как клетка E.coli; дрожжевая клетка, например клетка Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris, или клетка млекопитающих. Методы, используемые для эффективного введения вектора в клетку-хозяина, являются стандартными методами, хорошо известными специалистам, знакомым с методами рекомбинантной ДНК.
В другом аспекте изобретения предлагается способ получения полипептида, как определено выше, при котором клетку-хозяина, транформированную вектором экспрессии, как определено выше, культивируют в условиях, при которых продуцируется указанный полипептид, и выделяют указанный полипептид.
Среда, используемая для выращивания клеток, может быть любой традиционной средой, подходящей для данных целей. Подходящим вектором может быть любой из векторов, описанных выше, и соответствующей клеткой-хозяином может быть любая из типов клеток, перечисленных выше. Методы, используемые для конструирования вектора и эффективного его введения в клетку-хозяина, могут быть любыми методами, используемыми для этих целей, известными в области рекомбинантной ДНК. Рекомбинантный полипептид, экспрессируемый такими клетками, может быть секретируемым полипептидом, то есть экспортируемым через клеточную мембрану, в зависимости от типа клетки и строения вектора.
Если полипептид продуцируется внутриклеточно рекомбинантной клеткой-хозяином, то есть не секретируется клеткой, он может быть выделен стандартными методами, включающими в себя разрушение клетки механическими средствами, например с помощью разрушения ультразвуком или гомогенизации, или ферментативными или химическими средствами с последующей очисткой полипептида. Чтобы полипептид был секретируемым, последовательности ДНК, кодирующей полипептид, должна предшествовать последовательность, кодирующая сигнальный пептид, присутствие которого гарантирует секрецию полипептида из клетки таким образом, чтобы по меньшей мере существенная доля экспрессируемого полипептида секретировалась в культуральную среду и затем могла быть выделена в чистом виде.
Дальнейший аспект изобретения составляет полипептид по изобретению для использования в терапии, для использования в диагностике инфекции Helicobacter pylori у млекопитающих, включая человека, и для использования в качестве терапевтической или профилактической вакцины.
Другой важный аспект изобретения составляет вакцинная композиция для индуцирования защитного иммунного ответа у млекопитающих, включая людей, против бациллярной и/или коккоидной формы Helicobacter pylori. Такая вакцинная композиция содержит иммуногенно эффективное количество полипептида, как определено выше, включая по меньшей мере часть полипептида 29 кДа, содержащую иммуногенный эпитоп, или модифицированной формы указанного полипептида, которая сохраняет способность индуцировать защитный иммунитет против инфекции Helicobacter pylori. Термин "модифицированная форма" включает в себя, но не ограничен ими, такие формы полипептида, которые являются посттрансляционно модифицированными, например липидизированными. Полагается, что белок 29 кДа является липидизированным, см. Пример 4 ниже.
Оптимально вакцинная композиция содержит также фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, или другие иммунологически активные антигены для профилактического или терапевтического применения. Физиологически приемлемые носители и разбавители хорошо известны специалистам в данной области и включают в себя, например, забуференный фосфатом солевой раствор (PBS), или, в случае оральных вакцин, препараты на основе НСО3 - или порошковые препараты с энтеросолюбильным покрытием.
Вакцинная композиция может дополнительно включать в себя или вводиться совместно с ингибиторами кислой секреции, предпочтительно с ингибиторами протонного насоса (PPIs), например с омепразолом. Вакцина может быть изготовлена в виде препарата в известных системах доставки, например в липосомах, ISCOMs (иммуностимулирующие комплексы), коклеаты и т.д. (Rabinovich et al. (1994) Science 265, 1401-1404), или может быть присоединена или включена в полимерные микросферы разлагаемой или неразлагаемой природы. Антигены могут быть ассоциированы с живыми аттенуированными бактериями, вирусами или фагами или с убитыми векторами того же рода.
Как будет показано ниже в экспериментальной части, вакцинная композиция по изобретению может использоваться как для терапевтических, так и для профилактических целей. Вакцинная композиция по изобретению предпочтительно вводится в любую слизистую оболочку млекопитающих, например слизистую оболочку рта, носа, небной миндалины, желудка, кишечника (толстой и тонкой кишки), прямой кишки или влагалища. Вакцины для слизистой оболочки можно вводить вместе с соответствующими этой цели адъювантами. Вакцину можно также вводить парентерально, подкожно, внутрикожно или внутримышечно, возможно вместе с соответствующим адъювантом.
Альтернативный подход к созданию иммунного ответа против полипептида 29 кДа заключается в использовании метода, известного как "вакцинация нуклеиновой кислотой" или вакцинация "голой ДНК". Из уровня техники известно (Rabinovich et al. (1994) Science 265, 1401-1404), что инъекция в мышцу плазмидной ДНК, кодирующей интересующий антиген, может приводить к длительной экспрессии антигена и к генерированию иммунного ответа. Возможно несколько путей введения, таких как парентеральный, в слизистую оболочку или при помощи "генетического ружья", которое стреляет крошечными количествами золотых шариков, покрытых ДНК (Fynan et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 11478-11482).
Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может экспрессироваться в плазмиде, содержащей подходящий эукариотический промотор. Затем эта "голая ДНК" может быть инъецирована внутримышечно или введена внутрикожно при помощи "генетического ружья". Эпитопы экспрессируемого белка будут экспрессироваться молекулами МНС (главного комплекса гистосовместимости) на поверхности клеток и стимулировать иммунный ответ. Дальнейшими аспектами данного изобретения, следовательно, являются молекулы нуклеиновой кислоты и векторы, как описано в предыдущих параграфах, для применения в терапии, в особенности для использования в качестве вакцины. Дальнейшими аспектами изобретения также является применение таких молекул нуклеиновой кислоты и векторов в изготовлении композиций для лечения, профилактики или диагностики инфекций, вызываемых Helicobacter pylori.
Еще один аспект изобретения составляет применение полипептида, как определено выше, или модифицированной формы указанного полипептида, которая сохраняет способность индуцировать защитный иммунитет против инфекции Helicobacter pylori, в изготовлении композиций для лечения, профилактики или диагностики инфекции Helicobacter pylori. Такие композиции включают в себя, в частности, вакцинную композицию, вызывающую защитный иммунный ответ против бациллярной и/или коккоидной форм Helicobacter pylori. В изобретение входит также указанное применение в изготовлении диагностического набора для диагностики инфекции Helicobacter pylori. Такой диагностический набор описан ниже.
В еще одном аспекте изобретения предлагается способ получения и млекопитающих, включая человека, защитного иммунного ответа против инфекции Helicobacter pylori, причем указанный способ включает в себя стадию воздействия на указанного млекопитающего иммунологически эффективным количеством вакцинной композиции, как определено выше. Термин "иммунологически эффективное количество" предназначен для обозначения такого количества, которое вызывает существенный защитный ответ против Helicobacter pylori, который уничтожит инфекцию Н.pylori у инфицированного млекопитающего или предотвратит инфицирование восприимчивого млекопитающего. Обычно иммунологически эффективное количество составляет приблизительно от 1 мкг до 100 мг, предпочтительно приблизительно от 10 мкг до 10 мг, антигена Н.pylori для перорального введения, или приблизительно менее 100 мкг для парентерального введения.
Другой аспект изобретения составляет способ диагностики инфекции Helicobacter pylori in vitro, включающий в себя по меньшей мере одну стадию, на которой используют полипептид, как определено выше, содержащий часть полипептида 29 кДа, причем эта часть содержит иммуногенный эпитоп. Полипептид может быть возможно маркирован и/или пришит к твердой подложке. Способ диагностики может, например, включать в себя стадии (а) контактирования указанного полипептида, возможно связанного с твердой подложкой, с водой организма, взятой у млекопитающего; и (б) обнаружения антител в указаний воде, связавшихся с указанным полипептидом. Предпочтительными методами обнаружения антител являются методы ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), хорошо известные из уровня техники.
В еще одном аспекте изобретения предлагается диагностический набор для обнаружения инфекции Helicobacter pylori у млекопитающих, включая человека, содержащий компоненты, которые дают возможность выполнить диагностический метод таким образом, как он проиллюстрирован выше.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Клонирование и экспрессия полипептида 29 кДа из Н.pylori
1.1. Бактериальные штаммы, векторы и условия роста
Н. pylori CCUG 17874 (= NTCC 11637) выращивали на чашках с агаром с лошадиной кровью в микроаэрофильной атмосфере. В экспериментах по клонированию в качестве штаммов-хозяев использовали штаммы E.coli XLl-Blue MRF' и XLOLR (Stratagene, La Jolla, California), которые выращивали в питательной среде Luria-Bertani (LB) или в NZY среде с добавлением 0,2% мальтозы и 10 мМ MgSO4 при использовании для лямбда инфекции. Лямбда вектор экспрессии ZAP ExpressTM и его фагмидное производное pBK-CMV были получены от фирмы Stratagene.
ПРИМЕР 1: Клонирование и экспрессия полипептида 29 кДа из Н.pylori
1.1. Бактериальные штаммы, векторы и условия роста
Н. pylori CCUG 17874 (= NTCC 11637) выращивали на чашках с агаром с лошадиной кровью в микроаэрофильной атмосфере. В экспериментах по клонированию в качестве штаммов-хозяев использовали штаммы E.coli XLl-Blue MRF' и XLOLR (Stratagene, La Jolla, California), которые выращивали в питательной среде Luria-Bertani (LB) или в NZY среде с добавлением 0,2% мальтозы и 10 мМ MgSO4 при использовании для лямбда инфекции. Лямбда вектор экспрессии ZAP ExpressTM и его фагмидное производное pBK-CMV были получены от фирмы Stratagene.
1.2. Методы работы с ДНК
Хромосомную ДНК из Н.pylori 17874 получали путем суспендирования бактерий с чашек, которые предварительно инкубировали в течение 48 часов, в буфере, содержащем 50 мМ трис-Cl, рН 8,0, 25% сахарозы, 50 мМ ЭДТА, содержащем 10 мг/мл лизоцима и 5 нг/мл РНКазы без примеси ДНКаз (Boehringer Mannheim Scandinavia АВ, Bromma, Sweden). Суспензию инкубировали в течение 10 мин при 37oС. Затем добавляли равный объем лизирующего буфера (0,4% тритон-Х100 в 50 мМ трис-Cl, рН 8,0 и 62,5 мМ ЭДТА) и суспензию инкубировали при комнатной температуре до появления заметного лизиса бактерий. После этого суспензию трижды экстрагировали соответственно забуференным фенолом (рН 8,0), смесью фенол/хлороформ и хлороформом соответственно. ДНК осаждали из водной фазы и растворяли в ТЕ-буфере (10 мМ трис-Cl, рН 8,0 и 1 мМ ЭДТА).
Хромосомную ДНК из Н.pylori 17874 получали путем суспендирования бактерий с чашек, которые предварительно инкубировали в течение 48 часов, в буфере, содержащем 50 мМ трис-Cl, рН 8,0, 25% сахарозы, 50 мМ ЭДТА, содержащем 10 мг/мл лизоцима и 5 нг/мл РНКазы без примеси ДНКаз (Boehringer Mannheim Scandinavia АВ, Bromma, Sweden). Суспензию инкубировали в течение 10 мин при 37oС. Затем добавляли равный объем лизирующего буфера (0,4% тритон-Х100 в 50 мМ трис-Cl, рН 8,0 и 62,5 мМ ЭДТА) и суспензию инкубировали при комнатной температуре до появления заметного лизиса бактерий. После этого суспензию трижды экстрагировали соответственно забуференным фенолом (рН 8,0), смесью фенол/хлороформ и хлороформом соответственно. ДНК осаждали из водной фазы и растворяли в ТЕ-буфере (10 мМ трис-Cl, рН 8,0 и 1 мМ ЭДТА).
Рестрикционные ферменты были получены от фирмы Boehringer Mannheim Scandinavia АВ и использовались согласно инструкциям изготовителей. Плазмиды и ДНК фага лямбда очищали с использованием наборов Wizard (Promega, Madison, Wisconsin). Секвенирование проводили с использованием набора Sequenase 2,0 (Amersham Sweden AB, Solna, Sweden). Олигонуклеотиды были приобретены у фирмы Innovagen, Lund, Sweden. ПЦР проводили с использованием Tag ДНК-полимеразы (Boehringer-Mannheim Scandinavia AB).
1.3. Конструирование геномной библиотеки Н.pylori
Фрагменты хромосомной ДНК размерам 2-12 тпн очищали из препарата, полученного в результате неполного расщепления ДНК Н.pylori 17874 рестриктазой Sau3A, и клонировали в обработанном рестриктазой BamHI векторе ZAP ExpressТМ, как описано в протоколе фирмы Stratagene. После паковки in vitro полученную библиотеку титровали инфицирующим штаммом XL-1 Blue MRF и высевали клетки на индикаторные чашки, содержащие изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal). Титр библиотеки был равен 1,2•106 бляшкообразующих единиц/мл с 85% рекомбинантов.
Фрагменты хромосомной ДНК размерам 2-12 тпн очищали из препарата, полученного в результате неполного расщепления ДНК Н.pylori 17874 рестриктазой Sau3A, и клонировали в обработанном рестриктазой BamHI векторе ZAP ExpressТМ, как описано в протоколе фирмы Stratagene. После паковки in vitro полученную библиотеку титровали инфицирующим штаммом XL-1 Blue MRF и высевали клетки на индикаторные чашки, содержащие изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal). Титр библиотеки был равен 1,2•106 бляшкообразующих единиц/мл с 85% рекомбинантов.
Бляшки, экспрессирующие полипептид 29 кДа, выявляли при помощи иммунологического скриннинга, используя моноклональные антитела НР30-1:1:6 (Bolin et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33, 381-384) по стандартным методикам. Позитивные бляшки изолировали и повторяли посев и скрининг с использованием моноклональных антител до получения чистых бляшек. Превращение в фагмидную форму ZAP Express клонов проводили согласно ExAssist протоколу фирмы Stratagene.
1.4. Иммуноблотинг и дот-блоттинг
Ночные культуры Е.coli XLOLR, содержащей плазмиды с клонированными вставками ДНК Н.pylori 17874, изображенные на фиг.1, разбавляли в 100 раз в 5 мл LB-среды, содержащей 50 мг/мл канамицина. Культуры инкубировали при 37oС до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигала значения, равного 0,7. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и бактерии выращивали дополнительно в течение двух часов. Культуры без IPTG выращивали аналогичным образом. Культуры центрифугировали и ресуспендировали в 1/10 объема. 10 мкл ресуспензировали в 1/10 объема. 10 мкл суспензии смешивали с равным объемом 2х буфера для образцов, кипятили и анализировали методом SDS-PAGE (электрофорез с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле). Штамм XLOLR, выращенный аналогично, но в среде без канамицина, служил в качестве негативного контроля. Суспензию бактерий Н.pylori 17874 в PBS (OD при 600 нм = 1,0) использовали как позитивный контроль.
Ночные культуры Е.coli XLOLR, содержащей плазмиды с клонированными вставками ДНК Н.pylori 17874, изображенные на фиг.1, разбавляли в 100 раз в 5 мл LB-среды, содержащей 50 мг/мл канамицина. Культуры инкубировали при 37oС до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигала значения, равного 0,7. Затем добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и бактерии выращивали дополнительно в течение двух часов. Культуры без IPTG выращивали аналогичным образом. Культуры центрифугировали и ресуспендировали в 1/10 объема. 10 мкл ресуспензировали в 1/10 объема. 10 мкл суспензии смешивали с равным объемом 2х буфера для образцов, кипятили и анализировали методом SDS-PAGE (электрофорез с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле). Штамм XLOLR, выращенный аналогично, но в среде без канамицина, служил в качестве негативного контроля. Суспензию бактерий Н.pylori 17874 в PBS (OD при 600 нм = 1,0) использовали как позитивный контроль.
После иммобилизации белковых профилей на нитроцеллюлозных фильтрах проводили реакцию со специфическими для полипептида 29 кДа моноклональными антителами НР30-1: 1: 6, разбавленными 1;10, как описано ранее (Bolin et al, 1995), и связанные антитела выявляли при помощи меченного пероксидазой антимышиного IgG. Фильтры проявляли субстратом перекисью водорода и 4-хлоро-нафтолхромогеном (BioRad Svenska AB).
Дот-блот тест выполняли, используя ночные культуры вышеупомянутых штаммов. 2 мкл суспензии наносили на нитроцеллюлозные фильтры, подвергали воздушной сушке и инкубировали в течение 1 часа с моноклональными антителами НР30-1:1:6, разбавленными 1:10. Последующие шаги выполняли, как описано выше для иммуноб-лоттинга.
1.5. Молекулярное клонирование
Частично расщепленную хромосомную ДНК штамма Н.pylori 17874 клонировали в векторе экспрессии на основе фага лямбда (ZAP ExpressTM). Четыре бляшки, экспрессирующих полипептид 29 кДа, обнаружили в результате скрининга 24000 бляшек на реакцию со специфичными для полипептида 29 кДа моноклональными антителами. Позитивные бляшки очищали, и размер клонированных вставок проверяли гидролизом выделенной ДНК рестриктазами XbaI, и SalI. Размер вставок составлял от 3,7 до 1,78 тпн. После эксцизии in vivo фагмид pBK-CMV из четырех позитивных бляшек строили рестрикционные карты и сравнивали их со вставками в лямбда-векторе. Эти фагмиды, как было обнаружено, содержали перекрывающиеся ДНК-фрагменты того же размера, что и в лямбда-векторе. Большинство проверенных рестрикционных ферментов, кроме SmaI и NheI, не разрезали клонированные фрагменты.
Частично расщепленную хромосомную ДНК штамма Н.pylori 17874 клонировали в векторе экспрессии на основе фага лямбда (ZAP ExpressTM). Четыре бляшки, экспрессирующих полипептид 29 кДа, обнаружили в результате скрининга 24000 бляшек на реакцию со специфичными для полипептида 29 кДа моноклональными антителами. Позитивные бляшки очищали, и размер клонированных вставок проверяли гидролизом выделенной ДНК рестриктазами XbaI, и SalI. Размер вставок составлял от 3,7 до 1,78 тпн. После эксцизии in vivo фагмид pBK-CMV из четырех позитивных бляшек строили рестрикционные карты и сравнивали их со вставками в лямбда-векторе. Эти фагмиды, как было обнаружено, содержали перекрывающиеся ДНК-фрагменты того же размера, что и в лямбда-векторе. Большинство проверенных рестрикционных ферментов, кроме SmaI и NheI, не разрезали клонированные фрагменты.
Рестрикционная карта наименьшего (1,7 тпн) из клонированных фрагментов (pAEI), которые были дополнительно проанализированы, показана на фиг.1. Одна из клонированных вставок находилась в противоположном по отношению к векторному промотору направлении. Когда полные клеточные экстракты штаммов E. coli, содержащих указанные плазмиды, проанализировали иммуноблоттингом с моноклональными антителами НР30-1:1:6, то обнаружили, что они все экспрессировали полипептид с той же самой молекулярной массой, что и Н.pylori 17874. Не было замечено никакого различия в экспрессии полипептида 29 кДа в том случае, когда промотор вектора индуцировали IPTG. Это указало на то, что ген транскрибировался с собственного промотора. Были сконструированы и исследованы на экспрессию полипептида 29 кДа три субклона, содержащие показанные на фиг. 1 фрагменты ДНК. Ни один из клонов не экспрессировал полипептид. Когда XLOLR (pAEI) проверили дот-блот тестом (Bolin et al., 1995) и сравнили с Н.pylori, то было обнаружено, что он является слабо позитивным, что свидетельствовало о том, что некоторые из экспрессирующихся полипептидов могут быть доступны на поверхности.
1.6. Анализ последовательности ДНК
Обе нити 1,7 тпн вставки в pAEI и в субклонах секвенировали, используя Т3- и Т7-специфические праймеры, и в случае необходимости дополнительно использовали специфические праймеры, чтобы секвенировать те участки последовательности, которые не доступны при применении стандартных праймеров. Компьютерный анализ показал, что последовательность (SEQ ID NO:l) содержала открытую рамку считывания (ORF) размером 780 нп на одной нити, перекрывающую рестрикционные сайты, используемые при субклонировании (фиг.1). Предполагаемый сайт связывания рибосомы может быть идентифицирован (положения 782-785 SEQ ID NO:l). ORF кодировала 260 аминокислот полипептида с молекулярной массой 29126 Да (SEQ ID NO:2).
Обе нити 1,7 тпн вставки в pAEI и в субклонах секвенировали, используя Т3- и Т7-специфические праймеры, и в случае необходимости дополнительно использовали специфические праймеры, чтобы секвенировать те участки последовательности, которые не доступны при применении стандартных праймеров. Компьютерный анализ показал, что последовательность (SEQ ID NO:l) содержала открытую рамку считывания (ORF) размером 780 нп на одной нити, перекрывающую рестрикционные сайты, используемые при субклонировании (фиг.1). Предполагаемый сайт связывания рибосомы может быть идентифицирован (положения 782-785 SEQ ID NO:l). ORF кодировала 260 аминокислот полипептида с молекулярной массой 29126 Да (SEQ ID NO:2).
Аминокислотная последовательность, как было обнаружено, содержала возможную сигнальную последовательность размером 27 аминокислот. Последовательность Leu-Val-Gly-Cys (положения с 25 по 28 в SEQ ID NO:2 и 4) является одной из консенсусных последовательностей (Leu-X-Y-Cys), которую рассматривают как сайт узнавания для фермента сигнальной пептидазы II. Сигнальная пептидаза II расщепляет сигнальные последовательности перед остатком цистеина в пролипопротеинах. Таким образом, характеристики сигнальной последовательности подтверждают, что белок 29 кДа является липопротеином, и что зрелый белок содержит аминокислоты с 28 до 260.
1.7. Экспрессия рекомбинантного полипептида 29 кДа в Е. coli
Рекомбинантный полипептид 29 кДа продуцировался в высокой концентрации в Е. coli N4830-1 с конструкта вектора экспрессии pAL30, который содержит полный ген полипептида 29 кДа (положения 771-1667 в SEQ ID NO:l и 3). Для получения конструкта использовали вектор pML-LCTB λ7, который содержит сильный λPL промотор (получен от Michael Lebens, University of Gothenburg, Sweden). Этот вектор также содержит ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. Ген LCTB (кодирующий холерный токсин и его сигнальный пептид), который вставлен в вектор между λPL промотором и терминирующей областью, был вырезан из вектора в результате его обработки рестрикционными ферментами SmaI и HindIII.
Рекомбинантный полипептид 29 кДа продуцировался в высокой концентрации в Е. coli N4830-1 с конструкта вектора экспрессии pAL30, который содержит полный ген полипептида 29 кДа (положения 771-1667 в SEQ ID NO:l и 3). Для получения конструкта использовали вектор pML-LCTB λ7, который содержит сильный λPL промотор (получен от Michael Lebens, University of Gothenburg, Sweden). Этот вектор также содержит ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. Ген LCTB (кодирующий холерный токсин и его сигнальный пептид), который вставлен в вектор между λPL промотором и терминирующей областью, был вырезан из вектора в результате его обработки рестрикционными ферментами SmaI и HindIII.
Структурный ген, кодирующий полипептид 29 кДа, включая его сигнальную последовательность, амплифицировали при помощи ПЦР. Использовали праймер HP30N (GGC GTA GAA ATG GAA GCG С; соответствующий положениям от 522 до 540 в SEQ IN NO:1 и 3), который связывается с областью, расположенной в обратном направлении от стартового кодона ATG на расстоянии 271 нп, и праймер НР30С (ССС AAG ААТ CAT CAG ССС ТТА ААТ АСА CG), который распознает фрагмент ДНК, расположенный на 855 нп в прямом направлении от стартового кодона (соответствующий положениям с 1648 до 1667 в SEQ ID NO:l и 3). Праймер НР30С содержал HindIII сайт, который был добавлен к последовательности гена, кодирующего полипептид 29 кДа, при помощи реакции ПЦР. Полученный ПЦР продукт имел размер 1,1 тпн. Этот фрагмент ДНК был разрезан рестриктазами SspI и HindIII, дающими фрагмент 0,9 тпн, который затем лигировали с векторным фрагментом (2,7 тпн). Сконструированный вектор, получивший название рАL30 (3,6 тпн), трансформировали в Е. coli N4830-1 методом электропорации. Было обнаружено четыре позитивных клона (pAL30:l, 2, 3, 4).
Для индукции экспрессии рекомбинантного полипептида клетки N4830-1, содержащие рАL30: 1-4, варащивали в течении ночи при 30oС (репрессор фага лямбда сI ингибирует транскрипцию при указанной температуре) в среде 1•LB с ампициллином (100 мкг/мл). Небольую часть этой ночной культуры инокулировали в 5 мл 1•LB среды с ампициллином, и клетки выращивали при +30oС до тех пор, пока OD при 600 нм не достигала значения примерно 0,7. Затем температуру поднимали до +42oС, в результате чего репрессор инактивировался, и клетки инкубировали еще в течение двух часов.
Образцы, взятые до и после индукции, анализировали при помощи 14%-ного SDS-PAGE и иммуноблотинга, используя моноклональные антитела НР30-1:1:6, которые специфичны для полипептида 29 кДа. Все три индуцированных клона, использованных в иммуноблотинге (рАL30:1,3 и 4), экспрессировали после индукции большое количество рекомбинантного полипептида. Суспензия из неиндуцированных клеток содержала только низкое количество полипептида 29 кДа.
Клон pAL30: l был выбран для дальнейшего анализа. Чтобы проверить, что этот клон действительно содержал ген, кодирующий полипептид 29 кДа, концы фрагмента, вставленного в вектор, секвенировали. Было подтверждено, что последовательность, вставленная в вектор экспрессии, соответствовала ожидаемой последовательности клонированного ПЦР-фрагмента.
ПРИМЕР 2: Кинетика экспрессии полипептида 29 кДа при различных условиях культивирования
Использовали два штамма Н.pylori, а именно CCUG 17874 (лабораторный штамм) и Не1 73 (недавно выделенный от пациента. страдающего от язвы двенадцатиперстной кишки). Культивирование проводили на чашках с кровяным агаром, а также в бруцеллезной питательной среде (Brucella Broth) с добавлением циклодекстрина. Все культуры инкубировали в микроаэрофильной атмосфере, состоящей из 5% О2, 10% СО2 и 85% N2. Бактерии собирали после 2, 4 и 7 дней, промывали один раз в PBS и хранили при -20oС для последующего анализа. Экспрессию поверхностного полипептида 29 кДа анализировали методом ингибирование-ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), с применением специфических моноклональных антител, использовавшихся ранее для обнаружения поверхностных антигенов Е. coli (Lopez-Vidal, Y and Svennerholm, A-M., J. Clin. Microbiol. 28, 1906), против полипептида. Эти антитела также использовали в иммуноэлектронной микроскопии.
Использовали два штамма Н.pylori, а именно CCUG 17874 (лабораторный штамм) и Не1 73 (недавно выделенный от пациента. страдающего от язвы двенадцатиперстной кишки). Культивирование проводили на чашках с кровяным агаром, а также в бруцеллезной питательной среде (Brucella Broth) с добавлением циклодекстрина. Все культуры инкубировали в микроаэрофильной атмосфере, состоящей из 5% О2, 10% СО2 и 85% N2. Бактерии собирали после 2, 4 и 7 дней, промывали один раз в PBS и хранили при -20oС для последующего анализа. Экспрессию поверхностного полипептида 29 кДа анализировали методом ингибирование-ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), с применением специфических моноклональных антител, использовавшихся ранее для обнаружения поверхностных антигенов Е. coli (Lopez-Vidal, Y and Svennerholm, A-M., J. Clin. Microbiol. 28, 1906), против полипептида. Эти антитела также использовали в иммуноэлектронной микроскопии.
Когда CCUG 17874 культивировали в течение 7 дней, на чашках с кровяным агаром, также как и в бруцеллезной среде, приблизительно 70% бактерий переходили из спиральной формы в коккоидную форму. Это преобразование происходило уже после 3 дней в случае штамма Не1 73. Анализ методом ингибирование-ELISA показал довольно постоянную концентрацию 29 кДа полипептида в образцах, полученных как из чашечных, так и из бульонных культур, в течение 7 дней. Присутствие полипептида было подтверждено иммуноэлектронной микроскопией. 29 кДа полипептид, как было обнаружено, хорошо сохраняется в коккоидных формах Н. pylori. Как было обнаружено, полипептида 29 кДа было больше в штамме Не1 73, чем в CCUG 17874.
ПРИМЕР 3: Гуморальные иммунные ответы против полипептида 29 кДа
Гуморальные иммунные ответы против полипептида 29 кДа определяли в сыворотках и в желудочном материале, полученном путем аспирации, от пациентов с язвами двенадцатиперстной кишки (n=19), у бессимптомных Н.pylori носителей (n=18) и у неинфицированных контрольных субъектов такого же возраста (n=20).
Гуморальные иммунные ответы против полипептида 29 кДа определяли в сыворотках и в желудочном материале, полученном путем аспирации, от пациентов с язвами двенадцатиперстной кишки (n=19), у бессимптомных Н.pylori носителей (n=18) и у неинфицированных контрольных субъектов такого же возраста (n=20).
Уровни антител против 29 кДа полипептида тестировали в желудочном материале, полученном путем аспирации, и в сыворотках, полученных от трех групп субъектов, посредством различных ELISA методов. Большинство инфицированных субъектов имело существенно более высокие по сравнению со здоровыми контрольными людьми уровни специфических антител против полипептида 29 кДа как в сыворотке, так и в желудочном материале, полученном путем аспирации. Титры антител у бессимптомных носителей были сравнимы с таковыми у пациентов с симптомами.
ПРИМЕР 4: Мечение полипептидов [3H]пальмитатом
Так как аминокислотная последовательность полипептида 29 кДа содержала возможный сигнальный пептид, типичный для липопротеинов, исследовали мечение белка с радиоактивной пальмитиновой кислотой.
Так как аминокислотная последовательность полипептида 29 кДа содержала возможный сигнальный пептид, типичный для липопротеинов, исследовали мечение белка с радиоактивной пальмитиновой кислотой.
Е. coli N4830-1, как без вектора, так и с вектором pAL30:l, выращивали при 30oС в питательной среде LB, содержавшей 50 мкг/мл карбенициллина. При плотности клеток 108 бактерий/мл добавляли [3Н]пальмитиновую кислоту (5 мкКи/мл; DuPont NEN, Boston, MA) до конечной концентрации 50 мкКи/мл. Температуру доводили до 42oС и культуры инкубировали дополнительно в течение 12 часов. Клетки собирали центрифугированием и лизировали в SDS-PAGE лизирующем буфере. После электрофореза гель обрабатывали для флоуграфии, погружая гель в AmplifyTM (Amersham International, ПК) на 30 мин, высушивая его между листами целлофана и экспонируя гель на рентгеновской пленке при -70oС в течение 36 часов.
Результаты показали, что полипептид 29 кДа является липидизированным и, таким образом, пост-трансляционно модифицированным.
ПРИМЕР 5: Распределение с помощью тритона Х-114 E.coli, экспрессирующих рекомбинантный полипептид 29 кДа
Клетки E. coli, несущие pAL30:l, выращивали при +30oС в LB-среде, содержащей 50 мкг карбенициллина/мл. При клеточной плотности 108 бактерий/мл температуру поднимали до +42oС и культуры инкубировали долнительно в течение 3 часов. Клетки собирали центрифугированием (11,300•g, 10 мин, +4oС) и ресуспендировали в 25 мл PBS на грамм клеточного осадка. Суспензию замораживали и затем оттаивали при комнатной температуре, добавляли 25 мкл ДНКазы I (10 мкг/мкл). Образец мягко перемешивали переворачиванием в течение 30 мин при комнатной температуре и охлаждали до 8-12oС с последующим добавлением тритона Х-114 (конечная концентрация 0,3%). После инкубации с медленным переворачиванием при +4oС в течение 3 часов нерастворенный материал собирали центрифугированием (18,900•g, 10 мин, 25oС).
Клетки E. coli, несущие pAL30:l, выращивали при +30oС в LB-среде, содержащей 50 мкг карбенициллина/мл. При клеточной плотности 108 бактерий/мл температуру поднимали до +42oС и культуры инкубировали долнительно в течение 3 часов. Клетки собирали центрифугированием (11,300•g, 10 мин, +4oС) и ресуспендировали в 25 мл PBS на грамм клеточного осадка. Суспензию замораживали и затем оттаивали при комнатной температуре, добавляли 25 мкл ДНКазы I (10 мкг/мкл). Образец мягко перемешивали переворачиванием в течение 30 мин при комнатной температуре и охлаждали до 8-12oС с последующим добавлением тритона Х-114 (конечная концентрация 0,3%). После инкубации с медленным переворачиванием при +4oС в течение 3 часов нерастворенный материал собирали центрифугированием (18,900•g, 10 мин, 25oС).
Фазы анализировали посредством SDS-PAGE, идентичность полипептида 29 кДа проверяли вестерн-блоттингом с использованием моноклональных антител НР30-1: 1: 6. Результаты показали, что 29 кДа полипептид появился в фазе детергента, что подтверждает то, что он является липопротеином. Известно из уровня техники, что интегративные мембранные белки обычно переходят в фазу детергента (Bordier, С. (1981) J. Biol. Chem., vol. 256, 1604-1607).
Этот эксперимент также показал, что плазмида, введенная в E.coli, может экспрессироваться и продуцировать 29 кДа белок. Это важно для будущего производства вакцины в большом масштабе, так как Н.pylori растет недостаточно хорошо или быстро.
ПРИМЕР 6: Конструирование вектора экспрессии pS863 для продуцирования высоких уровней белка 29 кДа Н.pylori
6.1. Получение pS860
Чтобы получить удобные рестрикционные сайты на 5'-конце гена 29 кДа, синтезировали два синтетических олигонуклеотида для ПЦР амплификации. Плазмиду pS852 (идентичная плазмиде pAL30:l, описанной в Примере 1.7) использовали как матрицу для ПЦР амплификации. Последовательности этих двух олигонуклеотидов показаны ниже:
EcoRI Ndel
5'-CGGAATTCCATATGAGAGCAAATAATCATTTTAAAG-3'
BamHI XmaI NheI
5'-GCGGATCCCCCGGGGCTAGCTGGATGGTAATTCAATTTC-3'
Проводили ПЦР амплификацию и амплифицированный фрагмент 169 нп лигировали в ТА вектор (Mead, D.A. et al. (1991) Bio/Technology 9, 657-663). Полученная плазмида была обозначена как pS860 (фиг.2). Последовательность полученного конструкта подтвердили путем дидезокси-секвенирования (Sanger et. al (1977) Proc Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467).
6.1. Получение pS860
Чтобы получить удобные рестрикционные сайты на 5'-конце гена 29 кДа, синтезировали два синтетических олигонуклеотида для ПЦР амплификации. Плазмиду pS852 (идентичная плазмиде pAL30:l, описанной в Примере 1.7) использовали как матрицу для ПЦР амплификации. Последовательности этих двух олигонуклеотидов показаны ниже:
EcoRI Ndel
5'-CGGAATTCCATATGAGAGCAAATAATCATTTTAAAG-3'
BamHI XmaI NheI
5'-GCGGATCCCCCGGGGCTAGCTGGATGGTAATTCAATTTC-3'
Проводили ПЦР амплификацию и амплифицированный фрагмент 169 нп лигировали в ТА вектор (Mead, D.A. et al. (1991) Bio/Technology 9, 657-663). Полученная плазмида была обозначена как pS860 (фиг.2). Последовательность полученного конструкта подтвердили путем дидезокси-секвенирования (Sanger et. al (1977) Proc Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467).
6.2. Получение pS861
Чтобы заменить рестрикционные сайты на 3'-конце гена 29 кДа, синтезировали два синтетических олигонуклеотида для ПЦР амплификации. Плазмиду pS852 (pAL30: l) использовали как матрицу для ПЦР амплификации. Последовательности двух олигонуклеотидов приведены ниже:
EcoRI XmaI
5'-CGGAATTCCCCGGGTTATTATTCTCCACCGG-3'
PstI BamHI
5'-CGCTGCAGGGATCCTTATTATCGGTTTCTTTTGCCTTTTAA-3'
Проводили амплификацию ПЦР и амплифицированный фрагмент расщепляли рестриктазами XmaI, и BamHI с образованием фрагмента 357 нп. Этот фрагмент клонировали в pUC19, полученную плазмиду обозначили как pS861 (фиг.2). Последовательность конструкта подтвердили дидезоксисеквенированием (Sanger et. al (1977) Proc Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467).
Чтобы заменить рестрикционные сайты на 3'-конце гена 29 кДа, синтезировали два синтетических олигонуклеотида для ПЦР амплификации. Плазмиду pS852 (pAL30: l) использовали как матрицу для ПЦР амплификации. Последовательности двух олигонуклеотидов приведены ниже:
EcoRI XmaI
5'-CGGAATTCCCCGGGTTATTATTCTCCACCGG-3'
PstI BamHI
5'-CGCTGCAGGGATCCTTATTATCGGTTTCTTTTGCCTTTTAA-3'
Проводили амплификацию ПЦР и амплифицированный фрагмент расщепляли рестриктазами XmaI, и BamHI с образованием фрагмента 357 нп. Этот фрагмент клонировали в pUC19, полученную плазмиду обозначили как pS861 (фиг.2). Последовательность конструкта подтвердили дидезоксисеквенированием (Sanger et. al (1977) Proc Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467).
6.3. Получение плазмиды pS862
кДНК, кодирующую среднюю часть гена 29 кДа, выделяли при помощи гель-электрофореза в виде 280 нп NheI/XmaI фрагмента из плазмиды pS852 (pAL30:l). Этот фрагмент лигировали вместе с 357 нп XmaI/BamHI фрагментом из pS861 и 4061 нп NheI/BamHI фрагментом из pS861. Сконструированная плазмида была обозначена как pS862 (фиг.2).
кДНК, кодирующую среднюю часть гена 29 кДа, выделяли при помощи гель-электрофореза в виде 280 нп NheI/XmaI фрагмента из плазмиды pS852 (pAL30:l). Этот фрагмент лигировали вместе с 357 нп XmaI/BamHI фрагментом из pS861 и 4061 нп NheI/BamHI фрагментом из pS861. Сконструированная плазмида была обозначена как pS862 (фиг.2).
6.4. Получение плазмиды pS863
Затем выделяли 795 нп NdeI и BamHI рестрикционный фрагмент из pS862 и лигировали с 4 тпн NdeI/BamHI фрагментом из Т7 вектора pS637 (рЕТ-3а) (Studier, F.W. et al. (1990) Methods Enzymol. 185, 60-89). Полученный вектор экспрессии был обозначен как pS863 (фиг.2).
Затем выделяли 795 нп NdeI и BamHI рестрикционный фрагмент из pS862 и лигировали с 4 тпн NdeI/BamHI фрагментом из Т7 вектора pS637 (рЕТ-3а) (Studier, F.W. et al. (1990) Methods Enzymol. 185, 60-89). Полученный вектор экспрессии был обозначен как pS863 (фиг.2).
ПРИМЕР 7: Очистка рекомбинантного Н.pylori 29 кДа липопротеина
7.1. Штаммы-хозяева и бактериальные культуры
Вектор экспрессии pS863 трансформировали в следующие штаммы-хозяева E. coli; BL21(DE3); BL21 (DE3)pLysS; и BL21 (DE3)pLysE. Эксперименты по экспрессии выполняли в основном так, как описано (Studier et al. Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). Бактерии выращивали в среде LB (Ausubel, P.M. et al. (eds. ) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1992), содержавшей 50 мкг/мл карбенициллина. Кроме того, при использовании BL21(DЕ3)pLysS и BL21(DE3)pLysE в среду добавляли 30 мкг/мл хлорамфеникола. Для индукции Т7 системы экспрессии культуры выращивали до плотности приблизительно OD600= 0.5 и затем добавляли 0,4 мМ IPTG для индукции. Клетки собирали через примерно 180 минут после индукции. Штаммом-хозяином, который дал самый высокий уровень экспрессии, был BL21(DE3)pLysS.
7.1. Штаммы-хозяева и бактериальные культуры
Вектор экспрессии pS863 трансформировали в следующие штаммы-хозяева E. coli; BL21(DE3); BL21 (DE3)pLysS; и BL21 (DE3)pLysE. Эксперименты по экспрессии выполняли в основном так, как описано (Studier et al. Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). Бактерии выращивали в среде LB (Ausubel, P.M. et al. (eds. ) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1992), содержавшей 50 мкг/мл карбенициллина. Кроме того, при использовании BL21(DЕ3)pLysS и BL21(DE3)pLysE в среду добавляли 30 мкг/мл хлорамфеникола. Для индукции Т7 системы экспрессии культуры выращивали до плотности приблизительно OD600= 0.5 и затем добавляли 0,4 мМ IPTG для индукции. Клетки собирали через примерно 180 минут после индукции. Штаммом-хозяином, который дал самый высокий уровень экспрессии, был BL21(DE3)pLysS.
7.2. Очистка липопротеина 29 кДа Н.pylori
Культуры E.coli BL21(DE3)/pLysS, транформированные плазмидой pS863, выращивали, как описано выше. Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в холодном буфере (50 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, рН 8,0). Для каждого грамма осадка (влажная масса) добавляли 35 мл буфера.
Культуры E.coli BL21(DE3)/pLysS, транформированные плазмидой pS863, выращивали, как описано выше. Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в холодном буфере (50 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, рН 8,0). Для каждого грамма осадка (влажная масса) добавляли 35 мл буфера.
7.2.1. Экстракция тритоном Х-114
Чтобы экстрагировать липопротеин, тритон Х-114 (ТХ-114) добавляли до конечной концентрации 1,5 мас.% и суспензию перемешивали в течение одного часа при 0oС. Нерастворимый в тритоне материал был собран в осадок центрифугированием при 18900•g в течение 10 мин. В некоторых случаях осадок экстрагировали еще раз, но половинным объемом ТХ-114 содержащего буфера. После второй ТХ-114 экстракции осадок выбрасывали.
Чтобы экстрагировать липопротеин, тритон Х-114 (ТХ-114) добавляли до конечной концентрации 1,5 мас.% и суспензию перемешивали в течение одного часа при 0oС. Нерастворимый в тритоне материал был собран в осадок центрифугированием при 18900•g в течение 10 мин. В некоторых случаях осадок экстрагировали еще раз, но половинным объемом ТХ-114 содержащего буфера. После второй ТХ-114 экстракции осадок выбрасывали.
Фазовое распределение супернатанта от ТХ-114 экстракции получали, инкубируя его в течение 15 мин при 30oС с нерегулярным перемешиванием. Мутный раствор центрифугировали при 31300•g в течение 30 мин при +30oС. Собирали нижнию фазу детергента и разбавляли до 1% ТХ-114 холодным буфером (50 мМ трис-HCl, 2 MM ЭДТА, 10 мМ NaCl, pH 8,0).
7.2.2. Q-сефароза, pH 8,0
Разбавленную ТХ-114-фазу наносили на колонку с Q-сефарозой (Pharmacia) (20 мл/3 г клеточного осадка), уравновешенную буфером (50 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, 0,1% тритон Х-100, pH 8,0). 29 кДа липопротеин собирали как несвязывающуюся фракцию. Эта фракция была подвергнута фазовому распределению путем ее инкубирования при +30oС при кратковременном смешивании до тех пор, пока раствор был мутным. Две фазы были разделены центрифугированием при 31300 • g в течение 30 мин при +30oС. Нижнюю фазу детергента собирали и разбавляли до 1% ТХ-114 холодным буфером (10 мМ трис-HCl, 2 мM ЭДТА мМ, pH 8,6).
Разбавленную ТХ-114-фазу наносили на колонку с Q-сефарозой (Pharmacia) (20 мл/3 г клеточного осадка), уравновешенную буфером (50 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, 0,1% тритон Х-100, pH 8,0). 29 кДа липопротеин собирали как несвязывающуюся фракцию. Эта фракция была подвергнута фазовому распределению путем ее инкубирования при +30oС при кратковременном смешивании до тех пор, пока раствор был мутным. Две фазы были разделены центрифугированием при 31300 • g в течение 30 мин при +30oС. Нижнюю фазу детергента собирали и разбавляли до 1% ТХ-114 холодным буфером (10 мМ трис-HCl, 2 мM ЭДТА мМ, pH 8,6).
7.2.3. Q-сефароза, pH 8,6
Разбавленную ТХ-114-фазу наносили на 100 мл колонку с Q-сефарозой (Pharmacia), уравновешанную буфером (10 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, pH 8,6). Несвязывающаяся фракция содержала ТХ-114. Колонку промывали буфером А (10 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,1% тритон Х-100, pH 8,6). 29 кДа липопротеин собирали градиентом соли с буфером В (10 мM трис-HCl, 2 мM ЭДТА mM, 0,1% тритон Х-100, 1 М NaCl, pH 8,6). Градиент был следующим: 0-50%В. 40 мл; 50-100%В, 100 мл. 29 кДа липопротеин элюировали между 60-70% В.
Разбавленную ТХ-114-фазу наносили на 100 мл колонку с Q-сефарозой (Pharmacia), уравновешанную буфером (10 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, pH 8,6). Несвязывающаяся фракция содержала ТХ-114. Колонку промывали буфером А (10 мМ трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,1% тритон Х-100, pH 8,6). 29 кДа липопротеин собирали градиентом соли с буфером В (10 мM трис-HCl, 2 мM ЭДТА mM, 0,1% тритон Х-100, 1 М NaCl, pH 8,6). Градиент был следующим: 0-50%В. 40 мл; 50-100%В, 100 мл. 29 кДа липопротеин элюировали между 60-70% В.
7.2.4. SDS-PAGE и белковый электроблоттинг
Образцы белка с различных стадий очистки растворяли в буфере для образцов (50 мМ трис-HCl, pH 6,8, 8% глицерин, 1,6% SDS, 4% β-меркаптоэтанол, 0,02% бромфенолового синего) и разделяли на Novex преформированных градиентных гелях (4-20% полиакриламида) или на BioRad преформированных градиентных гелях (10-20% полиакриламида). Буфер для проведения электрофореза содержал 25 мМ трис, 192 мМ глицина, 0,5% SDS, рН 8,3. Гели окрашивали 0,1% кумасси бриллиантовым синим (Coomassie Brilliant Blue) R-250 в 40% метанола, 10% уксусной кислоты и отмывали 10% метанола, 10% уксусной кислоты, уксусная кислота.
Образцы белка с различных стадий очистки растворяли в буфере для образцов (50 мМ трис-HCl, pH 6,8, 8% глицерин, 1,6% SDS, 4% β-меркаптоэтанол, 0,02% бромфенолового синего) и разделяли на Novex преформированных градиентных гелях (4-20% полиакриламида) или на BioRad преформированных градиентных гелях (10-20% полиакриламида). Буфер для проведения электрофореза содержал 25 мМ трис, 192 мМ глицина, 0,5% SDS, рН 8,3. Гели окрашивали 0,1% кумасси бриллиантовым синим (Coomassie Brilliant Blue) R-250 в 40% метанола, 10% уксусной кислоты и отмывали 10% метанола, 10% уксусной кислоты, уксусная кислота.
Гели, предназначенные для полусухого электроблоттинга, не окрашивали, а замачивали в буфере для переноса (48 мМ трис, 38 мМ глицин, 0,075% SDS, 20% МеОН), белки переносили на PVDF (поливинилиденфторидные) мембраны (ImmobilonR Millipore, USA) в аппарате для полусухого блоттинга (BioRad). Иммунологический анализ выполняли сначала путем блокады PVDF мембраны в течение одного часа в 2%-ном BSA (бычьем сывороточном альбумине) в TBS (50 мМ трис-HCl, 2,5 М NaCl, рН 8,2), затем мембрану инкубировали в течение одного часа со специфическим моноклональным антителом (IgGl) против 29 кДа липопротеина, разбавленного 1: 10 1%-ным BSA в TBS. После стадии отмывки в TBS мембрану инкубировали в течение одного часа с антителом против мышиного IgG, сконъюгированным с щелочной фосфатазой (Dakopatts, Denmark). После дополнительной отмывки мембрану обрабатывали соответствующими субстратами (5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфатом (BCIP) и нитросиним тетразолием (NBT) (Sigma)).
7.2.5. Концентрация белка и пирогенность
Общую концентрацию белка определяли методом на основе бицинхониновой кислоты (ВСА Protein Assay. Pierce Chemical Company. USA).
Общую концентрацию белка определяли методом на основе бицинхониновой кислоты (ВСА Protein Assay. Pierce Chemical Company. USA).
Содержание эндотоксина оценивали с помощью пробы с лизатом хромогенных амебоцитов мечехвоста (LAL)(LAL COAMATICR Endotoxin. Endosafe Inc. USA).
Окрашенные SDS-гели сканировали (BioRad Imager GS-) для определения относительного количества белковых примесей в конечных препаратах. Препараты содержали <10% белковых примесей.
ПРИМЕР 8: Анализ Н.pylori 29 кДа белка для его использования в качестве вакцины
8.1. Материалы и методы
8.1.1. Животные
Самки SPF BALB/c мышей были приобретены в Bomholt цетре по разведению (Breeding centre, Denmark). Их содержали в обычных макролоновых клетках со свободным доступом к воде и пище. Возраст животных при прибытии составлял 4-6 недель.
8.1. Материалы и методы
8.1.1. Животные
Самки SPF BALB/c мышей были приобретены в Bomholt цетре по разведению (Breeding centre, Denmark). Их содержали в обычных макролоновых клетках со свободным доступом к воде и пище. Возраст животных при прибытии составлял 4-6 недель.
8.1.2. Инфекция
Минимум через одну неделю акклиматизации животные были инфицированы штаммом Н. pylori типа 2 (штамм 244, первоначально выделенный у пациента с язвой). Этот штамм, как было ранее доказано, является активным колонистом желудка мышей. Бактерии выращивали в течение ночи в бруцеллезной питательной среде с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки при +37oС в микроаэрофильной атмосфере (10% СО2, 5% O2). Животные получали оральную дозу омепразола (400 ммоль/кг), а через 3-5 ч их орально инокулировали Н.pylori (приблизительно 108 КОЕ/животное). Инфекция была проверена у контрольных животных через 2-3 недели после инокуляции.
Минимум через одну неделю акклиматизации животные были инфицированы штаммом Н. pylori типа 2 (штамм 244, первоначально выделенный у пациента с язвой). Этот штамм, как было ранее доказано, является активным колонистом желудка мышей. Бактерии выращивали в течение ночи в бруцеллезной питательной среде с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки при +37oС в микроаэрофильной атмосфере (10% СО2, 5% O2). Животные получали оральную дозу омепразола (400 ммоль/кг), а через 3-5 ч их орально инокулировали Н.pylori (приблизительно 108 КОЕ/животное). Инфекция была проверена у контрольных животных через 2-3 недели после инокуляции.
8.1.3. Иммунизации
Животных иммунизировали 4 раза в течение периода продолжительностью 34 дня (дни 1, 15, 25 и 35). Очищенный антиген вводили в дозе 100 мкг/мышь, а мембранные белки (МР) - в дозе 0,5 мг/дозу. Мембранные белки получали путем разрушения ультразвуком бактерий в PBS. Дебрис удаляли путем центрифугирования гомогената, полученного из клеток при воздействии ультразвука, при +4oС, 2000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант переносили в новую пробирку и цетрифугировали при +4oС, 15000 об/мин в течение 20 мин. Осадок собирали и хранили при -70oС до использования.
Животных иммунизировали 4 раза в течение периода продолжительностью 34 дня (дни 1, 15, 25 и 35). Очищенный антиген вводили в дозе 100 мкг/мышь, а мембранные белки (МР) - в дозе 0,5 мг/дозу. Мембранные белки получали путем разрушения ультразвуком бактерий в PBS. Дебрис удаляли путем центрифугирования гомогената, полученного из клеток при воздействии ультразвука, при +4oС, 2000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант переносили в новую пробирку и цетрифугировали при +4oС, 15000 об/мин в течение 20 мин. Осадок собирали и хранили при -70oС до использования.
В качестве адъюванта животные также получали 10 мкг/мышь холерного токсина (СТ) с каждой иммунизацией. Животным перорально давали омепразол (400 мкмоль/кг) за 3-5 ч до иммунизации как средство защиты антигенов от кислотной деградации. Животных умерщвляли через 4 недели после заключительной иммунизации.
8.1.4. Пассивная защита
Для того, чтобы проанализировать влияние моноклональных антител (MAbs) на способность Н.pylori колонизировать желудок мышей, MAbs с различными специфичностями смешивали с Н.pylori за 10 мин до инокуляции, как описано выше. Использовали MAbs, индуцированные против 29 кДа белка (НР30-1:1:6), против уреазы (Ure 8:1); и против устойчивого к нагреванию белка Е. coli (ST 1:3). MAbs титровали в ELISA, чтобы получить равные количества каждого МАb для использования в эксперименте. Для инокуляции использовали количество бактерий, составлявшее 107 на мышь. Мышей умерщвляли через 2 недели после инокуляции.
Для того, чтобы проанализировать влияние моноклональных антител (MAbs) на способность Н.pylori колонизировать желудок мышей, MAbs с различными специфичностями смешивали с Н.pylori за 10 мин до инокуляции, как описано выше. Использовали MAbs, индуцированные против 29 кДа белка (НР30-1:1:6), против уреазы (Ure 8:1); и против устойчивого к нагреванию белка Е. coli (ST 1:3). MAbs титровали в ELISA, чтобы получить равные количества каждого МАb для использования в эксперименте. Для инокуляции использовали количество бактерий, составлявшее 107 на мышь. Мышей умерщвляли через 2 недели после инокуляции.
8.1.5. Анализ инфекции
Мышей умерщвляли с помощью СО2 и цервикального смещения. Брюшную полость вскрывали и удаляли желудок. После рассечения желудка вдоль большой кривизны желудка его промывали физиологическим раствором. Участки слизистой оболочки полости и тела площадью 25 мм2 соскабливали по отдельности хирургическим скальпелем. Соскобы слизистой оболочки суспендировали в бруцеллезной питательной среде и помещали на кровяные Skirrow чашки. Чашки инкубировали в микроаэрофильных условиях в течение 3-5 дней и подсчитывали количество колоний. Идентичность Н. pylori была установлена тестом на уреазу и каталазу и прямым микроскопированием или окрашиванием по Грамму.
Мышей умерщвляли с помощью СО2 и цервикального смещения. Брюшную полость вскрывали и удаляли желудок. После рассечения желудка вдоль большой кривизны желудка его промывали физиологическим раствором. Участки слизистой оболочки полости и тела площадью 25 мм2 соскабливали по отдельности хирургическим скальпелем. Соскобы слизистой оболочки суспендировали в бруцеллезной питательной среде и помещали на кровяные Skirrow чашки. Чашки инкубировали в микроаэрофильных условиях в течение 3-5 дней и подсчитывали количество колоний. Идентичность Н. pylori была установлена тестом на уреазу и каталазу и прямым микроскопированием или окрашиванием по Грамму.
8.2. Результаты
8.2.1 Пассивная защита
Трем группам из 10 животных в каждой давали смесь Н.pylori штамм 244 и Mab и одной группе давали только Н.pylori. Смесь Mab и бактерий оставляли для реагирования в течение 10 мин перед ее инокуляцией мышам. Ни одно из использовавшихся MAbs не оказывало очевидного влияния на бактерии in vitro. Через две недели после инокуляции мышей умерщвляли и для каждой группы определяли показатель инфекции (фиг.3). Все мыши в контрольной группе и мыши, инокулированные ST Mab, были инфицированы. В группе с уреаза Mab все мыши были инфицированы, но в значительно меньшей степени по сравнению с контрольными. В группе, инокулированной Mab против 29 кДа белка, ни одна из мышей не была инфицирована.
8.2.1 Пассивная защита
Трем группам из 10 животных в каждой давали смесь Н.pylori штамм 244 и Mab и одной группе давали только Н.pylori. Смесь Mab и бактерий оставляли для реагирования в течение 10 мин перед ее инокуляцией мышам. Ни одно из использовавшихся MAbs не оказывало очевидного влияния на бактерии in vitro. Через две недели после инокуляции мышей умерщвляли и для каждой группы определяли показатель инфекции (фиг.3). Все мыши в контрольной группе и мыши, инокулированные ST Mab, были инфицированы. В группе с уреаза Mab все мыши были инфицированы, но в значительно меньшей степени по сравнению с контрольными. В группе, инокулированной Mab против 29 кДа белка, ни одна из мышей не была инфицирована.
8.2.2. Терапевтическая иммунизация
В данном исследовании животных инфицировали Н.pylori штамм 244 за один месяц до иммунизаций. Мыши в группах из десяти особей были затем иммунизированы либо холерным токсином (СТ), либо СТ вместе с мембранными белками, уреазой или 29 кДа белком. Контрольные животные получали только наполнитель (PBS). Через месяц после заключительной иммунизации животных умерщвляли и определяли КОЕ (фиг. 4). Все контрольные животные, также как животные, иммунизированные только СТ, были инфицированы. Животные, активно иммунизированные уреазой и СТ или 29 кДа белком и СТ, имели значительно меньшие значения КОЕ по сравнению с контрольными. Только одно животное в группе, иммунизированной уреазой, было полностью излечено от инфекции.
В данном исследовании животных инфицировали Н.pylori штамм 244 за один месяц до иммунизаций. Мыши в группах из десяти особей были затем иммунизированы либо холерным токсином (СТ), либо СТ вместе с мембранными белками, уреазой или 29 кДа белком. Контрольные животные получали только наполнитель (PBS). Через месяц после заключительной иммунизации животных умерщвляли и определяли КОЕ (фиг. 4). Все контрольные животные, также как животные, иммунизированные только СТ, были инфицированы. Животные, активно иммунизированные уреазой и СТ или 29 кДа белком и СТ, имели значительно меньшие значения КОЕ по сравнению с контрольными. Только одно животное в группе, иммунизированной уреазой, было полностью излечено от инфекции.
8.3. Выводы
Вышеприведенные результаты свидетельствуют о том, что 29 кДа Н.pylori белок важен для колонизации и/или персистенции инфекции, поскольку связывание Mab с этой структурой приводит к полному ингбированию колонизации.
Вышеприведенные результаты свидетельствуют о том, что 29 кДа Н.pylori белок важен для колонизации и/или персистенции инфекции, поскольку связывание Mab с этой структурой приводит к полному ингбированию колонизации.
Кроме того, 29 кДа Н. pylori белок при его использовании в качестве орального иммуногена в сочетании с холерным токсином в качестве орального адъюванта действует как стимулятор иммунного ответа, приводящий к существенному снижению степени колонизации Н.pylori в используемой животной модели.
В совокупности эти результаты настоятельно подтверждают возможность использования 29 кДа Н.pylori белка в препарате оральной вакцины для применения на людях для лечения и профилактики Н.pylori инфекций.
ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Плазмида pAEI была депонирована согласно Будапештскому Соглашению в Национальных коллекциях промышленных и морских бактерий (National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), Aberdeen, Scotland, UK) под регистрационным номером NCIMB 40732. Дата депонирования - 16 мая 1995.
Плазмида pAEI была депонирована согласно Будапештскому Соглашению в Национальных коллекциях промышленных и морских бактерий (National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), Aberdeen, Scotland, UK) под регистрационным номером NCIMB 40732. Дата депонирования - 16 мая 1995.
Список последовательностей приведен в конце описания.
Claims (10)
1. Рекомбинантный полипептид, который способен к индукции защитного иммунитета против инфекции Helicobacter pylori у млекопитающего, причем данный полипептид включает в себя аминокислотную последовательность, которая идентична или имеет по меньшей мере 90% гомологии с аминокислотной последовательностью с положения 1 по положение 260 SЕQ ID NO: 2; с положения 28 по положение 260 SЕQ ID NO: 2; с положения 1 по положение 260 SЕQ ID NO: 4; или с положения 28 по положение 260 SЕQ ID NO: 4.
2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что данный полипептид включает в себя аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 95% гомологии с аминокислотной последовательностью с положения 1 по положение 260 SЕQ ID NO: 2; с положения 28 по положение 260 SЕQ ID NO: 2; с положения 1 по положение 260 SЕQ ID NO: 4; или с положения 28 по положение 260 SЕQ ID NO: 4.
3. Полипептид по п. 1 или 2, отличающийся тем, что данный полипептид липидизирован.
4. Полипептид по пп. 1, 2 или 3 для лечения или профилактики инфекции Helicobacter pylori у млекопитающего.
5. Полипептид по пп. 1, 2 или 3 для изготовления вакцины для использования в элисировании защитного иммунного ответа против Helicobacter pylori.
6. Полипептид по пп. 1, 2 или 3 для изготовления вакцины для терапевтического лечения млекопитающего, инфицированного Helicobacter pylori, c целью уничтожить или подавить указанную инфекцию.
7. Полипептид по пп. 1, 2 или 3 для изготовления вакцины для профилактического лечения млекопитающего при риске инфекции Helicobacter pylori.
8. Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п. 1 или 2.
9. Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п. 1 или 2, выбранный из группы (а) фрагмента ДНК, который идентичен или существенно подобен положениям 796-1572 SEQ ID NO: 1; положениям 874-1572 SEQ ID NO: 1; положениям 796-1572 SEQ ID NO: 3; или положениям 874-1572 SEQ ID NO: 3; и (б) фрагмента ДНК, который является вырожденным, как результат генетического кода, по отношению к фрагменту ДНК, определенному в (а), и которая кодирует полипептид по п. 1 или 2.
10. Вакцинная композиция для индукции защитного иммунного ответа на инфекцию Helicobacter pylori, содержащая иммуногенно эффективное количество полипептида по пп. 1, 2 или 3, возможно вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE9502007A SE9502007D0 (sv) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | Novel polypeptides |
SE9502007-9 | 1995-06-01 | ||
SE9601085A SE9601085D0 (sv) | 1996-03-21 | 1996-03-21 | Novel polypeptides |
SE9601085-5 | 1996-03-21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98100200A RU98100200A (ru) | 1999-10-20 |
RU2195463C2 true RU2195463C2 (ru) | 2002-12-27 |
Family
ID=26662316
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98100200/13A RU2195463C2 (ru) | 1995-06-01 | 1996-06-03 | Антиген helicobacter pylori и вакцинная композиция |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6025164A (ru) |
EP (1) | EP0828757A1 (ru) |
JP (1) | JP3380559B2 (ru) |
KR (1) | KR19990022131A (ru) |
CN (1) | CN1191544A (ru) |
AR (1) | AR003125A1 (ru) |
BR (1) | BR9608627A (ru) |
CA (1) | CA2222797A1 (ru) |
CZ (1) | CZ357397A3 (ru) |
EE (1) | EE9700306A (ru) |
HU (1) | HUP9901546A3 (ru) |
IL (1) | IL122340A0 (ru) |
IS (1) | IS4615A (ru) |
MY (1) | MY119003A (ru) |
NO (1) | NO975490L (ru) |
NZ (1) | NZ303356A (ru) |
PL (1) | PL323741A1 (ru) |
RU (1) | RU2195463C2 (ru) |
SK (1) | SK155297A3 (ru) |
TR (1) | TR199701471T1 (ru) |
TW (1) | TW570925B (ru) |
WO (1) | WO1996038475A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012102645A2 (en) | 2011-01-27 | 2012-08-02 | «Garmonia», Ltd. | Peptide pharmaceutical composition, means for treatment of helicobacter pylori induced gastroduodenal diseases on the basis thereof, and a method of use thereof |
RU2751918C2 (ru) * | 2016-05-26 | 2021-07-20 | Сагабио Ко., Лтд. | Моноклональное антитело, подавляющее иммуносупрессорные функции патогенов, антиген-связывающий фрагмент указанного антитела и гибридомы, вырабатывающие указанное антитело |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2682122B1 (fr) * | 1991-10-03 | 1995-06-09 | Pasteur Institut | Nouveaux genes d'helicobacter pylori. leur utilisation pour la preparation de souches recombinantes de h. pylori. |
US5843460A (en) * | 1993-05-19 | 1998-12-01 | Institut Pasteur | Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides |
JPH08509873A (ja) | 1993-05-19 | 1996-10-22 | アンスティテュ・パストゥール | ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列 |
KR100333113B1 (ko) * | 1993-07-27 | 2002-11-27 | 시에스엘 리미티드 | 헬리코박터피롤리관련위십이지장질환의치료방법 |
US6406703B1 (en) | 1993-07-27 | 2002-06-18 | Csl Limited | Treatment of H. pylori associated gastroduodenal disease |
AUPM612494A0 (en) * | 1994-06-08 | 1994-06-30 | Csl Limited | Treatment or prevention of helicobacter infection |
CN1186516A (zh) * | 1995-06-07 | 1998-07-01 | 阿斯特拉公司 | 与幽门螺杆菌相关的诊断和治疗用的核酸和氨基酸序列 |
CA2284671A1 (en) * | 1997-03-26 | 1998-10-01 | Kevin P. Killeen | Carbohydrate antigens which immunoreact with polyclonal antisera against h. pylori |
EP1017417A1 (en) * | 1997-04-30 | 2000-07-12 | Merieux OraVax SNC | ANTI-$i(HELICOBACTER) VACCINE COMPOSITION FOR USE BY THE SUBDIAPHRAGMATIC SYSTEMIC ROUTE, AND COMBINED MUCOSAL/PARENTERAL IMMUNIZATION METHOD |
SE9702242D0 (sv) * | 1997-06-12 | 1997-06-12 | Astra Ab | Vaccine compositions V |
SE9702241D0 (sv) * | 1997-06-12 | 1997-06-12 | Astra Ab | Vaccine compositions IV |
US7393529B2 (en) | 1998-04-09 | 2008-07-01 | Idexx Laboratories, Inc. | Methods and compositions for inhibiting binding of IgE to a high affinity receptor |
SE9801288D0 (sv) * | 1998-04-14 | 1998-04-14 | Astra Ab | Vaccine delivery system and metod of production |
WO1999057278A2 (en) * | 1998-04-30 | 1999-11-11 | Chiron S.P.A. | IMMUNIZATION AGAINST AND TREATMENT FOR INFECTION BY $i(H.PYLORI) |
AU3205000A (en) * | 1999-02-19 | 2000-09-04 | Astrazeneca Ab | Expression of helicobacter polypeptides in pichia pastoris |
GB9924351D0 (en) | 1999-10-14 | 1999-12-15 | Brennan Frank | Immunomodulation methods and compositions |
EP1278768B1 (en) * | 2000-04-27 | 2006-11-15 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method for identifying helicobacter antigens |
GB0010371D0 (en) * | 2000-04-29 | 2000-06-14 | Astrazeneca Ab | Helicobacter pylori antigens |
US20020107368A1 (en) * | 2000-12-07 | 2002-08-08 | Jing-Hui Tian | Helicobacter proteins, gene sequences and uses thereof |
CA2535799A1 (en) | 2003-08-15 | 2005-03-03 | University Of Florida | Identification of porphyromonas gingivalis virulence polynucleotides for diagnosis, treatment, and monitoring of periodontal diseases |
US7381547B2 (en) * | 2004-04-28 | 2008-06-03 | Tzam Diagnostics, Llc | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR |
KR100613924B1 (ko) * | 2004-06-23 | 2006-08-21 | 현대자동차주식회사 | 자동차 연료 시스템 |
US20090269362A1 (en) * | 2005-07-25 | 2009-10-29 | Sant Andrea J | Method for Controlling Immunodominance |
CN101784655A (zh) * | 2007-04-27 | 2010-07-21 | 菲尼克斯股份有限公司 | 可溶性重组二十面体病毒样颗粒的改良生成和体内装配 |
CN101496898B (zh) * | 2009-02-16 | 2011-06-15 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗 |
CN108495650A (zh) | 2015-12-14 | 2018-09-04 | 慕尼黑工业大学 | 幽门螺杆菌疫苗 |
CN107456578A (zh) * | 2016-06-03 | 2017-12-12 | 硕英生医股份有限公司 | 一种关闭病原体的免疫抑制功能的方法及其用途 |
EP3272354A1 (en) | 2016-07-20 | 2018-01-24 | Technische Universität München | Agents and methods for the prevention or treatment of h. pylori infections |
CN111467368B (zh) * | 2020-04-13 | 2021-05-28 | 江南大学 | 含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用 |
CN113144182B (zh) * | 2021-04-22 | 2023-03-10 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种幽门螺杆菌口服缓释疫苗及其制备与应用 |
CN113896775A (zh) * | 2021-08-25 | 2022-01-07 | 河北医科大学第四医院 | 幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1990010458A1 (en) * | 1989-03-09 | 1990-09-20 | Praxis Biologics, Inc. | Vaccines for nontypable haemophilus influenzae |
US5721349A (en) * | 1992-02-26 | 1998-02-24 | Vanderbilt University | Vacuolating toxin-deficient H. pylori |
MX9301706A (es) * | 1992-04-13 | 1994-05-31 | Oravax Inc | Composicion de vacuna para el tratamiento de la infeccion por helicobacter. |
US5420014A (en) * | 1992-04-30 | 1995-05-30 | Auspharm International Ltd. | Rapid in vitro test for helicobacter pylori using saliva |
-
1996
- 1996-05-22 AR ARP960102670A patent/AR003125A1/es unknown
- 1996-05-30 MY MYPI96002075A patent/MY119003A/en unknown
- 1996-06-03 CZ CZ973573A patent/CZ357397A3/cs unknown
- 1996-06-03 SK SK1552-97A patent/SK155297A3/sk unknown
- 1996-06-03 RU RU98100200/13A patent/RU2195463C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-06-03 CA CA002222797A patent/CA2222797A1/en not_active Abandoned
- 1996-06-03 KR KR1019970708610A patent/KR19990022131A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-06-03 BR BR9608627A patent/BR9608627A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-06-03 JP JP53641496A patent/JP3380559B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-03 EE EE9700306A patent/EE9700306A/xx unknown
- 1996-06-03 EP EP96917779A patent/EP0828757A1/en not_active Withdrawn
- 1996-06-03 IL IL12234096A patent/IL122340A0/xx unknown
- 1996-06-03 HU HU9901546A patent/HUP9901546A3/hu unknown
- 1996-06-03 TR TR97/01471T patent/TR199701471T1/xx unknown
- 1996-06-03 CN CN96195684A patent/CN1191544A/zh active Pending
- 1996-06-03 PL PL96323741A patent/PL323741A1/xx unknown
- 1996-06-03 WO PCT/SE1996/000727 patent/WO1996038475A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-06-03 US US08/669,560 patent/US6025164A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-20 TW TW085110165A patent/TW570925B/zh active
- 1996-12-05 NZ NZ303356A patent/NZ303356A/en unknown
-
1997
- 1997-11-17 IS IS4615A patent/IS4615A/is unknown
- 1997-11-28 NO NO975490A patent/NO975490L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-09-15 US US09/396,975 patent/US20020168726A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CATHERINE J. LUKE. Identification of a 29 kDa flagellar sheath protein in Helicobacter pylori using a murine monoclonal antibogy. Microbiology. 1995, vol.141, p.597-604. * |
DOLORES G. EVANS. Cloning, Nucleotide Sequence and Expression of a Gene Encoding an Adhesin Subunit Protein of a Helicobacter pylori. Journal of Bacteriology. 1993, vol.175, No 3, p.674-682. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012102645A2 (en) | 2011-01-27 | 2012-08-02 | «Garmonia», Ltd. | Peptide pharmaceutical composition, means for treatment of helicobacter pylori induced gastroduodenal diseases on the basis thereof, and a method of use thereof |
RU2751918C2 (ru) * | 2016-05-26 | 2021-07-20 | Сагабио Ко., Лтд. | Моноклональное антитело, подавляющее иммуносупрессорные функции патогенов, антиген-связывающий фрагмент указанного антитела и гибридомы, вырабатывающие указанное антитело |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1996038475A1 (en) | 1996-12-05 |
EE9700306A (xx) | 1998-06-15 |
NO975490L (no) | 1998-01-07 |
MX9709194A (es) | 1998-07-31 |
AU6020596A (en) | 1996-12-18 |
PL323741A1 (en) | 1998-04-14 |
US20020168726A1 (en) | 2002-11-14 |
BR9608627A (pt) | 1999-06-15 |
EP0828757A1 (en) | 1998-03-18 |
AU703331B2 (en) | 1999-03-25 |
TR199701471T1 (xx) | 1998-02-21 |
HUP9901546A3 (en) | 2003-07-28 |
CZ357397A3 (cs) | 1998-05-13 |
JPH11507210A (ja) | 1999-06-29 |
AR003125A1 (es) | 1998-07-08 |
TW570925B (en) | 2004-01-11 |
NZ303356A (en) | 1999-05-28 |
US6025164A (en) | 2000-02-15 |
MY119003A (en) | 2005-03-31 |
JP3380559B2 (ja) | 2003-02-24 |
NO975490D0 (no) | 1997-11-28 |
CN1191544A (zh) | 1998-08-26 |
IS4615A (is) | 1997-11-17 |
KR19990022131A (ko) | 1999-03-25 |
HUP9901546A2 (hu) | 1999-08-30 |
IL122340A0 (en) | 1998-04-05 |
CA2222797A1 (en) | 1996-12-05 |
SK155297A3 (en) | 1998-08-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2195463C2 (ru) | Антиген helicobacter pylori и вакцинная композиция | |
EA001789B1 (ru) | Выделенные, по существу очищенные, поверхностные антигены белковой природы neisseria meningitidis и neisseria gonorrhoeae, их фрагменты и последовательности днк | |
Kostrzynska et al. | Molecular characterization of a conserved 20-kilodalton membrane-associated lipoprotein antigen of Helicobacter pylori | |
JP4368944B2 (ja) | 防御用ヘリコバクター抗原 | |
US7488814B2 (en) | Polynucleotides encoding novel proteins in enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) useful for diagnosis and therapy of EAEC infections | |
US20020028210A1 (en) | Vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide | |
JP2001523954A (ja) | 76 kDa、32 kDa、および50 kDaヘリコバクター(Helicobacter)ポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチド分子 | |
AU703331C (en) | Helicobacter pylori antigens and vaccine compositions | |
MXPA97009194A (en) | Antigens of helicobacter pylori and compositions of vac | |
AU8048798A (en) | Vaccine compositions comprising the (helicobacter pylori) flge polypeptide | |
AU3390599A (en) | Helicobacter pylori vaccine compositions | |
AU2007216886B2 (en) | Novel proteins in enteroaggregative escherichia coli (EAEC) useful for diagnosis and therapy of EAEC infections | |
WO2001049722A2 (en) | New actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane protein and its uses | |
WO1998056815A1 (en) | VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE HELICOBACTER PYLORI Pfr POLYPEPTIDE | |
EP1113074A1 (en) | Actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane protein and its use | |
WO1998056412A1 (en) | VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE HELICOBACTER PYLORI 26kDa POLYPEPTIDE |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040604 |