CN108495650A

CN108495650A - 幽门螺杆菌疫苗

Info

Publication number: CN108495650A
Application number: CN201680073261.3A
Authority: CN
Inventors: 托比亚斯·克鲁泽; 丹尼尔·霍恩伯格; 马库斯·格哈德; 马蒂亚斯·曼; 费利克斯·迈斯纳
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Technische Universitaet Muenchen
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Technische Universitaet Muenchen
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2018-09-04
Also published as: AU2016374289A1; JP6959937B2; WO2017102779A1; US10828358B2; BR112018012033A2; KR20180096643A; US20180360941A1; CA3007036A1; EP3389703A1; AU2016374289B2; JP2019504875A

Abstract

本发明涉及免疫原性组合物及其在预防或治疗由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)引起或与其相关的疾病或病症，特别是幽门螺杆菌(H.pylori)感染和由幽门螺杆菌引起的胃十二指肠病症中的用途。本发明还涉及在对象中检测幽门螺杆菌感染的方法。

Description

幽门螺杆菌疫苗

技术领域

本发明涉及免疫原性组合物及其在预防或治疗由幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)引起或与其相关的疾病或病症，特别是幽门螺杆菌(H.pylori)感染和由幽门螺杆菌引起的胃十二指肠病症中的用途。本发明还涉及在对象中检测幽门螺杆菌感染的方法。

背景技术

幽门螺杆菌(H.pylori)是一种微需氧革兰氏阴性细菌，能够在人的胃中终身持续存在。幽门螺杆菌感染是人中最常见的细菌感染性疾病：根据地区的社会经济状况，全球一半人口感染有幽门螺杆菌(Perez-Perez等，2004)。这种感染与许多胃疾病，例如慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌或胃部癌症和黏膜相关性淋巴样组织(mucosa associatedlymphoid tissue，MALT)淋巴瘤相关(Nomura等，1994；Forman，1996；Parsonnet等，1991；Blaser等，1995)。幽门螺杆菌是胃癌(第三最常见的癌症类型，2011年全球有983.000例病例)的主要原因(Jemal等，2011)。

胃癌伴随着相当大的社会经济成本。目前治疗一名胃癌患者的费用为约50,000欧元。预防胃癌包括早期治疗由幽门螺杆菌引起的感染。据估计，患有由幽门螺杆菌引起的感染的个体中至少有三分之一需要治疗。目前，难以预测哪些患者会发生与幽门螺杆菌感染相关的后续疾病。根据大量研究的结果，预防胃癌的对幽门螺杆菌感染的一般治疗是具有成本效益的，因为其将会预防超过95％的病例(Graham&Shiotani，2005)。患有胃溃疡、癌前或确定性胃癌的患者，胃癌患者的亲属，以及需要长期非类固醇抗炎药物(包括用于心血管疾病的阿司匹林)治疗的患者被明确指出进行治疗。由于在日本胃癌的比率较高，在那里建议所有感染幽门螺杆菌的个体都进行治疗，但是抗生素抗性比率稳定提高(Shiota等，2010)。

迄今为止，由幽门螺杆菌引起的感染的标准治疗由与质子泵抑制剂(例如奥美拉唑)组合的两种抗生素组成。一周治疗的费用为每位患者约200欧元。这种治疗在一些患者中具有显著的副作用，并且导致抗性病原体急剧增加。由于二线和三线治疗经常失败，所有患者中超过10％不能再接受治疗(Gao等，2010)，估计截止2020年其可能上升至60％。如果有可用的针对幽门螺杆菌的疫苗，则可以使数百万患者受益，并显著降低医疗成本。疫苗在对抗流行性感染性疾病方面高度有效。事实上，美国疾病控制中心(U.S.Center ofDisease Control)称疫苗接种是预防感染性疾病最有效的方法(U.S.CDC，2011)。然而，迄今为止，还没有可用的针对幽门螺杆菌的用于人的有效疫苗。Novartis在2010年使用基于三种抗原(CagA、VacA、NapA)的幽门螺杆菌疫苗完成的II期临床试验被认为是不成功的。由于这些抗原非常可变，并且仅在一些幽门螺杆菌菌株中存在，因此预期仅具有部分保护。

因此，本发明的一个目的是鉴定在对象中引发免疫应答并且适合作为针对幽门螺杆菌的泛保护性疫苗的幽门螺杆菌多肽。本发明的另一个目的是提供包含这些多肽/抗原中一种或更多种的免疫原性组合物，所述组合物可用于预防或治疗由幽门螺杆菌引起或与其相关的疾病或病症。本发明的另一个目的是鉴定可以用作幽门螺杆菌感染的生物标志物的多肽/抗原，并基于其用途提供用于在对象中检测幽门螺杆菌感染的方法。

发明概述

在一方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包含：

(a)至少一种分离的(多)肽，其包含：(i)选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列；或(ii)(i)的免疫原性变体；或(iii)(i)或(ii)的免疫原性片段；或

(b)编码根据项目(a)的分离的(多)肽的至少一种核酸分子。

在一个实施方案中，分离的(多)肽是重组(多)肽。

在一个实施方案中，免疫原性片段包含细胞外结构域或其片段。

在一个实施方案中，免疫原性变体包含与选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原，其中优选地，另外的抗原选自幽门螺杆菌的外膜蛋白和毒力因子蛋白、其免疫原性片段，以及编码这些蛋白质或片段的核酸分子。

在一个实施方案中，分离的(多)肽是融合蛋白。

在一个实施方案中，融合蛋白包含：

(i)选自SEQ ID NO：1至7的第一氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段，以及选自SEQ ID NO：1至7的优选不同的第二氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段；或

(ii)选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段，以及来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原，其中优选地，另外的抗原选自幽门螺杆菌的外膜蛋白和毒力因子蛋白及其免疫原性片段；或

(iii)选自SEQ ID NO：1至7的第一氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段，选自SEQ ID NO：1至7的优选不同的第二氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段，以及来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原，其中优选地，另外的抗原选自幽门螺杆菌的外膜蛋白和毒力因子蛋白及其免疫原性片段。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含根据项目(a)的至少两种不同的分离的(多)肽或根据项目(b)的至少两种不同的核酸分子。

在一个实施方案中，核酸分子是DNA或RNA，其中优选地，核酸分子包含在载体中。

在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含至少一种佐剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物是疫苗。

在另一方面，本发明涉及如本文限定的免疫原性组合物，其用作药物。

在另一方面，本发明涉及如本文限定的免疫原性组合物或涉及与根据项目(a)的分离的(多)肽特异性结合的多肽配体，其用于预防或治疗由幽门螺杆菌引起或与其相关的疾病或病症的方法，其中优选地，所述疾病或病症选自幽门螺杆菌感染和由幽门螺杆菌引起的胃十二指肠病症。

在另一方面，本发明涉及如本文限定的免疫原性组合物或与根据项目(a)的分离的(多)肽特异性结合的多肽配体在制备用于预防或治疗由幽门螺杆菌引起或与其相关的疾病或病症的药物中的用途，其中优选地，所述疾病或病症选自幽门螺杆菌感染和由幽门螺杆菌引起的胃十二指肠病症。

在另一方面，本发明涉及预防或治疗由幽门螺杆菌引起或与其相关的疾病或病症的方法，其中优选地，所述疾病或病症选自幽门螺杆菌感染和由幽门螺杆菌引起的胃十二指肠病症，所述方法包括向有此需要的对象施用如本文限定的免疫原性组合物或与根据项目(a)的分离的(多)肽特异性结合的多肽配体。

在一个实施方案中，胃十二指肠病症选自胃炎、慢性胃炎、胃或十二指肠溃疡、胃癌和MALT淋巴瘤。

在另一方面，本发明涉及药盒，其包含如本文限定的免疫原性组合物。

在另一方面，本发明涉及在对象中检测幽门螺杆菌感染的方法，其包括以下步骤：

(a)提供如本文限定的至少一种分离的(多)肽，其中优选地，至少一种分离的(多)肽被固定在固体支持物上；

(b)使至少一种分离的(多)肽与从对象获得的生物样品接触；以及

(c)确定生物样品中与至少一种分离的(多)肽特异性结合的抗体的存在或不存在，

其中抗体的存在指示对象中的幽门螺杆菌感染。

在另一方面，本发明涉及(多)肽或与该(多)肽特异性结合的抗体作为幽门螺杆菌感染的生物标志物的用途，所述(多)肽包含：(i)选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列；或(ii)(i)的免疫原性变体；或(iii)(i)或(ii)的免疫原性片段。

在另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含如本文限定的至少一种分离的(多)肽，优选如本文限定的多种不同的分离的(多)肽。

在一个实施方案中，如本文限定的至少一种分离的(多)肽或如本文限定的多种不同的分离的(多)肽被固定在固体支持物上。

在另一方面，本发明涉及如上限定的试剂盒用于在对象中检测幽门螺杆菌感染的用途。

附图简述

图1是举例说明通过表在蛋白质组修剪(surfome shaving)来鉴定疫苗候选物的方案。

图2示出了通过Ni-NTA亲和色谱和尺寸排阻色谱纯化的新鉴定疫苗候选物的经考马斯染色SDS凝胶。

图3示出了新鉴定的疫苗候选物的酶联免疫吸附测定(ELISA)数据，其表明每种受试疫苗候选物都能够引发体液免疫应答。

图4示出了流式细胞术分析，其确定每种受试疫苗候选物都暴露于细胞表面，参见(B)和(C)。通过balb/c小鼠的免疫接种产生针对疫苗候选物和对照蛋白的特异性抗体(A)。

图5示出了小鼠的疫苗接种研究，其确认用jhp_0775单独(C)和与幽门螺杆菌γ-谷氨酰转肽酶(HPG)组合(D)免疫接种使得细菌负荷显著降低。(A)和(B)中示出了实验设置。

图6示出了酶联免疫吸附测定(ELISA)，其示出了用jhp_0775单独和与HPG组合免疫接种后小鼠中的体液应答(B)。(A)中示出了作为该测定基础的检测模式。

图7示出了脾细胞的细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining，ICCS)，其显示用jhp_0775免疫接种在小鼠中诱导特异性T-细胞应答，参见(A)和(B)。

发明详述

虽然在上下文中详细描述了本发明，但应当理解的是，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅用于描述一些特定实施方案的目的，并不意欲限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。除非另外限定，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

在下文中，将描述本发明的某些要素。这些要素可以随一些特定的实施方案而列出，然而，应当理解的是，其可以以任何方式和任意数量组合以产生另外的实施方案。不应将不同描述的实施例和优选实施方案解释为将本发明限制于仅明确描述的一些实施方案。该描述应当被理解为支持并且涵盖将明确描述的实施方案与任意数量的公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任意排列和组合都应认为被本申请的说明书公开。

优选地，本文使用的术语如以下中所述进行限定：“A multilingual glossary ofbiotechnological terms(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，和H.编辑，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland，(1995)。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用在本领域文献中解释的化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法(参见例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，J.Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 2000)。

除非上下文另有要求，否则在该说明书和所附权利要求书通篇，词语“包含/包括”及其变化形式将被理解为意在包括所述成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组而不排除任何其他成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组，但是在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组，即该主题在于包括所述成员、整数或步骤或成员、整数或步骤的组。除非本文另有说明或明显与上下文矛盾，否则在描述本发明的情况下(特别是在权利要求书的情况下)使用的没有数量词修饰的名词以及类似引用应解释为涵盖一个/种或更多个/种。本文对数值范围的记载仅仅是为了作为单独指代落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都并入说明书中，如同其在本文单独记载一样。除非本文另有说明或在其他情况下明显与上下文矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任意合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如/如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不是对本发明另外要求保护的范围进行限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为表示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。

在本说明书的正文通篇引用了数个文件。本文无论是在上文还是在下文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)均在此通过引用整体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于该公开内容。

本发明人已使用表在蛋白质组修剪方法来鉴定作为针对幽门螺杆菌的合适疫苗候选物的蛋白质。所述蛋白质是推定的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)，其通常是免疫系统的有吸引力的靶标。其被克隆、在大肠杆菌(E.coli)中重组产生、纯化，并且成功地测试在小鼠中引发体液免疫应答。鉴于其在幽门螺杆菌中的高保守性，预期所述蛋白质赋予针对幽门螺杆菌的泛保护性免疫。

本发明提供了免疫原性组合物，其包含：

(a)至少一种分离的(多)肽，其包含以下或由以下组成：(i)选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列；或(ii)其免疫原性变体(即(i)的免疫原性变体)；或(iii)(i)或(ii)的免疫原性片段；或

(b)编码根据项目(a)的分离的(多)肽的至少一种核酸分子。

如本文所用，术语“免疫原性的”意指在对象中引发免疫应答的能力，即诱导体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答的能力。“体液免疫应答”由见于细胞外体液中的大分子(例如分泌抗体、补体蛋白和某些抗微生物肽)介导。“细胞介导的免疫应答”涉及响应于抗原的吞噬细胞、抗原特异性T淋巴细胞的激活，以及多种细胞因子的释放。在一个实施方案中，免疫应答由抗体介导(＝抗体应答)。如本文所用，术语“免疫原性片段”优选地是指这样的片段，其能够引发对该片段所来源的(多)肽具有特异性的免疫应答。

如本文所用，术语“对象”涉及任何生物体，例如脊椎动物，特别是任何哺乳动物，包括人和另外的哺乳动物二者，例如啮齿动物、兔或猴的动物。啮齿动物可以是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或栗鼠。优选地，对象是人。在一个实施方案中，对象是患有或怀疑患有疾病，特别是本文公开的疾病的对象，在本文中也称为“患者”。

术语“(多)肽”是指作为肽或多肽的分子。

术语“肽”一般涉及包含至少2个、至少3个、至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、至少12个或至少14个，并且优选多至8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、50个或100个通过肽键连接在一起的连续氨基酸的物质。术语“多肽”和“蛋白质”涉及大肽，优选具有多于100个氨基酸的肽，但术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中一般可互换使用。

术语“分离的(多)肽”意指该(多)肽与其天然环境分离。分离的(多)肽可以处于基本上纯化和/或纯的状态。术语“基本上纯化的”或“基本上纯的”意指该(多)肽基本上不含其他物质，例如天然或在体内与其一起存在和/或与其相关的物质，例如其他蛋白质、核酸、脂质和碳水化合物。

在一个实施方案中，分离的(多)肽是重组(多)肽。

如本文所用，术语“重组(多)肽”意指由重组核酸分子(例如DNA)在活细胞中表达(例如借助于特定的表达载体)产生的(多)肽。重组核酸分子是通过遗传重组的实验室方法(例如分子克隆)形成的核酸分子。

在一个实施方案中，分离的(多)肽在宿主细胞，优选原核宿主细胞(例如大肠杆菌)中产生。

任选地，选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列缺乏N-末端分泌序列(本文也称为信号序列或信号肽序列)，例如SEQ ID NO：1的第1至33位氨基酸、SEQ ID NO：2的第1至22位氨基酸、SEQ ID NO：3的第1至43位氨基酸、SEQ ID NO：4的第1至31位氨基酸或SEQ ID NO：5的第1至20位氨基酸。

在一个实施方案中，本文所述的分离的(多)肽还包含可检测标记或标签。

如本文所用，术语“可检测标记或标签”是指允许检测和/或分离和/或固定本文所述的分离的(多)肽的可检测标记或标签，并且意在包括用于这些目的的本领域中已知的任何标记/标签。特别优选的是亲和标签，例如甲壳质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚(His)(例如6×His或His₆)、Strep-tag 和增溶标签，例如硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)和SUMO；色谱标签，例如FLAG-标签；表位标签，例如V5-标签、myc-标签和HA-标签；荧光标记或标签(即荧光色素(fluorochrome)/荧光团)，例如荧光蛋白(例如GFP、YFP、RFP等)和荧光染料(例如FITC、TRITC、香豆素和菁)；发光标记或标签，例如萤光素酶；和(其他)酶标记(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或葡萄糖氧化酶)。还包括任何前述标记或标签的组合。

(多)肽标记或标签的氨基酸序列可以引入在本文所述的分离的(多)肽的氨基酸序列中的任何位置。例如，其可以添加到所述分离的(多)肽的N-末端和/或C-末端和/或添加至氨基酸侧链，例如通过与赖氨酸进行EDC-NHS偶联。其适用于非肽标记或标签。

根据本发明的分离的(多)肽还可以包含一种或更多种提高分离的(多)肽的稳定性和/或防止其聚集的修饰。术语分离的(多)肽的“稳定性”特别地涉及其“半衰期”，例如体内半衰期。“半衰期”涉及消除分子的一半活性、量或数目所需的时间。防止聚集还将提高分离的(多)肽的储存稳定性。

例如，分离的(多)肽可以与半衰期延长模块融合或缀合。这样的模块是本领域技术人员已知的并且包括例如白蛋白、白蛋白结合结构域、免疫球蛋白的Fc区/结构域、免疫球蛋白结合结构域、FcRn结合基序和聚合物。特别优选的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、透明质酸、聚唾液酸和PEG模拟肽序列。防止分离的(多)肽聚集的修饰对技术人员来说也是已知的，并且包括例如用一个或更多个亲水性氨基酸替换一个或更多个疏水性氨基酸，优选表面暴露的疏水性氨基酸。在一个实施方案中，分离的(多)肽，优选选自SEQID NO：1至7的氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段包含用亲水性氨基酸替换多至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个，优选5个、4个、3个或2个疏水性氨基酸，优选表面暴露的疏水性氨基酸。优选地，分离的(多)肽和/或其以上组分的其他特性，例如其免疫原性不被这样的替换损害。

根据本发明的分离的(多)肽还可以与载体材料例如钥孔血蓝蛋白(KeyholeLimpet Hemocyanin，KLH)、BSA、卵白蛋白等融合或缀合，以允许或促进引发免疫应答并且特别是高滴度抗体的方式将相应的抗原呈递给对象的免疫系统。

如本文所用，术语“与......融合”特别地是指基因融合，例如通过重组DNA技术。

如本文所用，术语“与......缀合”特别地是指得到稳定共价连接的化学和/或酶促缀合。

根据本发明的分离的(多)肽还可以包含允许将分离的(多)肽靶向递送至给定细胞、组织或器官的氨基酸序列，优选将分离的(多)肽靶向至特定细胞类型，例如树突细胞的氨基酸序列。合适的氨基酸序列在例如Sioud等，2013和Apostolopoulos等，2013中描述，并且包括例如具有氨基酸序列^NWYLPWLGTNDW(SEQ ID NO：29)的肽。

术语“部分”或“片段”在本文中可互换使用并且是指连续元件。例如，例如氨基酸序列或蛋白质的结构的一部分是指所述结构的连续元件。蛋白质序列的部分或片段优选包含该蛋白质序列的至少6个，特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个、至少100个、至少150个、至少160个、至少170个、至少180个、至少190个或至少200个连续氨基酸的序列。

在其中如本文限定的(多)肽包含选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列或其免疫原性变体的免疫原性片段的实施方案中，该(多)肽优选地不包含与该免疫原性片段连续的、SEQ ID NO：1至7的相应氨基酸序列或其相应免疫原性变体的另外N-末端和/或C-末端氨基酸序列。

在一个实施方案中，免疫原性片段缺乏N-末端分泌序列。

在一个实施方案中，免疫原性片段由SEQ ID NO：1的第34至201位氨基酸、或SEQID NO：2的第23至285位氨基酸、或SEQ ID NO：3的第44至268位氨基酸、或SEQ ID NO：4的第32至329位氨基酸、或SEQ ID NO：5的第21至477位氨基酸组成。

在一个实施方案中，免疫原性片段包含细胞外结构域或其片段，或由细胞外结构域或其片段组成。这样的序列/结构域可以通过使用本领域技术人员已知的标准生物信息学工具和/或公共数据库来确定。

如本文所用，术语“细胞外结构域”意指蛋白质中非细胞质的或嵌入膜中的那些部分，并且包括位于/暴露于细胞表面或壁膜间隙中的部分。

根据本发明的术语“变体”特别地是指突变体、剪接变体、构象变体、同种型、等位基因变体、物种变体和同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因的正常序列的改变，其意义常常不清楚。完全基因测序通常鉴定给定基因的多种等位基因变体。同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种(或品系)来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应包括任何翻译后修饰变体和构象变体。

为了本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。在蛋白质的N-末端和/或C-末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N-末端和/或C-末端截短变体。

氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入到氨基酸序列中的特定位点，但是随机插入并适当地筛选所得产物也是可能的。

氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸(例如1个、2个、3个、5个、10个、20个、30个、50个或更多个氨基酸)的N-末端和/或C-末端融合体。

氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如去除1个、2个、3个、5个、10个、20个、30个、50个或更多个氨基酸。缺失可以发生在蛋白质的任何位置，例如在N-末端和/或C-末端。

在一个实施方案中，免疫原性变体缺乏N-末端分泌序列。

氨基酸替换变体的特征在于序列中的至少一个残基被去除，并且在其位置插入另一个残基。在一个实施方案中，氨基酸替换变体包含多至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个氨基酸的替换。优选修饰发生在氨基酸序列中在同源蛋白或肽之间不保守的位置和/或用具有类似特性的其他氨基酸替换氨基酸。优选地，蛋白质变体中的氨基酸替换是保守氨基酸替换。保守氨基酸替换涉及用同一氨基酸家族(即其侧链(例如，在电荷和/或大小方面)相关的氨基酸)中的一个氨基酸替换另一个氨基酸。天然存在的氨基酸一般分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同归类为芳香族氨基酸。然而，也可以用具有不同特性的其他氨基酸替换氨基酸，例如用一个或更多个亲水性氨基酸替换一个或更多个(表面暴露的)疏水性氨基酸以降低或抑制分离的(多)肽的聚集，其中优选地，这些(多)肽的其他特性(例如其免疫原性)不被这样的氨基酸替换损害。

具有SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列的蛋白质是来自幽门螺杆菌菌株J99(ATCC700824)的蛋白质。表1给出了其名称和登录号。

在一个实施方案中，免疫原性变体是来自另一幽门螺杆菌菌株的等同蛋白。在一个实施方案中，等同蛋白是同源物，优选直系同源物。

“直系同源物”是通过从单一祖先基因/祖先蛋白物种形成而不是通过基因重复而相关的同源基因/同源蛋白。

优选地，给定参考氨基酸序列(例如，选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列，其任选地缺乏N-末端分泌序列)和作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性(优选同一性)程度将为至少约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。相似性或同一性程度优选地针对参考氨基酸序列的整个长度的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域来提供。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸来提供。在一些优选实施方案中，相似性或同一性的程度/百分比针对参考氨基酸序列的整个长度来提供。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可以使用本领域已知的工具，优选使用最佳序列比对，例如使用Align，采用标准设置，优选EMBOSS：：needle，矩阵：Blosum62，缺口开放10.0，缺口延伸0.5来进行。

“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。

在一个实施方案中，免疫原性变体包含与选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％(例如97％或98％或99％)同一性的氨基酸序列，即，

免疫原性变体包含与SEQ ID NO：1具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％(例如97％或98％或99％)同一性的氨基酸序列；或

免疫原性变体包含与SEQ ID NO：2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％(例如97％或98％或99％)同一性的氨基酸序列；或

免疫原性变体包含与SEQ ID NO：3具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％(例如97％或98％或99％)同一性的氨基酸序列；或

免疫原性变体包含与SEQ ID NO：4具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％(例如97％或98％或99％)同一性的氨基酸序列；或

免疫原性变体包含与SEQ ID NO：5具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％(例如97％或98％或99％)同一性的氨基酸序列；或

免疫原性变体包含与SEQ ID NO：6具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％(例如97％或98％或99％)同一性的氨基酸序列；或

免疫原性变体包含与SEQ ID NO：7具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％(例如97％或98％或99％)同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原。

如本文所用，术语“来自幽门螺杆菌的另外的抗原”优选地是指与根据以上项目(a)和(b)的物质(即分离的(多)肽和核酸分子)不同的抗原。

在一个优选实施方案中，另外的抗原选自幽门螺杆菌的外膜蛋白和毒力因子蛋白、其免疫原性片段，以及编码这些蛋白质或片段的核酸分子。

术语“外膜蛋白”是指与幽门螺杆菌的外膜缔合的蛋白质，其包括整合膜蛋白以及通过N-末端附接的脂质锚定于膜的脂蛋白。其结构和功能进一步描述在例如Koebnik等，2000中。根据本发明使用的特别优选的幽门螺杆菌外膜蛋白选自BabA、HpaA、Omp18、Omp22和SabA。

如本文所用，术语“毒力因子蛋白”是指参与幽门螺杆菌的致病性的蛋白质，例如功能蛋白，例如酶(参见例如Kalali等，2014)。根据本发明的特别优选的毒力因子蛋白是幽门螺杆菌的γ-谷氨酰转肽酶(gGT)(也称为HPGGT或HPG)。合适的HPG蛋白是例如WO 2008/046650 A1中描述的那些，并且包括HPG的酶促失活形式(S451/452A)，其任选地缺乏N-末端分泌序列。

可以是根据本发明的免疫原性组合物的一部分的另外的抗原还是US 2007/0042448 A1或WO 2004/094467 A2中描述的那些。

在一个实施方案中，分离的(多)肽是融合蛋白。

术语“融合蛋白”是指通过将两个或更多个不同的(多)肽或蛋白质连接，优选头尾(即N-末端至C-末端或反之亦然)连接，得到具有来源于每种原始蛋白质的功能特性的单个蛋白质而产生的蛋白质。

在一个实施方案中，融合蛋白包含：

例如，在以上替代方案(i)和(iii)中，

第一氨基酸序列可以是SEQ ID NO：1，并且第二氨基酸可以选自SEQ ID NO：2至7；或

第一氨基酸序列可以是SEQ ID NO：2，并且第二氨基酸可以选自SEQ ID NO：1和3至7；或

第一氨基酸序列可以是SEQ ID NO：3，并且第二氨基酸可以选自SEQ ID NO：1、2和4至7；或

第一氨基酸序列可以是SEQ ID NO：4，并且第二氨基酸可以选自SEQ ID NO：1至3和5至7；或

第一氨基酸序列可以是SEQ ID NO：5，并且第二氨基酸可以选自SEQ ID NO：1至4和6至7；或

第一氨基酸序列可以是SEQ ID NO：6，并且第二氨基酸可以选自SEQ ID NO：1至5和7；或

第一氨基酸序列可以是SEQ ID NO：7，并且第二氨基酸可以选自SEQ ID NO：1至6。

在一个实施方案中，融合蛋白包含(i)选自SEQ ID NO：1至7的至少一个氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段，以及(ii)如本文所述允许将融合蛋白靶向递送至给定细胞、组织或器官的氨基酸序列，优选将融合蛋白靶向至特定细胞类型，例如树突细胞的氨基酸序列。

本发明还提供了如本文限定的融合蛋白。

根据本发明，核酸分子可以是这样形式的分子，其为单链或双链的，并且是线性的或共价闭合以形成环。在一个实施方案中，核酸分子是DNA或RNA。

在本发明的背景下，术语“DNA”涉及包含脱氧核糖核苷酸残基并且优选地完全或基本上由脱氧核糖核苷酸残基组成的分子。“脱氧核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基基团的2’-位缺乏羟基的核苷酸。术语“DNA”包括分离的DNA例如部分或完全纯化的DNA、基本上纯的DNA、合成DNA和重组产生的DNA，并且包括经修饰的DNA，其通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而与天然存在的DNA不同。这样的改变可以包括例如向DNA的末端或在内部(例如在DNA的一个或更多个核苷酸处)添加非核苷酸材料。DNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸。这些改变的DNA可以被称为类似物或天然存在DNA的类似物。

在本发明的背景下，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选地完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基基团的2’-位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括分离的RNA例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA和重组产生的RNA，并且包括经修饰的RNA，其通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而与天然存在的RNA不同。这样的改变可以包括例如向RNA的末端或在内部(例如在RNA的一个或更多个核苷酸处)添加非核苷酸材料。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称为类似物或天然存在RNA的类似物。根据本发明，“RNA”是指单链RNA或双链RNA。在一个实施方案中，RNA是mRNA。在一个实施方案中，RNA是体外转录RNA(in vitrotranscribed RNA，IVT RNA)或合成RNA。

本发明还包括在严格杂交条件下与根据以上项目(b)的核酸分子杂交的核酸分子。

如本文限定的，“严格杂交条件”包括在68℃下在5×SSC/5×Denhardt溶液/1.0％SDS中杂交，并在室温下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤，或包括其本领域公认的等同方案(例如其中在60℃下在2.5×SSC缓冲液中进行杂交然后在37℃下在低缓冲液浓度下进行数个洗涤步骤并且保持稳定的条件)。可以改变盐浓度和温度的参数以实现寡核苷酸与靶核酸之间的最佳同一性水平。关于这样的条件的指导可以在本领域中例如通过以下获得：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，J.Sambrook等编辑，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 2000和Ausubel等(编辑)，1995，CurrentProtocols in Molecular Biology，(John Wiley和Sons，N.Y.)，Unit 2.10。

在一个实施方案中，核酸分子是经密码子优化的，例如被密码子优化成用于在除幽门螺杆菌之外的细菌(例如大肠杆菌)中表达或用于在真核细胞例如哺乳动物细胞(例如CHO细胞、BHK细胞、COS细胞和HEK293细胞)或昆虫细胞(例如SF9细胞、SF21细胞和HighFive^TM细胞)中表达。

在一个实施方案中，核酸分子被容置/包含在载体中。

如本文所用，术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体，黏粒载体，噬菌体载体如λ噬菌体，病毒载体如腺病毒或杆状病毒载体，或人工染色体载体如细菌人工染色体(bacterial artificial chormosome，BAC)、酵母人工染色体(yeastartificial chormosome，YAC)或P1人工染色体(P1 artificial chormosome，PAC)。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体，并且一般包含期望的编码序列和在特定宿主生物体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或在体外表达系统中表达有效连接的编码序列所需的合适DNA序列。克隆载体通常用于改造和扩增某种期望的DNA片段，并且可以缺乏表达期望的DNA片段所需的功能序列。

在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含至少一种佐剂。

术语“佐剂”是指增强针对抗原(例如针对根据以上项目(a)和(b)的物质或如本文限定的来自幽门螺杆菌的另外的抗原)的免疫应答的物质，例如通过提供免疫系统的一般刺激来增强。合适的佐剂是本领域技术人员已知的并且包括基于毒素的佐剂、基于TLR配体的佐剂、基于核酸/载体的佐剂、基于蛋白质的佐剂、基于聚合物的佐剂、黏膜佐剂、ISCOM基质和任何前述物质的组合。特定佐剂包括但不限于聚阳离子聚合物/肽、免疫刺激性脱氧核苷酸(ODN)、合成KLK肽、神经活性化合物(例如人生长激素)、明矾(alumn)、弗氏完全或不完全佐剂、霍乱毒素(CT)、CTA1-DD、热不稳定性肠毒素(LT)、CT或LT的突变体、聚IC、树突细胞(DC)结合肽和C3d融合蛋白。在一个实施方案中，基于TLR配体的佐剂是TLR5配体，其例如来自细菌鞭毛蛋白的组群，例如在WO 2010/050903 A1、Mori等，2012和Song等，2015中描述的那些。在一个实施方案中，佐剂选自霍乱毒素(CT)、CTA1-DD和热不稳定性肠毒素(LT)。

根据本发明，免疫原性组合物包含有效量的活性剂，即本文所述的(多)肽或核酸分子，以产生期望的反应或期望的效果。

根据本发明的免疫原性组合物优选地是无菌的。免疫原性组合物可以以均一剂型提供并且可以以本身已知的方式制备。根据本发明的免疫原性组合物可以例如是溶液或混悬剂的形式。

免疫原性组合物还可以包含一种或更多种载体和/或赋形剂，其全部优选地是可药用的。如本文所用，术语“可药用的”是指材料的无毒性，其优选地不与免疫原性组合物的活性剂的作用相互作用。

术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其中组合了活性组分以促进、增强或实现应用。根据本发明，术语“载体”还包括一种或更多种适合施用于对象的相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。

用于肠胃外施用的可能的载体物质(例如稀释剂)是例如无菌水、林格溶液、乳酸盐林格溶液、生理盐水、抑菌盐水(例如含有0.9％苄醇的盐水)、磷酸缓冲盐水(PBS)、Hank溶液、固定油、聚亚烷基二醇、氢化萘和生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。所得溶液或混悬剂优选地与接受者的血液等张。

如本文所用，术语“赋形剂”旨在包括以下所有物质，其可以存在于药物组合物中，例如根据本发明的免疫原性组合物中，并且其不是活性成分，例如盐、黏合剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇)、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、稳定剂、矫味剂或着色剂。

不可药用的盐可以用于制备可药用盐并且包括在本发明中。这种可药用盐以非限制性方式包括由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐也可以制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。可以添加盐来调节离子强度或张度。

用于药物组合物的合适防腐剂包括抗氧化剂、柠檬酸、柠檬酸钠、苯扎氯铵、氯丁醇、半胱氨酸、甲硫氨酸、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

用于药物组合物的合适缓冲物质包括盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。其他合适的缓冲物质包括精氨酸盐酸盐和精氨酸磷酸盐。

合适的稳定剂包括甘油、抗坏血酸盐/酯和组氨酸。

根据本发明的免疫原性组合物也可以如US 6,838,089 B1和US 6,372,260 B1中所述配制。

根据本发明的免疫原性组合物也可以配制成稳定的冻干产品，其用合适的稀释剂重构，所述稀释剂任选地包含一种或更多种如上所述的赋形剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物是疫苗或包含在疫苗中。

术语“疫苗”是指赋予或提高针对特定疾病的免疫力的制剂。根据本发明的疫苗赋予或提高针对由幽门螺杆菌引起或与其相关的疾病或病症，特别是本文提到的特定疾病的免疫力。

本发明还提供了如本文限定的免疫原性组合物，其用作药物。

如本文所用，术语“药物”是指用于进行治疗(即用于预防或治疗疾病或病症)的物质/组合物。根据本发明，术语“疾病”或“病症”是指任何病理状态。

如本文所用，术语“治疗”涉及改善患者的健康状况和/或延长(增加)患者的寿命的任何治疗。

如本文所用，术语“感染”是指致病因子(在此为幽门螺杆菌)侵入对象的身体组织、其增殖以及组织对这些因子及其产生的毒素的反应。

如本文所用，术语“胃十二指肠病症”(或简称“胃病症”)是指影响胃和邻近十二指肠的病症。“由幽门螺杆菌引起的胃十二指肠病症”是本领域技术人员已知的，并且包括例如胃炎、慢性胃炎、胃萎缩、胃或十二指肠溃疡、胃癌(也称为胃部癌症)和MALT淋巴瘤。

在一个实施方案中，多肽配体选自抗体、抗体衍生物和抗体模拟物。

术语“抗体”(也称为免疫球蛋白，Ig)是指至少包含通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(在本文缩写为VH)和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区。VH和VL区可以被进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变区，其散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

如本文所用，术语“抗体衍生物”是指包含至少一个抗体可变结构域而不具有抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY或IgW)的总体结构，但是仍然能够结合靶分子的分子。所述衍生物可以是但不限于功能性(即靶标结合，特别是特异性靶标结合)抗体片段，例如Fab、Fab2、scFv、Fv、或其部分，或免疫球蛋白的其他衍生物或组合例如纳米抗体、双抗体、微抗体、骆驼科单结构域抗体、单结构域或Fab片段、可变区的重链和轻链结构域(例如Fd、VL(包括Vλ和Vκ)、VH、VHH)以及由通过至少两个结构环连接的免疫球蛋白结构域的两条β链组成的微结构域。优选地，抗体衍生物是单价的。更优选地，衍生物是单链抗体，最优选地具有这样的结构：VL-肽接头-VH或VH-肽接头-VL。

如本文所用，术语“抗体模拟物”是指与抗体类似可以特异性结合抗原但与抗体在结构上不相关的人工(多)肽。其通常显著小于抗体，其中摩尔质量为约3至20kDa。抗体模拟物的非限制性实例是affibody、affilin、affimer、affitin、anticalin、avimer、DARPin、fynomer、Kunits结构域肽、monobody、蛋白A的Z结构域、γB结晶、泛素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)、来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7D、脂质运载蛋白(lipocalin)、膜受体的A结构域、锚蛋白重复基序、Fyn的SH3结构域、蛋白酶抑制剂的Kunits结构域、纤连蛋白的第十个III型结构域，或合成肽配体，其例如来自(随机)肽文库。合成肽配体具有用于与特定靶分子结合的非天然存在氨基酸序列。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”意指与另一靶标的结合相比，与结合剂(例如多肽配体(例如抗体))对之具有特异性的靶标(例如表位)的结合较强。“较强的结合”可以例如通过较低的解离常数(K_D)来表征。在一个实施方案中，如果结合剂能够与预定靶标结合而其不能与其他靶标结合，则该结合剂对所述预定靶标是特异性的。在一个实施方案中，与靶标“特异性结合”的结合剂对于该靶标具有小于10^-5M(例如10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11和10^-12或更小)的K_D值。给定结合剂的K_D值受结合剂的结合速率和解离速率二者影响，并且随温度而变化。在本发明的情况下，优选地在室温下K_D值低于上述值。结合条件优选为生理条件。技术人员知道确定K_D值的不同测定。优选的测定系统是竞争测定。

本文所述的药剂和组合物可以通过任何常规途径施用，例如通过肠内施用或通过肠胃外施用(包括通过注射或输注)。在一个实施方案中，施用肠胃外进行，例如皮内、皮下或肌内进行。在一个实施方案中，使用经黏膜施用，例如经口或舌下施用。

本文所述的药剂和组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的作用的量。在治疗特定疾病或治疗特定病症的情况下，期望的反应优选涉及抑制疾病进程。这包括减慢疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病或治疗病症中的期望的反应也可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或预防所述疾病或所述病症的发生。本文所述的药剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病症；疾病的严重程度；对象的个体参数，包括年龄、生理状况、身高和体重；治疗的持续时间、伴随治疗(如果存在的话)的类型，具体施用途径，和类似因素。因此，本文所述药剂的施用剂量可以取决于多个这样的参数。在对象中的反应在初始剂量下不足的情况下，可以使用较高的剂量(或通过不同的、更局部化的施用途径实现的有效更高剂量)。

本发明还提供了包含如本文限定的免疫原性组合物的药盒。

如本文所用，术语“成套试剂盒/药盒(简称：试剂盒/药盒)”是指包含一个或更多个容器和任选地数据载体的制品。所述一个或更多个容器可以填充有本文公开的一种或更多种装置或试剂。试剂盒/药盒中可包含另外的容器，其含有例如稀释剂、缓冲剂和另外的试剂。所述数据载体可以是非电子数据载体，例如图形数据载体例如信息页、信息表、条形码或存取码；或电子数据载体，例如软盘、光盘(CD)、数字多功能盘(DVD)、微芯片或另外基于半导体的电子数据载体。存取码可以允许访问数据库，例如互联网数据库、集中式数据库或分散式数据库。所述数据载体可以包含关于使用根据本发明的试剂盒/药盒的说明书。

本发明还提供了在对象中检测幽门螺杆菌感染的方法，其包括以下步骤：

其中抗体的存在指示对象中的幽门螺杆菌感染。

在一个实施方案中，所述方法包括使用来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原，其中优选地，所述至少一种另外的抗原被固定在固体支持物上。

在一个实施方案中，在以上方法中使用如本文限定的多种不同的分离的(多)肽，例如以包含如本文限定的多种不同的分离的(多)肽的组的形式使用。在一个实施方案中，该组还包含来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原。

在这样的实施方案中，对象中的幽门螺杆菌感染优选地通过与本文限定的多种不同的分离的(多)肽中至少一种特异性结合的抗体的存在来指不。

如本文所用，术语“固体支持物”(也称为固相)优选地是指能够与本文限定的分离的(多)肽结合的任何固体支持物。这样的支持物可以包含支持材料，例如玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龙、天然或改性纤维素(例如硝化纤维素)、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。支持物可以具有任何可能的结构构型，只要与其结合的分子(例如本文限定的分离的(多)肽)能够与其相应的结合配偶体结合即可。合适的构造包括球形构造(例如珠)、圆柱形构造例如测试容器或孔(其可以是多孔板，例如ELISA板的一部分)的内部和/或底部，或平坦构造例如测试条(例如硝化纤维素条)等。

根据本发明，“生物样品”可以是组织样品(包括体液)和/或细胞样品，并且可以以常规方式获得，例如通过组织活检(包括穿刺活检)和移出血液、支气管抽吸物、痰、尿、粪便或其他体液。根据本发明，术语“生物样品”还包括生物样品的级分。根据本发明的特别优选的生物样品是体液，例如血清和血浆。

进行“确定生物样品中与至少一种分离的(多)肽特异性结合的抗体的存在或不存在”的步骤的可能性是本领域技术人员已知的。

根据本发明优选的是在免疫测定中，优选在固相免疫测定中通过结合配偶体的直接或间接偶联来检测抗体。检测可以在ELISA、放射免疫测定(RIA)或者荧光或化学发光免疫测定中进行。用于这些检测方法的操作是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，通过使用包含本文限定的可检测标记的作为抗人免疫球蛋白抗体的结合配偶体来检测抗体。

根据本发明也可以在凝集测试或凝胶扩散测试中检测抗体。这些检测方法对于本领域技术人员也是已知的。

在一个实施方案中，该方法在步骤(b)之后且在步骤(c)之前包括去除未结合的抗体的步骤(＝洗涤步骤)。

本发明还提供了(多)肽或与该(多)肽特异性结合的抗体或其片段或变体作为幽门螺杆菌感染的生物标志物的用途，所述(多)肽包含：(i)选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列；或(ii)(i)的免疫原性变体；或(iii)(i)或(ii)的免疫原性片段。

如本文所用，术语“生物标志物”是指过程、事件或状况的独特的生物指示物或生物来源指示物。

本发明还提供了试剂盒，其包含如本文限定的至少一种分离的(多)肽，优选如本文限定的多种不同的分离的(多)肽。

在一个实施方案中，该试剂盒包含来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原。

本发明还提供了如上限定的试剂盒用于在对象中检测幽门螺杆菌感染的用途。

通过以下实施例进一步举例说明本发明，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：通过表在蛋白质组修剪鉴定新型幽门螺杆菌疫苗候洗物

在表在蛋白质组修剪中，用胰蛋白酶处理活细菌培养物，并与未经处理的培养物进行比较。通过用胰蛋白酶和/或蛋白酶K处理培养物，蛋白酶对所有暴露且可及的来自细菌表面的蛋白质进行修剪。然后通过质谱分析获得的肽并对单独的蛋白质进行鉴定(Rodriguez-Ortega等，2006)。使用定量质谱术(Cox和Mann，2008)在全蛋白质组对蛋白质强度进行量化，使得能够通过鉴定具有不同丰度的蛋白质来直接比较样品。使用合理的泛保护性疫苗候选物标准缩小所获得的蛋白质列表，所述泛保护性疫苗候选物理想地在相同物种内的保守性大于90％(Moffit等，2011)。然后，将所得蛋白质在大肠杆菌中重组产生，并在体内疫苗研究中测试其保护特性(参见图1)。

使用上述方法，本发明人对幽门螺杆菌的表在蛋白质组进行了分析并且鉴定出七种在相同物种内具有超过90％序列同一性和/或被认为在发病机理中起作用的新型疫苗候选物，其列于下表1中。

表1.如本文鉴定的疫苗候选物的列表，包括登录号和分配的SEQ ID NO。蛋白质trxA用作在UniProt参照簇中的同一性的参考。在登录时(2014年08月)，UniProt中注释了265种幽门螺杆菌菌株。

将表2中列出的蛋白质构建体(其包括缺乏预测的N-末端信号序列的疫苗候选物的截短形式；参见SEQ ID NO：15至19)在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中重组表达，随后通过Ni-NTA亲和色谱术和尺寸排阻色谱术纯化，并在-80℃下储存在等张且等氢离子的缓冲液中。图2示出了经纯化蛋白质的经考马斯染色的SDS凝胶。

表2.用于免疫接种研究的蛋白质构建体的列表

对于初始小鼠的免疫接种研究，在第0天、第7天、第14天和第21天将30μg的每种蛋白质与作为黏膜佐剂的10μg霍乱毒素(CT)一起腹膜内施用四次。用相应的蛋白质包被ELISA板并与从小鼠获得的抗血清一起孵育。通过二抗小鼠抗体-缀合物检测血清抗体与所吸附蛋白质的结合。所有抗血清都显示反应，而CT对照和二抗对照则没有(图3)。ELISA显示所有受试蛋自质都能够在用CT作为佐剂免疫接种后引发体液免疫应答，即所有受试疫苗候选物都被证明是免疫原性的。

为了确定疫苗候选物的表面暴露，将幽门螺杆菌J99的表面用识别相应蛋白质的特异性抗体染色。通过以一周的间隔向野生型balb/c小鼠腹膜内(i.p.)免疫接种30μg抗原和作为佐剂的10μg CT四次针对候选物产生抗血清(图4A)。随后，由全血制备相应的血清，进一步通过蛋白A亲和色谱纯化，并将分离的抗体的浓度调整至约1mg/ml。对幽门螺杆菌J99进行CFDA-SE标记并与抗体一起孵育。通过用第二小鼠660抗体进行标记，并用后续流式细胞术分析来检测抗体-抗原相互作用(图4B)。该实验以用HpaA(HPA；UniProt IDB5Z7F9)(幽门螺杆菌的公知外膜蛋白)、HPG(UniProt ID O25743)(位于细胞质中和外膜囊泡的内部的蛋白质)和仅CT而无抗原(“CT免疫接种”)免疫接种所产生的抗体为对照。

用候选物特异性抗体的染色显示对于所有受试疫苗候选物而言，荧光强度提高远高于CT免疫接种截止对照，证实其表面暴露(图4C)。HPA和HPG对照分别显示荧光强度显著提高或几乎不提高，从而验证实验设置。

实施例2：jhp_0775的体内效力

为了测试jhp_0775的治疗效力，在治疗方案下对小鼠接种疫苗。在第0天、第2天和第4天，用10⁸幽门螺杆菌SS1经口感染野生型balb/c小鼠。随后，在第28天经口对动物进行免疫接种并且在第35天和第42天经口与i.p.组合(图5A)地进行免疫接种。对于用jhp_0775和与HPG组合的jhp_0775经口免疫接种，分别将100μg抗原和30μg抗原与10μg CT一起施用。对于i.p.免疫接种，将30μg抗原与10μg CT一起施用。在第70天，处死小鼠，从胃中提取细菌并平板接种在琼脂板上。5天后，计数菌落形成单位(CFU)(图5B)。图5C/D中的数据显示为中值，并且通过Mann-Whitney U检验确定p值。用jhp_0775单独和与HPG组合免疫接种显著降低细菌负荷，其中p值分别为0.0030和0.0067。这些结果证实了jhp_0775单独和与HPG组合作为疫苗的效力。

通过与上文所述相同的实验从全血制备血清(图5A)。为了通过抗原特异性ELISA分析体液应答，将抗原包被到96孔微量滴定板上。随后，将孔封闭，并将血清以1∶100至1∶100000的连续稀释度添加。接下来，添加二抗小鼠-IgG-HRP缀合物(图6A)。孵育后，添加TMB底物溶液，并用2 N H₂SO₄终止酶促反应。在孵育步骤之间用PBS/0.05％吐温20进行四次洗涤。接受jhp_0775的两组均显示在抗jhp_0775 ELISA中稀释后高吸收值降低，而背景保持恒定在低水平(图6B)。这些结果显示jhp_0775在免疫接种后的免疫原性。

为了通过细胞内细胞因子染色(ICCS)分析针对jhp_0775的细胞免疫应答，通过与上文所述相同的实验分离脾细胞(图5A)。随后，将重组抗原添加到细胞中并孵育2小时。接下来，添加GolgiPlug^TM以抑制细胞因子分泌，导致其细胞内积聚。然后，用EMA(生存力)和针对CD4、IFNg、TNFa、IL-2和IL-17的抗体组对细胞进行染色。随后，通过流式细胞术分析细胞(图7A)，对CD4+细胞进行门控并计数至少100 000个细胞。数据显示为平均值±SD，并且p值由多重比较检验确定，其中星号表示组间显著差异(****p＜0.0001，*p＜0.05)。用jhp_0775和HPG免疫接种的组的CD4+细胞显示细胞因子TNFa、IL-2和IL-17显著产生，证明jhp_0775在免疫接种小鼠后诱导T细胞应答的能力。

参考文献

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19.United States Centers for Disease Control and Prevention(2011).“ACDC framework for preventing infectious diseases”，accessed 20.12.2012.

Claims

1.免疫原性组合物，其包含：

(b)编码根据项目(a)的分离的(多)肽的至少一种核酸分子。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述分离的(多)肽是重组(多)肽。

3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性片段包含细胞外结构域或其片段。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性变体包含与选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含来自幽门螺杆菌(H.pylori)的至少一种另外的抗原，其中优选地，所述另外的抗原选自幽门螺杆菌的外膜蛋白和毒力因子蛋白、其免疫原性片段，以及编码这些蛋白质或片段的核酸分子。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述分离的(多)肽是融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白包含：

(ii)选自SEQ ID NO：1至7的氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段，以及来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原，其中优选地，所述另外的抗原选自幽门螺杆菌的外膜蛋白和毒力因子蛋白及其免疫原性片段；或

(iii)选自SEQ ID NO：1至7的第一氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段，选自SEQ ID NO：1至7的优选不同的第二氨基酸序列或其免疫原性变体或前述任一种的免疫原性片段，以及来自幽门螺杆菌的至少一种另外的抗原，其中优选地，所述另外的抗原选自幽门螺杆菌的外膜蛋白和毒力因子蛋白及其免疫原性片段。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含根据项目(a)的至少两种不同的分离的(多)肽或根据项目(b)的至少两种不同的核酸分子。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子是DNA或RNA，其中优选地，所述核酸分子包含在载体中。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含至少一种佐剂。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物，其是疫苗。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性组合物，其用作药物。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性组合物，其用于预防或治疗由幽门螺杆菌引起或与其相关的疾病或病症的方法，其中优选地，所述疾病或病症选自幽门螺杆菌感染和由幽门螺杆菌引起的胃十二指肠病症。

14.根据权利要求13所述应用的免疫原性组合物，其中所述胃十二指肠病症选自胃炎、慢性胃炎、胃或十二指肠溃疡、胃癌和MALT淋巴瘤。

15.在对象中检测幽门螺杆菌感染的方法，其包括以下步骤：

(a)提供如权利要求1至4、6和7中任一项中限定的至少一种分离的(多)肽，其中优选地，所述至少一种分离的(多)肽被固定在固体支持物上；

(b)使所述至少一种分离的(多)肽与从所述对象获得的生物样品接触；以及

(c)确定所述生物样品中与所述至少一种分离的(多)肽特异性结合的抗体的存在或不存在，

其中抗体的存在指示所述对象中的幽门螺杆菌感染。