CN114907491B

CN114907491B - 一种多表位肽、幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗及制备方法

Info

Publication number: CN114907491B
Application number: CN202210703174.9A
Authority: CN
Inventors: 雷天柱
Original assignee: Northwest Institute of Eco Environment and Resources of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Eco Environment and Resources of CAS
Priority date: 2022-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-06-21
Also published as: CN114907491A

Abstract

本发明公开了一种多表位肽、幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗及制备方法，涉及生物医药技术领域。多表位肽由Hp尿素酶B亚基、CagA、NapA、VacA、HpaA、HspA、GGT以及KatA的优势Th细胞和B细胞抗原表位或区段构成。发明人发现选择上述优势的Th和B细胞抗原表位或区段可以激发机体产生针对这8种Hp黏附因子或毒力因子的高特异性抗体，具有更高的免疫特异性，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。将编码霍乱毒素B亚基(CTB)和多表位肽的基因融合表达，有助于增强Hp黏附因子和毒力因子抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的特异性抗体。

Description

一种多表位肽、幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种多表位肽、幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗及制备方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)简称Hp，是一种生存于胃部及十二指肠的各个区域内的革兰氏阴性微需氧的细菌，它与慢性胃炎、消化性胃溃疡、胃癌和胃黏膜相关组织淋巴瘤(MALT)等胃部疾病相关，被世界卫生组织归为I类致癌因子。我国Hp感染率高达58.07％。基于抗生素、质子泵抑制剂和铋剂联合，开发出的“三联”药物疗法虽然是目前根除Hp感染的有效方法，但该药物疗法存在药物价格昂贵，治疗周期长，病人依从性较差、长期药物治疗使耐药菌增多等弊端。有研究表明，免疫接种Hp疫苗可预防Hp的感染，使人群获得对Hp的持久性免疫力。因此研究开发安全、高效的预防性Hp疫苗是控制和阻断Hp感染切实有效的方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多表位肽、幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗及制备方法以有效控制和阻断Hp感染。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种多表位肽，其由幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基、细胞毒素相关蛋白CagA、中性粒细胞激活蛋白NapA、空泡形成细胞毒素VacA、胃表面受体黏附因子HpaA、热休克蛋白HspA、γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT和过氧化氢酶KatA的优势Th细胞和B细胞抗原表位或区段构成。

幽门螺旋杆菌侵袭胃黏膜细胞，发挥其毒力作用的过程可分为三个方面：(1)通过UreB、HspA以及HapA等蛋白完成对胃黏膜细胞的黏附和定殖。UreB通过水解尿素时产生的氨来中和胃酸对自身的杀伤作用。HspA具有储存镍的功能，作为UreB的镍供体在UreB水解尿素时发挥重要作用。HapA是Hp的鞭毛鞘膜蛋白，可与胃黏膜细胞的表面受体结合，促进Hp在胃黏膜细胞的定殖。(2)通过KatA、NapA等蛋白逃避或减弱宿主对Hp的免疫杀伤。KatA是存在于Hp表面的一种高度保守的过氧化氢酶，可将宿主中性粒细胞产生的有毒代谢物转化成水，帮助Hp逃避宿主的免疫。NapA是一种中性粒细胞激活蛋白，通过促进胃黏膜炎症反应帮助Hp逃避免疫系统的杀伤。(3)通过CagA、VacA以及GGT等毒力蛋白使Hp入侵和破坏胃黏膜细胞。CagA是Hp细胞毒素相关蛋白，促使毒素进入胃黏膜细胞，促进炎症反应的发生，并使胃黏膜发生溃疡和癌变。VacA被称为液泡形成细胞毒素蛋白，与Hp有毒液泡的形成有关，促使胃黏膜细胞的凋亡。GGT是一种γ-谷氨酰胺肽基转移酶可诱导胃黏膜细胞的凋亡和细胞周期的停止。

发明人基于机体对Hp的免疫保护性机制，选择幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基、细胞毒素相关蛋白CagA、中性粒细胞激活蛋白NapA、空泡形成细胞毒素VacA、胃表面受体黏附因子HpaA、热休克蛋白HspA、γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT和过氧化氢酶KatA的优势Th细胞和B细胞抗原表位或区段，通过生物信息学软件对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的多表位肽。该多表位肽可以与分子内黏膜佐剂CTB连接，组成Hp多价表位疫苗。

上述多表位肽可激发针对Hp尿素酶B亚基、CagA、NapA、VacA、HpaA、HspA、GGT以及KatA的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。

发明人发现，若将完整的Hp尿素酶B亚基、CagA、NapA、VacA、HpaA、HspA、GGT以及KatA蛋白进行组合，则存在一定的细胞生物学毒性，而多表位肽只含有这八种Hp黏附因子或毒力因子的优势Th和B细胞抗原表位或区段，避免了其生物学毒性，且能够激发针对这8种Hp黏附因子或毒力因子的高特异性抗体，具有更高的免疫特异性，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。

此外，以Hp尿素酶B亚基、CagA、NapA、VacA、HpaA、HspA、GGT以及KatA等制备Hp八价亚单位基因工程疫苗，存在重组蛋白过大，不易表达、提取、纯化等问题。而多表位肽含有这8种Hp黏附因子或毒力因子的优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对分子量较小，易于表达、提纯和融合。

相应地，由于多表位肽中各抗原表位或区段的分子量很小，又会带来免疫原性很低的问题。而为了解决该问题，发明人将多价抗原表位进行串联，可以在一定程度上增强Hp黏附因子和毒力因子抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的特异性抗体。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述多表位肽由顺序串联的如下肽段构成：

由顺序串联的幽门螺旋杆菌尿素酶B(UreB)亚基的第148-158位氨基酸序列、幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基的第188-198位氨基酸序列、细胞毒素相关蛋白CagA的第584-602位氨基酸序列、中性粒细胞激活蛋白NapA的第4-28位氨基酸序列、空泡形成细胞毒素VacA的第63-81位氨基酸序列、胃表面受体黏附因子HpaA第77-99位氨基酸序列、热休克蛋白HspA的第32-54位氨基酸序列、γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT的第271-293位氨基酸序列、过氧化氢酶KatA的第2-10位、过氧化氢酶KatA的第31-39位和过氧化氢酶KatA的第276-284位构成。

经过生物信息分析，发明人发现选择上述优势的Th和B细胞抗原表位或区段可以激发机体产生针对这8种Hp黏附因子或毒力因子的高特异性抗体，具有更高的免疫特异性，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。

而经过特定顺序的串联，可以增强Hp黏附因子和毒力因子抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的特异性抗体。

上述氨基酸序列的氨基酸位数均是从氨基酸肽链的N端起计。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述任意相邻两个肽段之间均具有间隔序列。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述间隔序列包括不限于KK或GPGPG。在其他实施方式中，其他的间隔序列只要不影响重组蛋白的结构/活性也可行。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述多表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明提供了上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述多表位肽的核酸序列。

本发明还提供了一种核酸，编码上述的多表位肽。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸具有如SEQ ID NO:4所示的序列。

本发明还提供了一种幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，多肽包括霍乱毒素B亚基(CTB)和多表位肽。

发明人将霍乱毒素B亚基(CTB)和多表位肽融合表达，可以获得幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗。经Western Blot、ELISA等多种免疫学方法检测Hp多价表位疫苗的免疫原性和免疫特异性，结果表明Hp八价多表位疫苗能够激发BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶B亚基、CagA、NapA、VacA、HpaA、HspA、GGT以及KatA等蛋白的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。

将编码霍乱毒素B亚基(CTB)和多表位肽的基因融合表达，通过“多价抗原表位串联”和“偶联分子内免疫佐剂CTB”两种设计思路来增强Hp黏附因子和毒力因子抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的特异性抗体。

在本发明应用较佳的实施方式中，霍乱毒素B亚基与多表位肽之间具有间隔序列。

在一种可选的实施方式中，间隔序列为KK或GPGPG。在其他实施方式中，其他的间隔序列只要不影响重组蛋白的结构/活性也可行。

在本发明应用较佳的实施方式中，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种核酸，其编码幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗的活性成分；

在一种可选的实施方式中，核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种表达盒、表达载体、重组菌及重组细胞，其包括上述的核酸。

在一种可选的实施方式中，上述表达盒连接有用于调控上述核酸表达的调控序列，包括不限于启动子、增强子、信号肽编码序列、筛选标记基因、终止子、组氨酸标签等。

重组细胞可以是感受态细胞，例如选自大肠杆菌或酵母感受态细胞。

重组菌包括不限于大肠杆菌，例如BL21、DH5α、Top10等。

表达载体包括不限于pET28等。

本发明还提供了一种幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗的制备方法，制备方法包括：将编码多表位肽的核苷酸序列融合在霍乱毒素B亚基的基因的下游，构建重组表达载体及其重组工程菌，经发酵后，分离纯化获得幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗。

在一种可选的实施方式中，理论上也可将编码多表位肽的核苷酸序列融合在霍乱毒素B亚基的基因的上游。

上述发酵是指：对重组工程菌进行培养，加入或不加入诱导物诱导融合蛋白的表达。

然后对培养物进行重组蛋白的提取，纯化。纯化的目的是为了获得目的条带大小的目标蛋白。

纯化包括不限于：盐沉淀法、亲和层析、凝胶层析等方法。

本发明具有以下有益效果：

本发明基于机体对Hp的免疫保护性机制，选择幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基、细胞毒素相关蛋白CagA、中性粒细胞激活蛋白NapA、空泡形成细胞毒素VacA、胃表面受体黏附因子HpaA、热休克蛋白HspA、γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT和过氧化氢酶KatA的优势Th细胞和B细胞抗原表位或区段，通过生物信息学软件对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的多表位肽。该多表位肽可以与分子内黏膜佐剂CTB连接，组成Hp多价表位疫苗。

而多表位肽含有这8种Hp黏附因子或毒力因子的优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对分子量较小，易于表达、提纯和融合。发明人发现选择上述优势的Th和B细胞抗原表位或区段可以激发机体产生针对这8种Hp黏附因子或毒力因子的高特异性抗体，具有更高的免疫特异性，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。

本发明提供的幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗可用于预防和治疗Hp感染相关性疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Hp八价多表位疫苗CXATE的分子结构设计示意图；

图2为重组表达载体pET28a-CXATE的双酶切鉴定结果图；

泳道M：DNA Marker；泳道1：pET28a-CXATE/EcoR I/Hind III；

图3为重组蛋白CXATE的原核表达后的蛋白电泳图；

泳道M：蛋白质Marker；泳道1：BL21 DE3/pET28a-CXATE全菌蛋白(未经IPTG诱导)；泳道2：BL21 DE3/pET28a-CXATE全菌蛋白(经IPTG诱导1h)；泳道3：BL21 DE3/pET28a-CXATE全菌蛋白(经IPTG诱导2h)；泳道4：BL21DE3/pET28a-CXATE包涵体蛋白(经IPTG诱导3h；泳道5：BL21DE3/pET28a-CXATE包涵体蛋白(经IPTG诱导4h)；

图4为重组蛋白CXATE的Ni-离子树脂亲和层析纯化后的蛋白电泳图；泳道M为蛋白质Marker；泳道1、2为纯化后的CXATE蛋白样品；

图5为Hp八价多表位疫苗CXATE诱发抗Hp尿素酶B(UreB)抗体的检测结果图；

图6为Hp八价多表位疫苗CXATE诱发抗CagA抗体的检测结果图；

图7为Hp八价多表位疫苗CXATE诱发抗NapA抗体的检测结果图；

图8为Hp八价多表位疫苗CXATE诱发抗VacA抗体的检测结果图；

图9为Hp八价多表位疫苗CXATE诱发抗HpaA抗体的检测结果图；

图10为Hp八价多表位疫苗CXATE诱发抗HspA抗体的检测结果图；

图11为Hp八价多表位疫苗CXATE诱发抗GGT抗体的检测结果图；

图12为Hp八价多表位疫苗CXATE诱发抗KatA抗体的检测结果图；

图13为Hp八价多表位疫苗CXATE致敏的小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应统计图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

材料

1.诱导剂IPTG溶液的配制：称取0.6g IPTG置于25ml离心管中，加入20ml无菌水，充分混匀溶解后，定容至25ml。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2.硫酸卡那霉素(Kan)贮液(100mg/mL)：称取100mg硫酸卡那霉素溶于1mL无菌水中，用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃冰箱保存备用。

3.培养基：(1)LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1L，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。固体LB液体培养基另加2％琼脂。

4.DNA电泳缓冲液(25×TAE)：称取121g Tris、18.6g Na₂EDTA·2H₂O和28.6ml冰乙酸，加水定容至1L。

5.SDS-PAGE电泳缓冲液(5×)：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS 5.0g；加入800ml的去离子水，搅拌溶解后用去离子水定容至1L，室温保存；

6.考马斯亮蓝蛋白染色试剂：(1)考马斯亮蓝G-250染液：考马斯亮蓝G-250100mg溶解在50ml 95％乙醇中，然后加入100ml 86％磷酸，用蒸馏水稀释至1L。(2)考马斯亮蓝R-250染液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中。(3)固定液：500ml乙醇、100ml冰醋酸用蒸馏水定容至1L。(4)脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水定容至1L。(5)保存液：25ml 87％甘油溶于225ml脱色液中。

7.RNase A溶液(10mg/ml)：10mg RNase A溶解于987μl水中，加入10μl 1M Tris-HCl(pH7.5)和3μl 5M NaCl，沸水浴15min后，缓慢冷却至室温，分成小份存于-20℃备用。

Lysozyme溶液(10mg/ml)：10mg Lysozyme溶于1ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)。

9.实验动物：BALB/c小鼠为SPF级，雄性，8～10周龄。

10.ELISA试剂：(1)包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。(2)洗涤液(PBST)：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2g KCl，0.5ml Tween-20，加入ddH₂O定容至1L。(3)封闭液：称取3.0g BSA溶解于100ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。(4)反应底物：可溶性单组份TMB底物溶液。(5)终止液：量取蒸馏水178.3ml，逐滴缓慢加入21.7ml(1M H₂SO₄)浓硫酸。

11.淋巴细胞增殖实验主要试剂(1)小鼠脾脏淋巴细胞分离液(上海生工生物工程有限公司)(2)RPMI-1640完全培养液：在RPMI-1640基础培养液加入10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。(3)RPMI-1640不完全培养液：称取10.4g RPMI-1640干粉、2.4gHEPES、0.75g NaHCO₃，加去离子水至1000ml，pH 7.4，超滤除菌，分装。13.BHI血平板：称取3.5g BHI干粉，加蒸馏水93ml，1.5g琼脂粉，121℃灭菌15min，待冷却至60℃以下，加入7ml脱纤维羊血，多粘菌素B(终浓度5μg/ml)，万古霉素(终浓度10μg/ml)和甲氧苄氨嘧啶(终浓度5μg/ml)，分装至培养皿，冷却后备用。14.尿素肉汤：称取葡萄糖1g、蛋白胨1g、磷酸二氢钾2g、氯化钠5g，加蒸馏水至1L，调节PH至7.2，再加入2ml 0.4％酚红溶液，高压灭菌(68.95KPa)20分钟，冷至60℃左右时加入已用滤菌器过滤的1ml 50％尿素溶液，混匀后备用。

实施例1

本实施例对Hp八价多表位疫苗CXATE的分子结构进行设计。

参照图1所示，根据“机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制”和“Hp尿素酶B亚基、细胞毒素相关蛋白CagA、中性粒细胞激活蛋白NapA、过氧化氢酶KatA、空泡形成细胞毒素VacA、胃表面受体黏附因子HpaA、热休克蛋白HspA以及γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT等关键黏附因子或毒力因子抗原表位或区段的免疫学性质”，利用通过生物信息学筛选到的UreB_148-158、UreB_188-198、CagA_584-602、NapA_4-28、VacA_63-81、HpaA_77-99、HspA_32-54、GGT_271-293、KatA_2-10、KatA_31-39、KatA_276-284等抗原表位或区段和分子内黏膜免疫佐剂CTB用于Hp八价多表位疫苗CXATE的构建。

然后，通过表位疫苗的构建理论和生物信息学的分析，对所选择的抗原表位或区段的连接顺序和间隔序列，加以分析和确定，最终设计出具有科学合理结构的Hp八价多表位疫苗CXATE。经MOE和DNAstar等生物信息学软件分析，CXATE具有较好的等电点、抗原性以及合理的高级结构。从设计理论上讲，CXATE能够激发机体产生针对Hp尿素酶B亚基、细胞毒素相关蛋白CagA、中性粒细胞激活蛋白NapA、过氧化氢酶KatA、空泡形成细胞毒素VacA、胃表面受体黏附因子HpaA、热休克蛋白HspA以及γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT等的T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答，能够达到Hp感染性疾病的有效预防和治疗。

实施例2

本实施例构建了重组表达载体pET28a-CXATE。

(1)多表位肽XATE核苷酸序列的基因合成

将前期设计的多表位肽XATE的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，委托通用生物科技公司进行基因合成。

(2)多表位肽XATE基因与pET28a-C表达载体的连接

将合成的多表位肽XATE基因和pET28a-C(含有CTB基因)，用EcoR I/Hind III分别进行双酶切，反应体系如下：

37℃酶切反应1h，然后以1％琼脂糖凝胶电泳分离。分别利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收多表位肽XATE基因和pET28a-C双酶切产物。将回收的pET28a-C线性化载体和XATE基因，在T4-DNA连接酶的作用下16℃过夜连接，形成重组表达载体pET28a-CXATE。

T4-DNA连接酶连接体系如下：

结果：利用EcoR I/Hind III双酶切待检重组质粒pET28a-CXATE，37℃反应2h，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切检测结果中出现一条660bp的DNA片段，与XATE基因大小一致。将pET28a-CXATE送交通用生物科技公司，采用T7启动子和终止子通用引物进行基因测序，证明pET28a-CXATE中融合基因CXATE的核苷酸序列与设计序列一致。重组表达载体pET28a-CXATE双酶切图谱如(图2)所示。

实施例3

本实施例进行重组蛋白CXATE的原核表达。

将测序正确的重组表达质粒pET28a-CXATE转化进BL21 DE3菌株中。在预先制备好的含50μg/mL Kan的LB平板上，接种环划线基因工程菌株BL21DE3/pET28a-CXATE，倒置于37℃培养箱，过夜培养12～16h后，挑取单个菌落，接种于含50μg/ml Kan的10ml LB培养液的三角瓶中，37℃220rpm振摇过夜；次日按1％接种于含50μg/ml Kan的50ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8。取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至IPTG终浓度为0.5mM，37℃220rpm培养4h，诱导CXATE融合蛋白表达。取出1ml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。最后，进行12％SDS-PAGE分析。

结果：将基因工程重组菌株BL21 DE3/pET28a-CXATE在IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导温度37℃、诱导表达4h。与对照菌株对比，基因工程重组菌株BL21 DE3/pET28a-CXATE在约37KDa处出现目的蛋白条带，与重组蛋白CXATE的理论大小相符合(图3)。

实施例4

本实施例对上述实施例中的重组蛋白CXATE进行纯化。

利用低压层析系统，重组蛋白CXATE菌体破碎离心液以0.5ml/min流速上样至Ni-离子树脂Binding-Buffer预平衡的Ni-离子树脂亲和层析柱。用Ni-离子树脂BindingBuffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线。用Ni-离子树脂Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线。用Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(pH7.4)进行透析过夜。最后，进行12％SDS-PAGE分析。

结果：经Ni-离子树脂亲和层析纯化后，可获得较高纯度的重组蛋白CXATE(图4)。

实施例5

本实施例测试Hp八价多表位疫苗CXATE的免疫原性和免疫特异性。

(1)BALB/c小鼠的免疫

实验分组：将SPF级BALB/c小鼠随机分为4组，分别为Hp尿素酶UreB免疫组、重组霍乱毒素CTB免疫组、Hp八价多表位疫苗CXATE免疫组和PBS免疫组。每组6只BALB/c小鼠，共24只，详细分组如下所示：

表1：SPF级BALB/c小鼠分组及免疫方案

免疫方式：用75％酒精对小鼠腹部消毒，然后腹腔注射重组蛋白和弗氏完全佐剂体积比1：1的混合乳化剂；每隔一周加强免疫一次，其中第2和3周使用弗氏不完全佐剂，第4周直接注射重组蛋白溶液。

抗血清的采集：在每次免疫前采取尾部静脉采血，检测血清特异性抗体水平的变化；在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分离，4℃下3000rpm离心5分钟分装血清，-70℃冻存备用。

(2)抗血清中特异性抗体的ELISA检测

将抗原(天然UreB、CagA、NapA、VacA、HpaA、HspA、GGT、KatA)用包被液稀释成5μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清(鼠抗UreB抗血清、鼠抗CXATE抗血清和鼠抗CTB抗血清)和小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10000)，100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应15min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD₄₅₀值。将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

结果参照图5-图12所示：天然Hp尿素酶(UreB)的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，Hp八价多表位疫苗CXATE能够产生与Hp尿素酶(UreB)相近水平的抗尿素酶抗体，而霍乱毒素B亚基(CTB)不能产生抗天然Hp尿素酶抗体(图5)；Hp细胞毒素相关蛋白CagA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp八价多表位疫苗CXATE组能够产生较高水平的抗CagA抗体(图6)；Hp中性粒细胞激活蛋白NapA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp八价多表位疫苗CXATE能够产生较高水平的抗NapA抗体(图7)；Hp空泡形成细胞毒素VacA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp八价多表位疫苗CXATE能够产生较高水平的抗VacA抗体(图8)；Hp胃表面受体黏附因子HpaA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp八价多表位疫苗CXATE免疫组能够产生较高水平的抗HpaA抗体(图9)；Hp热休克蛋白HspA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp八价多表位疫苗CXATE能够产生较高水平的抗HspA抗体(图10)；Hp的γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp八价多表位疫苗CXATE能够产生较高水平的抗GGT抗体(图11)；Hp过氧化氢酶KatA的包被浓度为5μg/ml，通过ELISA检测，只有Hp八价多表位疫苗CXATE能够产生较高水平的抗KatA抗体(图12)。

上述结果说明Hp八价多表位疫苗CXATE能够刺激机体产生针对Hp尿素酶B亚基、细胞毒素相关蛋白CagA、中性粒细胞激活蛋白NapA、空泡形成细胞毒素VacA、胃表面受体黏附因子HpaA、热休克蛋白HspA、γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT以及过氧化氢酶KatA的高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性。

(3)小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

将经抗原免疫的小鼠脊柱脱臼处死，75％酒精浸泡消毒5min后，移入超净工作台。剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。在20ml的无菌小烧杯中放入4～5ml EZ-SepTM Mouse 1×淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入到淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μl的1640培养基；800g离心30min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基制备成5×106/ml细胞浓度的悬液。在96孔平底培养板中，每孔加入100μl细胞，同时加入重组蛋白CXATE、尿素酶B亚基(UreB)、细胞毒素相关蛋白CagA、中性粒细胞激活蛋白NapA、空泡形成细胞毒素VacA、胃表面受体黏附因子HpaA、热休克蛋白HspA、γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT、过氧化氢酶KatA和生理盐水各100μl，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃5％CO₂培养箱中培养60h后，向各孔中加入MTT溶液(5mg/ml)30μl，继续培养4h后，轻轻吸出上清，每孔加入100μl DMSO，振荡混匀后用酶标仪读取OD₅₇₀值。

刺激指数计算公式如下：

结果参照图13所示：Hp八价多表位疫苗CXATE致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经Hp尿素酶B亚基、细胞毒素相关蛋白CagA、中性粒细胞激活蛋白NapA、空泡形成细胞毒素VacA、胃表面受体黏附因子HpaA、热休克蛋白HspA、γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT以及过氧化氢酶KatA和CXATE刺激均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而PBS免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明Hp八价多表位疫苗CXATE中关键黏附因子或毒力因子的Th表位或区段均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答。

综上，本发明提供的幽门螺旋杆菌多表位疫苗能够诱发机体产生针对UreB、CagA、NapA、VacA、HpaA、HspA、GGT、KatA的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院西北生态环境资源研究院

<120>一种多表位肽、幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗及制备方法

<160>4

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>330

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr

1 5 10 15 20

Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile

21 25 30 35 40

Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

41 45 50 55 60

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu

61 65 70 75 80

Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His ALa Ile Ala Ala Ile

81 85 90 95 100

Ser Met Ala Asn Gly Ser Lys Lys Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly

101 105 110 115 120

Pro Gly Pro Gly Glu Tyr Ser Met Asn Leu Gly Phe Leu Ala Lys Lys Lys Leu Val Gly

121 125 130 135 140

Lys Ala Ser Asn Phe Asn Lys Ala Val Ala Glu Ala Lys Asn Thr Gly Gly Pro Gly Pro

141 145 150 155 160

Gly Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val Leu Phe Met Lys Val His

161 165 170 175 180

Asn Phe His Trp Asn Val Gly Pro Gly Pro Gly Trp Gly Leu Lys Gln Ala Glu Glu Ala

181 185 190 195 200

Asn Lys Thr Pro Asp Lys Pro Asp Lys Val Gly Pro Gly Pro Gly Asn Lys Phe Lys Asn

201 205 210 215 220

Gln Thr Thr Leu Lys Val Glu Gln Ile Leu Gln Asn Gln Gly Tyr Lys Val Ile Gly Pro

221 225 230 235 240

Gly Pro Gly Lys Glu Lys Pro Leu Met Gly Val Val Lys Ala Val Ser His Lys Ile Ser

241 245 250 255 260

Glu Gly Cys Lys Cys Val Gly Pro Gly Pro Gly Tyr Arg Gly Tyr Lys Ile Ile Ser Met

261 265 270 275 280

Ser Pro Pro Ser Ser Gly Gly Thr His Leu Ile Gln Ile Leu Gly Pro Gly Pro Gly Val

281 285 290 295 300

Asn Lys Asp Val Lys Gln Thr Thr Lys Lys Val Leu Leu Gln Ser Thr Trp Phe Leu Lys

301 305 310 315 320

Lys Phe His Pro Phe Asp Val Thr Lys Ile

321 325 330

序列2

<210>2

<211>990

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgaccccgc agaacattac cgatctgtgc gcggaatatc ataacaccca gatttatacc 60

ctgaacgata aaatttttag ctataccgaa agcctggcgg gcaaacgcga aatggcgatt 120

attaccttta aaaacggcgc gatttttcag gtggaagtgc cgggcagcca gcatattgat 180

agccagaaaa aagcgattga acgcatgaaa gataccctgc gcattgcgta tctgaccgaa 240

gcgaaagtgg aaaaactgtg cgtgtggaac aacaaaaccc cgcatgcgat tgcggcgatt 300

agcatggcga acggcagcaa aaaagaattc gcctctggtg ttactaccat gattggcgga 360

cctgggcccg gtgaatattc catgaattta ggcttcttgg caaaaaagaa acttgtcgga 420

aaggcgtcaa actttaataa agctgtagcc gaggcaaaga acacaggggg tccaggcccg 480

ggattcgaaa tcctcaaaca tctacaagcg gatgctatag tgctgtttat gaaggttcac 540

aatttccatt ggaacgtcgg gcctggtccc ggctggggat taaaacaggc cgaggaagca 600

aataagacgc cagacaaacc ggataaggta gggcctggtc ccggcaacaa atttaagaat 660

caaactacct tgaaagtgga gcagattctt caaaaccagg gatacaaggt tatcgggcca 720

ggtccgggca aagaaaagcc tctcatggga gtcgtaaaag cggtgtcgca caagataagt 780

gaggggtgta aatgcgttgg tcccggccca ggatatcgtg ggtacaagat tatcagcatg 840

tctccgcctt cctcaggtgg cacacatcta atacaaattc tgggacccgg gccaggtgtc 900

aataaagacg taaagcagac gactaaaaag gtgttattgc aatcgacctg gttccttaaa 960

aagtttcacc cgttcgatgt tacaaaaatc 990

序列3

<210>3

<211>210

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly Phe Leu Ala Lys Lys Lys Leu Val Gly

1 5 10 15 20

Lys Ala Ser Asn Phe Asn Lys Ala Val Ala Glu Ala Lys Asn Thr Gly Gly Pro Gly Pro

21 25 30 35 40

Gly Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val Leu Phe Met Lys Val His

41 45 50 55 60

Asn Phe His Trp Asn Val Gly Pro Gly Pro Gly Trp Gly Leu Lys Gln Ala Glu Glu Ala

61 65 70 75 80

Asn Lys Thr Pro Asp Lys Pro Asp Lys Val Gly Pro Gly Pro Gly Asn Lys Phe Lys Asn

81 85 90 95 100

Gln Thr Thr Leu Lys Val Glu Gln Ile Leu Gln Asn Gln Gly Tyr Lys Val Ile Gly Pro

101 105 110 115 120

Gly Pro Gly Lys Glu Lys Pro Leu Met Gly Val Val Lys Ala Val Ser His Lys Ile Ser

121 125 130 135 140

Glu Gly Cys Lys Cys Val Gly Pro Gly Pro Gly Tyr Arg Gly Tyr Lys Ile Ile Ser Met

141 145 150 155 160

Ser Pro Pro Ser Ser Gly Gly Thr His Leu Ile Gln Ile Leu Gly Pro Gly Pro Gly Val

161 165 170 175 180

Asn Lys Asp Val Lys Gln Thr Thr Lys Lys Val Leu Leu Gln Ser Thr Trp Phe Leu Lys

181 185 190 195 200

Lys Phe His Pro Phe Asp Val Thr Lys Ile

201 205 210

序列4

<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcctctggtg ttactaccat gattggcgga cctgggcccg gtgaatattc catgaattta 60

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gaggcaaaga acacaggggg tccaggcccg ggattcgaaa tcctcaaaca tctacaagcg 180

gatgctatag tgctgtttat gaaggttcac aatttccatt ggaacgtcgg gcctggtccc 240

ggctggggat taaaacaggc cgaggaagca aataagacgc cagacaaacc ggataaggta 300

gggcctggtc ccggcaacaa atttaagaat caaactacct tgaaagtgga gcagattctt 360

caaaaccagg gatacaaggt tatcgggcca ggtccgggca aagaaaagcc tctcatggga 420

gtcgtaaaag cggtgtcgca caagataagt gaggggtgta aatgcgttgg tcccggccca 480

ggatatcgtg ggtacaagat tatcagcatg tctccgcctt cctcaggtgg cacacatcta 540

atacaaattc tgggacccgg gccaggtgtc aataaagacg taaagcagac gactaaaaag 600

gtgttattgc aatcgacctg gttccttaaa aagtttcacc cgttcgatgt tacaaaaatc 660

Claims

1.一种多表位肽，其特征在于，多表位肽由顺序串联的如下肽段构成：

由顺序串联的幽门螺旋杆菌尿素酶B（UreB）亚基的第148-158位氨基酸序列、幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基的第188-198位氨基酸序列、细胞毒素相关蛋白CagA的第584-602位氨基酸序列、中性粒细胞激活蛋白NapA的第4-28位氨基酸序列、空泡形成细胞毒素VacA的第63-81位氨基酸序列、胃表面受体黏附因子HpaA第77-99位氨基酸序列、热休克蛋白HspA的第32-54位氨基酸序列、γ-谷氨酰胺肽基转移酶GGT的第271-293位氨基酸序列、过氧化氢酶KatA的第2-10位、过氧化氢酶KatA的第31-39位和过氧化氢酶KatA的第276-284位构成，所述多表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的多表位肽。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.一种幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，其特征在于，所述多肽包括霍乱毒素B亚基（CTB）和权利要求1所述的多表位肽。

5.根据权利要求4所述的幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗，其特征在于，所述霍乱毒素B亚基与所述多表位肽之间具有间隔序列。

6.根据权利要求5所述的幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗，其特征在于，所述间隔序列为KK或GPGPG。

7.根据权利要求4所述的幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

8.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求4-7任一项所述的幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗的活性成分。

9.根据权利要求8所述的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

10.一种表达盒、表达载体、重组菌及重组细胞，其特征在于，其包括权利要求8-9任一项所述的核酸。

11.一种权利要求4-7任一项所述的幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗的制备方法，其特征在于，制备方法包括：将编码多表位肽的核苷酸序列融合在霍乱毒素B亚基的基因的下游，构建重组表达载体及其重组工程菌，经发酵后，分离纯化获得幽门螺旋杆菌八价多表位疫苗。