CN112457411A

CN112457411A - 一种幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白lhuc及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112457411A
Application number: CN202011343937.0A
Authority: CN
Inventors: 孔令义; 杨蕾; 谢文伟; 赵文锋
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-11-25
Also published as: CN112457411B

Abstract

本发明公开一种重组幽门螺杆菌多表位串联疫苗及其制备方法。本疫苗是由大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)和幽门螺杆菌抗原HpaA、UreB和CAT中挑选的表位组成。本发明提供的幽门螺杆菌多串联表位疫苗能够在胃黏膜中产生高滴度抗体sIgA和血清中特异性IgG抗体。且特异性抗体IgG能显著抑制幽门螺杆菌尿素酶活力。可用作预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗。

Description

一种幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种螺旋状、微需氧的革兰氏阴性菌，是目前发现唯一能够长期定植在人体胃中的病原微生物。全球感染率在50％以上，主要集中在发展中国家，而在发达国家中感染率较低。我国的感染率在30％-50％，主要集中在10岁以内的儿童和40-60岁之间的中老年人群体。它与胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌和胃淋巴癌等胃肠道疾病密切相关。在胃癌患者中至少有90％与幽门螺旋杆菌感染有关，因而世界卫生组织(WHO)将幽门螺旋杆菌定为Ⅰ类致癌因子。目前临床上主要采用联合用药治疗，其中三联疗法最常见。但近年来随着克拉霉素和甲硝唑的耐药性增加、医疗成本过高和再次感染的缺点逐渐暴露，疫苗预防和治疗将成为替代抗生素疗法的重要手段。

幽门螺杆菌定植在酸性胃环境中第一步是吸附在胃黏膜上，所以黏附素对于细菌定植至关重要。幽门螺旋杆菌黏附素A亚基(HpaA)是分布在菌体表面的保守脂蛋白。早期HpaA已经被证明是有效抗原并被广泛用来开发疫苗。为了抵抗胃酸对细菌的攻击，幽门螺旋杆菌中存在一种pH调节机制，其中尿素酶是最关键的蛋白，它可以分解尿素产生NH3中和H+。同时它也是幽门螺旋杆菌中含量最高的蛋白，占菌体总蛋白的10％。尿素酶是由UreA和UreB两个亚基组成,其中活性位点在UreB中，所以亚单位疫苗和活载体疫苗常选用UreB作为抗原。在幽门螺旋杆菌感染过程中机体会产生相应的免疫反应，其中单核细胞和巨噬细胞会产生活性氧(ROS)攻击细菌。细菌中存在过氧化氢酶可以逃避机体免疫系统的攻击，这也是导致胃炎的重要因素。

现有幽门螺杆菌疫苗主要由以下五种形式：(1)全菌活疫苗，是较为传统的疫苗，其抗原成分复杂，含有H.pylori的所有抗原成分，免疫应答效率高，但是其特异性不高、易发生交叉免疫反应，具有致癌的潜在可能性，因此，众多研究者不鼓励发展H.pylori全菌疫苗；(2)亚单位疫苗，是H.pylori疫苗研究的重点，其抗原成分清楚、安全性好、特异性强，常见的亚单位疫苗的抗原主要包括尿素酶(UreA、UreB)、空泡毒素(VacA)、毒素相关蛋白(CagA)、粘附素(BabA、HpaA)等。据统计，选择尿素酶作为疫苗抗原的研究报道占H.pylori疫苗研究文献的70％以上，因此尿素酶已成为H.pylori疫苗首选亚单位抗原；(3)联合疫苗，具有两种或多种抗原成分。单价疫苗存在免疫原性弱、免疫效果差等缺点，而联合疫苗可获得比单价疫苗较好的免疫保护效果，能明显提高动物的免疫保护率；(4)核酸疫苗，属于第三代疫苗。与常规疫苗相比具有生产制备简便、高效、廉价、无致病性、能激发细胞和体液免疫应答等优点；(5)表位疫苗，是疫苗发展的新方向。表位疫苗是采用抗原表位制备而成的疫苗。表位疫苗具有特异性高、免疫原性强等特点，是H.pylori疫苗设计的新思路，具有较好的应用前景。多肽或蛋白的氨基酸序列与生物功能密切相关，有时候仅一个氨基酸残基发生改变，就可能导致生物活性的完全失去或部分降低。因此，一种虽然通过软件可以预测出抗原的优势表位，但是每个抗原具备多个不同的表位，而不同的表位、不同表位间的融合以及不同的连接顺序将直接影响融合蛋白的免疫原性和反应性。

现有的H.pylori疫苗免疫预防或治疗效果均不理想，其可能的原因是：(1)疫苗抗原的选择与组成不合理；(2)免疫佐剂活性不足，存在安全隐患；(3)免疫投递途径与方式不确定，使得免疫应答强度较弱(吴超，李海波等.一种幽门螺杆菌多表位融合蛋白及其制备的多表位疫苗.中国，201210330695.0，212.12.26)。由于H.pylori疫苗项目难度较大，绝大部分还集中在小鼠及灵长类动物身上试验，迄今为止，仅有几家研究单位分别进行了疫苗的I或II期临床试验。1999年由Orovax公司研发的重组H.pylori尿素酶治疗性疫苗进入II期临床试验，虽然有较好的保守性抗原和耐受性，但是需佐剂，且需多剂服用；Oravax公司研究的表达尿素酶的监督沙门菌进入I期临床试验，其服用简单，未产生明确的粘膜免疫反应；Antex Biologics公司研制的灭活全菌抗原疫苗进入II期临床试验，具有较全的免疫性，但制备困难，安全性需进一步考察(邹全明.幽门螺杆菌疫苗的研究进展.胃肠病学[J]，2007，12(9):567-570)。因此，研制出一种用于H.pylori疫苗免疫预防的药物就显得尤为重要了。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC。

本发明目的在于提供该融合蛋白的制备方法。

本发明的又一目的是提供该融合蛋白的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC，包含氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的由HpaA、UreB、CAT中的优势Th细胞和B细胞表位串联而成多表位肽HUC。

本发明多表位肽HUC是从幽门螺杆菌抗原黏附素A亚基HpaA、尿素酶B亚基UreB和过氧化氢酶CAT的优势Th细胞和B细胞表位中挑选，其中包括：HpaA154-171(MEGVLIPAGFIKVTILEP)、HpaA132-141(DPKRTIQKKS)、UreB237-251(VADKYDVQVAIHTDT)、UreB327-334(SIKEDVQF)、UreB349-363(TLHDMGIFSITSSDS)、UreB546-561(FVDGKEVTSKPANKVS)、CAT387-397(SLPGYKEDKSA)、CAT394-405(SARDPKFNLAHI)。

作为本发明的一种优选，所述的融合蛋白LHUC还包括与多表位肽HUC串联的黏膜佐剂；所述的黏膜佐剂选自大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基LTB或霍乱毒素B亚基CTB。

作为本发明的一种优选，所述的融合蛋白LHUC串联于黏膜佐剂下游。

作为本发明的进一步优选，所述的融合蛋白LHUC氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

编码本发明所述的幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC的DNA片段。

作为本发明的一种优选，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

含有本发明所述的编码多表位串联融合蛋白LHUC的DNA片段的重组表达载体。

作为本发明的一种优选，所述的重组表达载体以pET28a表达载体为出发载体，将所述的DNA片段插入pET28a表达载体的NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位点所得。

本发明所述的幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白、所述的编码该融合蛋白的DNA片段、所述的重组表达载体在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。

本发明所述的多表位肽HUC或编码该多表位肽的DNA片段在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。

一种幽门螺杆菌疫苗，其特征在于包含本发明所述的融合蛋白LHUC。

本发明所述的幽门螺杆菌疫苗的制备方法，包括将权利要求4所述的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过工程菌发酵后，清洗包涵体，经Ni柱纯化最后透析复性得到权利要求1所述的融合蛋白LHUC。

本发明还提供上述多串联表位疫苗的制备方法，具体如下：

(1)将筛选得到的并经密码子优化的编码幽门螺杆菌抗原HpaA、UreB和CAT的表位序列与不耐热肠毒素B亚基(LTB)序列串联形成融合蛋白，再将其对应的基因序列插入到表达载体中。

(2)将步骤(1)中的重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白。

有益效果：本发明通过选择幽门螺杆菌多种抗原上的有效表位进行科学合理的组合可以达到更强的免疫效果且避免产生毒副作用。本发明通过将黏膜佐剂LTB与多表位肽HUC串联共表达的方式可以使融合肽LHUC形成一种五聚体的形式来增强其免疫原性。

上述疫苗通过腹腔注射途径免疫BALB/c小鼠，免疫过后取小鼠血清和胃肠黏膜上清评估疫苗抗体效价。结果显示疫苗组小鼠相比对照组小鼠血清产生高水平IgG抗体。且胃肠黏膜中的sIgA抗体水平也比对照组显著升高。表明疫苗具有较强的免疫原性。综上所述，本发明中的疫苗可以显著提高血清中的抗体IgG和胃肠黏膜中的抗体sIgA水平。并且抗体IgG能够与幽门螺杆菌尿素酶结合并有效抑制其酶活来抑制幽门螺杆菌在胃中定植，从而达到预防和治疗幽门螺杆菌感染的目的。

附图说明

图1为本发明8条候选多肽

图2为根据表位预测工具IEDB对8条候选多肽的分析结果，

2、4、8序列在表位CAT387-397和CAT394-405之间、3和7序列在表位UreB349-363和CAT394-405之间连接处表位预测分值较高，有存在接合表位的可能，所以排除。根据二级结构预测结果，无规卷曲处存在抗原表位的可能性较大抗原性较强，序列1的无规卷曲占48.74％，所以1序列(SEQ ID NO:3)作为我们的备选肽链。

图3为本发明重组质粒pET28a-LHUC质粒构建示意图。

图4为本发明重组质粒pET28a-LHUC质粒酶切鉴定示意图。泳道1：Marker，泳道2：酶切前的质粒，泳道3：酶切后的质粒。

图5为本发明SDS-PAGE观察疫苗蛋白表达鉴定结果。泳道1：Marker，

泳道2：未加IPTG诱导的细菌裂解物，泳道3：诱导1小时的细菌裂解物，泳道4：诱导2小时的细菌裂解物，泳道5：诱导3小时的细菌裂解物，泳道6：诱导4小时的细菌裂解物，泳道7：诱导5小时的细菌裂解物。

图6为本发明SDS-PAGE疫苗观察蛋白诱导表达纯化鉴定结果。泳道1：Marker，泳道2：未加IPTG诱导的细菌裂解物，泳道3：加IPTG诱导后的细菌裂解物，泳道4：融合蛋白包涵体沉淀，泳道5：清洗后的包涵体沉淀，泳道6：纯化后的包涵体蛋白。

图7为本发明GM1-ELISA实验结果。结果显示疫苗蛋白和黏膜佐剂LTB，能和神经节苷脂GM1特异性结合，且OD值随着疫苗蛋白和LTB浓度增加而增加。

图8为本发明血清IgG抗体和胃肠黏膜sIgA抗体ELISA检测结果。结果表明，免疫后的小鼠血清和胃肠黏膜中能产生特异性抗体IgG和sIgA，且与对照组相比具有显著性差异。

图9为本发明血清抗体IgG免疫印迹检测结果。实验结果显示疫苗抗体IgG能有效结合疫苗蛋白和黏膜佐剂LTB,而对照组血清中不含有与疫苗蛋白和黏膜佐剂LTB结合的抗体。

图10为本发明血清抗体IgG纯化SDS-PAGE检测结果。泳道1：Marker，泳道2：血清稀释液上柱后的流穿溶液，泳道3：PBS洗脱下的杂蛋白，泳道4-8：甘氨酸洗脱下来的抗体IgG蛋白。

图11为本发明血清抗体IgG中和幽门螺杆菌尿素酶实验结果。结果表明疫苗特异性抗体IgG能有效结合幽门螺杆菌尿素酶并抑制其活性，且抑制率随着抗体浓度增加而增加。

图12为本发明融合肽LHUC对幽门螺杆菌感染小鼠预防实验结果。结果表明用融合肽LHUC预防免疫后能显著抑制幽门螺杆菌定植。

图13为本发明融合肽LHUC对幽门螺杆菌感染小鼠治疗实验结果。结果表明用融合肽LHUC治疗免疫后能显著抑制幽门螺杆菌定植。

具体实施方式

实施例1

根据幽门螺杆菌感染的免疫保护机制，结合文献筛选和生物信息学工具IDEB预测的方式筛选到了3个T细胞表位(HpaA_154-171、UreB_237-251、UreB_546-561)和5个B细胞表位(UreB_349-363、UreB_327-334、CAT_394-405、CAT_387-397和HpaA_132-141)。通过分析各表位间的抗原性和添加氨基酸KK和GS的方式避免各表位间相互影响，对各表位排列顺序进行优化(图1-图2),获得SEQ ID NO:3所示的序列1多肽为备选肽链,命名为HUC。最后将黏膜佐剂LTB连接在多表位肽HUC的N端，中间用一段柔性肽PQDPPP隔开。通过DNASTAR、Expasy和MOE等生物信息学工具分析融合肽的等电点、抗原性、亲水性、稳定性和高级结构等。由理化性质预测结果可知，分子质量为27.8KD，理论等电点为9.42，脂肪指数为78.31；不稳定指数为34.92，属于稳定蛋白质；分子式为C₁₂₄₁H₂₀₁₂N₃₃₀O₃₇₃S₁₀；半衰期大于10h；平均亲水性为-0.49，氨基酸分值最小为-3.48，最大为3.06，表明其为亲水性蛋白质，是一条科学合理的肽链，并将其命名为LHUC。从设计理论上来说，融合肽LHUC能够激发体内产生T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答来抑制幽门螺杆菌在胃内定植。

实施例2重组质粒构建

根据大肠杆菌密码子偏爱性，将疫苗蛋白氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化并交由擎科生物公司合成。在序列的5，端引入NdeⅠ酶切位点，3，端引入HindⅢ酶切位点，将序列插入到pET28a表达载体中。构建好的质粒转入到大肠杆菌DH5ɑ中，在卡那抗性平板上37℃过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR和质粒双酶切验证。质粒酶切和测序验证后进行保存。酶切电泳图参照图4。

实施例3多串联表位疫苗制备与纯化

(1)多串联表位疫苗表达验证

将实施例2中构建的重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆接种于含50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡过夜。按照1：100比例接种于含50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养,当OD 600值在0.6-0.8之间时加入IPTG至终浓度1mM，分别在诱导1、2、3、4、5小时后收集细菌。细菌与蛋白上样缓冲液混匀后在沸水中煮沸10分钟离心，收集上清通过12％SDS-PAGE检测，结果如图5所示。

(2)多串联表位疫苗表达和纯化

按照上述方法培养1L细菌，诱导5小时后，8000rpm/min离心15min收集菌体，100倍体积PBS溶液混匀后，高压均质机进行破壁。12000rpm/min离心30min收集沉淀。依次用含0.5％曲拉通和含2M尿素的PBS溶液各搅拌1小时。离心后收集沉淀，将沉淀用含8M尿素的PBS溶液过夜溶解。

将溶解后的蛋白过0.22um的滤膜，通过Ni柱亲和层析进行纯化。首先用结合缓冲液平衡(50mM PBS，0.3M Nacl，8M尿素)柱子，将样品与填料混匀在摇床上摇晃30min。用洗涤缓冲液(50mM PBS，0.3M Nacl，8M尿素，30mM咪唑)洗去未结合的蛋白。最后用洗脱缓冲液(50mM PBS，0.3M Nacl，8M尿素，200mM咪唑)分管收集目的蛋白，通过12％SDS-PAGE检测，结果如图6所示。

(3)多串联表位疫苗复性

用结合缓冲液稀释目的蛋白并装入透析袋(截留分子量10KD)中透析复性。依次用50倍体积6M尿素、4M尿素、2M尿素、0M尿素4℃透析，每次12小时。最后将透析袋中的的溶液离心收集上清，用超滤管进行浓缩，用BCA法测蛋白浓度，并加入甘油-20℃保存。

实施例4 GM1-ELISA实验检测多串联表位疫苗中佐剂LTB的佐剂活性

将神经节苷脂GM1溶于包被液中并加入到96孔板中，每孔1ug，4℃过夜包被。每孔加入200ul脱脂牛奶37℃封闭2小时，用PBST洗涤4次。将疫苗蛋白、LTB和BSA稀释成浓度为100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.12mg/ml、1.56mg/ml、0.78mg/ml，每孔加入100ul 37℃孵育2小时，用PBST洗涤4次。再将鼠抗LTB多克隆抗体按照1：1000稀释加入96孔板中，37℃孵育2小时，用PBST洗涤4次。再将HRP标记兔抗小鼠IgG多克隆抗体按照1：2000稀释加入96孔板中37℃孵育2小时，用PBST洗涤4次。各孔再加入100ul显色液，37℃孵育15分钟，最后加入50ul 2M H₂SO₄终止反应，450nm测定吸光度。实验结果如图7所示。

实施例5疫苗抗体制备

分别用上述纯化好的疫苗蛋白、佐剂LTB和PBS与完全弗氏佐剂按1：1乳化。腹腔注射到BALB/c雄性小鼠(南京青龙山动物养殖中心)体内，免疫剂量为100ug/只。两周后进行加强免疫，与不完全弗氏佐剂乳化后注射。同样的方法两周后再加强免疫一次，最后一次免疫结束后两周，取眼球静脉血，胃和肠。血液常温静置2小时后，3000rpm/min离心10分钟，得到血清。将胃置于3ml PBS中，匀浆机搅碎离心收集上清。同样的方法，将肠置于5ml PBS中，得到上清，用于评估疫苗抗体效价。

实施例6疫苗抗体效价评估

通过ELISA实验来评估抗体效价，将疫苗蛋白溶于碳酸盐缓冲液置终浓度为5ug/ml，在96孔板中加入100ul 4℃过夜包被，用PBST洗涤4次，再加入200ul脱脂牛奶37℃封闭2小时后备用。

将血清按照1：1000稀释于PBS中，胃肠破碎物上清按照1：10稀释于PBS中，每孔加入100ul，37℃孵育2小时，用PBST洗涤4次。再将HRP标记兔抗小鼠IgG多克隆抗体和HRP标记山羊抗小鼠IgA按照1：2000稀释加入96孔板中37℃孵育2小时，用PBST洗涤4次。各孔再加入100ul显色液，37℃孵育15分钟，最后加入50ul 2M H₂SO₄终止反应，450nm测定吸光度。结果如图8所示。

实施例7免疫印迹法检测疫苗蛋白的免疫原性

取佐剂LTB和疫苗蛋白进行12％SDS-PAGE电泳，200mA恒流1小时电转到PVDF膜上，再将膜放入到5％脱脂牛奶中封闭2小时。分别放入按1：1000稀释的含疫苗抗体IgG的血清和PBS对照组血清中4℃过夜孵育，TBST洗膜三次，每次10分钟。再将膜放入按1：5000稀释的HRP标记兔抗小鼠IgG多克隆抗体中，室温孵育2小时，TBST洗膜三次，每次10分钟。ECL化学发光检测试剂盒显影。结果如图9所示。

实施例8血清抗体IgG纯化

用至少10倍柱体积的PBS对Protein G亲和柱进行平衡，且将血清样品在PBS中稀释20倍。将样品按照1ml/min的流速上样，结合后用20倍柱体积的PBS洗涤，除去杂蛋白。最后用约5倍柱体积的100mM甘氨酸进行洗脱，分管收集洗脱液。通过12％SDS-PAGE检测，结果如图10所示。将洗脱下的抗体混合并在PBS中透析去除甘氨酸，最后用超滤管对抗体进行浓缩，并用BCA法测定蛋白浓度。

实施例9抗体中和尿素酶实验

将50ul幽门螺杆菌尿素酶与50ul不同浓度的疫苗抗体IgG和不同浓度的对照组LTB多克隆抗体混匀，4℃过夜孵育。再加入100ul含有50mmol PBS(PH6.8),500mmol尿素,0.02％酚红,和0.1mmol DTT的尿素酶检测试剂，37℃孵育4小时，550nm波长下检测吸光值，并按照以下公式计算抑制率。实验结果如图11所示。

抑制率＝(无抗体时OD值-有抗体时OD值)/无抗体时OD值。

实施例10融合蛋白LHUC的药效学评估主要从预防和治疗两个方面进行评价。

(1)预防方案：将18只SPF级C57bl/6小鼠分为LHUC、LTB和PBS组，每组6只。免疫组每只小鼠灌胃200ul与完全弗氏佐剂按1：1乳化后的LHUC(100ug)，LTB组每只小鼠灌胃200ul与完全弗氏佐剂按1：1乳化后的LTB(100ug)，PBS组每只小鼠灌胃200ul PBS溶液。一周后同等剂量的LHUC与不完全弗氏佐剂乳化进行灌胃。同样的方法在三四周进行灌胃。在最后一次灌胃两周后，每只小鼠用200ul新培养的幽门螺杆菌NSH57(1×10⁹cfu/ml)进行灌胃，同样的方法一周内进行四次。在最后一次灌胃后两周处死小鼠并取四分之一胃组织置于500ul尿素酶检测试剂中，37℃孵育4小时，550nm波长下检测吸光值。

(2)治疗方案：将18只SPF级C57bl/6小鼠分为LHUC、LTB和PBS组，每组6只。每只小鼠用200ul新培养的幽门螺杆菌NSH57(1×10⁹cfu/ml)进行灌胃，同样的方法一周内进行四次。四周后免疫组每只小鼠灌胃200ul与完全弗氏佐剂按1：1乳化后的LHUC(100ug)，LTB组每只小鼠灌胃200ul与完全弗氏佐剂按1：1乳化后的LTB(100ug)，PBS组每只小鼠灌胃200ulPBS溶液。一周后同样的方法与不完全弗氏佐剂乳化后灌胃，共三次每周一次。在最后一次灌胃后两周处死小鼠并取四分之一胃组织置于500ul尿素酶检测试剂中，37℃孵育4小时，550nm波长下检测吸光值。

预防和治疗实验结果(图12-图13)都显示，LHUC组的OD值显著低于LTB组与PBS组，表明融合肽LHUC免疫后可以显著预防和治疗幽门螺杆菌感染。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Lys Val Lys Phe Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Leu Cys Ala His Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

20 25 30

Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

35 40 45

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

50 55 60

Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

65 70 75 80

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

85 90 95

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105 110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Pro Gln Asp Pro

115 120 125

Pro Pro Met Glu Gly Val Leu Ile Pro Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr

130 135 140

Ile Leu Glu Pro Lys Lys Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala

145 150 155 160

Ile His Thr Asp Thr Lys Lys Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser

165 170 175

Lys Pro Ala Asn Lys Val Ser Lys Lys Thr Leu His Asp Met Gly Ile

180 185 190

Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Lys Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val

195 200 205

Gln Phe Lys Lys Ser Ala Arg Asp Pro Lys Phe Asn Leu Ala His Ile

210 215 220

Gly Ser Ser Leu Pro Gly Tyr Lys Glu Asp Lys Ser Ala Lys Lys Asp

225 230 235 240

Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser

245

<210> 2

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacaaag tgaaattcta cgtgctgttt accgccctgc tgagcagcct gtgcgcccac 60

ggcgccccgc agagcattac cgaactgtgc agcgaatacc acaacaccca gatttatacc 120

atcaatgata aaatcctgag ctataccgaa agcatggcag gcaaacgtga aatggttatt 180

attaccttta aaagcggcgc aaccttccag gttgaagtcc cgggcagcca gcatattgac 240

agccaaaaaa aagcaattga acgtatgaaa gataccctgc gtattaccta tctgaccgaa 300

accaaaattg ataaactgtg tgtttggaat aataaaaccc cgaatagcat tgcagcaatt 360

agcatggaaa atccgcagga tccgccgccg atggaaggtg ttctgattcc ggcaggtttt 420

attaaagtta ccattctgga accgaaaaaa gttgcagata aatatgatgt tcaggttgca 480

attcataccg ataccaaaaa atttgttgat ggtaaagaag ttaccagcaa accggcaaat 540

aaagttagca aaaaaaccct gcatgatatg ggtattttta gcattaccag cagcgatagc 600

aaaaaaagca ttaaagaaga tgttcagttc aaaaaaagcg cacgtgatcc gaaatttaat 660

ctggcacata ttggtagtag cctgccgggt tataaagaag ataaaagtgc gaaaaaggat 720

ccgaaacgta caattcagaa aaagagctaa 750

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Gly Val Leu Ile Pro Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu

1 5 10 15

Glu Pro Lys Lys Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His

20 25 30

Thr Asp Thr Lys Lys Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro

35 40 45

Ala Asn Lys Val Ser Lys Lys Thr Leu His Asp Met Gly Ile Phe Ser

50 55 60

Ile Thr Ser Ser Asp Ser Lys Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe

65 70 75 80

Lys Lys Ser Ala Arg Asp Pro Lys Phe Asn Leu Ala His Ile Gly Ser

85 90 95

Ser Leu Pro Gly Tyr Lys Glu Asp Lys Ser Ala Lys Lys Asp Pro Lys

100 105 110

Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser

115

<210> 4

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggaaggtg ttctgattcc ggcaggtttt attaaagtta ccattctgga accgaaaaaa 60

gttgcagata aatatgatgt tcaggttgca attcataccg ataccaaaaa atttgttgat 120

ggtaaagaag ttaccagcaa accggcaaat aaagttagca aaaaaaccct gcatgatatg 180

ggtattttta gcattaccag cagcgatagc aaaaaaagca ttaaagaaga tgttcagttc 240

aaaaaaagcg cacgtgatcc gaaatttaat ctggcacata ttggtagtag cctgccgggt 300

tataaagaag ataaaagtgc gaaaaaggat ccgaaacgta caattcagaa aaagagctaa 360

Claims

1.一种幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示的由HpaA、UreB、CAT中的优势Th细胞和B细胞表位串联而成多表位肽HUC。

2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC，其特征在于，所述的融合蛋白LHUC还包括与多表位肽HUC串联的黏膜佐剂；所述的黏膜佐剂选自大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基LTB或霍乱毒素B亚基CTB。

3.根据权利要求2所述的幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC，其特征在于所述的融合蛋白LHUC氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.编码权利要求1～3中任一项所述的幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白LHUC的DNA片段。

5.根据权利要求4所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

6.含有权利要求4或5所述的DNA片段的重组表达载体。

7.权利要求1～3中任一项所述的幽门螺杆菌多表位串联融合蛋白、权利要求4或5所述的DNA片段、权利要求6所述的重组表达载体在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。

8.权利要求1中所述的多表位肽HUC或编码该多表位肽的DNA片段在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。

9.一种幽门螺杆菌疫苗，其特征在于包含权利要求1～3中任一项所述的融合蛋白LHUC。

10.权利要求9所述的幽门螺杆菌疫苗的制备方法，其特征在于将权利要求4所述的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过工程菌发酵后，清洗包涵体，经Ni柱纯化最后透析复性得到权利要求1所述的融合蛋白LHUC。