CZ357397A3 - Antigeny Helicobacter pylori a vakcinační kompozice - Google Patents

Antigeny Helicobacter pylori a vakcinační kompozice Download PDF

Info

Publication number
CZ357397A3
CZ357397A3 CZ973573A CZ357397A CZ357397A3 CZ 357397 A3 CZ357397 A3 CZ 357397A3 CZ 973573 A CZ973573 A CZ 973573A CZ 357397 A CZ357397 A CZ 357397A CZ 357397 A3 CZ357397 A3 CZ 357397A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polypeptide
helicobacter pylori
lys
leu
vector
Prior art date
Application number
CZ973573A
Other languages
English (en)
Inventor
Ingrid Bölin
Ann-Mari Svennerholm
Original Assignee
Astra Aktiebolag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9502007A external-priority patent/SE9502007D0/xx
Priority claimed from SE9601085A external-priority patent/SE9601085D0/xx
Application filed by Astra Aktiebolag filed Critical Astra Aktiebolag
Publication of CZ357397A3 publication Critical patent/CZ357397A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Antigeny Helicobacter pylori a vakcinační kompozice
Oblast techniky
Vynález řeší rekombinantní polypeptidy, které sestávají z antigenů Helicobacter pylori, které jsou exprimovány na povrchu délivé (bacilární) formy i na povrchu kulovité (coccoidní) formy Helicobacter pylori a umožňují nasměrování systémických i lokálních (mukosální) protilátek. Vynález dále řeší molekuly nukleových kyselin. Tyto rekombinantní polypeptidy jsou užitečné pro diagnózu Helicobacter pylori infekcí a pro výrobu vakcinačních kompozic, které mohou vyvolat ochrannou imunitní odezvu proti uvedených infekcím, přičemž tyto kompozice jsou dobré jak pro terapeutické, tak pro preventivní použiti.
Dosavadní stav techniky
Gramnegativní bakterie Helicobacter pylori je důležitým lidským pathogenem, který vyvolává určité gastroduodenální nemoci. Kolonizace žaludečního epitelu touto bakterií vede k aktivnímu zánětu a progresivní chronické gastritidě, která výrazně zvyšuje riziko, že se vyvine vředová choroba.
Za účelem kolonizace žaludeční sliznice používá Helicobacter pylori řadu virulentních faktorů. Mezi tyto faktory patří několik adhesinů, s kterými se bakterium spojuje se sliznici a/nebo se váže k buňkám, ureázám, které pomáhají neutralizovat kyselé prostředí a proteolytickým enzymům, které sliznici ztekucují. Přes silně viditelnou imunitní odezvu na Helicobacter pylori, doprovázenou produkcí lokálních (mukosálních) i systémických protilátek, patogen persistuje v žaludeční sliznici po dobu celého života hostitele velmi často. Proč tomu tak je, lze snad vysvětlit • * · ·« • · · · · ···· ·· · · ♦ ♦ * — 9 — · · v·· · · · · · ♦··· · ** ·«·«·« · · · • 9 «9 ·* ···» ·· * · spontánně indukovanou imunitní odezvou, která je neadekvátní nebo je zaměřena na špatné epitopy antigenů.
Aby se lépe porozumělo patogenézi a imunologii Helicobacter pylori infekcí, je velmi důležité definovat antigenní strukturu této bakterie. Zejména je třeba pro charakterizaci povrchově exponovaných (adhesinům podobných) a vylučovaných proteinů, které jak se ukazuje, představují hlavni virulentní faktory v mnoha bakteriálních patogenech a které mohou být užitečné pro diagnózu Helicobacter pylori a při výrobě vakcinačních prostředků.
Klonování genu hpaA, který kóduje 20 kDa receptor nesoucí podjednotku N-acetylneuraminyllaktozu nesoucí vláknitý hemaglutinyn. (NLBH Helicobacter pylori), bylo objeveno Evansem et al. 1993. J.Bacteriol. 175, 674-683.
Monoklonální protilátky (MAb) proti membránovým preparátům Helicobacter pylori byly objeveny Bólingem et al. (1995 J. Clin. Microbiol 33,381-384), jeden z těchto MAbů, označovaný jako HP30-l:l:6, reagoval s 30 kDa proteinem, který se ukázal být vystaven na povrchu intaktní bakterie a má vlastnosti podobné adhesinu.
Jestliže jsou buňky Helicobacter pyloripodrobeny stresu nebo fyzikálnímu ataku, přemění se z bacilární podoby do coccoidní. V této formě buňky Helicobacter pylori mohou býti nebo měla přeneseny mezi jedinci v přímým kontaktem, sloužit imunitní bacilární i coccoidní, pylori. Přestože systémická omezenou roli této formě, např. vodní cestou
Jako účinná vakcinační kompozice by formám, tedy Helicobacter odezva proti obojím ve které se vyskytuje imunita patrné infekcím sliznice, hraje pouze při ochraně proti infekcím sliznice, je také důležité, že vakcinační kompozice podpoří imunitní mechanizmy lokálně v žaludku.
Úkol vynálezu
Tento vynález si klade za úkol nalézt antigenni peptidy Helicobacter pylori, které mohou být užitečné např. pro vyvolání ochranné imunitní odezvy proti infekci Helicobacter pylori a pro diagnózu této infekce. Tohoto cíle se dosáhlo rekombinantním klonováním genu Helicobacter pylori, který kóduje protein, umístěný na povrchu této bakterie. Sekvence nukleové kyseliny tohoto genu je podobná sekvenci hpaA genu, jak v Journal of Bacteriology, bylo publikováno složení ji publikoval Evans et al. 1993 175, str.674-683. Nicméně zatímco hpaA genu, kódujícího protein o délce 20 kDa, překvapivě bylo zjištěno, že molekula DNA podle vynálezu kóduje polypeptid o molekulové hmotnosti 29 kDa.
Polypeptid o hmotnosti 29 kDa se ukázal být anitenním proteinem, který je exprimován ve všech kmenech Helicobacter pylori, včetně coccoidních forem této bakterie, a který je schopen vyvolat mukosální i systemickou imunitní odpověd u hostitele, jehož produkce protilátek se měří. Polypeptid 29 kDa je exprimován všemi testovanými kmeny Helicobacter pylori a protilátky, vytvořené proti tomuto proteinu nereagují křížově s obecnou lidskou endogenní bakterií jiných druhů nebo s vybranými lidskými tkáněmi včetně žaludeční sliznice. Toto je důležité, neboť dobře konzervovaný adhesin s imunogenními vlastnostmi, uvedený polypeptid 29 kDa, je užitečný jak pro detekci Helicobacter pylori infekci, tak pro výrobu vakcinačních kompozic, které, pokud jsou podány ve vhodné faramceutické kompozici vyvolávají ochrannou nebo terapeutickou imunitní odezvu proti zrnípněným infekcím.
Experimentální výsledky, které jsou uvedeny dále, proto udávají, že protein 29 kDa Helicobacter pylori je důležitý pro kolonizaci a/nebo přetrvávání infekce Helicobacter pylori, neboť vazba monoklonální protilátky k proteinu 29 kDa způsobuje úplnou inhibici kolonizace Helicobacter pylori u myší. Dále Protein 29 kDa Helicobacter pylori, pokud je užíván jako orální imunogen, působí jako stimulátor imunitní odezvy, což vede k zřetelné redukci kolonizace Helicobacter pylori u myší, které byly nakaženy Helicobacter pylori 1 měsíc před imunizací.
Stručný popis přiložených vyobrazení
Obr. 1: obsahující 1,7 polypeptid 29
Mapa restrikčního enzymu plazmidu pAEl, kb fragment Helicobacter pylori, kódující kDa. Srafovaný obdélník určuje pozici strukturálního genu. Umístění promotorových sekvencí T3 a T7 jsou znázorněny nad černými obdélníky indikujícími vektor.
Obr. 2: Plazmidové mapy pS861, pS862 a pS863, naplněné oblasti: lac operonový promotor (Plac) nebo bakterifág T7RNA, polymerázový promotor (T7 promotor), šedá plocha: PCR generované 5'- zakončení nebo 3'- zakončení genu 29 kDa. Terminátor T7 transkripční terminátor. Původ: pBA 322 plazmidová replikace.
Obr. 3: Vliv monoklonálních protilátek na kolonizaci Helicobacter pylori u BALB/c myši.
Obr. 4: Terapeutické orální imunizace Helicobacter pylori nakažené myši.
Podstata vynálezu
V celém tomto popisu a zejména v následujících příkladech, znamenají výrazy standardní protokoly a standardní procedury, pokud jsou používány v kontextu s technikami molekulárního klonování, protokoly a postupy, které lze naleznout v běžné laboratorní příručce jako je
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular
Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbos
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
v prvním aspektu tohoto vynálezu se řeší rekombinantní polypeptid, který má aminokyselinou sekvenci úplně nebo podstatně shodnou s antigenem, vystaveným na povrchu Helicobacter pylori s přibližnou molekulovou hmotností 29 kDa.
Uvedený antigen vystavený na povrchu podle vynálezu má následující důležité vlastnosti:
. Je to adhesin, který je důležitý pro kolonizaci žaludeční sliznice.
. Je exprimován na povrchu jak dělivé (bacilární) formy, tak odolné (coccoidní) formy Helicobacter pylori.
. Je to silný antigen, poskytující terč jak systémickým tak lokálním (mukosálnim) produkovaným protilátkám, . Je konzervován ve všech testovaných kmenech Helicobacter pylori
Protilátky proti polypeptidu 29 kDa nereagují křížové s mnoha různými nehelicobakteriálními bakteriemi nebo s vybranými lidskými tkáněmi včetně žaludeční sliznice.
Polypeptid 29 kDa je lipidován a tak postranslačně modifikován. Tento znak polypeptidu může mít význam pro jeho imunogenicitu a jeho vlastní expozici na povrchu Helicobacter pylori. Je známo v oboru, že tukové modifikace mohou být podstatné pro imunologické vlastnosti bakteriálních lipoproteinú (viz Weis J. J. et al. (1994) Infection and Immunity, vol 62, 4632-4636).
. Je to putativní faktor virulence, přičemž termín faktor virulence znamená specifickou schopnost molekuly v kontaktu s Helicobacter pylori na povrchu epitelu žaludeční sliznice • · • · * ·
a/nebo v stabilní a udržované infekci Helicobacter pylori.
Ve výhodném provedení má zmíněný polypeptid sekvenci aminokyselin v pozicích 1-260 nebo 28-260 podle přiloženého přehledu SEQ ID NO 2 nebo SEQ ID NO 4. Jak je dále popsáno v experimentální části, předpokládá se, že pozice 1-260 v SEQ ID NO 2 a SEQ ID NO 4 představují samostatný protein, zatímco pozice 1-27 představuje signální sekvenci a pozice 28-260 představuje zralý polypeptid. Jediným rozdílem mezi SE ID NO 2 a SEQ ID NO 4 je to, že SEQ ID NO 2 má zbytek SER v pozici 222, zatímco SEQ ID NO 4 má v téže pozici zbytek ARG.
Nicméně polypeptid podle vynálezu není přísně omezen na polypeptid s aminokyselinovou sekvencí identickou se zhora zmíněnými pozicemi SEQ ID NO 2 nebo SEQ ID NO 4, uvedenými v přehledu sekvencí. Vynález také zahrnuje polypeptidy, nesoucí různé modifikace, jako substituce, malé výpadky, vložené zbytky nebo převrácené části řetězců, přičemž všechny takto odvozené polypeptidy mají v podstatě vlastnosti 29 kDa polypeptidu podle vynálezu. Tyto vlastnosti, včetně schopnosti vyvolat mukosální i systémickou imunitní odezvu proti Helicobacter pylori u savčího hostitele, schopnost působit jako adhesin a přítomnost polypeptidu v bacilární i coccoidní formě Helicobacter pylori.
V rámci vynálezu jsou následně i polypeptidy, jejichž sekvence aminokyselin je alespoň z 90 % homologní, výhodně alespoň 95 % homologní, se sekvencí aminokyselin, jak je uváděna na pozicích 1-260 nebo na pozicích 28-260 v SEQ ID NO 2 aSEQ ID NO 4, v přehledu sekvencí. Tyto polypeptidy mají pochopitelně biologické účinky v podstatě stejné, jako polypeptid 29 kDa podle vynálezu.
Do vynálezu se také zahrnují peptidky, které mají délku řetězce alespoň 5 aminokyselin, které zahrnují
imunogenní epitop polypeptidu 29 kDa podle vynálezu a zachovávají si schopnost vyvolat imunitní odezvu Helicobacter pylori u savčího hostitele. Jako takovýto epitop (epitopy) lze uvést samotný ve fúzní formě se vyskytující protein, kde epitop je navázán na inertní nebo imunologický aktivní polypeptidový nosič. Identifikace těchto epitopů je založena na přítomnosti protilátek proti různým segmentům polypeptidu 29 kDa, existujícím u hostitele, který vytváří protilátky.
Jedna cesta jak získat informace o struktuře na epitopech polypeptidu 29 kDa, je produkce a charakterizace monoklonálních protilátek, vázaných na polypeptid, následovaná mapováním epitopu, např. analýza PEPSCAN. Monoklonálni protilátky se mohou vyrábět standardní metodou, jak je popsaná v publikaci De St.Groth (1980) in J. Immunol. Methods, vol. 35, 1-21.
V dalším aspektu vynálezu se řeší izolovaná a čištěná molekuly nukleové kyseliny, která má nukleotidovou sekvenci, kódující polypeptid, jak je shora definován. Ve výhodném provedení podle vynálezu je uvedena molekula nukleové kyselinu DNA molekula, která má nukleotidovou sekvenci identickou se SEQ ID NO 2 nebo SEQ ID NO 3 v přehledu sekvencí. Nicméně DNA molekula podle vynálezu nemusí být striktně omezena na sekvenci znázorněnou jako SEQ TO NO 2 nebo SEQ ID NO 3. Vynález také zahrnuje DNA molekuly, v nichž byly provedeny modifikace jako substituce, malé výpadky nebo vložení nebo převrácení, které přesto kódují peptidy, které mají podstatné biochemické vlastnosti shodné jako polypeptid 29 kDa podle vynálezu. Zkušenému pracovníkovi v oboru je jasné, že A a G záměny substituce a T a C záměny substituce, které mají vliv na sekvenci aminokyselin, nejsou u H.pilori neobvyklé. Jediným rozdílem mezi SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 3 je, že SEQ ID NO 1 má zbytek A v pozici 1458, zatímco SEQ ID
NO 3 má zbytek C ve stejné pozici.
Součástí vynálezu jsou také DNA molekuly, jejichž nukleotidové sekvence jsou degenerované, protože obsahuji genetický kod, znázorněný nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO 1 nebo SEQ ID NO 3. Přestože existuje 64 možných kodonů, ale pouze 20 aminokyselin, většina aminokyselin je kódována více než jedním kodonem. Tato přírodní degenerace, nebo redundance genetického kódu je v oboru velmi dobře známá. Proto lze odvodit, že sekvence DNA, znázorněné v přehledu sekvencí, je pouhým příkladem v rámci velké, ale definitivní skupiny DNA sekvencí, která bude kodovat polypeptid, popsaný shora.
V návaznosti na to vynález zahrnuje izolovanou molekulu nukleové kyselinu, zvolenou z:
a) molekul nukleové kyselinu zahrnující nukleotidovou sekvenci, která se identická s, nebo podstatně podobná pozicím 796-1572 nebo 874 až 1572 v SEQ ID NO 1 nebo SEQ ID NO 3 v přehledu sekvencí,
b) molekuly nukleové kyselinu, zahrnující nukleotidovou sekvenci schopnou hybridizace na nukleotidovou sekvenci komplementární regionu kódujícímu polypeptid v DNA molekule, jak je definován v a), a který kóduje polypeptid podle vynálezu, nebo funkční ekvivalent, tvořený jeho modifikovanou formou a
c) molekuly nukleové kyselinu, zahrnující sekvenci nukleové kyseliny, která je degenerativní jako důsledek genetického kódu, k nukleotidové sekvenci, jak je definována v a) nebo b), a která kóduje polypeptid podle vynálezu nebo jeho funkční ekvivalent, nebo jeho modifikaci.
Dalším aspektem vynálezu nukleovou kyselinu molekuly podle výhodně plazmidový vektor pAEl je vektor, který zahrnuje vynálezu. Takový vektor je (uložený podle budapešťské dohody o ukládání mikroorganismů pod přístupovým NCIMB 40732) .
Vektor podle vynálezu může také být replikovatelným expresním vektorem, který nese a je schopen zprostředkovat expresi molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu. V tomto kontextu je termín replikovatelný míněn v tom významu, že vektor je schopen replikovat v daných typech hostitelských buněk, do kterých je introdukován. Příklady vektoru a virů, jsou bakteriofágy, kosmidy, plasmidy a jiné rekombinantní vektory. Molekuly nukleové kyseliny jsou vloženy do genomů vektoru standardními metodami, známými v oboru. Exprese vektoru podle vynálezu může být s výhodou kterákoli z vektoru pAl 30:1, pAL 30:2, pAL 30:3, pAL 30:4 nebo, ještě výhodněji pAS863.
Součástí vynálezu je také hostitelská buňka nesoucí vektor podle vynálezu. Takovouto hostitelskou buňkou může být prokaryotická buňka, unicelulární eukaryotická buňka nebo buňka odvozená od vícebuněčného oranismu. Hostitelská buňka tak může například být bakteriální buňkou jako je E.coli buňka, buňkou droždí nebo Saccharomices cervisiae nebo Pichia pastoris nebo savčí buňka. Metody, používané k účinnému zavedení vektoru do hostitelské buňky jsou standardními metodami, dobře známými v oboru a pracovníkům obeznámeným s metodami rekombinace DNA. Podle dalšího aspektu vynálezu se řeší způsob výroby polypeptidu, jak je definován shora, přičemž tento způsob zahrnuje kultiaci hostitelské buňky, transformované expresním vektorem, jak je definován shora, za podmínek, kdy uvedený polypeptid je produkován první i následnou generací buněk.
Roztok, používaný pro kultivaci těchto buněk může být jakékoli obvyklé medium vhodné pro tyto účely. Vhodný vektor může být kterýkoli z vektorů zhora popsaných a vhodnou • ·
- 10 hostitelskou kulturou buněk může být jakýkoli typ shora uvedený. Způsoby dosažení konstrukce vektoru a provedení introdukce tohoto vektoru do buněk hostitelských mohou být libovolné způsoby známé pro tyto účely na poli rekombinace DNA. Rekombinantní polypeptid exprimovaný buňkami může být vylučován, tj. dodáván skrz membránu buněk, v závislosti na typu buněk a složení vektoru.
Jestliže je polypeptid produkován intracelulárně rekombinantním hostitelem, tj. není vylučován buňkou, může být vyráběn standardními postupy, zahrnujícími drcení buněk mechanickými prostředky, např. sonizací nebo homogenizací nebo enzymatickými nebo chemickými prostředky s následným čistěním. Za účelem vylučování by měla sekvence DNA, kódující peptid, předcházet sekvenci kódující signální peptid, jejíž přítomnost zajišťuje vylučování polypeptidu buňkami, tak, že alespoň signifikantní část polypeptidu, který má být exprimován, se vylučuje do kultivačního roztoku a získává.
Dalším aspektem vynálezu je polypeptid podle vynálezu pro použití v terapii, pro použití v diagnóze Helicobacter pylori infekce u savců, včetně lidí a pro použití jako léčivé nebo profylaktické vakciny.
Dalším významným kompozice pro vyvolání včetně člověka, proti aspektem vynálezu je vakcinační ochranné imunitní odezvy u savce, bacilární a/nebo coccoidní formě
Helicobacter pylori. Tato vakcinační kompozice obsahuje imunitně účinné množství polypeptidu definovaného shora, včetně alespoň jedné části peptidu 29 kDa obsahujícího imunitní epitop, nebo modifikované formy uvedeného polypeptidu, která si zachovává schopnost vyvolat ochrannou imunitu proti infekci Helicobacter pylori.
Termínem modifikovaná forma se rozumí aniž by však to by jediný význam, mimo jiné formy polypeptidu, které jsou postransačné
- 11 modifikovány, např. lipidovány. Je možno předpokládat, že protein 29 kDa je lipidován, viz příklad 4 dole.
Vakcinační kompozice přijatelný nosič aktivní použití.
jsou známy odborníkům v fosfátem pufrovaná solanka farmaceuticky imunologicky terapeutické a rozpouštědla např.
obsahuje nebo antigeny pro Fyziologicky popřípadě ředidlo, nebo profylaktické přijatelné oboru a patří (PBS) nebo v také další nebo nosiče mezi ně případě orálních vakcin, HCO3 ionty včetně roztoku založených na jejich obsahu nebo entericky povlečené práškové formulace.
Vakcinační kompozice mohou popřípadě zahrnovat nebo být podávány spolu s inhibitory vylučování kyselin, výhodně inhibitory protonové pumpu (PPI), např. omeprazol. Tato vakcina může být formulována do známého systému pro podávání, jako jsou lypozomy, ISCOM, kocheláty, atd. (viz Rabinovich et al. (1994) Science 265, 1401-1404) nebo mohou být připojeny k nebo zahrnuty v polymerních mikrokuličkách degradovatelné nebo nedegradovatelné povahy. Antigeny mohou být asociovány s živými bakteriemi, viry nebo fágy nebo s mrtvými vektory téhož druhu.
Jak bude ukázáno v experimentální části, uvedené dále, vakcinační kompozice podle vynálezu se dá použít pro terpeutické i profylaktické účely. Vakcinační kompozice podle vynálezu se výhodně podává do libovolné sliznice savců, přičemž příkladem může být jícnová, nosní tonsilární, žaludeční, střevní (tenkého i tlustého střeva), rektální a vaginální sliznice. Mukosální vakcíny lze podávat spolu s adjuvanty, určenými pro daný požadovaný účel. Vakcina se může také podat parenterálně, subkutánně, intrakutánně nebo intramuskulárné, popřípadě spolu s vhodným adjuvantem.
Alternativním přístupem pro vytvoření imunitní odezvy
- 12 proti polypeptidů 29 kDa je použití přístupu známého jako vakcinace nukleovou kyselinou nebo naked DNA vaccination. V oboru je známo, že nitrosolová injekce plazmidu DNA kódujícího antigenu, který je předmětem zájmu, může vést k dlouhodobé expresi antigenu a vytvoření imunitní odezvy (viz např. Rabinovich et al., supra) podávání, které jsou možné se nabízí mukosální nebo cestou gene-gun, která několik způsobů pro parentální, dodává nepatrná množství DNA povlečených zlatých nosičů (Fynan et al. (1993 Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90, 11478-11482).
Molekula nukleové kyselinu podle vynálezu může tedy, jak bylo shora uvedeno být exprimována v plazmidu obsahujícím vhodný eukaryotický promotor. Tato naked DNA může být pak injekčně podána intramuskulárné nebo indradermálné cestou gene-gun. Epitopy exprimovaného proteinu se pak exprimují molekulami MHC na povrchu buněk a zajišťují imunitní odezvu. Obdobně lze konkrétné použit molekuly nukleové kyselinu a vektory, jak jsou popsány v předešlých odstavcích, jako vakcíny, což představuje další aspekty tohoto vynálezu. Použití takovýchto molekul nukleových kyselin a vektorů při výrobě prostředků pro léčení, prevenci nebo diagnózu infekcí Helicobacter pylori také představuje další aspekty vynálezu.
Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu je použití polypeptidů jak je definován shora, nebo jeho modifikované formy, která má schopnost indukovat ochrannou imunitu proti infekci Helicobacter pylori, při výrobě prostředků pro léčení, prevenci nebo diagnózu infekce Helicobacter pylori. Tyto kompozice zahrnují konkrétně vakcinační kompozice vyvolávající ochrannou imunitní odezvu proti bacilární a/nebo coccoidní formě Helicobacter pylori. Součástí vynálezu je také uvedené použiti při výrobě diagnostických souprav pro diangozu infekcí Helicobacter pylori. Takováto diagnostická souprava je dále popsaná v textu popisu.
·· >» • · ♦· * « ··
- -X · ·· · · — 2 3 · · »» • * · » •· · · •· · • ♦· * • ·· • · · · · · se řeší způsob proti infekcím
Podle dalšího aspektu vynálezu, vyvolání ochranné imunitníé odezvy Helicobacter pyloriu savce včetně člověka, přičemž tento způsob zahrnuje stupen podáváni účinného množství vakcinační kompozice, jak je definovaná shora, tomuto savci nebo člověku. Výraz imunologicky účinné množství je míněn tak, že znamená takové množství, které vyvolá signifikantní ochrannou odezvu proti Helicobacter pylori, která působí proti infekci touto bakterií u nakažených savců nebo prevenci této infekce u ohrožených savců. Obvyklou imunitně účinnou dávkou je asi 1 μg na 100 mg, výhodně asi 10 μg na 10 mg antigenu Helicobacter pylori pro orální podáni, nebo přibližně méně než 100 μg pro parenterální podání.
Dalším aspektem vynálezu je způsob diagnózy in vitro infekcí Helicobacter pylori, zahrnující alespoň jeden stupen, při němž se používá polypeptid, definovaný shora, včetně části polypeptid 29 kDa, kterážto zahrnuje imunitní epitop. Polypeptid může být popřípadě značený a/nebo připojený na pevný podklad. Způsob diagnózy může např. zahrnovat stupně: (a) působení uvedeného polypeptidu, popřípadě vázaného k pevnému podkladu, na tělesnou tekutinu, odebranou savci a (b) detekci protilátek z uvedené tělní tekutiny, vázaných na uvedený polypeptid. Výhodnými způsoby detekce protilátek jsou ELISA (Enzyme linked immunoabsorbent assay) metody, které jsou v oboru dostatečně známé.
Ještě dalším aspektem vynálezu je vyřešení diagnostické soupravy pro detekci infekce Helicobacter pylori u savce, včetně člověka, která zahrnuje komponenty schopné provádět diagnostickou metodu, jak je popsána shora.
* ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Klonování a exprese polypeptidu 29 kDa z
Helicobacter pylori.
1.1. Bakteriální kmeny, vektory a kultivační podmínky.
Helicobacter pyloriCCUG 17874 (=NTCC 11637) byl kultivován na agarových plotnách z koňské krve mikroaerofi lni atmosféře. Kmeny Escherichia coli XLl-Blue MRF a XLORL (Stratagene, La Jolla, California) byly použity jako kmeny hostitelské pro klonovací experimenty a byly kultivovány v půdě Luria-Bertani (LB) nebo NZY doplněné 0,2% maltozou a 10 mM MgSO^, pokud byly používány pro lambda infekci. Lambda expresní vektor ZAP Express a jeho fagemidm derivát pBK-CMV byly získány od firmy Stratagene.
1.2. DNA techniky
Rozmícháním bakterií z ponechány 48 z Helicobacter hodin pylori %
Tris-Cl, pH 8, mg/ml lysozynu Mannheim Scandinavia inkubovaných ploten, kde byly připravena chromozomová DNA přičemž bylo použito 50 mM mM EDTA obsahující 10 byla
17874, sacharoza, 50 ng/ml DNasy-prosté RNasy (Boehringer AB, Bromma, Sweden). Suspenze byla inkubována 10 minut při 37°C. Byl přidán ekvivalentní objem pufru pro rozklad (0,4% Triton X100 v 50 mM Tris-Cl, pH 8 a 6,25 mM EDTA) a suspenze byla inkubována při pokojové teplotě až do znatelného rozkladu bakterií. Suspense byla poté ve třech stupních extrahována pufrovaným fenolem (pH 8,0), fenol/chloroform a chloroform. DNA byla vysrážena z vodné fáze a znovu rozpuštěna v TE pufru (lOmM Tris-Cl, pH 8,0 a 1 mM EDTA).
inkubovány při 37°C dokud OD při 600 nm nedosáhla 0,7. Poté bylo přidáno IPTG na finální koncentraci 1 mM a bakterie byly kultivovány další dvě hodiny. Kultury bez IPTG byly kultivovány podobně. Kultury byly pak odstředěny a resuspendovány v 1/10 objemu. 10 μΐ suspense bylo smíseno s ekvivalentním objemem 2x vzorku pufru, povařeno a analyzováno SDS-PAGE. Kmen XLORL, nakultivovaný stejnou cestou, ale bez kanamycinu, sloužil jako negativní kontrola, pro pozitivní kontrolu byla použita suspense Helicobacter pylori 17874 v PBS (OD při 600 nm = 1,0).
Po imobilizaci proteinových vzorků na nitrocelulozových vrstvách byla provedena reakce s polypeptidem 29 kDa specifickým pro MAb HP30-l:l:6 zředěným 1:10, jak bylo popsáno shora (Bóhlin et al. 1995) a navázané protilátky byly detekovány pomocí anti-mouse IgG značeného s peroxydázou. Filtrační papíry byly vyvíjeny na podkladu peroxidu vodíku a 4-chlornaftolovým chromogenem (Bio Rad Svenska AB).
Dot blot test byl proveden pomocí přes noc získané kultury shora uvedených kmenů. 2 μΐ suspense byly naneseny na nitrocelulozový filtrační papír, sušeny vzduchem a inkubovány s MAb HP30-l:l:6 zředěným 1:10 po dobu jedné hodiny. Poté byly provedeny další stupně, jak jsou obvyklé při této technice.
1.5. Molekulární klonování
Z části vybraná chromozomální DNA z Helicobacter pylori kmene 17874 byla klonována na lambda expresní vektor (ZAP Express™). Po screeningu 24 tisíc plaků na reakci s MAb specifickým pro polypeptid 29 kDa byly detekovány 4 plaky exprimující tento polypeptid. Tyto pozitivní plaky byly čištěny a velikost klonovaných insertů byla zjišťována pomocí • · • · • »····· * · η -τ · 4 · · · · “ 1 f ~ * · 4 ·»···♦
DNA-přípravků s Xbal a Sáli. Velikost vložených části řetězce (insertů) byla mezi 3,7 až 1,78 kb. Po in vivo excisi pBK-CMV fagemidů ze čtyř pozitivních plaků byly konstruovány mapy restrikčních enzymů a porovnány s inserty v lambda vektoru. U fagemidů bylo zjištěno, že obsahují navázané DNA fragmenty stejné velikosti jako byly v lambda vektoru. Většina z těchto restrikčních enzymů, které byly testovány, s výjimkou Smál a Nhel, neobsahovala další klonované fragmenty.
Restrikční mapa nejmenšího klonovaného fragmentu 1,7 (pAEI), která byla dále analyzována, je zobrazena na obr. 1. Jeden z klonovaných insertů byl v opačném směru analogický vektorovému promotoru. Při analýze extraktů celých buněk E.coli, kmenů obsahujících tyto plazmidy, pomocí imunoforézy s MAb HP30-l:l:6, bylo zjištěno, že exprimují polypeptid o stejné molekulové hmotnosti jako Helicobacter pylori 17874. V expresi polypeptidu 29 kDa nebyla zaznamenána žádná diference, při srovnáni s vektorovým promotorem indukovaným IPTG. To ukazuje, že gen byl transkribován z jeho vlastního promotoru. Celkem byly konstruovány, jak je znázorněno na obr. 1, tři subklony, obsahující DNA fragmenty, a ty byly také testovány pijákovým testem (Bólin et al. 1995) a srovnávány s Helicobacter pylori, přičemž bylo zjištěno, že jsou mírně pozitivní, což ukazuje, že na povrchu musí být vystaven alespoň částečně exprimovaný polypeptid.
1.6. Analýza DNA sekvence
Oba řetězce insertu 1,7 kb pAEI a subklony byly sekvencovány s použitím T3 a T7-specifických primérů a, pokud to bylo nutné, doplněny specifickými priméry pro pokrytí regionů sekvence, které nejsou přístupné se standardními priméry. Počítačová analýza ukázala, že sekvence (SEQ ID NO 1) obsahující otevřený čtecí rámec (open reading frame - ORF) 780 bp na jednom řetězci, určující restrikčnímu enzymu místa •
- 18 používaná pro subklonování (obr. 1). Putativní rybosomová vazebná místa bylo možno identifikovat (pozice 782-785 v SEQ ID NO 1). ORF kóduje 260 aminokyselin polypeptidu o molekulové hmotnosti 29 126 Da (SEQ ID NO 2).
Minokyselinová sekvence obsahuje, jak abylo zjištěno, možnou signální sekvenci 27 aminokyselin. Tato sekvence Leu-Val-Gly-Cys (pozice 25-28 v SEQ ID NO 2 a 4) je jedna z dohodnutých sekvencí (Leu-X-Y-Cys) označovaných jako rozpoznávací místo pro enzym signální peptidázy 2. Signální peptidáza 2 štěpí signální sekvence před cysteinovým zbytkem v prolipoproteinech. Charakteristiky signální sekvence tedy naznačují, že protein 29 kDa je lipoprotein, a že zralý protein obsahuje aminokyseliny 28-260.
1.7. Exprese rekombinantního polypeptidu 29 kDa v E.coli
Rekombinantni polypeptid 29 kDa byl vyráběn ve vysoké koncentraci v E.coli N4830-1 konstruovaném expresním vektorem pAL30, který obsahuje celý gen polypeptidu 29 kDa (pozice 771-1667 v SEQ ID NO 1 a 3). Vektor používaný pro konstrukci byl pML-LCTB lambda 7 (získaný od Michael Lebens, University of Toghenburg, Sweden), který obsahuje silný lambda PL promotor. Tento vektor také obsahuje β laktamázový gen poskytující resistenci vůči ampicilinu. Gen LCTB (kódující toxin choler! a jeho signální pcptid), který je vložen mezi lambda PL promotor a terminátorový region ve vektoru, byl odseknut z vektoru štěpením pomocí restrikčnich enzymů Smál a HindlII.
Strukturní gen kódující polypeptid 29 kDa, zahrnující jeho signální sekvenci, byl amplifikován pomocí polymerázové řetězcové reakce (Polymerase Chain Reaction - PCR). Použitými priméry byly HP30N (GGC GTRA GAA ATG GAA GCG C, odpovídající pozicím 522 až 540 v SEQ ID NO 1 a 3), které váží horní větev
- 15 Restrikční enzymy byly získány od firmy Boehringer Mannheim Scandinavia AB a použity v souladu s instrukcemi výrobce. Plazmidy a lambda DNA byly čištěny pomocí Wizard kitú (Promega, Madison, Wisconsin). Sekvencování bylo prováděno pomocí Sekvenázy 2.0 kitu (Amersham Sweden AB, Solná, Sweden). Oligonukleotidy byly získány od Innovagen, Lund, Sweden. PCR byla vytvořena pomocí Taq DNA plymerázy (Boehringer-Mannheim Scandinavia AB).
1.3. Konstrukce genomové knihovny Helicobacter pylori
Chromozomové fragmenty DNA o velikosti v rozsahu 2-12 kb byly čištěny z částečně předčištěné Sau3A Helicobacter pylori 17874 DNA klonovaný do BamHI s použitím ZAP Express·111 vektoru, jak je popsáno v návodu firmy Stratagene. Následovalo zpracování in vitro, knihovna byla titrována infektováním kmenem XL-1 Blue MRF a nanesena na indikační plotny obsahující izopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidu IPTG a 5-brom-4-chlor-3-indolyl-3~D-galaktopyranosidu (X-Gal.)Titr knihovny byl 1,2 x 106 PFU/ml s 85 % rekombinantů.
Plaky exprimující plypeptid 29 kDa byly detekovány imunologickým testem s použitím MAb HP30-l:l:6 (Bólin et al. (1995) J. Cllin. Microbiol. 33,381-384) pomocí známých metod. Pozitivní plaky byly izolovány a opět nanášeny a testovány s MAb, což bylo opakováno až do získání čistých plaků. Konverze na fagemidovou formu ZAP expresních klonů byla provedena pomoci ExAssist protokolu (Stratagene).
1.4. Imunoforézní a dot-blot test
Kultura E.coli XLORL, ponechaná přes noc, obsahující plazmidy s klonovanými vloženými částmi z Helicobacter pylori 17874 je znázorněna na obr. 1, přičemž se jedná o zředění 1:100 až 5 ml LB roztoku s 50 mg/ml kanamycinu. Kultury byly • * « « * · · · ·
271 bp ATG startovního kodonu a HP30C (CCC AAG ATT CAT CAG CCC ΤΤΆ AAT ACA CG) která rozpoznává DNA fragment dolní větve 855 bp startovního kodonu (odpovídající pozicím 1648 až 1667 v SEQ ID NO 1 a 3). HP30C primér obsahující HindlII štěpící místo pro PCR reakci, byl přidán k sekvenci polypeptidového genu polypeptidu 29 kDa. Výsledný PCR produkt byl 1,1 kb. Tento DNA fragment byl štěpen pomocí SspI a HindlII, což poskytlo fragment 0,9 kb, který byl ligatován na vektorový fragment (2,7 kb). Vektorová konstrukce, nyní nazvaná pAL30 (3,6 kb) byla vnesena do E.coli N4830-1 elektroporací. Nalezeny byly čtyři pozitivní klony (pAL30: 1, 2, 3, 4).
Pro vyvolání exprese rekombinantního polypeptidu N4830-1 buněk obsahujících pAL30:l-4 byly kultivovány tyto buňky přes noc při 30°C (lambda cl represor inhiboval při této teplotě transkripci) v lx LB s ampicilinem (100 μ-g na ml). Malá část této kultury byla inokulována v 5 ml lx LB s ampicilinem a buňky byly namnoženy při 30°C, dokud nebyla O.D. při 600nm asi 0,7. Teplota byla přitom zvýšena na 412°C, čímž se aktivoval represor, a kultura byla inkubována po další dvě hodiny.
Vzorky odebrané před a po indukci, byly analyzovány na 14 % SDS-page a imunoforézou s pomocí monoklonální protilátky HP30-l:l:6, která je specifická pro polypeptid 29 kDa. Všechny tři indukované klony, použité při imunoforézc (pAL30:l, 3 a 4), exprimovaly po indukci velká množství rekombinantního peptidu. Suspense z neindukovaných buněk obsahovala pouze malé množství polypeptidu 29 kDa.
Klon pAL30:l byl vybrán pro další analýzu. Za účelem ověření, že klon skutečně obsahuje gen kódující 29 kDa, byly konce fragmentů, vložených do vektoru, sekvencovány. Bylo ověřeno, že vložené sekvence v expresním vektoru odpovídají očekávané sekvenci klonovaného PCL fragmentu.
• ·
- 20 Přiklad 2: Kinetika a exprese polypeptidu 29 kDa při různých kultivačních podmínkách.
Byly používány dva kmeny Helicobacter pylori, zejména CCUG 17874 (laboratorní kmen) a Hel73 (nyní izolovaný z pacienta trpícího duodenálním vředem). Kultivace byla prováděna na krevních agarových plotnách, a na kultivační půdě Brucella Broth doplněné cyklodextrinem. Všechny kultury byly inkubovány v mikroaerofilní atmosféře sestávající z 5 % kyslíku, 10 % oxidu uhličitého a 85 % dusíku. Bakterie byly sklizeny po dvou, čtyřech a sedmi dnech, promývány jednou v ΡΒΞ a ponechány při -20 °C pro následující analýzu. Exprese povrchu peptidu 29 kDa byla pak analyzována inhibicí ELISA s použitím specifických monoklonálních protilátek, jak jsou používány v předchozím provedení pro detekci povrchových antigenů E.coli (Lopez-Vidal, Y a Svennrholm, A-M., J.Clin. Microbiol. 28, 1906) s použitím polypeptidu. Tyto protilátky byly také používány v imunoelektronové mikroskopii.
Po sedmidenní kultivaci kmene CCUG 17874, na krevních agarových plotnách a v Brucella Broth, se přibližně 70 % bakterií převedlo ze spirální formy na coccoidní formu. Tato konverze se projevovala vždy po třech dnech v Hel73. Inhibice - ELISA ukazuje plně konstantní koncentraci polypeptidu 29 kDa ve vzorcích z obou destiček a objemové kultury, v průběhu sedmi dnů. Přítomnost polypeptidu byla potvrzena imunoelektronovou mikroskopií. Polypeptid 29 kDa, jak bylo zjištěno, dobře chrání před coccoidní formou Helicobacter pylori. Bylo také zjištěno, že polypeptid 29 kDa je účinnější v Hel73 než v CCUG 17874.
Příklad 3: Odezva protilátek proti polypeptidu 29 kDa.
- 21 Protilátkové odezvy na polypeptid 29 kDa byly stanoveny v séru pacientů s dvanácterníkovými vředy (n=19) v asymptotických Helicobacter pylori nosičích (n=18) a v nenakažených
Koncentrace kontrolách srovnatelného věku (n=20). 29 kDa byla od tří skupin Hlavní podíl s kontrolními zdravými a žaludečních vzorcích signifikantně vyšší protilátek žaludčních testována v jedinců, způsobem podle nakažených jedinců měl osobami, v séru proti polypeptidu vzorcích a v séru různých ELISA metod, ve srovnání hladiny specifických protilátek proti polypeptidu 29 kDa. titry protilátek v asymptotických vzorcích byly srovnatelné s titry symptomatických pacientů.
Příklad 4: Značení polypeptidu 3H palmitátem
Protože aminokyselinová sekvence polypeptidu 29 kDa obsahuje možný signální peptid typický pro lypoproteiny, bylo pokusně provedeno značení proteinu radioaktivní kyselinou palmitovou: kmen E.coli N4830-1, bud bez pAL 30:1, byl kultivován při 30°C v LB-živném roztoku doplněném 50 μg karbencilinu / ml buněčné hustoty 108 bakterií/ml, 3H palmitová kyselina (5 mCi/ml, DuPont NEN, Boston, MA) byla přidána na finální koncentraci 50μ<:ί/ιη1, teplota byla zvýšena na +42°C a kultury byly inkubovány po dalších 12 hodin. Buňky byly koncentrovány odstředěním a rozloženy v SDS-PAGE pufru. Po elektroforéze byl gel podroben flougrafii imerzním gelem v Amplify™ (Amersham International, UK) po dobu 30 minut, sušen mezi celofánovými foliemi a pomocí gelu byl exponován film, citlivý na paprsky X při -70°C po dobu 36 hodin.
Výsledky ukazují, že polypeptid 29 kDa je lipidován a tak post-translačné modifikován.
Přiklad 5: Triton X-lll, podílející se na expresi rekombinantního polypeptidu 29 kDa bakteriemi E.coli.
- 22 Buňky E.coli, nesoucí pAL30:l, byly kultivovány při
30°C v LB-roztoku doplněném hustotě 108 bakterii/ml, kultury byly inkubovány koncentrovány odstředěním μg carbencilinu/ml při buněčné teplota byla zvýšena na 4 2°C a další tři hodiny. Buňky byly (11 300 x g, 10 minut, + 4°C a resuspendovány v 25 ml PBS na 1 gram buněčné sraženiny.
Suspenze byla zmrazená a pak rozehřátá na pokojovou teplotum, načež bylo přidáno 25 μΐ DNAzy (10 μg na μΐ). Vzorek byl jemně protřepán převracením při pokojové teplotě po dobu 30 minut a ochlazen na 8-12°C načež byl přidán Triton X114 na finální koncentraci 0,3 %. Po inkubaci doprovázené jemným převracením, která trvala 36 hodiny a byla prováděna při 4°C, byl nerozpustný podíl shromážděn pomocí odstředění (18 900 x g, 10 minut, 25°C.
Jednotlivé fáze byly analyzovány SDS-page a byla ověřena identita polypeptidu 29 kDa metodou Western blotting pomocí MAb HP30-l:l:6. Výsledky ukazují, že polypeptid 29 kDa se objevoval v detergentní fázi, což potvrdilo, že jde o lypoprotein. Je známo, že integrální membránové proteiny jsou normálně získatelné z detergentní fáze (Bordier, C (1981) J. Biol. Chem., vol 256, 1604-1607).
Tento experiment také potvrdil, že plazmid, vložený do E.coli může exprimovat a produkovat protein 29 kDa. To je důležité pro budoucí býrobu vakciny ve větším měřítku, protože Helicobacter pylori se nemnoží příliš dobře ani rychle.
Příklad 6: Konstrukce expresního vektoru pS863 pro produkci velkých množství proteinu 29 kDa Helicobacter pylori.
6.1. Příprava pS860
- 23 Pro vytvoření obvyklách restrikčních míst pro 5' zakončení genu 29 kDa byly szntetizovány dva szntetické oligonukleotidy pro PCR amplifikaci. Plazmid pS852 (identický v plazmidu pAL30:l, popsanému v příkladě 1.7) byl pro PCR amplifikaci použit jako matrice. Sekvence těchto dvou oligonukleotidú jsou uvedeny dále:
EcoRI Ndel
5' -CGGAATTCCATATGAGAGCAAATAATCATTTTAAAG-3'
BamHI Xmal Nhel
5' -GCGGATCCCCCGGGGCTAGCTGGATGGTAATTCAATTTC-3‘
Poté byla provedena PCR amplifikace a 165 bp amplifikovaný fragment byli ligován do TA vektoru (Mead, D.A. et al.(1991) Bio/Technology 9,657-663). Zkonstruovaný plazmid byl označen pS860 (obr. 2). Sekvence konstrukce byla potvrzena dideoxy sekvencováním (Sanger et al. (1977) Proč.Nati.Acad.Sci. USA 74, 5463-5467).
6.2. Příprava pS861
Za účelem změny restrikčních míst na 3' zakončení genu 29 kDa byly syntetizovány dva syntetické oligonukleotidy pro PCR amplifikaci. Jako matrice byl pro PCR amplifikaci použit plazmid pS852 (pAL30:l). Sekvence dvou oligonukleotidú jsou uvedeny dále:
EcoRI Xmal
5' -CGGAATTCCCCGGGTTATTATTCTCCACCGG-3'
Pstl BamHI
5' -CGCTGCAGGGATCCTTATTATCGGTTTCTTTTGCCTTTTAA-3'
Byla provedena amplifikace a amplifikované fragmenty byly
- 24 voleny z Xmal a BamHI generujících 357 bp fragmentů. Tento fragment byl klonován do pUC19, zkonstruovaný plazmid byl označen pS861 a jeho složení je uvedeno na obr. 2. Sekvence zkonstruovaného plazmidu byla potvrzena dideoxy sekvencováním (Sanger et al. (1977) Proč.Nati.Acad.Sci. USA 74, 5463-5467).
6.3. Příprava plazmidu pS862
Gelovou elektroforézou byla izolována cDNA kódující střední část genu 29 kDa jako fragment 280 bp Nhel/Xmal plazmidu pS852 (pAL30:l). Tento fragmgent byl ligován s fragmentem 357 bp Xmal/BamHI ze pS861 a fragmentem 4061 bp Nhel/BamHI ze pS861. Vytvořený plazmid byl označen pS862 (obr.2).
6.4. Příprava plazmidu pS863
Poté byl izolován 795 bp Ndel a BamHI restrikční fragment z pS862 a ligován do 4 kb NdcI/BamHI fragmentu z T7 vektoru pS637 (pET-3a) (Studier, F.W. et al. (1990) Methods Enzymol. 185, 60-89). Výsledný expresní vektor bvyl označen jako pS863 (obr. 2).
Příklad 7: Přečištění rekombinančního lipoproteinu 29 kDa Helicobacter pylori
7.1. Hostitelské kmeny a bakteriální kultury
Expresní vektor pS863 byl transformován do následujících hostitelských kmenů E.coli: BL21 (DE3), BL21(DE3JpLysS, a BL21(DE3)pLysE. Postupy k vyvolání exprese byly prováděny v podstatě tak, jak jsou popsány studierem et al. (Methods Enzymol. 185,60-89, 1990). Bakterie byly kultivovány v LB roztoku (Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New • · *
carbencilinu. Dále, pokud
BL21(DE3)pLysE, byl živný
Zork, 1992) obsahujícím 50 pG/ml byly použity BL21(DE3JpLysS and roztok doplněn 30 pg/ml chloramphenicolu. Pro indukci T7 expredsního systému, byly kultury pěstovány až do hustoty zhruba OD600 = 0,5 a pak doplněny 0,4 mM IPTG pro indukci. Buňky byly zklízeny asi 180 minut po indukci. Hostitelský kmen, který poskytl vysoké hladiny exprese byl BL21(DE3)pLysS.
7.2. Přečištění lypoproteinu 29 kDa Helicobacter pylori
Kultury E.coli BL21(DE3)/pLysS, transformované plazmidem pS863 byly kultivovány, jak je popsáno shora, a nakultivované buňky byly shromážděny odstředěním a resuspendovánu ve studeném pufru (50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA lOmM Naci, pH 8,0). Na každý gram buněk, (hmotnost za vlhka) bylo přidáno 35 ml pufru.
7.2.1. Extrakce tritonem X114
Pro extrakci lipoproteinu byl přidán Triton 114 (TX114) na finální koncentraci 1,5 % (obj/obj) a suspense byla míchána jednu hodinu při 0°C. Podíl, nerozpustný v tritonu, byl oddělen odstředěním při 18 900 x g po dobu 10 minut. V některých případech byly pelety extrahovány jednou, ale polovičním objemem pufru s obsahem TX114. Po druhé extrakci TX114 byly pelety dekantovány.
Fáze s obsahem supernatantu z extrakce pomocí TX114 byla inkubována 15 minu při 30°C za občasného míchání. Rozmíchaný roztok byl odstředěn při 31 300 x g 30 minut při 30°C. Nižší detergentní fáze byla schromážděna a zředěna na obsah TX114 1 % studeným pufrem (50 mM Tris-HCl, 2mM EDTA 10 mM Naci, pH 8,0).
7.2.2. Q-sepharosa, pH 8,0
Zředěná fáze TX114 byla nanesena na Q-sepharosovou kolonu (Pharmacia) (20 ml/3g buněčné ssedliny) stabilizovanou pufrem (50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA 10 mM NaCl, 0,1 % TritonX-100, pH 8,0). Lipoprotein 29 kDa byl pak koncentrován jako nenavázaná frakce. Tato frakce byla zpracována inkubací s případným mícháním, dokud byl roztok zakalen. Uvedené dvě fáze byly odděleny odstředěním při 31 300 x g po dobu 30 minut při 30°c. Musí detergentní fáze pak byla shromážděna a zředěna studeným pufrem (10 mM Tris-HCl, 2mM EDTA, pH8,6) na 1% TX114.
7.2.3. Q-sepharosa, pH 8,6
Zředěná fáze TX114 byla nanesena na 100 ml Q-sepharosovou kolonu (Pharmacia) stabilizovanou pufrem (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8,6). Nenavázaná frakce obsahovala TX-114. kolona byla promyta pufrem A (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0,1 % TritonX-100, pH 8,6). Lipoprotein 29 kDa byl pak koncentrován gradientovou chromatografií s gradientem soli pomocí pufru B (10 mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 0,1 Triton X-100, pH 8,6). Gradient elučních činidel byl použit následují: 0 - 50 % B, 40 ml; 50 - 100 B 100 ml. Lipoprotein 29 kDa byl eluován mezi 60 až 70 % B.
7.2.4. SDS-PAGE a elektroforéza proteinu
Vzorky proteinu z různých stupňů čistění byly solubilizovány ve vzorku pufru (50 mM Tris HC1, pH 6,8, 8% glycerin, 1,6 % SDS, 4% β-merkaptoetanol, 0,02% bromfenolová modř) a separována na Novexu s gradientem na Novexem upravených gradinetových gelech (4-20 % polyakrylamidu nebo BioRad gradientových gelech 10-20 % polyakrylamidu).
• » • ·
- 27 Elektroforézné používaný pufr obsahoval 25 mM Tris, 192 mM glycinu, 0,5 % SDS, pH 8,3. Gely byly napouštěny 1% Coomasova brilantní modř R-250 v 40% methanolu, 10% kyselině octové a vymývány 10% methanolem,10% kyselinou octovou.
Gely, používané pro polosuchý elektrobloting nebyly napouštěny, ale namáčeny v pufru transfer (48 mM Tris, 38 mM glycinu, 0.075 % SDS, 20 % MeOH), načež bylyproteiny přeneseny na PVDF membrány (Immobilon™, Millipore, USA), zařízení pro polosuchý poloblotting (BioRad). Imunodetekce byla dosažena prvním blokováním PVDF membrány po dobu jedné hodiny v 2% BSA v TBS (50 mM Tris-HCl, 2,5 M NaCI,, pH8,2) a poté byla membrána inkubována jednu hodinu se specifickou monoklonální protilátkou (IgGl) proti lypoproteinu 29 kDa, zředěné 1:10, 1% BSA v TBS. Po stupni promývání membrány TBS, byla tato membrána inkubována po dobu 1 hodiny s antimouse IgG protilátkou, konjugovanou s alkalickou fosfatázou (Dakopatts, Denmark). Po dalším promytí byla membrána vyvíjena vhodnými substráty (5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát (BCIP) a nitrátové tetrazolinové modři (NBT) (Sigma)).
7.2.5. Koncentrace proteinu a pyrogenicita
Celková koncentrace proteinu byla stanovena BCA (Pears Chemical Company USA).
Obsah endotoxinu byl testován testem pomocí lyzátu chromogenního amebocytu Limulus (LAL) test (LAL COAMATIC™ Endotoxin, Endosafe lne. USA).
SDS gely byly za účelem detekce relativního množství proteinových konaminantú ve finálních preparátech skenovány zařízením BioRad Imager GS-. Preparáty obsahovaly do 10 % proteinových kontaminantů.
- 28 Příklad 8: Analýza proteinu Helicobacter pylori 29 kDa pro použití jako vakcíny
8.1. Materiály a metody
8.1.1. Zvířata
Samice SPF BALB/c myší byly získány z Bomholt Breeding centre (Denmark). Tyto myši byly ponechány v běžných makrolonobvých klecích s plným přístupem k vodě a k potravě. Zvířata byla získána ve stáři 4-6 týdnů.
8.1.2. Infekce
Po alespoň jednom týdnu aklimatizace byla zvířata nakažena mikroorganismem Helicobacter pylori typu 2 (původní kmen 244, izolovaný od pacienta, trpícího vředem. U tohoto kmene byla předtím zjištěna dobrá schopnost kolonizovat myší žaludek. Bakterie byly ponechány k namnožení přes noc v živném roztoku Brucella, doplněném 10 % fetálního telecího séra při 37°C v mikroaerofilní atmosféře (10 % oxidu uhličitého, 5 % kyslíku). Zvířatům byl podán orálně omeprazol v dávce 400 mmol/kg a poté byla orálně inokulována přibližně o
10° cfu/zviře mikroorganismem Helicobacter pylori. Infekce byla ověřena u kontrolních zvířat 2-3 týdny po inokulaci.
8.1.3. Imunizace
Zvířata byla imunizována 4x v průběhu 34denní periody (dny, kdy byla prováděna imunizace: 1, 15, 25 a 35).
Přečištěný antigen byl podán v dávce 100 pg/myš a membránové proteiny (MP) v dávce 0,5 mg/dávka. Membránové proteiny byly připraveny sonizací bakterií v PBS. Kal byl odstraněn odstředěním směsi při 4°C, 2000 otáček za minutu po dobu 5 minut. Supernatant byl přenesen do nové trubice a odstředěn při 4°C, 15 000 ot/min. po dobu 2ú minut. Sraženina byla oddělena a uchovávána při -70°C do použití.
Zvířatům byl také při každé imunizaci podáván jako adjuvant chloratoxin (CT) v množství 10 ^g/myš. Omeprazol (400 μιηοΐ/kg) byl podáván zvířatům orálně 3-5 hodin před imunizací za účelem ochrany antigenů před rozkladem v kyselém prostředí. Po 4 týdnech po poslední imunizaci byla zvířata usmrcena a provedena analýza.
8.1.4. Pasivní ochrana
Analýza účinku monoklonálních protilátek (MAb) na schopnost Helicobacter pylori kolonizovat myší žaludek, byla prováděna tak že tyto protilátky, s různou specifitou, byly sraíseny s bakteriemi Helicobacter pylori 10 minut před inokulací, jak je popsáno shora. MAb působily proti proteinu 29 kDa (HP30-1:1:6), proti ureáze (URe 8:1) a proti tepelně stálému proteinu E.coli (ST 1:3). MAb byly titrovány v ELISA roztoku, přičemž se zajistila srovnatelná dávka protilátek v každém experimentu. Počet bakterií na myš, použitý pro inakulaci, byl 107. Analýza byla prováděna 2 týdny po inokulací.
8.1.5. Analýza infekce
Myši byly usmrceny CO2 cervikální dislokací. Abdomen byl otevřen a byl vyjmut žaludek. Po rozříznutí žaludku na obvodu více vyklenuté části byl žaludek promyt slaným roztokem. Sliznice z povrchu a z tělesa žaludku o ploše 25 mm2 byla odděleně oškrábána pomocí chirurgického skalpelu.
Oškrábaná (Brucella) sliznice byla rozmíchána v živném roztoku a nanesena na krevní Skirowovy plotny. Ty byly inkubovány v mikroaerofilnich podmínkách po dobu 3-5 dnů a byl spočítán počet kolonií. Identita Helicobacter pylori ·· * · v ♦ ·» • · ·· • ·ι· ·* «· • · · · byla potvrzena ureázovým a katalázovým testem a přímou mikroskopií nebo Gram testem.
8.2. Výsledky
8.2.1. Pasivní ochrana
V testu byly použity, tři skupiny po deseti zvířatech,, přičemž v každé skupině byla podána směs Helicobacter pylori kmen 244 a MAb, a jedné skupině byl podán pouze Helicobacter pylori. Směs MAb a bakterií byla ponechána 10 minut k vzájemnému působení, před inokulací myši. Z použitých MAb neměla žádná protilátka jasný vliv na bakterie invitro. Dva týdny po inokulací byly myši usmrceny a byl testován rozsah infekce u jednotlivých skupin (obr. 3). Všechny myši v kontrolní skupině i v skupině inokulované spolu s ST MAb byly nakaženy. Ve skupině, u které byla aplikována ureáza MAb, byly také všechny myši nakaženy, ale rozsah infekce byl signifikantně nižší ve srovnání s kontrolou. Ve skupině inokulované MAb proti proteinu 29 kDa nebyla nakažena ani jedna myš,
8.2.2. Terapeutická imunizace
Zvířata byla při tomto testu nakažena mikroorganismem
Helicobacter pylori kmen 244 jeden měsíc před
byly potom ve skupinách po deseti imunizovány bud choleratoxinem (CT) nebo CT spolu s membránovými proteiny, ureázou nebo proteinem 29 kDa. Kontrolní skupina zvířat obdržela pouze vehikulum (PBS). Měsíc po poslední imunizaci byla zvířata usmrcena a bylo stanoveno CFU (obr. 4). Všechna kontrolní zvířata, stejně jako zvířata imunizovaná pouze CT, byla nakažena. Zvířataúčinné imunizovaná ureázou a CT, nebo proteinem 29 kDa a CT, měla signifikantně sníženou hodnotu
CFU ve srovnání s kontrolou. Pouze jedno zvíře ve skupině • · · • · ·· imunizované ureázou bylo plně uchráněno před infekcí.
8.3. Závěry
Shora uvedené výsledky ukazují, že protein 29 kDA Helicobacter pylori je důležitý pro kolonizaci a/nebo přetrvávání infekce, neboť vazba MAb na tuto strukturu vede k úplné inhibici kolonizace.
Dále, protein 29 kDa Helicobacter pylori, pokud je používán jako orální imunogen za spolupůsobení choleratoxinu jako orálního adjuvantu, působí jako stimulátor imunitní odezvy, vedoucí k signifikantnímu snížení stupně kolonizace Helicobacter pylori u použitého pokusného zvířete.
Celkové lze říci, že tyto výsledky velmi dobře dokládají použitelnost proteinu 29 kDa Helicobacter pylori při orální vakcinaci u lidí, pomoci které se dá léčit a nebo chránit před infekcemi Helicobacter pylori.
Uložení mikroorganismů
Plazmid pAEl byl uložen podle Budapešťské dohody v národní sbírce NCIMB, Aberdeen, Skotsko, UK a to pod číslem NCIMB 40732. Datum uložení bylo 16. května 1995.
• · · ·
PŘEHLED SEKVENCÍ (1) OBECNÁ INFORMACE (i) Přihlašovatel
(A) Jméno: ASTRA AB
(B) Ulice: Vástra Málarehamnen 9
(C) Město: Sodertálje
(E) Země: Sweden
(F) Směrovací čísla (ZIP): S-151 85
(G) Telefon: +46 8 553 260 00
(H) Fax: +46 8 553 288 20
(I) telex: 19237 astra s
(ii) Název vynálezu: Bacterial Antigens and Vaccine
Compositions (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Forma čitelná počítačem:
(A) Nosič: Flopy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release +1,0, Verze +1.30 (EPO) (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 1670 základních páru (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA « · · • · · (ix) Znak:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 793..1575 (ix) Znak:
(A) Jméno/klíč: mat-peptid (B) Umístění: 793..1572 (ix) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
GATCCTATCG CGCCAAAGGT GGTATTAGGA ATAAGAGCTT GATTATTAAT CTCCCTGGTA 60
AGTCCAAAAA GTATTAGAGA ATGCTTAGAG GCGGTTTTTC CAGCGATTCC TTATTGCGTG 120
GATTTGATTT TAGGGAATTA CATGCAAGTG AATGAAAAAA ACATTCAAGC GTTTGCCCCC 180
AAACAATAAG GTAAAAAATG CCACTCACTC ATTTGAATGA AGAAAATCAA CCTAAAATGG 240
TGGATATAGG GGATAAAGAA ACCACTGAAA GAATCGCTCT AGCAAGCGGT CGTATCAGCA 300
TGAATAAAGA GGCTTATGAC GCTATTATCA ATCATGGCGT CAAAAAGGGT CCGGTATTAC 360
AAACTGCTAT TATTGCTGGG ATTATGGGGG CTAAAAAGAC AAGCGAACTC ATTCCCATGT 420
GCCATCCAAT CATGCTCAAT GGGGTGGATA TTGATATTTT AGAAGAAAAA GAGACTTGTA 480
GTTTTAAACT CTATGCGAGA GTCAAAACTC AAGCTAAAAC GGGCGTAGAA ATGGAAGCGC 540
TAATGAGTGT GAGCGTAGGG CTTTTAACCA TTTATGACAT GGTGAAAGCC ATTGATAAGA 600
GCATGACAAT TAGCGGTGTG ATGCTGGAAT ATAAAAGTGG AGGCAAAAGT GGGGATTATA 660
ACGCTAAAAA ATAGAAAAAG ACTGATAATC TAAAGATATT AGGGTAAAAT AACATTTTGA 720
CAACAAAAGC GTGTTGGTTG CTTCGGATTT GTTGTTATAG AAGTCTAAAA TATTACAATC 780
AAGGATAGAA CG ATG AGA GCA AAT AAT CAT TTT AAA GAT TTT GCA TGG Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp 15 10 828
AAA AAA TGC CTT TTA GGC GCG AGC GTG GTG GCT TTA TTA GTG GGA TGC 876
Lys Lys Cys Leu Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys 15 20 25
AGC CCG CAT ATT ATT GAA ACC AAT GAA GTC GCT TTG AAA TTG AAT TAC 924
Ser Pro His lle lle Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr 30 35 40
CAT CCA GCT AGC GAG Glu AAA GTT CAA GCG TTA GAT GAA AAG ATT TTG CTT Leu 60 972
His 45 Pro Ala Ser Lys 50 Val Gin Ala Leu Asp 55 Glu Lys lle Leu
TTA AGG CCA GCT TTC CAA TAT AGC GAT AAT ATC GCT AAA GAG TAT GAA 1020
Leu Arg Pro Ala Phe Gin Tyr Ser Asp Asn lle Ala Lys Glu Tyr Glu
65 70 75
AAC AAA TTC AAG AAT CAA ACC GCG CTC AAG GTT GAA CAG ATT TTG CAA 1068
Asn Lys Phe Lys Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin lle Leu Gin
80 85 90
AAT CAA GGC TAT AAG GTT ATT AGC GTA GAT AGC AGC GAT AAA GAC GAT 1116
Asn Gin Gly Tyr Lys Val lle Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp
95 100 105
TTT TCT TTT GCA CAA AAA AAA GAA GGG TAT TTG GCG GTT GCT ATG AAT 1164
Phe Ser Phe Ala Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn
110 115 120
GGC GAA ATT GTT TTA CGC CCC GAT CCT AAA AGG ACC ATA CAG AAA AAA 1212
Gly Glu lle Val Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr lle Gin Lys Lys
125 130 135 140
TCA GAA CCC GGG TTA TTA TTC TCC ACC GGT TTG GAC AAA ATG GAA GGG 1260
Ser Glu Pro Gly Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly
145 150 155
GTT TTA ATC CCG GCT GGG TTT ATT AAG GTT ACC ATA CTA GAG CCT ATG 1308
Val Leu lle Pro Ala Gly Phe lle Lys Val Thr lle Leu Glu Pro Met
160 165 170
AGT GGG GAA TCT TTG GAT TCT TTT ACG ATG GAT TTG AGC GAG TTG GAC 1356
Ser Gly Glu Ser Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp
175 180 185
ATT CAA GAA AAA TTC TTA AAA ACC ACC CAT TCA AGC CAT AGC GGG GGG 1404
lle Gin Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly
190 195 200
TTA GTT AGC ACT ATG GTT AAG GGA ACG GAT AAT TCT AAT GAC GCG ATC 1452
Leu Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala lle
205 210 215 220
AAG AGC GCT TTG AAT AAG ATT TTT CGA AAT ATC ATG CAA GAA ATA GAC 1500
Lys Ser Ala Leu Asn Lys lle Phe Ala Asn lle Met Gin Glu lle Asp
225 230 235
AAA AAA CTC ACT CAA AAG AAT TTA GAA TCT TAT CAA AAA GAC GCC AAA 1548
Lys Lys Leu Thr Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys
240 245 250
If « ·
GAA TTA AAA AGA AAC CGA TAA AAA CAAATAA CGCATAAGAA 1595
Glu Leu Lys Gly Lys Arg Asn Arg
255 260
AAGAACGCTT GAATAAACTG CTTAAAAAGG GTTTTTTAGC GTTCTTTTTG AGCGTGTATT 1655
TAAGGGCTGA TGATC 1670
- 35 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 261 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: proteinová (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Met Arg 1 Ala Asn Asn 5 His Phe Lys Asp Phe Ala Trp 10 Lys Lys Cys 15 Leu
Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys Ser Pro His Ile
20 25 30
Ile Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr HiS Pro Ala Ser
35 40 45
Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys Ile Leu Leu Leu Arg Pro Ala
50 55 60
Phe Gin Tyr Ser Asp Asn Ile Ala Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Lys
65 70 75 80
Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin Ile Leu Gin Asn Gin Gly Tyr
85 90 95
Lys Val Ile Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala
100 105 110
Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu Ile Val
115 120 125
Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gin Lys Lys Ser Glu Pro Gly
130 135 140
Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu Ile Pro
145 150 155 160
f * W · 4« «
- 36 - • v • • • · · · v · • • · • · • · ·· • · • « • ·
* * ♦ · »
Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu Glu Pro Met Ser Gly GlU Ser
165 170 175
Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp Ile Gin Glu Lys
180 185 190
Phe Leu Lys Thr Thr HÍS Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr
195 200 205
Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ile Lys Ser Ala Leu
210 215 220
Asn Lys Ile Phe Ala Asn Ile Met Gin Glu Ile Asp Lys Lys Leu Thr
225 230 235 240
Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tys Gin Lys Asp Ala Lys Glu Leu Lys Gly
245 250 255
Lys Arg Asn Arg
260 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 1670 základních párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvojitý (D) Typologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Znak:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 793..1575 (ix) Znak:
(A) Jméno/klíč: mat-peptid (B) Umístění: 793..1572 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
• «
GATCCTATCG CGCCAAAGGT GGTATTAGGA ATAAGAGCTT GATTATTAAT CTCCCTGGTA 60
AGTCCAAAAA GTATTAGAGA ATGCTTAGAG GCGGTTTTTC CAGCGATTCC TTATTGCGTG 120
GATTTGATTT TAGGGAATTA CATGCAAGTG AATGAAAAAA ACATTCAAGC GTTTGCCCCC 180
AAACAATAAG GTAAAAAATG CCACTCACTC ATTTGAATGA AGAAAATCAA CCTAAAATGG 240
TGGATATAGG GGATAAAGAA ACCACTGAAA GAATCGCTCT AGCAAGCGGT CGTATCAGCA 300
TGAATAAAGA GGCTTATGAC GCTATTATCA ATCATGGCGT CAAAAAGGGT CCGGTATTAC 360
AAACTGCTAT TATTGCTGGG ATTATGGGGG CTAAAAAGAC AAGCGAACTC ATTCCCATGT 420
GCCATCCAAT CATGCTCAAT GGGGTGGATA TTGATATTTT AGAAGAAAAA GAGACTTGTA 480
GTTTTAAACT CTATGCGAGA GTCAAAACTC AAGCTAAAAC GGGCGTAGAA ATGGAAGCGC 540
TAATGAGTGT GAGCGTAGGG CTTTTAACCA TTTATGACAT GGTGAAAGCC ATTGATAAGA 600
GCATGACAAT TAGCGGTGTG ATGCTGGAAT ATAAAAGTGG AGGCAAAAGT GGGGATTATA 660
ACGCTAAAAA ATAGAAAAAG ACTGATAATC TAAAGATATT AGGGTAAAAT AACATTTTGA 720
CAACAAAAGC GTGTTGGTTG CTTCGGATTT GTTGTTATAG AAGTCTAAAA TATTACAATC 780
AAGGATAGAA CG ATG AGA GCA AAT AAT CAT TTT AAA GAT TTT GCA TGG Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp 828
10
AAA Lys AAA TGC CTT Leu TTA GGC GCG Ala AGC Ser 20 GTG Val GTG GCT TTA Leu TTA Leu 25 GTG Val GGA Gly TGC Cys 876
Lys Cys 15 Leu Gly Val Ala
AGC CCG CAT ATT ATT GAA ACC AAT GAA GTC GCT TTG AAA TTG AAT TAC 924
Ser Pro His Ile Ile G1U Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr
30 35 40
CAT CCA GCT AGC GAG AAA GTT CAA GCb TTA GAT GAA Λ H HrtVJ a mm ni i mmr' 1 1*J X X 070 J f 4-1
His Pro Ala Ser Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys Ile Leu Leu
45 50 55 60
TTA AGG CCA GCT TTC CAA TAT AGC GAT AAT ATC GCT AAA GAG TAT GAA 1020
Leu Arg Pro Ala Phe Gin Tyr Ser Asp Asn Ile Ala Lys Glu Tyr Glu
65 70 75
AAC AAA TTC AAG AAT CAA ACC GCG CTC AAG GTT GAA CAG ATT TTG CAA 1068
Asn Lys Phe Lys Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin Ile Leu Gin
80 85 90
AAT CAA GGC TAT AAG GTT ATT AGC GTA GAT AGC AGC GAT AAA GAC GAT 1116
Asn Gin Gly Tyr Lys Val Ile Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp
95 100 105
* · • · · * * ·«·· · • 0 » v · · · ·* ·· tf ♦ · ··♦♦ ···
TTT Phe TCT Ser 110 TTT GCA CAA AAA AAA GAA GGG TAT Tyr TTG Leu GCG Ala 120 GTT GCT ATG AAT 1164
Phe Ala Gin Lys Lys 115 Glu Gly Val Ala Met Asn
GGC GAA ATT GTT TTA CGC CCC GAT CCT AAA AGG ACC ATA CAG AAA AAA 1212
Gly Glu Ile Val Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gin Lys Lys
125 130 135 140
TCA GAA ccc GGG TTA TTA TTC TCC ACC GGT TTG GAC AAA ATG GAA GGG 1260
Ser Glu Pro Gly Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly
145 150 155
GTT TTA ATC CCG GCT GGG TTT ATT AAG GTT ACC ATA CTA GAG CCT ATG 1308
Val Leu Ile Pro Ala cly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu Glu Pro Met
160 160 170
AGT GGG GAA TCT TTG GAT TCT TTT ACG ATG GAT TTG AGC GAG TTG GAC 1356
Ser Gly Glu Ser Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp
175 180 185
ATT CAA GAA AAA TTC TTA AAA ACC ACC CAT TCA AGC CAT AGC GGG GGG 1404
Ile Gin Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly
190 195 200
TTA GTT AGC ACT ATG GTT AAG GGA ACG GAT AAT TCT AAT GAC GCG ATC 1452
Leu Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ile
205 210 215 220
AAG AGA GCT TTG AAT AAG ATT TTT GCA AAT ATC ATG CAA GAA ATA GAC 1500
Lys Arg Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Asn Ile Met Gin Glu Ile Asp
225 230 235
AAA AAA CTC ACT CAA AAG AAT TTA GAA TCT TAT CAA AAA GAC GCC AAA 1548
Lys Lys Leu Thr Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys
240 245 250
GAA TTA AAA GGC AAA AGA AAC CGA TAA AAACAAATAA CGCATAAGAA 1595
Glu Leu Lys Gly Lys Arg Asn Arg
255 260
AAGAACGCTT GAATAAACTG CTTAAAAAGG GTTTTTTAGC GTTCTTTTTG AGCGTGTATT 1655
TAAGGGCTGA TGATC1670 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 261 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (D) Topologie: lineární
- 39 (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Met 1 Arg Ala Asn Asn 5 His Phe Lys Asp Phe 10 Ala Trp Lys Lys Cys 15 Leu
Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys Ser Pro His Ile
20 25 30
Ile Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr His Pro Ala Ser
35 40 45
Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys Ile Leu Leu Leu Arg Pro Ala
50 55 60
Phe Gin Tyr Ser Asp Asn Ile Ala Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Lys
65 70 75 80
Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin Ile Leu Gin Asn Gin Gly Tyr
85 90 95
Lys Val Ile Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala
100 105 110
Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu Ile Val
115 120 125
Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gin Lys Lys Ser Glu Pro Gly
130 135 140
Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu Ile Pro
145 150 155 160
Ala Gly Phe Ile Lys Val Thr Ile Leu Glu Pro Met Ser Gly Glu Ser
165 170 175
Leu Asp Ser Phe mu 1 lid. 4ri© e Asp Leu r> Λ -wOtU. /· Ί , , U1U Leu Asp T Ί « 11C /* Ί kJlll Ί <. uiu Lys
180 185 190
Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr
195 200 205
Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ile Lys Arg Ala Leu
210 215 220
Asn Lys Ile Phe Ala Asn Ile Met Gin Glu Ile Asp Lys Lys Leu Thr
225 230 235 240
Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys Glu Leu Lys Gly
245 250 255
• ·

Claims (22)

1. Polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je shodná, nebo v podstatě podobná, na pozicích 1-260 nebo 28-260 se sekvencí SEQ ID NO 2 nebo se sekvencí SEQ ID NO 4 v přehledu sekvencí.
2. Peptid o délce řetězce alespoň 5 aminokyselin zahrnující iiuunogenní epitop polypeptidů podle nároku 1.
3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která má sekvenci nukleotidů, kódující polypeptid podle nároku 1.
4. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, vybraná ze skupiny zahrnující:
(a) molekuly nukleových kyselin obsahující sekvenci nuklotidu, která je identická nebo v podstatě podobná, na pozicích 796-1572 nebo 874-1572, sekvenci SEQ ID NO 1 nebo SEQ ID NO 3, uvedených v přehledu sekvencí, (b) molekuly nukleových kyselin obsahující sekvenci nukleotidů, schopnou hybridizovat na nukleovou sekvenci komplementární k regionu molekuly nukleové kyseliny, kódující polypeptid, jak je definován v (a), a který kóduje polypeptid podle nároku 1, nebo jejich funkčně ekvivalentní modifikované formy a (c) molekuly nukleových kyselin obsahující sekvenci nukleových kyselin, která je degenerována podle genetického kódu na nukleotidovou sekvenci, jak je definována v (a) nebo (b), a která kóduje polypeptid podle nároku 1, nebo jeho funkčně ekvivalentní modifikovanou formu.
5. Vektor, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4.
6. Vektor podle nároku 5, který je plazmidovým • · · · ♦ · vektorem pAEl (NCIMB 40732),
7. Vektor podle nároku 5, který je expresním vektorem schopným zprostředkovat expresi DNA molekuly podle nároku 3 nebo 4.
8. Vektor podle nároku 7, který je plazmidovým vektorem pS863 zobrazeným na obr. 2.
9. Hostitelská buňka nesoucí vektor podle kteréhokoli z nároků 5-8.
10. Způsob výroby polypeptidů, který je antigenem 29 kDa, a je vystaven na povrchu mikroorganismu Helicobacter pylori, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky transformované expresním vektorem podle nároku 7 nebo 8 za podmínek, kdy je produkován uvedený polypeptid a izolaci uvedeného polypeptidů.
11. Polypeptid nebo peptid podle nároku 1 použití při léčení.
12. Polypeptid nebo peptid podle nároku 1 použití při diagnóze infekce Helicobacter pylori.
13= Polypeptid nebo peptid podle nároku 1 použití jako vakcina.
nebo 2 pro nebo 2 pro nebo 2 pro
14. Vakcinační prostředek pro vyvolání ochranné imunitní odezvy vůči infekci Helicobacter pylori, vyznačující se tím, že zahrnuje imunologicky účinné množství polypeptidů podle nároku 1, nebo jeho modifikované formy, která si zachovává schopnost vyvolat ochrannou imunitu proti infekci Helicobacter pylori, popřípadě spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
15. Vakcinační prostředek podle nároku 14 pro použití jako terapeutická vakcina u savců včetně člověka, který je nakažen Helicobacter pylori.
16. Vakcinační prostředek podle nároku 14 pro použití jako preventivní vakcina, chránící savce, včetně člověka, . proti infekci Helicobacter pylori.
»
17. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 nebo jeho modifikované formy, která si uchovává schopnost vyvolat ochrannou imunitu proti infekci Helicobacter pylori, při výrobě prostředku pro léčení, prevenci nebo diagnózu infekce Helicobacter pylori.
18. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 nebo jeho modifikované formy, která si udržuje schopnost vyvolat ochrannou imunitu proti infekci Helicobacter pylori při výrobě diagnostické soupravy pro diagnózu infekce Helicobacter pylori.
19. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 2 nebo jeho modifikované formy, která si udržuje schopnost vyvolat ochrannou imunitu proti infekci Helicobacter pylori při výrobě diagnostické soupravy pro výrobu vakciny pro použití k vyvolání ochranné imunitní odezvy proti Helicobacter pylori.
20. Způsob diagnózy infekce Helicobacter pylori invitro, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden krok, • při kterém se používá polypeptid podle nároku 1 nebo 2, popřípadě značený nebo spojený s pevným nosičem.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že zahrnuj e stupně:
(a) působení uvedeného polypeptidu, popřípadě vázaného na pevný nosič, na tělní tekutinu odebranou savci a (b) detekci protilátek z uvedené tělní tekutiny navázáním na uvedený polypeptid.
22. Diagnostická souprava pro detekci infekce Helicobacter pylori u savců, včetně člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje komponenty, schopné uskutečnit způsob podle nároku 20 nebo 21.
CZ973573A 1995-06-01 1996-06-03 Antigeny Helicobacter pylori a vakcinační kompozice CZ357397A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9502007A SE9502007D0 (sv) 1995-06-01 1995-06-01 Novel polypeptides
SE9601085A SE9601085D0 (sv) 1996-03-21 1996-03-21 Novel polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ357397A3 true CZ357397A3 (cs) 1998-05-13

Family

ID=26662316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ973573A CZ357397A3 (cs) 1995-06-01 1996-06-03 Antigeny Helicobacter pylori a vakcinační kompozice

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6025164A (cs)
EP (1) EP0828757A1 (cs)
JP (1) JP3380559B2 (cs)
KR (1) KR19990022131A (cs)
CN (1) CN1191544A (cs)
AR (1) AR003125A1 (cs)
BR (1) BR9608627A (cs)
CA (1) CA2222797A1 (cs)
CZ (1) CZ357397A3 (cs)
EE (1) EE9700306A (cs)
HU (1) HUP9901546A3 (cs)
IL (1) IL122340A0 (cs)
IS (1) IS4615A (cs)
MY (1) MY119003A (cs)
NO (1) NO975490L (cs)
NZ (1) NZ303356A (cs)
PL (1) PL323741A1 (cs)
RU (1) RU2195463C2 (cs)
SK (1) SK155297A3 (cs)
TR (1) TR199701471T1 (cs)
TW (1) TW570925B (cs)
WO (1) WO1996038475A1 (cs)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2682122B1 (fr) * 1991-10-03 1995-06-09 Pasteur Institut Nouveaux genes d'helicobacter pylori. leur utilisation pour la preparation de souches recombinantes de h. pylori.
US5843460A (en) * 1993-05-19 1998-12-01 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
WO1995014093A1 (en) 1993-05-19 1995-05-26 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
US6406703B1 (en) 1993-07-27 2002-06-18 Csl Limited Treatment of H. pylori associated gastroduodenal disease
NZ269124A (en) * 1993-07-27 1997-06-24 Csl Ltd Vaccine comprising helicobacter antigens and its use in treating such infections
AUPM612494A0 (en) * 1994-06-08 1994-06-30 Csl Limited Treatment or prevention of helicobacter infection
RU98100081A (ru) * 1995-06-07 2005-11-27 Астра Актиеболаг (SE) Нуклеиново-кислотные и аминокислотные последовательности helicobacter pylory для диагностики и терапии
AU6584298A (en) * 1997-03-26 1998-10-20 Avant Immunotherapeutics, Inc. Carbohydrate antigens which immunoreact with polyclonal antisera against (h. pylori)
KR20010020366A (ko) * 1997-04-30 2001-03-15 메리오 오라벡 횡경막하 전신 경로용 항-헬리코박터 백신 조성물 및 복합 점막/경구 면역법
SE9702241D0 (sv) * 1997-06-12 1997-06-12 Astra Ab Vaccine compositions IV
SE9702242D0 (sv) * 1997-06-12 1997-06-12 Astra Ab Vaccine compositions V
US7393529B2 (en) * 1998-04-09 2008-07-01 Idexx Laboratories, Inc. Methods and compositions for inhibiting binding of IgE to a high affinity receptor
SE9801288D0 (sv) * 1998-04-14 1998-04-14 Astra Ab Vaccine delivery system and metod of production
US6841155B1 (en) * 1998-04-30 2005-01-11 Chiron S.R.L. Immunization against and treatment for infection by H. pylori
WO2000049044A1 (en) * 1999-02-19 2000-08-24 Astrazeneca Ab Expression of helicobacter polypeptides in pichia pastoris
GB9924351D0 (en) 1999-10-14 1999-12-15 Brennan Frank Immunomodulation methods and compositions
ATE345354T1 (de) * 2000-04-27 2006-12-15 Max Planck Gesellschaft Methode zur identifizierung von helicobacter antigenen
GB0010371D0 (en) * 2000-04-29 2000-06-14 Astrazeneca Ab Helicobacter pylori antigens
US20020107368A1 (en) * 2000-12-07 2002-08-08 Jing-Hui Tian Helicobacter proteins, gene sequences and uses thereof
WO2005019249A2 (en) 2003-08-15 2005-03-03 University Of Florida Identification of porphyromonas gingivalis virulence polynucleotides for diagnosis, treatment, and monitoring of periodontal diseases
US7381547B2 (en) * 2004-04-28 2008-06-03 Tzam Diagnostics, Llc Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR
KR100613924B1 (ko) * 2004-06-23 2006-08-21 현대자동차주식회사 자동차 연료 시스템
US20090269362A1 (en) * 2005-07-25 2009-10-29 Sant Andrea J Method for Controlling Immunodominance
EP2139993A2 (en) * 2007-04-27 2010-01-06 Dow Global Technologies Inc. Improved production and in vivo assembly of soluble recombinant icosahedral virus-like particles
CN101496898B (zh) * 2009-02-16 2011-06-15 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗
RU2449805C1 (ru) 2011-01-27 2012-05-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Гармония" Пептидная фармацевтическая композиция, средство на ее основе для лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемых helicobacter pylori, и способ его использования
JP6959937B2 (ja) 2015-12-14 2021-11-05 テクニシェ ユニバーシタット ミュンヘン ヘリコバクターピロリワクチン
US10577409B2 (en) * 2016-05-26 2020-03-03 Sagabio Co., Ltd. Monoclonal antibody inhibiting immunosuppressive functions of pathogens, antigen-binding fragment thereof, and hybridomas producing such antibody
CN107456578A (zh) * 2016-06-03 2017-12-12 硕英生医股份有限公司 一种关闭病原体的免疫抑制功能的方法及其用途
EP3272354A1 (en) 2016-07-20 2018-01-24 Technische Universität München Agents and methods for the prevention or treatment of h. pylori infections
CN111467368B (zh) * 2020-04-13 2021-05-28 江南大学 含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用
CN113144182B (zh) * 2021-04-22 2023-03-10 成都欧林生物科技股份有限公司 一种幽门螺杆菌口服缓释疫苗及其制备与应用
CN113896775A (zh) * 2021-08-25 2022-01-07 河北医科大学第四医院 幽门螺杆菌特异性免疫原性肽段

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100188323B1 (ko) * 1989-03-09 1999-06-01 이곤 이이 버어그 비타입성 헤모필루스 인플렌자에 대한 백신
US5721349A (en) * 1992-02-26 1998-02-24 Vanderbilt University Vacuolating toxin-deficient H. pylori
MX9301706A (es) * 1992-04-13 1994-05-31 Oravax Inc Composicion de vacuna para el tratamiento de la infeccion por helicobacter.
US5420014A (en) * 1992-04-30 1995-05-30 Auspharm International Ltd. Rapid in vitro test for helicobacter pylori using saliva

Also Published As

Publication number Publication date
IS4615A (is) 1997-11-17
US6025164A (en) 2000-02-15
HUP9901546A2 (hu) 1999-08-30
SK155297A3 (en) 1998-08-05
AR003125A1 (es) 1998-07-08
EP0828757A1 (en) 1998-03-18
US20020168726A1 (en) 2002-11-14
NZ303356A (en) 1999-05-28
KR19990022131A (ko) 1999-03-25
IL122340A0 (en) 1998-04-05
WO1996038475A1 (en) 1996-12-05
JP3380559B2 (ja) 2003-02-24
RU2195463C2 (ru) 2002-12-27
EE9700306A (xx) 1998-06-15
TW570925B (en) 2004-01-11
JPH11507210A (ja) 1999-06-29
AU6020596A (en) 1996-12-18
CA2222797A1 (en) 1996-12-05
MY119003A (en) 2005-03-31
MX9709194A (es) 1998-07-31
HUP9901546A3 (en) 2003-07-28
PL323741A1 (en) 1998-04-14
BR9608627A (pt) 1999-06-15
NO975490D0 (no) 1997-11-28
TR199701471T1 (xx) 1998-02-21
CN1191544A (zh) 1998-08-26
AU703331B2 (en) 1999-03-25
NO975490L (no) 1998-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ357397A3 (cs) Antigeny Helicobacter pylori a vakcinační kompozice
US6630582B1 (en) Treatment and prevention of helicobacter infection
Kostrzynska et al. Molecular characterization of a conserved 20-kilodalton membrane-associated lipoprotein antigen of Helicobacter pylori
EA001789B1 (ru) Выделенные, по существу очищенные, поверхностные антигены белковой природы neisseria meningitidis и neisseria gonorrhoeae, их фрагменты и последовательности днк
JP4368944B2 (ja) 防御用ヘリコバクター抗原
CA2183769A1 (en) Vacuolating toxin-deficient h. pylori and related methods
US20020054883A1 (en) Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof
AU2003227537A2 (en) Expec-specific proteins, genes encoding them and uses thereof
US20020028210A1 (en) Vaccine composition comprising helicobacter pylori flagellin polypeptide
US6100066A (en) Nucleic acid molecules encoding Haemophilus somnus proteins
AU750792B2 (en) 76 kDa, 32 kDa, and 50 kDa helicobacter polypeptides and corresponding polynucleotide molecules
US20040047871A1 (en) Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and prepaation thereof
AU703331C (en) Helicobacter pylori antigens and vaccine compositions
WO1998006853A1 (en) Treatment and prevention of helicobacter infection
SK173099A3 (en) Vaccine compositions comprising the helicobacter pylori flge polypeptide
MXPA97009194A (en) Antigens of helicobacter pylori and compositions of vac
AU3390599A (en) Helicobacter pylori vaccine compositions
WO1997028264A1 (en) A novel gene encoding an outer membrane protein of helicobacter pylori and a recombinant microorganism expressing the same
JPH06189773A (ja) トレポネーマ・ヒオジセンテリエ ワクチン
WO1998056815A1 (en) VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE HELICOBACTER PYLORI Pfr POLYPEPTIDE
WO2001049722A2 (en) New actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane protein and its uses
EP1113074A1 (en) Actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane protein and its use
WO1998056412A1 (en) VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING THE HELICOBACTER PYLORI 26kDa POLYPEPTIDE

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic