CN107456578A - 一种关闭病原体的免疫抑制功能的方法及其用途 - Google Patents

一种关闭病原体的免疫抑制功能的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高活体免疫能力的方法，该方法包括对病原体所存在的环境施予一种可关闭该病原体的免疫抑制功能的组成物。该病原所存在环境包括该病原体附着的活体宿主体内。所述病原体的免疫抑制功能是由该病原体所分泌或产生的免疫抑制物质所提供。因此，该关闭该病原体的免疫抑制功能的组成物即包括关闭该免疫抑制物质作用的功能抑制剂。该功能抑制剂包括可识别该免疫抑制物质或其一部份的抗体。本发明还公开了所述抑制剂组成物的用途。

Description

一种关闭病原体的免疫抑制功能的方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种关闭病原体的免疫抑制功能的方法及其用途，特别涉及一种关闭病原体所分泌的免疫抑制物质的作用，以提高宿主免疫能力的方法，以及其用途。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori,H.pylori)是一种革兰氏阴性细菌，全世界已经有一半的成年人口受到感染。由幽门螺旋杆菌引发的慢性炎症可以导致包括从消化道溃疡到胃癌的数种结果，取决所导致的胃发炎程度与范围而定。虽然宿主体内主要产生趋向Th1型的粘膜免疫反应，但因无法达到足以保护宿主免于幽门螺旋杆菌感染的程度，以致形成慢性感染，并会在部分患者身上发展成胃癌病变。先前的研究已经证明，幽门螺旋杆菌裂解物能抑制诱导有丝分裂原的T细胞增殖。示出该裂解物中存在与免疫抑制活性相关的因子。这些因子可以衰减T细胞的活性，且其作用机制与细菌毒力基因CagA及VacA无关。研究人员已经提出几种机制，用来解释幽门螺旋杆菌能够直接或间接抑制T-细胞的免疫反应的原因。包括：幽门螺旋杆菌可通过精氨酸酶抑制T细胞的增殖以及T细胞上受体的表达；幽门螺旋杆菌能刺激免疫抑制型激素TGF-β的释放；幽门螺旋杆菌会透过VacA干扰恒定链依赖抗原(invariant chain-dependent antigen)的表达；幽门螺旋杆菌会负向调控DC通过CagA磷酸化胞内蛋白的功能；或幽门螺旋杆菌能经由VirB7和VirB11抑制巨噬细胞的吞噬功能，等等。
虽然上述各种机制都可能言之成理，但目前业界认为调节性T细胞(Treg细胞，regulatory T-cells)是抑制T细胞活性，以及平衡炎症和细菌的持续感染的主要调控因素。2003年即有报导指出，CD4+CD25+T 细胞与幽门螺旋杆菌诱导的免疫抑制和其寄生有关。进一步的研究表明，宿主Treg细胞是保护受幽门螺旋杆菌感染的宿主免于产生过度的胃炎症和疾病症候的主要关键，但是同时也会促进细菌寄生在胃和十二指肠黏膜上。此外，患者胃上皮细胞表达的共同刺激因子B7-H1，也会促进CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞在幽门螺旋杆菌感染后的胃上皮细胞的发展。这表示，这种病原体会促进宿主Treg细胞的诱导。随后的研究则检验这些幽门螺杆菌所诱导的Treg细胞的功能。结果示出这种Treg细胞能够抑制对幽门螺杆菌特异性效应T细胞的作用，使其失能。此外，幽门螺旋杆菌引起的胃炎常会并发FoxP3+Treg细胞的浸润，其菌体寄生的程度与黏膜中TGF-β的表达程度相关。以上各种研究报告示出，因幽门螺旋杆菌诱导的宿主Treg反应，对于宿主的幽门螺旋杆菌免疫反应，以及对于幽门螺旋杆菌的相关疾病的致病机制，都是重要的调控因素。
幽门螺旋杆菌热休克蛋白60(H.pylori heat shock protein 60–HpHSP60)可诱导单核细胞分泌促发炎细胞激素与TGF-β1的表达。已有报导提出HpHSP60与尿素酶一起表达在细菌的细胞壁，并可作为胃幽门螺旋杆菌对胃上皮细胞的粘附分子。此外，也有研究发现，施用抗HpHSP60抗体可以干扰幽门螺旋杆菌的生长。因此，HpHSP60不仅是影响幽门螺旋杆菌生存能力的重要因素，同时也提供幽门螺旋杆菌于人胃寄生所需的凭借。然而，许多研究也示出，HpHSP60为一种免疫原，会强烈的刺激促炎症细胞激素，如TNF-α、IL-8和IL-6的产生。这些细胞激素造成感染部位发生发炎反应，且这种HpHSP60诱导的发炎反应可促进肿瘤发生恶变，包括血管增生和癌细胞移转。HpHSP60对于胃幽门螺旋杆菌感染人类宿主也是一种重要的致病因子。
由于HpHSP60和Treg细胞之间的关系复杂，对于两者关系的研究成为此行业重要的课题。不过，过去的研究都着重于HpHSP60所诱导的发炎反应。鲜少对于HpHSP60与宿主免疫抑制间的关系加以探讨。
美国专利号6,403,099涉及一种热休克蛋白与多糖或寡糖所形成的共轭化合物。该化合物可诱导形成抗多糖抗体，可做为人类及动物使用的疫苗。其中，所述热休克蛋白包括幽门螺旋杆菌热休克蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种关闭病原体的免疫抑制功能的方法。本发明的目的也在于提供一种关闭病原体的免疫抑制功能的用途。
本发明的目的也在于提供一种关闭病原体所分泌的免疫抑制物质的作用的方法，以及该方法的用途。
本发明的目的也在于提供一种新颖的提高活体免疫能力的方法及其用途。
根据本发明，若干病原体会产生抑制宿主免疫能力的功能。该功能特别是由该病原体所分泌或产生的免疫抑制物质所提供。通过关闭该免疫抑制物质的作用，即可关闭该病原体的免疫抑制功能。由于该免疫抑制功能被关闭，宿主自身的免疫功能即不受抑制。可通过该不受抑制的免疫功能，达成减少甚至消灭该病原体的目的。
根据本发明的一种方面，提供一种新颖的提高活体免疫能力的方法，以及该方法在制备预防、治疗疾病的药物的用途。
根据本发明，该提高活体免疫能力的方法包括对寄宿在活体体内或体外的细菌性病原体直接或间接施予一种可关闭(block)该细菌性病原体的免疫抑制功能的组成物的步骤。在本发明的特定实施例中，该组成物施予所述病原体附着的活体宿主体内。在此种及其他实例中，病原体的免疫抑制功能是由病原体所分泌或产生的免疫抑制物质所提供。因此，关闭该病原体的免疫抑制功能的组成物即包括关闭免疫抑制物质作用的功能抑制剂。其中，功能抑制剂可包括可识别免疫抑制 物质或其一部份的抗体。免疫抑制物质可为一种蛋白质，一部份为蛋白质的氨基酸序列的一部份。抗体可为由活体对免疫抑制物质产生免疫应答所天然产生的抗体。抗体可为前述抗体经人类化的抗体。
该组成物可包括有效剂量的功能抑制剂及其药学上可接受的载体或稀释剂。也可含有提高免疫刺激的有效性的佐剂。
本发明的用途包括以功能抑制剂制备刺激或增强针对病原体的免疫反应的药物。本发明的用途也包括以该功能抑制剂制备治疗或预防与该病原体的存在或异常表达有关的疾病或病症的药物。
根据本发明的特定实施例，一种提高活体免疫能力的方法包括对一病原体所存在环境，施予一种功能抑制剂组成物，以关闭病原体所分泌或产生的热休克蛋白的作用。在此类型的实施例中，病原所存在环境包括病原体附着的活体宿主体内。病原体可包括幽门螺旋杆菌以及其他附着于活体表面的细菌。
在此种及其他实例中，功能抑制剂可包括可识别热休克蛋白或其一部份氨基酸序列的抗体。该抗体可为由活体对热休克蛋白或其一部份氨基酸序列产生免疫反应所自然产生的抗体。抗体可为前述抗体经人类化的抗体。
组成物可包括有效剂量的功能抑制剂及其药学上可接受的载体或稀释剂。也可含有提高免疫刺激的有效性的佐剂。
本发明的用途包括以功能抑制剂制备刺激或增强针对该病原体的免疫应答的药物。本发明的用途也包括以功能抑制剂制备治疗或预防与病原体的存在或异常表达有关的疾病或病症的药物。
附图说明
图1示出HpHSP60对PBMC增殖的影响的实验结果。
图2示出HpHSP60对PBMC中T细胞增殖的影响的实验结果。
图3示出测定HpHSP60对PBMC细胞周期的影响的实验结果。
图4示出以HpHSP60对Treg细胞作体外诱导的实验结果。
图5示出检验HpHSP60促进Treg增殖的实验结果。
图6示出HpHSP60诱导型Treg细胞对抑制T细胞增殖的实验结果。
图7示出在活体动物中幽门螺旋杆菌因HSP60受到抑制而抑制菌体生长的实验结果。
图8也示出在活体动物中幽门螺旋杆菌因HSP60受到抑制而抑制菌体生长的实验结果。
图9示出在活体动物中因HSP60受到抑制而抑制Treg的实验结果。
图10示出HpHSP60中诱导Treg细胞的活性序列的位置的检测结果。
图11示出图10的实验结果数据化的结果。
图12示出探究抗HpHSP60抗体的免疫机制的实验结果。
图13示出抗HpHSP60抗体对Treg细胞在胃粘膜的表达的检测结果。
图14示出抗HpHSP60抗体对IL-10在胃粘膜的表达的检测结果。
图15示出检测LHP-1(9E4)抗体可识别的HpHSP60片段的实验结果。
图16示出进一步检测LHP-1(9E4)抗体可识别的HpHSP60片段的实验结果。
具体实施方式
虽然不欲为任何理论所拘束或限制，但根据本发明，若干病原体可以产生或分泌免疫抑制物质，以抑制宿主的免疫能力，达到使病原体增殖而造成宿主疾病的结果。此种病原体包括幽门螺旋杆菌以及其他类似的细菌，例如Arcobacter suis、Tannerellaforsythia、Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Helicobacter felis等菌。本发明发现，热休克蛋白即为此种免疫抑制物质的一种。根据本发明的实施例，幽门螺旋杆菌热休克蛋白(HpHSP60)能够通过与单核细胞的作用，刺激免疫抑制型激素IL-10以及TGF-β的产生，进而诱导Treg细胞的增殖，造成宿主免疫抑制现象，导致无法对抗幽门螺旋杆菌的慢性感染。
本发明进一步发展出一种提高宿主免疫能力的新方法，利用可以关闭所述免疫抑制物质作用的功能抑制剂，关闭所述免疫抑制物质的作用，有效抑制Treg细胞的增殖，消除免疫抑制的现象。
本发明所提出的功能抑制剂，包括能识别所述免疫抑制物质或其一部份结构并关闭该免疫抑制物质作用的物质。当免疫抑制物质为热休克蛋白时，功能抑制剂则包括能识别所述热休克蛋白的氨基酸序列或其一部份的抗体。
所述功能抑制剂可形成单克隆抗体的形式，以利大量生产。功能抑制剂可与药学上可接受的载体或稀释剂形成药物组成物。组成物也可含有提高免疫刺激的有效性的佐剂。佐剂可包括前述美国专利号6,403,099所示的免疫刺激剂。药物组成物可供作为刺激或增强针对病原体的免疫反应的药物。也可供作为治疗或预防与病原体的存在或异常表达有关的疾病或病症的药物。
以下将以实例并参考图式，说明本发明的关闭病原体的免疫抑制功能的方法及其用途。但须理解，本发明的范围并不限于实施例所记载的范围。例如，该实施例虽然以幽门螺旋杆菌的致病机制及幽门螺旋杆菌热休克蛋白60(HpHSP60)的功能抑制剂作为实例，但例如Helicobacter felis菌(可导致人类慢性肠炎)与Arcobacter suis菌(可导致人类牙周病)的热休克蛋白氨基酸序列中，也含有与HpHSP60相同的片段，例如HSP 60 101-200。本发明的方法及用途均可应用于此种以及其他致病的细菌，以及其他具相同致病机制的病原体。
实施例1：细胞培养，PBMC与T-细胞的分离
由健康供体所提供的人外周血单核细胞(PBMC)使用Ficoll-Paque Plus(商标，瑞典Uppsala的GE Healthcare公司生产)以密度梯度离心法分离，再悬浮于含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液中。为进行单核细胞的移除，将PBMC在10-cm的培养皿中以在106/mL的密度下培养过夜，使单核细胞附着。而悬浮的细胞在1500rpm下离心15分钟后收集。从该PBMC获得的全部T细胞使用磁力分选装置(Miltenyi Biotec公司，美国麻州)，进行负向筛选分离。简言之，即将PBMC以非T细胞抗体混合物(此抗体混合物皆标记有生物素)共同培养，接着以再与含抗生物素抗体的微磁珠反应，再利用磁座将非T细胞-生物素-抗-生物素-磁珠复合物吸附，T细胞则经由制造商的冲堤液冲堤后收集而得。
实施例2：HpHSP60对PBMC增殖的影响
以细胞增殖测定法检测，将以CD3mAb活化的PBMC，加入不同剂量的HpHSP60、rGFP及煮沸后的HpHSP60分析其细胞增殖情形。将各组细胞取0.2毫升，以1×106细胞/ml的浓度接种在预处理有抗CD3单克隆抗体的96孔微量培养盘的各孔中。于96小时后以MTT分析法测定细胞的增殖。图1示出实验结果。图中示出的数值为增殖指数。细胞增殖指数的计算方法如下：
增殖指数(100％)＝(经抗-CD3+HpHSP60处理的细胞的OD595值)/(经抗CD3-处理的细胞的OD595值)×100％。与未经加入HpHSP60之对照组比较，如有显著差异，则以*表示(P<0.05)(n＝15)。
图1示出，(◆)为HpHSP60加入至人外周血单核细胞(PBMC)后，T细胞增殖现象受到抑制。(■)rGFP为实验系统对照组蛋白，对T细胞增殖现象没有影响。由对照组可知，并非任何蛋白都可抑制T细胞增殖。(▲)Boiled HpHSP60表示只有HpHSP60序列但经煮沸丧失蛋白质的结构，使蛋白质变性失活。实验结果示出煮沸后的HpHSP60序列不会影 响T细胞增殖。
实施例3：HpHSP60对PBMC中T细胞增殖的影响
经抗CD3单克隆抗体处理，含T-细胞或无T细胞的PBMC，加入或不加入HpHSP60(200ng)，以CD3表面标记染色鉴定后，计算细胞数量。进行CD3表面标记染色时，将收集的细胞，以CD3单克隆抗体(OKT3)染色。其次再以IgG FITC荧光二级抗体(Biolegend公司，美国加州)染色。为进行FoxP3的细胞内染色，将细胞收集后，以CD4 FITC荧光单克隆抗体(Biolegend公司，美国加州)染色。将处理后的细胞固定和细胞膜打洞。随后用FoxP3-PE单克隆抗体(BD Biosciences公司，美国麻州)根据制造商的规定做细胞内染色。之后进行细胞周期分析：在72小时后将细胞用70％的乙醇固定。再以DNA染色缓冲液(含5％的Triton-X100，0.1毫克/毫升的RNase A和4微克/毫升的PI)染色，在室温下进行30分钟，之后检测DNA含量的变化。使用FACS流式细胞仪(Becton Dickinson公司，德国海德堡)和CELLQUEST Pro程序(Becton Dickinson公司，德国海德堡)进行荧光分析。
实验结果示出于图2。图2中的数值增殖指数(倍数)＝(经抗CD3/HpHSP60处理组中的T细胞或非T细胞数量)/(在未处理的对照组中的T细胞或非T细胞数量)。如有显著差异，则以*表示(P<0.05)，(N＝4)。实验结果证明HpHSP60可抑制PBMC中T细胞的增殖。图中，(□)示出PBMC中T细胞的部分；(■)示出PBMC中非T细胞的部分。由结果得知HpHSP60是针对T细胞作抑制。
实施例4：测定HpHSP60对细胞周期的影响
取PBMC细胞，以PBMC细胞本身、经过CD3活化的PBMC细胞以及经Anti-CD3+HpHSP60处理的PBMC，观察其subG1、G1、S和G2/M期的百分比，结果示出于图3的直方图。图中示出三次重复实验的结果。
图3示出，HpHSP60可抑制T细胞的增殖，而非造成T细胞死亡。图 中，图3A的Cellalone示出一般T细胞未经CD3活化会处在休眠期(G0/G1)。图3B的Anti-CD3示出经过CD3活化后，T细胞开始活化生长，而形成典型细胞周期图形。图3C的Anti-CD3+HpHSP60则示出与图3B比较，并无变化，且在Sub G0/G1期(代表细胞死亡之DNA片段)的比例与Anti-CD3组相比没有增加。实验结果显示HpHSP60的作用是抑制T细胞的生长，而不是造成T细胞死亡。
实施例5：以HpHSP60对Treg细胞作体外诱导的结果
对在经HpHSP60处理的PBMC细胞中，CD4+FoxP3+细胞的比例，随时间推移量作测量。与仅以抗CD3处理的对照组比较，如有显著差异，则以*表示(P<0.05)(n＝5)。结果示出于图4。
由于CD4和FoxP3是Treg细胞的标记，所以从图4即可直接识别HpHSP60对Treg细胞生长的影响。图中，(●)cell alone表示Treg细胞原始生长现象。(■)anti-CD3表示以CD3活化后Treg细胞生长现象。(▲)Anti-CD3+HpHSP60则表示Treg细胞大幅增殖。实验结果证明HpHSP60可促进Treg细胞的增殖。
实施例6：HpHSP60促进Treg细胞增殖
承接实施例5，在72小时后收集细胞后，作总RNA分离。使用实时PCR测定FoxP3mRNA表达量。与以抗CD3抗体处理的对照组比较，如有显著差异，则以*表示(P<0.05)，(n＝4)。结果示出于图5。
由于FoxP3是Treg细胞的标记，所以Treg细胞被活化时，FoxP3表达量也会增加。图中示出，由分析mRNA结果发现加入HpHSP60后FoxP3的表达量明显增加，进一步证明加入HpHSP60会促进Treg增殖。
实施例7：HpHSP60诱导型Treg细胞对抑制T细胞增殖的影响
以功能性检测法测量HpHSP60诱导的Treg细胞对T细胞增殖的影响。所得结果示出于图6的直方图。图中的数字表示增殖性细胞的百分 比。该图代表三次重复的结果。
实验结果示出，当Treg细胞增加，相对会抑制T细胞活化。证明PBMC加入HpHSP60后，由于Treg细胞增殖，抑制了T细胞的活化。
实施例8：抗HpHSP60血清(anti-HpHSP60serum)与HpHSP60单克隆抗体的制备
将幽门螺旋杆菌热休克蛋白60(HpHSP60)打入小鼠体内，使其发生免疫反应(immunization)。经过多次施打HpHSP60后(boost)，小鼠体内产生抗HpHSP60的抗体。将小鼠的血液收集后，取其血清，得到含有抗HpHSP60抗体的血清，称为抗HpHSP60血清(anti-HpHSP60serum)。此步骤取得的抗体为多克隆抗体(polyclonal antibody)。
将小鼠的脾脏细胞与骨髓癌细胞融合形成杂交瘤(hybridoma)。进一步筛选，利用酵素免疫分析法(ELISA)挑出专一性抗体。
将所得的细胞株稀释，重新平分到96槽细胞培养盘中，计算使得每槽中只含有一个细胞，使其生长成群落后，再次以ELISA筛选专一性抗体。得到单克隆的抗体。
实施例9：幽门螺旋杆菌因HSP60受到体内抑制而抑制菌体生长的效果
从台湾台北的实验动物繁育研究中心购买C3H/HeN小鼠，并保持在无病原体隔离下。使用前所有食物、水和笼架用品都进行消毒。5周龄雄性小鼠在接种幽门螺旋杆菌前，先以静脉注射0.1毫升由实施例8得到的抗HSP60血清(anti-HpHSP60serum)。在施打抗血清24小时后，使小鼠感染0.5mL的活幽门螺杆菌(ATCC编号为15,415的菌株，约109菌落形成单位)。以BHI液体培养基经由口服管喂法，在3天的期间内喂食两次。在确认感染幽门螺旋杆菌后，将小鼠静脉注射0.1ml由实施例8得到的抗HSP60血清，每3天一次。
在感染幽门螺旋杆菌第8周后，所有的小鼠在无菌条件下牺牲。将完整的胃沿小弯切开。每个胃分割成两个相等的纵向样品，每个样品都含有胃体和胃窦。再将胃组织磨碎后培养胃组织中的幽门螺旋杆菌，另外以免疫组织化学染色分析FoxP3的表达，以评估幽门螺旋杆菌在胃中寄生的状态。评估结果以平均值±SEM表示。使用单尾Student’s t-test方法评量统计学显著性。P<0.05即视为有显著差异。结果示出于图7、图8、图9。
图7和图8示出，抗HpHSP60血清显著降低在小鼠接种幽门螺旋杆菌第8周后，从其胃组织裂解液得到的幽门螺杆菌的菌落数。为研究抗体减少幽门螺旋杆菌在胃部寄生的机制，对Treg细胞在受幽门螺杆菌感染的胃组织中的表达量进行评估。图9示出，抗HpHSP60血清的处理显著降低Treg细胞在胃粘膜的表达量。上述结果表明，幽门螺旋杆菌慢性感染与HpHSP60具有相关性，且抑制HpHSP60可减少幽门螺旋杆菌的寄生量，同时也减少Treg细胞的产生。
实施例10：HpHSP60中诱导Treg细胞的活性序列的位置
为找出HpHSP60中诱导调控型T细胞的活性序列的位置，准备抗HpHSP60的单克隆抗体，包括含HpHSP60全序列以及其片段的单克隆抗体。依照实施例9的方法，先将小鼠在以抗HpHSP60血清处理24小时后，喂食幽门螺旋杆菌并确认感染幽门螺旋杆菌后，将小鼠静脉注射0.1ml，每3天一次分别施打PBS、血清、抗HSP60血清、LHP-1(9E4)单克隆抗体及LHP-2(5A8)单克隆抗体。于8周后牺牲小鼠，将小鼠胃壁磨碎后，在胃幽门螺旋杆菌分离培养基(EYE agar)上再培养胃匀浆，以确认胃中的幽门螺旋杆菌寄生。结果示出于图10。
图10中的红色点为幽门螺旋杆菌菌落，示出抗HSP60血清虽有抑制幽门螺旋杆菌生长的效果，但LHP-1(9E4)抗体则能有效完全消灭幽门螺旋杆菌。
计算胃幽门螺旋杆菌分离培养基平板中的有色菌落数，测定幽门螺旋杆菌菌落数(CFU)。如有显著差异，则以*表示(P<0.05)。结果示出于图11。图11示出经施以LHP-1(9E4)抗体后，可以完全消灭幽门螺旋杆菌。
实施例11：抗HpHSP60抗体的免疫机制
为了解抗HpHSP60抗体的免疫机制，对于实施例10的小鼠，在接种幽门螺旋杆菌后第2、3、8周，分别量测其幽门螺旋杆菌的尿素酶活性，以测定幽门螺旋杆菌分泌酵素UreaseB的活性。尿素酶活性以对照组小鼠(未经幽门螺旋杆菌感染)的尿素酶活性作标准化。结果示出于图12。该图示出，LHP-1(9E4)抗体是通过抑制HpHSP60而达成抑制幽门螺旋杆菌生长，甚至消灭幽门螺旋杆菌的效果。
该LHP-1(9E4)抗体是以位于HpHSP60101-200的氨基酸序列作为抗原。含该抗体的杂交瘤Hybridoma 9E4，保藏日为2016年3月2日，保藏在美国模式培养物集存库(AmericanType Culture Collection )(地址：美国20110维吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801)，ATCC保藏编号为PTA-122900。
实施例12：抗HpHSP60抗体对Treg细胞在胃粘膜的表达的评估
为了解抗HpHSP60抗体对Treg细胞在胃粘膜的表达的评估结果。将实施例10的小鼠胃以10％福尔马林固定，经石蜡包埋。将组织切片以H&E染色，随后对FoxP3作免疫组织化学染色。结果示出于图13(原物200μm，放大倍数100倍)。图中示出在第8周牺牲的小鼠胃壁切片中Treg细胞的表达量。示出经LHP-1(9E4)处理的小鼠胃黏膜找不到Treg表达。
实施例13：抗HpHSP60抗体对IL-10在胃粘膜的表达的评估
将实施例10的小鼠胃以10％福尔马林固定，经石蜡包埋。将组织 切片以H&E染色，随后对IL-10作免疫组织化学染色。结果示出于图14(原物200μm，放大倍数100倍)。图中示出在第8周牺牲的小鼠胃壁切片中IL-10细胞的表达量。示出经LHP-1(9E4)处理的小鼠胃黏膜找不到IL-10表达。
实施例14：LHP-1(9E4)抗体可识别的HpHSP60片段
为了解8LHP-1(9E4)抗体可识别的HpHSP60片段，以8LHP-1(9E4)抗体对不同片段的HpHSP60做识别。结果示出在图15。图中黑点部分代表LHP-1抗体可识别到HpHSP60的片段。所识别的片段包括以下，并以IgK作为本实验的阳性对照组，因大部分作出小鼠的单克隆抗体为kappa种类：
Whole—HpHSP60 1-547全长。
1-200—HpHSP60 1-200片段
101-200—HpHSP60 101-200片段
1-250—HpHSP60 1-250片段
200-300—HpHSP60 200-300片段
300-547—HpHSP60 300-547片段
由结果得知，LHP-1抗体可识别到HpHSP60的片段为101-200。该片段的氨基酸序列为(SEQ ID NO：1)：
EGLRNITAGANPIEVKRGMDKAAEAIINELKKASKKVGGKEEITQVATISANSDHNIGKLIADAMEKVGKDGVITVEEAKGIEDELDVVEGMQFDRGYLS
实施例15：LHP-1(9E4)抗体可识别的HpHSP60片段进一步限定
以实施例14的方法，将LHP-1(9E3)抗体识别的序列缩小至31个氨基酸序列。结果示出于图16。图中，黑点部分代表LHP-1(9E3)抗体可识别到HpHSP60的片段。图中示出，[1]为HpHSP60 134-200片段。观察到黑点，为可识别。而[5]为HpHSP60 101-168片段，未观察到黑点，为不可识别。此实验可以推论，LHP-1(9E3)抗体可识别HpHSP60的序列为169-200片段。该片段的氨基酸序列为(SEQ ID NO：2)：
KDGVITVEEAKGIEDELDVVEGMQFDRGYLS
生物材料保藏
美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection )(地址：美国20110维吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801)，2016年3月2日，ATCC保藏编号为PTA-122900。

Claims (15)

1.一种提高活体免疫能力的方法，包括：对寄宿在所述活体体内或体外的细菌性病原体直接或间接施予一种可关闭(block)所述细菌性病原体的免疫抑制功能的组成物的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述组成物施予所述病原体附着的活体宿主体内。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细菌性病原体所包括胃幽门螺旋杆菌、Arcobacter suis、Tannerella forsythia、Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacteractinomycetemcomitans、Helicobacter felis中的一种。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述细菌性病原体的免疫抑制功能由该病原体所分泌或产生的免疫抑制物质所提供，且关闭所述病原体的免疫抑制功能的所述组成物包括关闭所述免疫抑制物质作用的功能抑制剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述细菌性病原体所分泌或产生的免疫抑制物质包括热休克蛋白或其片段。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述热休克蛋白包括热休克蛋白60或其片段。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述热休克蛋白60包括SEQ ID NO：1的序列。
8.如权利要求4所述的方法，其中，所述功能抑制剂包括可识别所述免疫抑制物质或其一部份氨基酸序列的化合物或抗体。
9.如权利要求4所述的方法，其中，所述功能抑制剂包括可识别该免疫抑制物质或其一部份氨基酸序列的抗体人源化的产物。
10.如权利要求5所述的方法，其中，所述功能抑制剂包括可识别所述热休克蛋白或其一部份氨基酸序列的抗体。
11.如权利要求5所述的方法，其中，所述功能抑制剂包括由宿主对该热休克蛋白或其一部份氨基酸序列产生免疫反应所自然产生的抗体。
12.如权利要求4所述的方法，其中，所述组成物包括有效剂量的所述功能抑制剂及其药学上可接受的载体或稀释剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述组成物还含有提高免疫刺激的有效性的佐剂。
14.一种以权利要求8至11任一项所述的功能抑制剂组成物制备刺激或增强针对所述病原体的免疫反应的药物的用途。
15.一种以权利要求8至11任一项所述的功能抑制剂组成物制备治疗或预防与所述病原体的存在或异常表达有关的疾病或病症的药物的用途。
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简廷谚: "探讨幽门螺旋杆菌热休克蛋白60序列对诱发调控型T细胞的影响", 《国立交通大学生物科技研究所硕士论文》 *

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