TW570925B

TW570925B - Bacterial antigens and vaccine compositions

Info

Publication number: TW570925B
Application number: TW085110165A
Authority: TW
Inventors: Ingrid Boelin; Ann-Mari Svennerholm
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1995-06-01
Filing date: 1996-08-20
Publication date: 2004-01-11
Also published as: HUP9901546A3; NO975490D0; AU703331B2; JP3380559B2; RU2195463C2; NO975490L; TR199701471T1; CN1191544A; PL323741A1; NZ303356A; EP0828757A1; IL122340A0; BR9608627A; JPH11507210A; CZ357397A3; KR19990022131A; US6025164A; EE9700306A; MY119003A; HUP9901546A2

Description

570925 A7 . -------------B7 五、發明説明（1 ) - 技術範圍本發明提供包含幽門螺桿菌抗原的重組多肽，在分裂（样菌的）形式和休止（類球菌的）形式之兩種幽門螺桿菌的表面上表現出孩抗原’並提供全身及局部(黏膜)的抗體產生。本發明更提供編碼該多肽的核酸分子，以及含有這類核酸分子的載體和宿主細胞。該多肽可用來診斷幽η螺桿菌感染，並製造謗發對抗這類感染之保護性免疫反應的疫苗組合物，該疫苗組合物適用於治療和預防兩種用途。背景技藝革蘭氏-陰性桿菌的样菌，是二種重秀的人類病原體’涉及數種胃十二指腸的疾病。被捍菌移生至胃上皮，導致主動的炎症和進行性的慢性胃炎，大大地增加了發展成消化性潰瘍疾病的危險。爲了移生到胃黏膜，幽門螺·桿菌使用了一些毒性因子。這類毒性因子包括數種黏素（adhesin)，# 了它使样菌與黏液在一起，且/或結合到上皮細胞上；尿素酶，它幫助中和酸性的環境；以及蛋白水解酵素，它使得黏液較易流動 0 經濟部中央標隼局員工消費^*'作社印製不管利用局部（黏膜的）及全身性抗體兩者的產生，而對幽門螺桿菌有強烈顯著的宿主免疫反應，該病原菌仍留存在胃黏膜中’通常長達宿主的一、生。這樣很可能是因爲自發的免疫反應是不適當的，或是針對抗原上錯誤的抗原決定位。爲了瞭解幽門螺桿菌感染的發病原理和免疫學，定出梦 _______- 4 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 570925 經濟部中央標準局員工消費^*'作社印製五、發明説明（2 細^之抗原結構是極爲重要的。特定而言，需要描述表面暴露（像是黏素）和被分泌之蛋白質的特徵，在許多細菌性病原中，已經顯示該表面暴露和被分泌的蛋白質構成主要的毒性因予，並可以利用它們來診斷幽門螺疫苗組合物。 Evans等人（1993) j· Bacteri〇1. 175, 67心683 已經揭示了基因hpaA的選殖，該基因係編碼幽門螺样菌之與沁乙醯神經胺基乳糖結合的微纖維血球凝集素（NLBH)的2〇 kDa受體結合亞單元。已經由ΒδΗη等人（1995) j· Clin奶以扑⑹33 381 384揭示了對抗幽門螺桿菌之膜製品的單株抗體（MAbs)。這 MAbs其中有一種被命名爲Hp3〇_1:1:6，與一個％印狂的白質反應，顯示該蛋白質暴露在完整細菌的表面上，並有類似黏素的特性。 ' 只要發生緊迫或受到威脅，幽門螺桿菌便從1菌形式轉化成類球菌（形式。在類球菌形式時，幽門螺桿菌細胞對抗生素及其他抗細菌製非常不敏感。間接的證據指出，門螺桿菌可以此形式在個體之間傳播，可能是經由水或接接觸。因此，一個有效的疫苗组合物應該謗發朝向幽門螺桿菌之類球菌和桿菌形式的免疫反應。因爲全身性免疫在保護對抗黏膜感染可能只扮演·一個有限的角色，所以疫苗組合物將促進在胃局部之保護释免疫機制也是重要的。發明目的本發明之目的係提供一種抗原性的幽門螺桿菌多肽，它些蛋具幽直 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

5- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) ( 21〇><297公慶 U在謗發對抗幽門螺桿菌感染之保護性免疫反應及診斷幽門·螺桿菌感染上可能是有用的。藉著重組選殖編碼表面暴路蛋白#的幽門螺桿菌基因，已經達成此—目的。該基因的核酸序列類似由Evans等人（1993)在Journal of actenology ’第175册，674_683中公告的baA基因之序列 …''而，在報告中説hpaA基因係編碼2〇 kDa蛋白質的同時，已經驚人地發現，根據本發明之DNA分子係編碼具有分子量29 kDa之多肽。 =示該29 kDa之多肽是一種抗原性蛋白質，被表現在所有抑系的幽門螺桿菌中，亦在桿菌的類球菌形式中，且其能夠在宿主中引起黏膜和全身性免疫反應，由抗體產生而測定之。測試被所有幽門螺样菌品系表現w29kDa多肽，而朝著該蛋白質產生的抗體並沒有與其他種類常見之内源 2人類細菌有交叉反應，或是·與被選出之人類組織，包括胃黏膜有父叉反應。因此是一種必要的、良好保護並具有免疫原性的黏素，該29 kDa之多肽在檢測幽門螺桿菌感染和製造疫苗組合物兩方面都將是有用的，當以適當之藥學經濟部中央標準局員工消費^-作社印製調配物來提供該多肽時，將會謗發對抗這類感染的保護性或治療性免疫反應。因此以下的實驗數據指出，該29kDa的幽門螺桿菌對於幽門螺桿菌的移生及/或感染的持續是很重要的，因此單株抗體與該29 kDa蛋白質結合，夺老鼠體内導致幽門螺桿菌移生的完全抑制。而且，當利用該29 kDa之幽門螺捍菌蛋白質作爲口服免疫原時，用來當作免疫反應的刺激劑， -6- 經濟部中央標準局員工消費^*'作社印製 570925 A7 .. __ B7 _ 五、發明説明（4 ) — 在免疫前一個月先以幽門螺桿菌感染的老鼠體内，導致幽門螺样菌的移生明顯地降低。圖片説明圖1 :含有編碼29 kDa多肽之幽門螺桿菌1.7 kb片段之質體pAEl的限制酶舆圖。細線條塊表示結構基因的位置。在黑色條塊之上顯示之T3和T7啓動基因序列的位置表示載體。圖 2 : pS860、pS861、pS862和 pS863 的質體舆圖。填滿的箭頭：lac操縱子啓動基因（Plac)或噬菌體T7 RNA聚-合酶啓動基因（丁7啓動基因）。灰色填滿-處：PCR產生該29 kDa基因之5··末端或31-末端。終止序列：T7轉錄終丰序歹|J 。Ori : pBR322質體複製起點。圖3 :單株抗體在BALB/c老鼠體内對幽門螺样菌之移生的影響。 \ 圖4 :幽門螺样菌感染BALB/c老鼠的治療性口服免疫作用。發明之揭示内容在整個説明之中，且特別是在下列的實例中，當在分子選殖技術的上下文中使用”標準草案"和"標準程序” 一詞時，應明瞭它們就像在一般實驗手册中找到的草案和程序一樣，如 Sambrook，J·，Fritsch，E.F·、和 Maniatis，T. (1989)， Molecular Cloning: A Laboratory manual,第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cole Spring Harbor，NY 0 在第一個重要的觀點中，本發明提供一種重組的多肽， -7- 張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇ϋ7公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570925 &、發明説明（5 G有ΐ::上量：約29心之幽門螺桿菌表面暴露抗原 U，或大體上類似的胺基酸序列。根據本發明之該表面-暴露抗一特性Γ 敬丹有下列的重要它是一種黏素，對於胃黏膜的移生是很重要的； •它被暴露在幽門螺样菌之分裂（桿菌的）形式以及休止 (類球菌）形式兩者的表面上； •它是強抗原，使全身性和局部(黏膜的）兩者的抗體產生都昇高； i被保存在所有受試的幽門螺桿菌之品系中； •對抗該29 kDa多肽之抗體，與許多不同的非_螺桿菌類細菌或選定之人類組織，包括胃黏膜並沒有交又反應该29 kDa多肽是脂質化的·，因此是在轉譯之後修改。該多肽的這個特徵，對於其免疫原性，以及它在幽門螺桿菌表面上的適當暴露均可能具有重要性。在此項技藝中，已知該脂質修改對於細菌之脂蛋白的免疫原特性可能是不可缺的（參見Weis，J.J.等人（1994)，經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Infection and Immunity，第 62册，4632-4636)。 • 它是公認的毒性因子，藉此應瞭解”毒性因子” 一詞是指一個分子、特別涉及幽門·螺样菌對胃黏膜上皮表面的附著，及/或在建立並維持#門螺桿菌的感染。在較佳的形式中，該多肽具有根據在序列一覽表之序列識別2或4號中的位置1-260或28-260之胺基酸序列。如同更本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570925 五、發明説明（6 進一步描述在實驗章節中的，的位置代表未切開^咸/信在序列識別2和4號中 ^ ^ ’的蛋白質，同時位置1-27則代表 ::號序列，且位置28.260代表成熟的多肽。在序列識別2 破和序列識別4號，間的唯-差異，是序列識別2號在位置 22〈處具有4胺酸殘基，而序列識別4號在相同位置是具有精胺酸殘基。然而，並未嚴格限制根據本發明之多肽是具有與上文提及在序歹！冑表中序列識別2號或4號之位置相同的胺基酸序列之多1。本發明較喜愛強調該多肽帶有類似取代、少量刪除、插人或逆位的修改，儘管如此·，該多肽大體上仍具有根據本發明之29kDa多肽的特性。這類特性包括在哺乳動物宿主中，誘發對抗關螺捍菌之黏膜和全身性免疫反應的能力；擔任黏素之職務的能力；且該多肽存在於幽門螺桿菌之桿菌和類球菌兩種形^中。因此包含在本發明中的多肽，其胺基酸序列具有至少 90%的同源性’較佳的具有至少95%的同源性，帶有如序列一覽表中序列識別2或4號中位置U26〇或位置28_26〇所示經濟部中央標準局員工消費^*-作社印製之胺基酸序列’儘管如此，該多肽大體上仍具有根據本發明之29 kDa多肽的生物活性。位之亦包含在本發明中的肽類，具有至少5個胺基酸的長度，其包括根據本發明之29 kDa多·肽的免疫原性抗原決定，並保留在哺乳動物宿主體内謗兮對抗幽門螺桿菌細菌_ 免疫反應的能力。這類抗原決定位可能單獨或是以融合蛋白質之形式存在，在那裏該抗原決定位與惰性或具有免疫 9 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570925 A7 B7 五、發明説明（活性之載體多肽融合。確認這些抗原決定位，將以宿主對該29 kDa之多肽片段產生抗體的出現爲基礎。

在該29 kDa多肽之抗原決定位上獲得結構訊息的一種方法，是與該多肽結合之單株抗體的產製和定出特徵。接下來藉著例如PepScan分析來定出抗原決定位的舆圖。可藉著“準方法來產製單株抗體，諸如由De. St. Groth (1980) 在J· Immunol· Methods，第35册，1-21中描述的那些。訂在其他的觀點中，本發明提供分離和純化具有編碼如同上述多肽之核荅酸序列的核酸分子。在本發明較佳的形式中，該核酸分子是DNA分子，它具有與序列一覽表中序列識別1或3號相同的核菩酸序列。然而，並未嚴格限制根據本發明IDNA分子是如同序列一覽表中序列識別丨或3號所示的序列。本發明較喜愛強調該DNA分子帶有類似取代、 •f 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 V量刪除、插入或逆位的修改·，儘管如此，它仍编碼出大體上具有根據本發明之29 kDa多肽之生物活性的多肽。熟叫此=者已知對胺基酸序列沒有影響的A 〇〇和T㈠〇取代，並不常發生在幽門螺桿菌中。在序列識號丨號和序列識別3號之間唯—的差異，是序列識別1號在位置1458之處具有A殘基，而序列識別3號在相同位置處則具有c殘基。、包△含在本發明中的還有DNA分子，因爲基因密碼而將其核酸序列簡併成如序列識別1或ί號所示的核：y：酸序列。因 A有64個可能的密碼子’但是只充織天然的胺基酸，大邵份的胺基酸是由-個以上的密碼子來編碼的。基因密碼的天然@併或•，冗長"在此項技藝中是已爲人所熟知的。

570925 A7 B7 五、發明説明（8 因此將明瞭在序列一覽表中所顯示的DNA序列，只是編碼上述多肽、廣大但限定之DNA序列群中的一個實例。因此’本發明包括經過分離的核酸分子，係選自： (a) 包括下述核苷酸序列的核酸分子，該序列與在序列一覽表中序列識別1或3號之位置796-1572或874_ 1572處的相同或大體上類似； (b) 包括下述核苷酸序列的核酸分子，該序列能夠與（幻中定義之DNA分子之多肽密碼區互補的核甞酸序列雜交，且其編碼根據本發明的多肽，或是其在功能上相等的修改形式；以及 - (c) 包括下述核苷酸序列的核酸分子，該序列因爲棊因密碼的結果而被簡併成如同⑷或（1))中定義的核荅酸序列，且其編碼根據本發明之多肽，或是其在功能上相等的修改形式。 Λ ^ 本發明更進一步的觀點是包含根據本發明之核酸分子的載體。這樣的載體可能最好是質體pAEl (以登錄編號 NCIMB 40738寄存在布達佩斯條約之下）。經濟部中央標準局員工消費条作社印製根據本發明之載體也可以是可複製的表現載體，它攜帶根據本發明之核酸分子，並能夠傳達其表現。就此而論， ”可複製的”一詞意指該載體能夠在已經將它們導入的既定種類之宿主細胞中複製。載體的·實例爲諸如噬菌體之類的病毒、黏接質體、質體及其他重組載體。藉著此項技藝中已知的標準方法將核酸分子插入載體的基因組中。根據本發明之表現載體可能最好是載體pAL30:l、pAL30:2、 -11 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董） 570925 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費^-作社印製五、發明説明（9 pAL30:3、pAL30:4中的任何一個，或者更佳的是pS863。儲存根據本發明之載體的宿主細胞亦包含在本發明中，這類宿主細胞可以是原核生物的細胞、單細胞眞核生物的細胞或衍生自多細胞生物的細胞。因此宿主細胞可以是例如大腸样菌（E· Coli)細胞；得自酵母的細胞，如酒酵母菌 (Saccharomyces cervisiae)或巴斯德畢赤酵母（Pichia past〇ris) ，或哺乳動物細胞。完全將載體導入宿主細胞中所使用的方法’疋熟悉重組DNA方法的人所熟知的標準方法。在另外的觀點中，本發明提供產製如同上述之多肽的方. 法’該方法包括在得以產製該多肽的條件之下？培養以如同上述之表現載體轉化的宿主細胞，並回收該多肤。細胞生長所使用的培養基，可以是任何適合該目的的傳統培養基。適當之載體可以是任何上述的載體，且適合的宿主細胞可以是任何上文列舉的細胞種類。建構載體並完成將其導入宿主細胞所使用的方法，可以是爲了此種目的、在重組DNA領域中已知的任何方法。可將由細胞表現的重組多肽分泌出來，也就是通過細胞膜輸出，係依據細胞的種類和載體的組成。如果藉著重组宿主以細胞内之方式來產製多肽，也就是不經由該細胞分泌，則可以藉著標準程序，包括藉著機械方式，例如超音波振盪或均質化·作用，或是經由酵素或化學方法使細胞破裂，接著再純化之。爲了要被分泌出來，編碼該多肽的D N A序列前面應該有一個編碼信號肽的序列，該編碼信號肽之序列的存在係確保從細胞中分泌該多 -12- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 0 570925 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) 肽，以便將明顯比例的被表現多肽分泌到培養基中，並將其回收。本發明更進一步的觀點是將根據本發明之多肽使用在治療上、使用在診斷包括人類之哺乳動物的幽門螺桿菌感染上，以及使用在治療或預防性的疫苗上。本發明另一個重要的觀點是在包括人類之哺乳動物體内 ’謗發對抗幽門螺桿菌之样菌及/或類球菌形式之保護性免疫反應的疫苗組合物。這類疫苗化合物包括具有免疫原效力之含量的上述多肽，包括至少一部份含有免疫原性之抗原決定物的29 kDa多肽，或是保留謗發對抗幽門螺捍菌感染之保護性免疫能力的該多肽之修改形式。”修峰形式·, 一詞’包括但不限於在轉譯之後被修改的多肽形式，例如脂質化。咸相信該29 kDa蛋白質被脂質化，參見下文的實例4。 ' 經濟部中央標準局員工消費^-作社印製疫苗組合物亦可視需要包含藥學上可接受之載劑或稀釋劑’或其他在預防或治療用途上具有免疫活性之抗原。生理學上可接受的載劑及稀釋劑是在此項技藝中熟諳此藝者已知的，並包括例如磷酸緩衝之生理鹽水（PBS)，或在口服疫田的案例中，以HCO3·爲基礎的調配物，或有腸衣塗覆的散劑調配物。疫苗組合物可視需要包含酸分-泌抑制劑，或與其一起投予’較佳的是質子幫浦抑制劑（PPIs)，例如奥美普拉左 (〇mepraz〇le)。可將該疫苗調製成‘已知的遞送系統，如微脂粒、ISCOMs、蜗形體（c〇chleate)等等（參見例如尺度適财⑽）A4^T2I0^^ 570925 A7 .

Rabinovich等人（1994) Science 265, 1401-1404)，或將其附加在或包含在可降解或非-可降解之性質的聚合物微球體中。該抗原可與活的減毒細菌、病毒或噬菌體結合在一起，或與相同種類的死載體結合在一起。如同將以下文之實例章節證實的一樣，可將根據本發明之疫苗組合物用於治療或預防的目的。最好是將根據本發明之疫苗組合物投予任何哺乳動物的黏膜，例如口頰、鼻腔、扁桃腺、胃、腸（小腸和大腸）、直腸及陰道的黏膜。黏膜用疫苗可以爲了此一目的而與適當的佐劑一起提供。該疫苗也可以非經腸之方式給予，藉著·皮下、皮内或肌肉内的途徑，可視需要與適當之佐劑一起給予。經濟部中央標準局員工消費合作社印製另一種產生對抗29 kDa多肽之免疫反應的途徑，是使用已知爲核故接種"或"裸露DNA"接種之途徑。在此項技藝中已知在肌肉内注射編碼感興趣之抗原的質體DNA，可能導致抗體的持續表現，並產生免疫反應（參見例如 Rabinovich等人，在前）。數種投藥途徑都是可能的，像是非經腸的、黏膜的方式，或經由遞送塗覆-微量DNA之金質小珠的”基因-槍"（Fynan等人（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90，11478-11482)。因此，可以在包含適當眞核生物啓動基因的質體中，表現根據本發明之核酸分子。然後可經由”基因-槍"，將該裸露的DNAn以肌肉内方式注射或以皮内方式給予。被表現之蛋白質的抗原決定位，將由在細胞表面上的MHC分子來表現，並激起免疫反應。因此，將在先前段落中揭示的 -14- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 570925 A7 . B7 經濟部中央標準局員工消費含作社印製五、發明説明（12 ) - 核酸分子及載體使用在治療上，特別是用來當作疫苗，爲本發明更進一步I觀點。這類核酸分子及載體在製造治療、預防或診斷幽門螺桿菌感染之組合物上的用途，亦爲本發明進一步之觀點。本發明的另一個觀點是上述之多肽，或保留謗發對抗幽門螺样菌感染之保護性免疫之能力的該多肽之修改形式，在製造冶療、預防或診斷幽門螺桿菌感染之組合物上的用途。這類組合物特別包括謗發對抗幽門螺样菌之样菌及/ 或類球菌形式的保護性免疫反應的疫苗組合物。在本發明一中亦包括在製k衫斷幽門螺桿菌感染之診斷工具組上的用途。在下文中進一步説明這類診斷工具組。在更進一步的觀點中，本發明提供在包括人類的哺乳動物體内，謗發對抗幽門螺样菌感染之保護性免疫反應的方法’该方法包括對該哺乳動物'投予有免疫效力之含量的上述疫备組合物之步驟。"有免疫效力之含量"一詞，企圖意指謗發明顯的保護性幽門螺样菌反應之含量，它將會在已經感染的哺乳動物體内撲滅幽門螺桿菌之感染，或在易受感染的哺乳動物體内預防感染。典型的具有免疫效力之含量’供口服投藥的將包括大約1微克到1 〇〇毫克的幽門螺桿菌抗原’較佳的是大約1 〇微克到i 〇毫克，或是供非經腸投藥的則是大約低於100微克。· 本發明的其他觀點，是在活體叶診斷幽門螺桿菌感染的方法’包括至少一個步驟，其中係使用包含一部份29 多肽的上述多肽，該部份包含免疫原性之抗原決定位。該 •15- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再^^本頁) 1: ,ιτ Γ 570925 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 .. _B7 __五、發明説明（13 ) 一多肽可視需要標記及/或偶聯到一個固體擔體上。診斷的方法包括步驟⑷使該多肽，可視需要與固體擔體結合，與取自哺乳動物的體液接觸；並（b)從該體液中檢測與該多肽結合的抗體。檢測抗體的較佳方法是ELISA (酵素連結免疫吸附分析）法，其爲此項技藝中已熟知的。在另外的觀點中，本發明提供在包括人類的哺乳動物體内檢測幽門螺样菌感染的診斷工具組，其包含能夠完成上文舉例之診斷方法的成份。實例實例1 :從幽門螺桿菌中選殖並表現29 kOa多肽： 1.1.細菌品系、載體和生長條件 . 使幽門螺样菌CCUG 17874 (=NTCC 11637)在微量需氧的氣壓下，生長在馬血瓊脂.盤上。使用大腸样菌（Ε· coli)品系 XLl-Blue MRF’和 XLOLR (Stratagene，La Jolla，California) 作爲選殖實驗的宿主品系，並在用於又感染時，使其生長在補充有0.2%麥芽糖和10 mM MgS04的Luria-Bertani肉湯 (LB)或NZY培養基中。由Stratagene獲得λ表現載體ZAP ExpressTM，及其噬菌體質體（Phagemid)之衍生物pBK-CMV 〇 1·2· DNA技術藉著將自培養48小時之培養盤'的細菌，懸浮於含有10毫克/毫升溶菌酶和5毫微克/毫升不含DNA酶之RNA酶 (Boehringer Mannheim Scandinavia AB，Bromma，Sweden)的 50 mM Tris-Cl，pH 8.0、25%蔗糖和 50 mM EDTA中，來製 —_____-16-_ 本纸浪尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570925 A7 B7 五、發明説明（14 ) — 請先閱讀背面之注意事項再填寫本 t 備得·自幽門螺桿菌之染色體DNA。在+37°C下培養該懸浮液10分鐘。加入等體積的溶解緩衝溶液（在50mM的Tris-Cl ，卩118.0中0.4%三通又100;和62.5111]^£0丁八），並在室溫下培養該懸浮液，直到發生明顯的細菌溶解爲止。然後以三個步驟來萃取該懸浮液，分別利用經過緩衝的酚（pH 8.0) ，紛/氯仿和氣仿。使DNA從液相中沉澱出來，並將其溶解於 TE_緩衝溶液（10 mM Tris-Cl，pH 8.0，1 mM EDTA)。從 Boehringer Mannbeim Scandinavia AB購買限制酶，並根據製造者的指示使用。利用Wizard工具組（Promega，· Madison，Wisconsin)來純化質體和；I DNA。使用:序列酶2.0 工具組（Amersham Sweden AB，Solna，Sweden)來完成定序歹J 之工作。從Innovagen，Lund，Sweden購置寡核菩酸。利用 Taq DNA聚合酶（Boehringer-Mannheim Scandinavia AB)來完成 PCR。 ' · 1.3·建構幽門螺样菌之基因組資料庫經濟部中央標準局員工消費^-作社印製從Sau3A-部份切開的幽門螺桿菌17874 DNA中純化出大小範圍在2-12 kb的染色體DNA片段，並按照在Stratagene 草案中的描述，將其選殖到經過BamHI消化之ZAP ExpressTM載體中。接著在活體外包裝，藉著使品系XL-1 Blue MRF感染來滴定該資料庫，並將其舖平在含有異丙基 -/?-0-硫代半乳糖吡喃糖甞（1?了6)和5-溴-4-氣-34丨哚基-；9· D-半乳糖吡喃糖芸（X-Gal)的指示劑盤上。該資料庫的力價爲1·2 X 106 PFU (斑點形成單位）/毫升，帶有85%的重組體0 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570925 A7 · B7 經濟部中夬標準局員工消費合作衽印製五、發明説明（15 ) - 藉著免疫學上的篩檢，根據標準方法利用MAb HP30-1:1:6 (B61in等人（1995) J. Clin. Microbiol. 33, 381-384)來檢測表現出29 kDa多肽的斑點。分離陽性的斑點，並重覆利用MAb來舖平和篩檢，直到獲得斑點的純淨爲止。利用 ExAssist草案（Stratagene)來完成ZAP Express純種系之噬菌體質體形式的轉化。 1·4.免疫墨點和小墨點試驗將圖1中描述，含有攜帶得自幽門螺样菌17874之經過選殖的插入序列之質體的大腸桿菌XLOLR之過夜培養物，以-1:100倍稀釋於5毫升含有50毫克/毫升康黴素的LB培養基中。在+37°C下培養該培養物，直到在600毫微米處的OD 値是0.7爲止。加入IPTG至終濃度爲1 mM，並使細菌生長額外的2小時。以類似之方式使培養物在不含IPTG之下生長。將該培養物離心，並以1/10“體積將其再懸浮。將10 微升的懸浮液與等體積之2X試樣緩衝溶液混合，煮沸並藉SDS-PAGE來分析之。以相同方法但不含康黴素之下生長的品系XLOLR，係擔任陰性對照組之職務。利用在PBS 中之幽門螺桿菌17874的懸浮液（在600毫微米之處OD値 = 1·〇)作爲陽性對照組。在將該蛋白質的輪廓固定在硝基-纖維素平板上之後，按照先前的描述（B0lin等人，1995)來完成與稀釋成1:10、對29 1^&多肽有專一性之]^八1)11?30-1:1:60勺反應，並藉著使用以過氧化酶標示的抗-老鼠IgG來檢測已經結合的抗體。利用過氧化氫受酶質和4-氣莕驗色原（BioRad Svenska _ -18- (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570925 A7 B7 五、發明説明（16 AB)來展開濾紙。利用上述品系之過夜培養物來完成小墨點試驗。將2微升懸浮液點在硝基纖維素濾紙上，風乾，並與稀釋成1:10 的MAbHP3〇-l:：L6—起培養1小時。按照免疫墨點法中的説明，完成後續的步驟。 1.5.分子選殖將传自幽門螺样囷17874、經過部份消化之染色體dna 選殖到λ表現載體（ZAP Express™)中。與對29 kDa多肽有專一性的MAb反應，筛選24000個斑點之後，檢測出代表 29 kDa多肽的四個斑點。純化陽性的斑點，並藉著利用 Xbal和Sail來消化DNA-製品，測驗選殖之插入序列的大小 °該插入序列的大小係從3·7到1·78 kb。在活體内從四個陽性的斑點上切開pBK-CMV噬菌體質體之後，建構限制酶舆圖’並與在λ載體中的插·入序列比較。發現該噬菌體質體含有部份重疊的DNA-片段，與在λ載體中的大小相同。測試了許多限制酶，除了 SamI* NheI之外，均無法切開經過選殖的片段。經濟部中央標準局員工消費合作杜印製進-步分析最小選殖之1-7片段（pAE1)的限制舆圖，出示於圖1中。經過選殖之插人序列的其中之_，係在載體啓動基® W目反方^當在免疫墨點法中，利用MAb HP30_ 1:1:6分析含有這些質體的大腸捍'菌品系之完整細胞萃取液時’發現它們都表現出具有與幽門螺样菌議相同分子量的多肽。當將載體啓動基因與謂_起導入時，在29 kDa多肤的表現中並沒有觀察到差異。這顯示該基因從它 570925 Μ ‘· Β7 五、發明説明（17 ) — 自己的啓動基因中被轉錄。建構圖1所示之三個含有DNA 片段的亞純種系’並檢查有關2 9 kD a多肤的表現。沒有任何純種系表現出該多肽。當在小墨點分析（B61in等人， 1995)中測試XLOLR (pAEl)，並與幽門螺桿菌比較時，發現是微弱陽性的，顯示有些被表現的多肽可能暴露在表面上。 1.6. DNA序列的分析經濟部中央標準局員工消費合作社印製利用T3-和T7”引子來定出pAEl之1.7 kb插入序列的兩股，以及亞純種系的序列，並在有需要時以特殊的引子補充-，以便覆蓋該序列不能利用標準引子的區域。電腦分析顯示，序列（序列識別1號）在一股上含有一個780 bp的打開密碼（ORF)，連結亞純種系所使用的限制酶位置（圖1)。可以辨認出一個公認的核糖體結合位置（序列識別1號之位置 782_785)。該ORF係編碼分子量29，126 Da之多肽的260個胺基酸（序列識別2號）。發現該胺基酸序列含有一個27個胺基酸之可能的信號序列。序列Leu-Val-Gly-Cys (在序列識別2號和4號中的位置25到28)是被指定作爲酵素信號肽酶π 之識別位置的一致序列（Leu-X-Y-Cys)的其中一種。信號肽酶II切開在脂蛋白原中半胱胺酸殘基之前的信號序列。因此該信號序列的特徵，暗示該29 kDa蛋白質是脂蛋白，且成熟的蛋白質含有胺基酸28到26¾。 1.7. 在大腸桿菌中表現重組的29 kDa多肽在大腸桿菌N4830-1中，以高濃度從含有29 kDa多肽之完整基因（在序列識別1號和3號中位置771-1667)的表現載體 ______-20 - 本紙張尺度適财關家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐) ' 570925 A7 B7 五、發明説明（18 ) " 構築體pAL30中，產製重組的29kDa多肽。該構築體所使用的載體爲 pML-LCTB 凡 7 (獲自 Michael Lebens，University of Gothenburg，Sweden)，其含有強有力的APL啓動基因0 該載體也含有卢-内醯胺酶基因，提供氨芊青黴素抗藥性。被插在；IPl啓動基因和載體内終端區域之間的LCTB基因 (編碼霍亂弧菌毒素及其信號肽），藉著利用限制酶Smal和 Hindlll的切開作用，而從載體上被切下。經濟部中央標準局員工消費合作社印製藉著聚合酶連鎖反應（PCR)，來擴大編碼29 kDa多肽的結構基因，包括它的信號序列。所使用的引子爲HP30N -(GGC GTA GAA ATG GAA GCG C ;相當·於序列識別1號和3 號中的位置522到540)，其給合ATG起始密碼子的上源271 bp，以及 HP30C (CCC AAG ATT CAT CAG CCC TTA AAT ACA CG)，其辨認起始密碼子下源855 bp的DNA片段（相當於序列識別1號和3號中位置1648到1667)。該HP30C引子含有Hindlll切開位置，藉著PCR反應將其加至29 kDa多肽基因的序列中。所得的PCR產物爲1.1 kb。藉著SspI和Hindlll 切開這個DNA片段，得到一個0.9 kb的片段，將其連結到載體片段（2.7 kb)上。藉著電孔法將現在叫做PAL30 (3.6 kb) 的載體構築體轉化到大腸样菌N4830-1内。發現四個陽性的純種系（pAL30:1、2、3、4)。要引起重組多肽的表現，使含有pAL30:l到4的N4830-1 細胞在帶有氨苄青黴素（100微克毫升）的1 X LB中，在+30 X：下生長過夜（在此溫度下，λ cl抑制劑抑制了轉錄作用）。將一小部份該過夜培養物接種在帶有氰爷青黴素的5毫 ____ -21 _ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570925 A7 B7 五、發明説明（19 )

升1 X LB中，並使細胞在+30°C下生長，直到在600毫微米處之O.D.値大約0.7爲止。然後將溫度昇高到+42°C，藉此使抑制劑失活，再培養額外的2小時。在14% SDS-PAGE上並藉著免疫墨點法，使用對29 kDa多肽有專一性的單株抗體HP30-1:1:6，分析在謗發之前和之後所取得的試樣。在免疫墨點法中所使用的三個經過謗發的純種系（pAL30: 1、3和4)，均在謗發之後表現出大量的重組多肽。得自未經謗發細胞的懸浮液，則僅含有少量的 29 kDa多肽。選出純種系pAL30:l以便進一步分析ό爲了缉實該純種系實際上含有編碼29 kDa多肽的基因，定出被插入載體之片段的末端。這證實了插入表現載體内的序列，相當於經過選殖之PCR片段的預期序列。實例2 :在各種培養條件中29 k.Da多肽的表現動力學經濟部中央標隼局員工消費合作社印製使用名叫CCUG I7874 (實驗室品系）和Hel 73 (最近從罹患十二指腸潰瘍之病人身上分離）的兩種幽門螺样菌品系。在血液瓊脂培養皿以及補充有環化糊精（cyclodextrin)的布氏（Brucella)肉湯中完成培養。在包含5% 02、10% C02 和85% >12微量需氧的氣壓下培養所有的培養物。在2、4和 7天之後收穫細菌、以PBS沖洗一次並保存在-2(TC下，以供後續分析使用。藉著抑制-ELIS A，使用像先前用來檢測大腸桿菌表面抗原（Lopez-Vidal，Y和 Svennerholm，A-M·，J. Clin. Microbiol· 28, 1906-)—樣，對該多肽有專一性的單株抗體來分析29 kDa表面多肽的表現。這些抗體亦被用於免 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570925 A7 . B7 — - - ___ 五、發明説明（2〇 ) · 疫電子顯微鏡檢查中。當已經培養CCUG 17874七天時，在血液瓊脂培養皿上，以及在布氏，肉湯中’大約有7 0 %的細菌已經由螺旋形式轉變成類球菌形式。這種轉變在Hel 73中，於3天之後便已經發生。抑制-ELISA顯示，在得自培養皿和肉湯培養物的兩種試樣中，在7天的期間内具有完全不變的29 kDa多肽濃度。藉著免疫電子顯微鏡檢查，證實該多肽的存在。發現該29 kDa多肽被良好地保存在幽門螺桿菌的類球菌形式中。並發現在Hel 73中的29 kDa多肽比在CCUG 17874中的更多。 · 實例3 :對抗29 kDa多肽的抗體反應在得自罹患十二指腸潰瘍之病人（n=19)的血清和胃抽吸物，在無症狀之幽門螺桿菌帶原者（n=18)和在未-感染的年齡相配合之對照組（n=20)中，·確定對抗29 kDa多肽的抗禮反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製經由不同的ELISA方法，測試得自三組患者之胃抽吸物和血清中對抗29 kDa多肽的抗體含量。大部份被感染的患者比起健康的對照組人們，在血清和胃抽吸物兩者之中，皆具有明顯較高含量之抗29 kDa多肽的專一性抗體。在無症狀帶原者體内的抗體，可與有徽候患者的那些相匹敵。實例4 :以[3H]棕櫚酸標示多肽· 因爲29 kDa多肽的胺基酸序列含有典型供脂蛋白使用之可能的信號肽，所以研究以放射性棕櫚酸來標示該蛋白質 -23 - 本紙張尺度適用中國g家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570925 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 .. B7五、發明説明（21 ) — 使缺乏或帶有pAL30:l的大腸样菌N4830-1，在+3(TC下於補充有50微克羧芊青黴素/毫升的LB-肉湯中生長。在 108細菌/毫升的細胞密度時，加入[3H]棕搁酸（5毫居里/毫升；DuPont NEN，Boston，MA)至50微居里/毫升之終濃度。將濃度升至+42°C，並再培養該培養物另外12小時。藉著離心作用收集細胞，並將其溶解在SDS-PAGE溶解缓衝溶液中。在電泳之後，爲了螢光顯影而處理凝膠，藉著將凝膠浸入 AmplifyTM (Amersham International，UK) 30分鐘，使其在玻璃紙板之間脱水，並在-70°C下將該凝膠暴露在X- -光軟片下36小時。 · ：結果顯示該29 kDa多肽是脂質化的，且因此是在轉譯後被修改。實例5 ··表現重組29 kDa多.肽之大腸样菌的三通X-114分配使帶有pAL30:l之大腸桿菌細胞在+30°C下，於補充有50 微克羧芊青黴素/毫升之LB-肉湯中生長。在108細胞/毫升的細胞密度下，將溫度昇高到+42°C，並再培養該培養物另外3小時。藉著離心（11.300 X g，10分鐘，+4°C )收集細胞，並將每克細胞小球再懸浮於25毫升的PBS中。冷凍該懸浮液，然後在室溫下溶解，並加入25微升DNA酶（10微克/微升）。藉著轉化作用，在室溫下輕輕地振動試樣30分鐘，再冷卻至8-12X：，接著加火三通X-114(終濃度0.3%) 。在+4°C下藉著溫和的轉化作用，養3小時之後，藉著離心（18.900 xg，10分鐘，+25Ό)收集不溶的物質。藉著SDS-PAGE分析物相，並藉著西方墨點法利用MAb __-24-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 570925 A7 B7 五、發明説明（22 ) 請 HP30-1:1:6來證實29 kD夸多肽的身份。結果指出該29 kDa 多肽出現在清潔劑相中，這證實它是一個脂蛋白。在此項技藝中已知通常在清潔劑相中回收完整的膜蛋白（Bordier， C. (1981) J· Biol. Chem.，第 256册，1604-1607)。此實驗亦證實了插入大腸桿菌的質體能夠表現並產製該 29 kDa蛋白質。這對進一步大規模產製疫苗是很重要的，因爲幽門螺桿菌無法非常完美或迅速地生長。實例6 :爲了產製高含量之幽門螺样菌29 kDa蛋白質而建構表現載體pS863 6.1. pS860之製備 - 要產生合適該29 kDa基因5’-末端的限制酶位置，丙合成兩個供PCR擴大作用使用之合成的寡核菩酸。利用質體 pS852 (與實例1.7中描述之質體pAL30:l相同）作爲PCR擴大作用的模板。將這兩個寡核嘗\酸的序列列舉於下：

EcoRI Ndel 5,-CGGAATTCCATATGAGAGCAAATAATCATTTTAAAG-3,

BamHI Xmal Nhel 5,-GCGGATCCCCCGGGGCTAGCTGGATGGTAATTCAATTTC-3, 經濟部中央標準局員工消費今作社印製完成PCR擴大作用，並將169 bp之經過擴大的片段連結到 TA 載體（Mead，D.A·等人（1991>Bio/Technology 9, 657-663) 。所建構的質體被命名爲pS860 (圖2)。藉著二脱氧定序列法來證實該構築體的序列（Sanger等人（1977) Proc. Natl. Acad· Sci· USA 74, 5463-5467)。 -25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570925 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 .·____B7_五、發明説明（23 ) — 6.2. pS861之製備爲了改變在該29 kDa基因31-端上的限制位置，而合成兩個供PCR擴大作用使用之合成的寡核甞酸。利用質體 pS852 (pAL30:l)作爲PCR擴大作用的模板。將這兩個寡核甞酸的序列列舉於下： EcoRI Xmal 5f-CGGAATTCCCCGGGTTATTATTCTCCACCGG-3, PstI BamHI 5,-CGCTGCAGGGATCCTTATTATCGGTTTCTTTTGCCTTTTAA-3, 完成PCR擴大作用並以Xmal和BamHI消化經過擴大的片段，產生357 bp之片段。將該片段選殖到pUC19中，所建構的質體被命名爲pS861 (圖2)。藉著二脱氧定序列法來證實該構築體的序列（Sanger等人（Γ977)，Proc· Natl· Acad· Sci· USA 74, 5463-5467)。 6·3·質體pS862之製備藉著凝膠電泳法分離出编碼該29 kDa中央部份的cDNA，就像得自質體 pS852 (pAL30:l)的 280 bp Nhel/XamI片段。將該片段與得自pS861之357 bp Xmal/BamHI片段，以及得自pS861之4061 bp Nhel/BamHI片段連結在一起。所產生的質體被命名爲pS862 (圖2)。 · 6·4·質體pS863之製備其後，從pS862中分離出795 bp之Ndel和BamHI限制片段，並將其連結到得自T7載體pS637 (pET-3a)的4 kb ___-26- _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 570925 經濟部中央標準局員工消費含作社印製 A7 .. B7 五、發明説明（24 ) 一 Ndel/BamHI片段上（Studier，F· W.等人（1990) Methods Enzymol· 185, 60-89)。所得的表現載體被命名爲pS863 (圖 2)。實例7 :重組幽門螺样菌29 kDa脂蛋白的純化 7.1. 宿主品系及細菌培養物將表現載體pS863轉化到以下的大腸桿菌宿主品系中： BL21(DE3) ; BL21(DE3)pLysS和 BL21(DE3)pLysE。本質上按照 Studier等人的描述（Methods Enzymol. 185，60-89，1990)來完成表現實驗。使細菌在含有50微克/毫升羧苄青黴素的-LB培養基（Ausubel，F.M.等人（編著）Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1992)中生長。4匕夕卜，在使用 BL21(BE3)pLysS和 BL21(DE3)pLysE時，該培養基需補充30微克/毫升的氣黴素。爲了謗導T7表現系統，使該培養物生長至大約〇b6()()=0.5的密度，然後補充0.4 mM IPTG來謗導之。在謗導之後大約180分鐘時收穫細胞。提供最高表現程度的宿主品系爲BL21(DE3)pLysS。 7.2. 幽門螺捍菌29 kDa脂蛋白的純化使利用質體pS863轉化之大腸样菌BL21(DE3)/pLysS培養物如同上述方式生長，並藉著離心收集細胞，然後再懇浮於冰冷的緩衝溶液（50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，10 mM NaCl ’ pH 8.0)中。每克小球（濕童）加35毫升緩衝溶液。 7·2·1·三通X-114萃取作用要萃取脂蛋白，加入三通Χ-114(ΤΧ-114)至1.5% (體積/ 體積）之終濃度，並在0°C下攪拌該懸浮液1小時。藉著以 ________-27 -_______ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） 570925 A7 .. B7 五、發明説明（25 ) ' 18，900 X g離心10分鐘，使不溶於-三通的物質形成小球。在一些案例中，再次萃取該小球，但是只使用一半體積含有TX-114的緩衝溶液。在第二次TX-114萃取作用之後拋棄該小球。得自TX-114萃取作用之上清液的相位分布，係藉著在 +3(TC下培養15分鐘，並偶爾混合而獲得。在+3〇°C下以 3 1，300 X g離心該混濁溶液30分鐘。收集下層的清潔劑相，並以冰冷的緩衝溶液（50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，10 mM NaC卜 pH 8.0)稀釋至 1% TX-114。 7.2.2. Q-瓊脂糖，pH 8.0 · 經濟部中夬榡準局員工消費合作衽印製將已經稀釋之TX-114-相，施用於利用緩衝溶液（50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，10 mM NaCl，0.1%三通 X-100，pH 8.0)平衡過的Q-瓊脂糖管拄（Pharmacia)(20毫升/3克細胞小球）中。以未-結合溶離份之形，式收集29 kDa脂蛋白。對該溶離份進行相位分布，係藉著在+30°C下培養，並偶爾將其混合，直到溶液混濁爲止。藉著在+30°C下以31，300 X g 離心30分鐘，將兩個相分離。收集下層的清潔劑相，並以冰冷的緩衝溶液（10 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，pH 8.6)稀釋至 1%X-114。 7.2.3. Q-瓊脂糖，pH 8.6 將已經稀釋之TX-114-相，施用於100毫升、利用緩衝溶液（10 mM Tris-HC卜 2 mM EDTA，pH 8.6)平衡過的 Q-瓊脂糖管柱（Pharmacia)中。未-結合的溶離份含有TX-114。以緩衝溶液 A (10 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，0.1%三通 X- ___— _-28-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570925 A7 B7 五、發明説明（26 ) - 100，pH 8.6)沖洗該管柱。藉著含有缓衝溶液B ((10 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，0.1%三通 Χ-100，1Μ NaC卜 pH 8.6)的鹽梯度來收集29 kDa脂蛋白。該梯度如下：0-50% B ，40毫升；50-100% B，100毫升。在60-70% B之間洗脱出該29 kDa脂蛋白。 * 7.2.4. SDS-PAGE和蛋白質電子墨點法將得自不同純化步驟的蛋白質試樣，溶解於試樣緩衝溶液（50 mM,Tris-HCl，pH 6.8，.8%甘油，1.6% SDS，4% - 巯基乙醇，0.02%溴酚藍）中，並在Novex預製梯度凝膠（4- -20%聚丙烯醯胺）或BioRad預製梯度凝膠（10-20%聚丙烯醯胺）上將其分離。進行電泳所用的緩衝溶液含有25 mM Tris 、192 mM對羥苯基甘胺酸、0.5% SDS，pH 8.3。以在40% 甲醇、10%醋酸中的0.1%考馬斯寶石藍（Coomassie Brilliant Blue) R-250將該凝膠染色，並以10%甲醇、10%醋酸乙酯來脱染色。經濟部中央標準局員工消費合作社印製企圖供半-乾-電子墨點法使用之凝膠，不將其染色，但浸泡在轉移緩衝溶液（48 mM Tris，38 mM對羥苯基甘胺酸，0.075% SDS，20% MeOH)中，並藉著半-乾-電子墨點裝置（BioRad)，將蛋白質轉移到PVDF膜(Immobilon®，Millipore， USA)上。藉著首先在含有2% BSA的TBS (50 mM Tris_HCl ，2.5M NaCl，pH 8.2)中阻擋該PVDF膜1小時，並隨後將該膜與利用含有1% BSA之TBS稀釋成1:10、對抗291〇3月旨蛋白的專一性單株抗體（IgGl) —起培養1小時，而完成免疫檢測。在利用TBS的沖洗步驟之後，將該膜與連結-鹼性 __- 29 -_ 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4现格（21〇χ 297公釐） 570925 A7 · · ___ B7__ 五、發明説明（27 ) — 鱗酸酶之抗-老鼠IgG抗體（Dakopatts，Denmark)—起培養1小時。在另一次沖洗之後，利用適當的受酶質（5-溴-4-氯-3- 啕哚基磷酸鹽（BCIP)和氮藍四唑（NBT)(Sigma))將該膜展開〇 7.2.5.蛋白質濃度和熱原性藉著二辛可寧酸（bicichoninic acid)法（BCA Protein Assay. Pierce Chemical Company，USA)來定出總蛋白質濃度。藉著顯色的鱟屬（Limulus)變形細胞之溶胞產物（LAL)試驗（LAL COAMATIC® Endotoxin· Endosafe Inc. USA)來分析-内毒素含量。 · . 掃描經過染色的SDS-凝膠（BioRad Imager GS-)，定出在終製品中之蛋白質污染物的相對含量。該製品含有<10% 的蛋白.質污染物。實例8 :對於幽門螺桿菌29 kDa蛋白質用來當作疫苗的分析 8.1 ·材料和方法 8.1.1. 動物經濟部中央標準局員工消費^-作社印策從Bomholt Breeding Centre (Denmark)講買雌性SPF BALB/c 老鼠。將牠們關在普通的聚碳酸酯籠子中，並自由供應水和食物。動物到達時爲4-6週齡大。 8.1.2. 感染 — 在最低的一週適應期之後，以第2型幽門螺桿菌品系（品系244，最初分離自溃瘍的病人）來感染動物。稍早時已經證實該品系是老鼠胃部極佳的殖民者。使細菌在+37°C下 ____ -30-_ 本纸張尺度適用中國國家系^( CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570925 A7 B7 五、發明説明（28 ，在微量需氧的氣壓（10% C02，5% 02)下，於補充有10% 胎牛血清的布氏肉湯中生長過夜。提供動物奥美普拉左 (400毫莫耳/公斤）之口服劑量，並在3_5小時後口服接種幽門螺样菌（大約108 cfu/動物）。在接種後2-3週，檢查對照組動物的感染。 8.1.3.免疫法在34天的期間内（第i、15、25和35天）將動物免疫4次。以100微克/老鼠之劑量，以及0.5毫克/膜蛋白（MP)之劑量/ 劑量來提供經過純化的蛋白質。藉著超音波振盪在pBS中的細菌來製備膜蛋白。在+4°C下藉著以·2Ό00 Γρ珥旋轉超音波振盪器5分鐘而移除碎屑。將上清液移至新的試管中，並在+4°C下以15,000 rpm旋轉20分鐘。回收小球並儲存在· 70°C下直到使用爲止。與每次免疫一起，亦提供動物作爲佐劑的丨0微克/老鼠之霍亂弧菌毒素（CT)。在免疫之前3-5小時，先給動物口服奥美普拉左（400微莫耳/公斤），以此方式保護抗原免於故性降解作用。在最後一次免疫之後四週將動物犧牲。 8·1·4·被動的保護作用經〆濟部中央標準員工消費合. 作社印製要分析單株抗體（MAbs)在幽門螺桿菌移生到老鼠胃黏膜上之能力的效力，在上述接種之前，先將具有不同專一性之MAbs與幽門螺桿菌混合1 〇分 '鐘。使用對29 kDa蛋白質 (ΗΡ3〇-1:1:6)、對尿素酶（Ure8:l) :以及對大腸样菌之熱_ 穩定蛋白質（ST 1··3)會昇高的MAbs。在ELISA中滴定MAbs ’谷許在實驗中使用等量的各個MAbs。接種係使用每隻 -31 - 570925 A7 .· --—------ -B7_ 五、發明説明（29^ 一 *—~- 老鼠1〇7個細菌的數目。在接種之後2週犧牲老鼠。 8.1·5·感染的分析藉著c〇2和4椎脱臼法來犧牲老鼠。打開腹腔並取出胃。在沿著胃大彎切開胃之後，以生理鹽水沖洗之。從面積 25平方毫米的竇（antrum)和小體（⑶印似)上，利用外科手術刀分別刮下黏膜。將黏膜刮取物懸浮於布氏肉湯中，並置於血液斯科諾（Bl0〇d Skimm)培養皿中。在微量需氧的條件下，培養該培養皿％5天，並計算菌落的數目。藉著尿素酶和過氧化氫酶試驗，以及藉著直接的顯微鏡檢查或革蘭氏染色來確定幽門螺桿菌的身份。· 8.2.結果 8·2·1·被動的保護作用經濟部中央標準局員工消費A:·口作社印製具有10隻動物的三組，.分別提供幽門螺样菌244和MAbs 的混合物，一組僅提供幽門螺·样菌。在接種到老鼠體内之前，容許MAbs與細菌的混合物先反應10分鐘。所使用的 MAb ’沒有一個對活體外的細菌有任何明顯的影響。在接種之後兩週犧牲老鼠，並定出每一組的感染比例（圖3)。在對照組中所有的老鼠，以及以ST MAb接種的那些均被感染。在尿素酶MAb組中，所有的老鼠均被感染，但是具有比對照組明顯較低的程度。在以對抗29 kDa蛋白質之 MAb接種的組別中，沒有任何一·隻老鼠被感染。 8 · 2 · 2 ·治療性免疫在該研究中，於免疫之前1個月先以幽門螺桿菌品系244 來感染動物。然後以霍亂呱菌毒素（CT)或CT與膜蛋白、尿 ______-32-__ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570925 經濟部中央標準局員工消費合. 社印製 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) _ aa各鼠。對照組素酶或29 kDa蛋白質來免疫以10隻爲一組的名队，、>始1個月犧牲動動物僅接受媒劑（PBS)。在最後一次免疫之後

b总，以及僅以CT 物，並定出CFU (圖4)。所有的對照組老鼠’ Μ 々，以29 kDa蛋白免疫的那些均被感染。利用尿素酶與CT，或μ 。您j降低的CFU値質與CT主動免疫的動物，具有比對照組明顯界-，。在尿素酶-免疫組中只有一隻動物完全治疲了 ▲感染 8 . 3 .結論上述的結果顯示29 kDa幽門螺桿菌蛋白質對於感$的移生及/或持續是很重要的，因此MAb與該結構的結合’導致移生的完全抑制。 _ 此外，當使用29 kDa幽門螺桿菌蛋白質作爲口服免疫原，並與作爲口服佐劑之霍亂弧菌毒素結合時’係擔任免疫反應的刺激者，導致在所使用之動物模式中’幽門螺桿菌之明顯降低的移生程度。 \ 總而言之，這些結果強烈地支持爲了用在人類身上’治療及預防幽門螺桿菌的感染，在口服疫苗調配物中使用29 kDa幽門螺桿菌蛋白質。微生物的寄存質體pAEl已經在布達佩斯條約之下，以登錄號碼NCIMB 40732寄存在 National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB)，Aberdeen，Scotland，UK。寄存日期爲 1995年5月16日。 33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 570925 A7 B7 五、發明説明（31 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列一覽表 (1) 共同訊息： (i) 申請者： (A) 姓名：ASTRA AB (B) 街道：V^straMMarehamnen9 (C) 城市：Sodertalje (E) 國家：Sweden (F) 郵遞區號（ZIP) ·· S-151 85 (G) 電話·· +46 8 553 260 00 (H) 傳眞：+46 8 553 288 20 · (I) 電傳：19237 astra s 、 (ii) 發明名稱··細菌抗原和疫苗組合物 (iii) 序列數目·· 4 (iv) 電腦可讀形式： · (A) 媒體型式：軟碟 (B) 電腦：IBM PC可相容的 (C) 操作系統：PC-D0S/MS-D0S (D) 軟體：Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EP0) (2) 序列識別1號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度·· 1670個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股 (D) 局部解剖學：直線狀 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）請先閎背面 ί 頁 570925 A7B7 五、發明説明（32 ) (ii)分子類型：cDNA (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：CDS (B) 位置：793··1575 (ix)特徵·· (A) 名稱/關键：mat—肽 (B) 位置：793..1572(xi)序列説明：序列識別1號：經濟部中央標準局員工消費^*-作社印製 GATCCTATCG CGCCAAAGGT GGTATTAGGA ATAAGAGCTT GATTATTAAT CTCCCTGGTA 60 AGTCCAAAAA GTATTAGAGA ATGCTTAGAG GCGGTTTTTC CAGCGATTCC TTATTGCGTG 120 GATTTGATTT TAGGGAATTA CATGCAAGTG AATGAAAAAA ACATTCAAGC GTTTGCCCCC 180 AAACAATAAG GTAAAAAATG CCACTCACTC ATTTGAATGA AGAAAATCAA CCTAAAATGG 240 j TGGATATAGG GGATAAAGAA ACCACTGAAA GAATCGCTCT AGCAAGCGGT CX；TATCAGCA 300 I ' TGAATAAAGA GGCTTATGAC GCTATTATCA ATCATGGCGT CAAAAAGGGT CCGGTATTAC 360 j AAACTGCTAT TATTGCTGOG ATTATGGGCG CTAAAAAGAC AAGCGAACTC ATTCCCATGT 420 GCCATCCAAT CATGCTCA-^T GGGGTGGATA TTGATATTTT AGAAGAAAAA GAGACTTGTA 480 GTTTTAAACT CTATGCGAGA GTCAAAACTC AAGCTAAAAC GGGCGTAGAA ATGGAAGCGC 540 i . ! TAATGAGTGT GAGCGTAGGG CTTTTAACCA TTTATGACAT GGTGAAAGCC ATTGATAAGA 600 GCATGACAAT TAGCGGTGTG ATGCTGGAAT ATAAAAGTGG AGGCAAAAGT GGGGATTATA 660 ACGCTAAAAA ATAGAA.\AAG ACTGATAATC TAAAGATATT AGGGTAAAAT AACATTTTGA 720 CAACAAAAGC GTGTTGGTTG CTTCGGATTr GTTGTTATAG AAGTCTAAAA TATTACAATC 780 j AAGGATAGAA CG ATG AG A GCA AAT AAT CAT ΊΤΤ AAA GAT ΊΤΤ GCA TGG 323 i Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp 1 1 5 10 ；AAA A.AA TGC CTT TTA GGC GCG AGO GTG GTG GCT TTA ΊΤΑ GTG GGA TGC 876 ! Lys Lys Cys Leu Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys 丨 20 25 -35- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570925 A7… B7 五、發明説明（33 ) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 AGO CCG CAT ATT ATT GAA ACC AAT GAA GTC GCT TTG AAA TTG AAT TAC 924 Ser Pro His lie lie Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr 30 35 40 CAT CCA GCT AGO GAG AAA GTT CAA GCG ΊΤΑ GAT GAA AAG ATT TTG CTT 972 His Pro Ala Ser Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys lie Leu Leu 45 50 55 60 TTA AGG CCA GCT TTC CAA TAT AGC GAT AAT ATC GCT AAA GAG TAT GAA 1020 Leu Arg Pro Ala Phe Gin Tyr Ser Asp Asn lie Ala Lys Glu Tyr Glu 65 70 75 AAC AAA TTC AAG AAT CAA ACC GCG CTC AAG GTT GAA CAG ATT TTG CAA 1063 Asn Lys Phe Lys Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin lie Leu Gin 80 85 90 AAT CAA GGC TAT AAG GTT ATT AGC GTA GAT AGC AGC GAT AAA GAC GAT 111S Asn Gin Gly Tyr Lys Val lie Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp ! 95 100 .105 ΊΤΓ TCT TTT GCA CAA AAA AAA GAA GGG TAT TTG GCG GTT GCT ATG AAT 1164 Phe Ser Phe Ala Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn 110 115 120 i GGC GAA ATT GTT ΊΤΑ CGC CCC GAT CCT AAA AGG ACC ATA CAG AAA AAA 1212 Gly Glu lie Val Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr lie Gin Lys Lys / 125 130 -135 140 / 气 · TCA GAA CCC GGG ΊΤΑ TTA TTC TCC ACC GGT TTG GAC AAA ATG GAA GGG 1260 Ser Glu Pro Gly Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly 145 150 155 GTT ΊΤΑ ATC CCG GCT GGG ΤΓΤ ATT AAG GTT ACC ATA CTA GAG CCT ATG 1308 Val Leu lie Pro Ala. Gly Phe lie Lys Val Thr lie Leu Glu Pro Met 160 165 170 I ! AGT GOG GAA TCT TTG GAT TCT TTT ACG ATG GAT TTG AGC GAG TTG GAC 1356 Ser Gly Glu Ser Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp I 175 180 185 ATT CAA GAA AAA TTC TTA AAA ACC ACC CAT TCA AGC CAT AGC GGG GGG 1404 lie Gin Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His'Ser Ser His Ser Gly Gly ； 190 195 200 TTA GTT AGC ACT ATG GTT AAG GGA ACG GAT AAT TCT AAT GAC GCG ATC 1452 Leu Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala lie 205 210 215 220 AAG AGC GCT TTG AAT AAG ATT TTT GCA AAT ATC ATG CAA GAA ATA GAC 1500 :Lys Ser Ala Leu Asn Lys lie Phe Ala Asn lie Met Gin Glu lie Asp 225 230 235 -36- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570925 A7B7 五、發明説明（34 ) AAA AAA CTC ACT CAA AAG AAT TTA GAA TCT TAT CAA AAA GAC GCC ΑΛΑ

Lys Lys Leu Thr Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys 240 245 250

GAA ΊΤΑ AAA GGC AAA AGA AAC CGA TAA AAACAAATAA CGCATAAGAA

Glu Leu Lys Gly Lys Arg Asn Arg * 255 260

AAGAACGCTT GAATAAACTG CTTAAAAAGG GTTTTTTAGC GTTCTTTTTG AGCGTGTATT TAAGGGCTGA TGATC (2)序列識別2號的訊息： (i) 序列#徵： (A) 長度：261個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 · . (D)局部解剖學：直線狀、 (ii) 分子類型：蛋白質 (xi)序列説明··序列識別2號：

Met Arg Ala Asn Asa His Phe Lys Asp Phe Ala Trp Lys Lys Cys Leu 1 5 10 15

Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys Ser Pro His lie 20 25 30 lie Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr His Pro Ala Ser 35 40 45

Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys lie Leu Leu Leu Arg Pro Ala 50 55 60

Phe Gin Tyr Ser Asp Asn lie Ala Lys Glu Tyr Glu Asn. Lys Phe Lys 65 70 '75 80

Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin lie Leu Gin Asn Gin Gly Tyr 85 *90 95

Lys Val lie Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala 100 105 110

Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu lie Val 115 120 125 37- 、紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1543 1595 1655 1670 許先閲讀背之注項再填寫本頁經濟部中夬橾準局員工消費合作、社印製 570925 經濟部中央標準局員工消費A.··口作社印製 A7 .·_B7_ 五、發明説明（35 ) ' Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr lie Gin Lys Lys Ser Glu Pro Gly 130 135 140 Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu lie Pro 145 150 155 160 Ala Gly Phe lie Lys Val Thr lie Leu Glu Pro Met Ser Gly Glu Ser 165 170 175 Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp lie Gin Glu Lys 180 185 190 Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr 195 200 205 Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala Ila Lys Ser Ala Leu 210 215 220 Asn Lys lie Phe Ala Asn lie Met Gin Glu lie Asp Lys Lys Leu Thr 225 230 235 240 Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys Glu Leu Lys Gly 245 250 255 Lys Arg Asn Arg * 260 . r (2)序列識別3號的訊息·· (i) 序列特徵： (A) 長度：1670個鹼基對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：雙股· (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：cDNA · (ix)特徵： (A) 名稱/關键·· CDS (B) 位置：793..1575 ____— —__- 38 " ___本紙張尺度適用中国國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、言 570925 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ·. B7 五、發明説明（36 ) — (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵： (B) 位置·· 793..1572 (xi)序列説明··序列識別3號：

GATCCTATCG CGCCAAAGGT GGTATTAGGA ATAAGAGCTT GATTATTAAT CTCCCTGGTA

AGTCCAAAAA GTATTAGAGA ATGCTTAGAG GCGGTTTTTC CAGCGATTCC TTATTGCGTG

GATTTGATTT TAGGGAATTA CATGCAAGTG AATGAAAAAA ACATTCAAGC GTTTGCCCCC

AAACAATAAG GTAAAAAATG CCACTCACTC ATTTGAATGA AGAAAATCAA CCTAAAATGG

TGCATATAGG GCATAAAGAA ACCACTGAAA GAATCGCTCT AGCAAGCGGT CGTATCAGCA

TGAATAAAGA GGCTTATGAC GCTATTATCA ATCATGGCGT CAAAAAGOGT CCGGTATTAC

AAACTGCTAT TATTGCTGGG ATTATGGGGG CTAAAAAGAC AAGCGAACTC ATTCCCATGT

GCCATCCAAT CATGCTCAAT GGGGTGCATA TTGATATTTT AGAAGAAAAA GAGACTTGTA

GTTTTAAACT CTATGCGAGA GTCAAAACTC AAGCTAAAAC GGGCGTAGAA ATGGAAGCGC

TAATGAGTGT GAGCGTAGGG CTTTTAACCA TTTATGACAT GGTGAAAGCC ATTGATAAGA

GCATGACAAT TAGCGGTGTG ATGCTGGAAT ATAAAAGTGG AGGCAAAAGT GGGGATTATA

ACGCTAAAAA ATAGAAAAAG ACTGATAATC TAAAGATATT AGGGTAAAAT AACATTTTGA

CAACAAAAGC GTGTTGGTTG CTTCGGATTT GTTGTTATAG AAGTCTAAAA TATTACAATC AAGGATAGAA CG ATG AGA GCA AAT AAT CAT ΊΤΓ AAA GAT ΤΊΤ GCA TGG Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp 15 10

AAA AAA TGC CTT ΊΤΑ GGC GCG AGO GTG GTG GCT ΊΤΑ ΊΤΑ GTG GGA TGC

Lys Lys Cys Leu Leu Gly Ala Ser Val Varl Ala Leu Leu Val Gly Cys 15 20 25

AGC CCG CAT ATT ATT GAA ACC AAT GAA GTC..GCT TTG AAA TTG AAT TAC

Ser Pro His He lie Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr 30 35 40 i

j CAT CCA GCT AGC GAG AAA GTT CAA GCG TTA GAT GAA AAG ATT TTG CTT ! His Pro Ala Ser Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys lie Leu Leu 45 50 55 60 •39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐）

570925 A7B7 〆經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（37 TTA AGG CCA GOT TTC CAA TAT AGO GAT AAT ATC GCT AAA GAG TAT GAA 1020

Leu Arg Pro Ala Phe Gin Tyr Ser Asp Asn lie Ala Lys Glu Tyr Glu 65 70 75 AAC AAA TTC AAG AAT CAA ACC GCG CTC AAG GTT GAA CAG ATT TTG CAA 1〇〇3

Asn Lys Phe Lys Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin lie Leu Gin 80 85 90 AAT CAA GGC TAT AAG GTT ATT AGC GTA GAT AGO AGO GAT AAA GAC GAT 1116

Asn Gin Gly Tyr Lys Val lie Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp 95 100 105 ΊΤΤ TCT TTT GCA CAA AAA AAA GAA GGG TAT TTG GCG GTT GCT ATG AAT H〇4

Phe Ser Phe Ala Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Al<a Val Ala Met Asn 110 115 120 GGC GAA ATT GTT ΊΤΑ CGC CCC GAT CCT AAA AGG ACC ATA CAG AAA AAA 1212

Gly Glu lie Val Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr He Gin Lys Lys 125 130 135 140 - TCA GAA CCC GGG ΊΤΑ TTA TTC TCC ACC GCT TTG GAC AAA ATG GAA GCG 1260

Ser Glu Pro Gly Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly 145 150 155 GTT TTA ATC CCG GCT GGG ΊΤΤ ATT AAG GTT ACC ATA CTA GAG CCT ATG 1303

Val Leu lie Pro Ala Gly Phe lie Lys VaL Thr lie Leu Glu Pro Met 160 165' 170 AGT GGG GAA TCT TTG GAT TCT ΊΤΤ ACG ATG GAT TTG AGC GAG TTG GAC 1356 ；Ser Gly Glu Ser Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp 175 180 185 ATT CAA GAA AAA TTC ΊΤΑ AAA ACC ACC CAT TCA AGC CAT AGC GGG GGG 1404 lie Gin Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly 190 195 200 TTA GTT AGC ACT ATG GTT AAG GGA ACG GAT AAT TCT AAT GAC GCG ATC 1452

Leu Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala lie 205 210 215 220 AAG AGA GCT TTG AAT AAG ATT ΊΤΤ GCA AAT ATC ATG CAA GAA ATA GAC 1500

Lys Arg Ala Leu Asn Lys lie Phe Ala Asn lie Met Gin Glu lie Asp 225 230 235 AAA AAA CTC ACT CAA AAG AAT TTA GAA TCT TAT CAA AAA GAC CCC AAA 1543

Lys Lys Leu Thr Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys 240 245 250 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570925 A7 B7 五、發明説明（38 ) GAA ΊΤΑ AAA GGC AAA AGA AAC CGA TAA AAACAAATAA CGCATAAGAA Glu Leu Lys Gly Lys Arg Asa Arg * 255 260 AAGAACGCTT GAATAAACTG CTTAAAAAGG GTTTTTTAGC GTTCTTTTTG AGCGTGTATT TAAGGGCTGA TGATC (2)序列識別4號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：261個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 · (xi)序列説明：序列識別4號：、 1595 1655 1670 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消 f 合· 作社印製

Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp Lys Lys Cys Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ala Ser Val ValAla Leu'Leu Val Gly Cys Ser Pro His lie 20 25 30 lie Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr His Pro Ala Ser 35 40 45 Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys lie Leu Leu Leu Arg Pro Ala 50 55 60 Phe Gin Tyr Ser Asp Asa lie Ala Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Lys 65 70 75 80 Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin lie Leu Gin Asn Gin Gly Tyr 85 90 95 Lys Val lie Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala 100 * 105 110 Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu lie Val 115 120 125 Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr lie Gin Lys Lys Ser Glu Pro Gly 130 ^ 135 140 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570925 Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（39 )

Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu lie Pro 145 150 155 160

Ala Gly Phe lie Lys Val Thr lie Leu Glu Pro Met Ser Gly Glu Ser 165 170 175

Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp lie Gin Glu Lys 130 135 190

Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr 195 200 205

Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala lie Lys Arg Ala Leu 210 215 220

Asn Lys lie Phe Ala Asn lie Met Gin Glu lie Asp Lys Lys Leu Thr 225 230 235 240

Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala- Lys Glu Leu Lys Gly 245 250 255

Lys Arg Asa Arg ♦ * 260 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ιτ 經濟部中央標隼局員工消費^*-作社印製 42 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims

570925 第085110165號專中文申請專利範圍利申請案替換本(92牟丄44η Α8 Β8 C8 D8 -11 六、申請專利範園公告本 1. 一種重組多肽，其能夠於哺乳類動物中謗發保護性免疫對抗幽門螺桿菌（Helicobacter pylori)感染，其中該多肽由與胺基酸序列之序列識別2號之位置1至位置 2 6 0，序列識別2號之位置2 8至位置2 6 0，序列識別4 號之位置1至位置260，或序列4號之位置28至位置 2 6 0相同乏胺基酸序列所組成。 SEQ-IDNO: 2: Met Arg Ala Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp Lys Lys Cys Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys Ser Pro His lie 20 25 30' lie Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys-'Leu Asn Tyr His Pro Ala Ser 35 40 / 45 \ 6lu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys lie Le,u Leu Leu Arg ^ro. Ala 50 55 60 Phe Gin Tyr Ser. Asp .Asn lie Ala Lys Glu Tyr Glu Asn jLys Phe Lys 65 70 75 80 Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin lie Leu Gin Asn Gin Gly Tyr 85 90 95 Lys Val .^11 e Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala 100 105 110 Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu lie Val 115 120 125 Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr lie Gin Lys Lys Ser Glu Pro Gly 130 135 ^ 140 Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu lie Pro 145 150 155 160 Ala Gly Phe lie*Lys Val Thr lie LeuGlu Pro Met Ser*Gly Glu Ser 165 170 175 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公董) 570925 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 Leu Asp Ser· Phe TJir，Wet Asp Leu Ser Glu Leu Asp lie Gin Glu-^Lys ,180 185 190 Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr 195 200 205 Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala lie Lys Ser Ala Leu 210 215 220 Asn Lys lie Phe Ala Asn lie Met Gin Glu lie Asp Lys Lys Leu Thr 225 230 235 240 Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys Glu Leu Lys Gly •’ 245 250 255 -Lys Arg Asn Arg ； * - 260 SEQ ID:NO: 4: Met Arg Ala Asn Asn His Phe Ly-s Asp Phe Ala Trp Lys Lys Cys Leu ， 5 15 Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys Ser Pro Hi's lie 20 25 30 lie Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr His PrjD Ala Ser 35 40 45 I Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys lie Leu. Leu Leu Arg Pro Ala 50. 55 60 Phe Gin Tyr Ser Asp Asn lie Ala Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Lys 65 70 75 80 Asn. Gin Tiir Ala Leu Lys Val Glu Gin lie Leu Gin Asn Gin Gly Tyr 85 90 95 Lys Val lie Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp Phe Ser Phe Ala 100 105 110 Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn Gly Glu lie Val 115 120 125 Leu^Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr lie Gin.Lys Lys Ser Glu Pro Gly 130 135 140 . -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝訂

570925 A8 B8 C8 D8 六申請專利範圍 Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly Val Leu lie Pro 145 150 155 1乡。 Ala Gly Phe lie Lys Val Thr lie Leu Glu Pro Met Ser Gly Glu Ser 165 170 175 Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp lie Gin Glu Lys 180 185 190 Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly Leu Val Ser Thr 195 200 205 Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala lie Lys Arg Ala »Leu 210 ' 215 220 -Asn Lys 工le Phe Ala Asn lie Met C?ln Glu lie Asp Lys Lys Leu Thr 225 ' 230 235 240 Gin Lys~ Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys Glu Leu Lys Gly 245 250 255 Lys Arg Asn Arg ★ . 260 2. —種重組多肽，其能夠於哺乳類動物中誘發保護性免疫對抗幽門螺桿菌（Helicobacter pylori)感染，其中該多肽由與胺基酸序列之序列識別2號之位置1至位置 2 6 0，序列識別2號之位置2 8至位置2 6 0，序列識別4 號之位置1至位置260，或序列4號之位置28至位置 2 6 0相同之胺基酸序列所組成，其中該多肽被脂化。 3. —種分離之核酸分子，其編碼根據申請專利範圍第1 項之多肤。 4. 一種分離之核酸分子，其為選自： (a)編碼根據申請專利範圍第.1項之多肽之核钵酸序列之核酸分子，其與序列識別1號之位置796-1572，序列識別1號之位置874-1572，序列識別3號之位置796- -3- 本紙張尺度適用中國國家標準((：^8) A4規格(210X297公釐) 570925 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1572,或序列識別3號之位置874-1572相同； SEQIDNO: 1 GATCCTATCG CGCCAAAGGT GGTATTAGGA ATAAGAGCTT GATTATTAAT CTCCCTGGTA AGTCCAAAAA GTATTAGAGA ATGCTTAGAG GCGGTTTTTC CAGCGATTCC TTATTGCGTG GATTTGATTT TAGGGAATTA CATGCAAGTG AATGAAAAAA ACATTCAAGC GTTTGCCCCC AAACAATAAG GTAAAAAATG CCACTCACTC ATTTGAATGA AGAXAATCAA CCTAAAATGG l^GGATATAGG GGATAAACAA ACCACTGAAA GAATCGCTCT AGCAAGCGGT CGTATCAGCA TGAATAAAGA GGCTTATGAC GCTATTATCA ATCATGGCGT CAAAAAGGGT CCGGTATTAC AAACTGCTAT TATTGCTGGG ATTATGGGGG CTAAAAAGAC AAGCGAACTC ATTCCCATGT GCCATCCAAT CATGCTCAAT GGGGTGGATA TTGATATTTT' AGAAGAAAAA GAGACTTGTA GTTTTAAACT CTATGCGAGA GTCAAAACTC AAGCTAAAAC GGGCGTAGAA ATGGAAGCGC TAATGAGTGT GAGCGTAGGG CTTTTAACCA TTTATGACAT GGTGAAAGCC ATTGATAAGA GCATGACAAT TAGCGGTGTG · ATGCTGGAAT ATAAAAGTGG AGGCAAAAGT GGG<?ATTATA ACGCTAAAAA ATAGAA^AAG ACTGATAATC TAAAGATATT AGGGTAAAAT AA(^TTTTGA CAACAAAAGC GTGTTGCTTG CTTCGGATTT GTTGTTATAG AAGTCTAAAA TATTACAATC AAGGATAGAA CG ATG AG A. GCA AAT AAT CAT TTT AAA GAT TTT GCA TGG Met Arg Ala-Asn Asn His Phe Lys Asp Phe Ala Trp 1 5 10 AAA AAA TGC CTT TTA GGC GCG AGC GTG GTG GCT TTA TTA GTG GGA TGC Lys Lys Cys Leu Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Glv Cys 15 20 25 AGC CCG CAT ATT ATT GAA ACC AAT GAA GTC GCT TTG AAA TTG AAT TAC Ser Pro His lie lie Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr 30 35 40 SO 120. 180 240 300 360 420 430 540 600 660 720 780 823 876 924

-4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公复) 570925 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 CAT CCA GCT AGC GAG AAA GTT CAA GCG TTA GAT GAA AAG ATT TTG CTT \ 972 His Pro Ala Ser (51u Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys lie Leu Leu 45 50 55 60 TTA AGG CCA GCT TTC CAA TAT AGC GAT AAT ATC GCT AAA GAG TAT GAA 1020 Leu Arg Pro Ala Phe Gin Tyr Ser Asp Asn lie Ala Lys Glu Tyr Glu* 65 70 75 AAC AAA TTC AAG AAT CAA ACC GCG CTC AAG GTT GAA CAG ATT TTG CAA 1063 Asn Lys Phe Lys Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin lie Leu Gin 80 85 90 AAT CAA GGC TAT AAG GTT ATT AGC GTA GAT AGC AGC GAT AAA GAC GAT 1116 Asn Gin Gly Tyr Lys Val lie Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp 95 100 105 TTT TCT TTT GCA CAA>AAA AAA GAA GGG ·ΤΑΤ TTG GCG GTT GCT ATG AAT 1164 Phe Ser Phe Ala Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Met Asn 110 ' 115 120 GGC GAA ATT GTT TTA CGC CCC GAT CCT AAA AGG ACC ATA CAG AAA AAA, 1212 Gly Glu lie Val Leu Arg Pro Asp Pro Lys Arg Thr lie Gin Lys Lys 125 130 135 140 TCA GAA CCC GGG TTA TTA TTC TCC ACC GGT TTG GAC AAA ΑΊΌ GAA GGG 1260 Ser Glu-Pro Gly Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly ^ 145 150 155 GTX TTA ATC CCG GCT GGG TTT ATT AAG GTT ACC ATA CTA GAG CCT ATG ， 13 08 Val Leu lie Pro Ala Gly Phe lie Lys.·Val Thr lie Leu Glu Pro Met 160 165 170 AGT GGG GAA TCT TTG GAT TCT TTT ACG ATG GAT TTG *AGC GAG TTG GAC 1356 Ser Gly Glu Ser Leu Asp iser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp 175 180 185 ATT CAA GAA AAA/rTTC TTA AAA ACC ACC CAT TCA AGC CAT AGC GGG GGG 1404 lie Gin Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly 190 * 195 200 TTA GTT AGC ACT ATG GTT AAG GGA ACG GAT AAT TCT AAT GAC GCG ATC - 1452 Leu Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala lie 205 210 215 220 AAG AGC GCT TTG AAT AAG ATT TTT GCA AAT ATC ATG CAA GAA ATA GAC 1500 Lys Ser Ala Leu Asn Lys lie Phe Ala Asn lie Met Gin Glu lie Asp 225 230 235 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 570925 A8 B8 C8

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 裝 % 570925 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範園 _ _ \ AAA AAA TGC CTT TTA GGC GCG AGC GTG GTG GCT ΊΤΑ TTA GTG GGA TGC * 87$ Lys Lys Cys Leu Leu Gly Ala Ser Val Val Ala Leu Leu Val Gly Cys 15 20 25 AGC CCG CAT ATT ATT GAA ACC AAT GAA GTC GCT TTG AAA TTG AAT TAC 924 Ser Pro His lie lie Glu Thr Asn Glu Val Ala Leu Lys Leu Asn Tyr 30 35 40 CAT CCA GCT AGC GAG AAA GTT CAA GCG TTA GAT GAA AAG ATT TTG CTT 972 His Pro Ala Ser Glu Lys Val Gin Ala Leu Asp Glu Lys lie Leu Leu 45 50 55 60 ·· TTA AGG CCA G^T TTC CAA TAT AGC GAT AAT ATC GCT AAA GAG TAT GAA *1020 Leu Arg Pro Ala Phe Gin Tyr Ser Asp Asn lie Ala Lys Glu Tyr Glu 65 70 75 AAC AAA TTC AAG AAT* CAA ACC GCG CTC AAG GTT GAA CAG ATT TTG CAA 1068 Asn Lys Phe Lys Asn Gin Thr Ala Leu Lys Val Glu Gin lie Leu Gin 80 85 90 AAT CAA GGC TAT AAG GTT ATT AGC GTA GAT AGC AGC GAT AAA GAC GATr lllo Asn Gin Gly Tyr Lys Val lie Ser Val Asp Ser Ser Asp Lys Asp Asp 95 100 / 105 TTT TCT TTT GCA CAA AAA AAA GAA'GGG TAT TTG GCG GTT GCT ATG AAT 1164 Phe Ser Phe Ala Gin Lys Lys Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala. Met Asn 110 115 120 GGC GAA ATT GTT TTA CGC CCC GAT CCT ·%ΑΑΑ AGG ACC ATA CAG AAA AAA 1212 Gly Glu lie Val Leu vArg Pro Asp Pro Lys Arg Thr lie Gin Lys Lys 125 130 135 140 TCA GAA CCC GGG TTA TTA ^TTC TCC ACC GGT TTG GAC AAA ATG GAA GGG 1260 Ser Glu Pro Gly -Leu Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asp Lys Met Glu Gly 、 J.45 150 155 GTT TTA ATC CCG GCT GGG ΤΤΓ ATT AAG GTT ACC ATA CTA GAG CCT ATG 1308 Val-Leu He Pro Ala Gly Phe He Lys Val Thr He Leu Glu Pro Met 160 165 170 AGT GGG GAA TCT TTG GAT ΊΧ：Τ TTT ACG ATG GAT TTG AGC GAG TTG GAC 1356 Ser Gly Glu Ser Leu Asp Ser Phe Thr Met Asp Leu Ser Glu Leu Asp 175 180 185 ATT CAA GAA AAA TTC TTA AAA ACC ACC CAT TCA AGC CAT AGC GGG GGG 1404 lie Gin Glu Lys Phe Leu Lys Thr Thr His Ser Ser His Ser Gly Gly 190 195 200 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝

570925 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1452 1500 1548 1595 1655 1670 TTA GTT AGC ACT ATG GTT AAG* GGA ACG GAT AAT TCT AAT GAC GCG ATC Leu Val Ser Thr Met Val Lys Gly Thr Asp Asn Ser Asn Asp Ala lie 205 210 215 220 AAG AGA GCT TTG AAT AAG ATT TTT GCA AAT ATC ATG CAA GAA ATA GAC Lys Axg Ala Leu Asn Lys lie Phe Ala Asn lie Met Gin Glu lie Asp 225 230 235 AAA AAA CTC ACT CAA AAG AAT TTA GAA TCT TAT CAA AAA GAC GCC AAA Lys Lys Leu Thr Gin Lys Asn Leu Glu Ser Tyr Gin Lys Asp Ala Lys 24〇 245 250 GAA TTA AAA GGC AAA AGA AAC CGA TAA AAACAAATAA CGCATAAGAA Glu "Leu Lys Gly Lys,Arg Asn Arg ★ 255 260 AAGAACGCTT GAATAAACTG CTTAAAAAGG GTTTTTTAGC GITCTTTITG AGCGTGTATT TAAGGGCTGA TGATC (b)編碼根據申請專利範圍第1或2項之多肽之核酸分子，其係能夠與如同（a)中定義之核酸分子之多肽密碼區完全互補的核苷酸序列雜交；以及 (C)因為基因密碼的結果而被簡併成如同（a)或（b)中定義的核苷酸序列，且編碼根據申請專利範圍第1或2項之多肽之核酸分子。 5· —種製備含根據申請專利範圍第3或4項核酸分子之質體載體之方法，其包括將根據申請專利範圍第3或4 項之核酸分子導入一^載體中’其中該質體載體為質體載體 PS862 或 pS863， pS862如下： -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 570925 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍

6. —種製備含有根據申請專利範圍第5項之方法製備之質體載體之宿主細胞之方法，其包括將該質體載體導入一宿主細胞内。 7. —種製備多肽的方法，該多肽為幽門螺桿菌表面暴露的29 kDa抗原，該方法包括在某種條件下培養以根據申請專利範圍第5項之方法所製得之質體轉化的宿主 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 570925 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 _ ' 細胞，藉此產生該多肽，並回收該多肽。 8·根據申請專利範圍第1或2項之多肽或肽，其係用於診斷幽門螺桿菌感染。 9·根據申請專利範圍第1或2項之多肽或肽，其係用為疫苗。 10. —種疫苗組合物，其係用於謗發對抗幽門螺桿菌感染之保護性免疫反應，其包含免疫有效量的根據申請專利範圍第1或2項之多肽，可視需要與藥學上可接受之載劑或稀釋劑併用。 11. 根據申請專利範圍第1 〇項之疫苗組合物，其中該多肽係調製成選自微脂粒、ISCOMs、蝸形體（cochleates)及聚合物微球體之遞送系統。 12. 根據申請專利範圍第10項之疫苗組合物，其中該多肽係與減毒細菌、病毒或噬菌體調配。 13· —種疫苗組合物，其係用於謗發對抗幽門螺桿菌感染之保護性免疫瓦應，其包含根據申請專利範圍第3或 4項之核酸分子，可視需要與藥學上，可接受之載劑或稀釋劑併用。 14.根據申請專利範圍第1或2項之重組多肽，係用於製造診斷幽門螺桿菌感染之組合物。 15·根據申請專利範圍第1或2項之重組多肽，係用於製造診斷幽門螺桿菌感染之診斷工具組。 16·根據申請專利範圍第1或2項之重組多肽，係用於製造謗發對抗幽門螺桿菌之保護性免疫反應之疫苗。 -10-

申請專利範

.艮據申請專利範圍第3或4項之核酸分予，係用切發對抗幽Η螺样菌之保護性免疫反應之疫苗。包 •種在活體外診斷幽門螺桿菌感染的方法，該方法括： (:) :可視需要與固態擔體結合的根據申請專利範圍觸;=2項《多肽，與從哺乳動物中取得的體液接 (b)從與該多肽結合之該體液中檢測抗體。 19·種衫斷工具組，係用於檢測哺乳動物體内視需要為 ^頒幽門螺桿菌感染，其包括根據申請專利範圍第1 或2員之多肽，視需要將多肽標示或與固態擔體偶聯。 2〇·根據申凊專利範圍第i或2項之重組多肽，其係用於製造醫療性治療被幽門螺桿菌感染之哺乳動物之疫苗’以根除或抑制該感染。 21 ·根據申請專利範圍第2〇項之重組多肽，其中該哺乳動物為人類。 22·根據申請專利範圍第1或2項之重組多肽，係用於製 U預防性治療有幽門螺桿菌感染危險之哺乳動物之疫苗。 23. 根據申請專利範圍第22項之重組多肽，其中該哺乳動物為人類。 24. 根據申請專利範圍第3或4項之核酸分子，其係用於製造醫療性治療被幽門螺桿菌感染之哺乳動物之疫 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 570925 A8 B8 C8 D8 六申請專利範圍苗，以根除或抑制該感染。 25. 根據申請專利範圍第24項之核酸分子，其中該哺乳動物為人類。 26. 根據申請專利範圍第3或4項之核酸分子，其係用於製造預防性治療有幽門螺桿菌感染危險之哺乳動物之疫苗。 27. 根據申請專利範圍第26項之核酸分子，其中該哺乳動物為人類。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)