CN110563818A - 用于针对金黄色葡萄球菌的免疫的稳定化的蛋白质 - Google Patents

Abstract

消除含有半胱氨酸的金黄色葡萄球菌抗原的二硫键的形成增强了抗原的稳定性。本发明提供了具有点突变的含有半胱氨酸的金黄色葡萄球菌抗原的变体形式，所述点突变对半胱氨酸残基进行了取代、删除或修饰。

Description

用于针对金黄色葡萄球菌的免疫的稳定化的蛋白质

本申请要求2012年8月31日提交的美国临时申请61/695,723的权益，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及包含衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原的免疫原性组合物及其在免疫中的用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性球菌，并且是血流、下呼吸道和皮肤以及其他软组织感染的主要原因。其导致从轻度皮肤感染到致命性疾病(包括肺炎和败血症)的多种疾病，且在美国每年与金黄色葡萄球菌相关的死亡率超过了任意其他感染性疾病(包括HIV/AIDS)。

目前没有批准的针对金黄色葡萄球菌的疫苗。在2005年的III期临床试验中，与安慰剂组相比，基于来自5型和8型细菌的表面多糖混合物的疫苗StaphVAX^TM无法减少感染。参考文献1报道了来自默克公司(Merck)和因特塞尔公司(Intercell)的“V710”疫苗的数据，该疫苗基于单个抗原IsdB，这是一种保守的螯合铁的细胞表面蛋白[2，3]。然而，V710的临床试验在2011年终止，其依据是观察到V710不可能表现出统计学上显著的临床益处，且与安慰剂接受者相比，在疫苗接受者中出现了更高频率的关于总体死亡率和多器官功能障碍的安全问题[4]。

参考文献5公开了作为疫苗策略的多种金黄色葡萄球菌抗原及其组合。参考文献6公开了金黄色葡萄球菌多肽抗原在简单的缓冲溶液中不稳定并可通过加入稳定化添加剂(如EDTA)稳定抗原。抗原的不稳定性是不希望的，因为(1)这使得疫苗无法在给予前长时间储存，以及(2)各批次间疫苗的不一致性会影响质量和管理机构批准的要求。此外，含有这些不稳定抗原的疫苗的生产会变得复杂且涉及多个纯化步骤。因此，本发明的一个目标是鉴定用于在免疫原性组合物中稳定金黄色葡萄球菌多肽抗原的其他策略。

发明内容

发明人发现，防止抗原的寡聚化是增强抗原稳定性的有效策略。多种金黄色葡萄球菌抗原含有半胱氨酸残基，且它们在标准缓冲溶液中可形成寡聚体，包括由半胱氨酸残基之间的二硫键形成的共价二聚体。发明人发现，含有这些共价二聚体的组合物可以是不稳定的，且可形成聚集体或影响组合物中其他抗原的稳定性(如果存在)。可通过取代、修饰或删除半胱氨酸残基从而使二硫键无法形成的方式防止共价二聚体的形成。有趣的是，防止这些抗原形成共价二聚体提高了抗原稳定性并维持了组合物的高总体选择性(即相对于总体抗原存在高比例的单个同种型)和纯度。此外，发明人发现，这些半胱氨酸缺陷型抗原在引发针对野生型含半胱氨酸抗原的免疫应答中仍是有效的。因此，可在疫苗制剂中包含半胱氨酸缺陷型抗原以提高抗原稳定性。

天然状态下Sta006抗原在其成熟形式中具有N端半胱氨酸。发明人发现，删除半胱氨酸停止了二聚化并生成较易于表征和分析的蛋白，而不对免疫原性产生负面影响。含有半胱氨酸缺陷型Sta006抗原的组合物较稳定。因此，本发明提供了一种氨基酸序列与SEQID NO：4具有至少90％(例如大于等于91％、大于等于92％、大于等于93％、大于等于94％、大于等于95％、大于等于96％、大于等于97％、大于等于98％、大于等于99％、大于等于99.5％)相同性的多肽，该多肽没有游离的巯基且能够引发(例如在给予人时)识别野生型Sta006抗原(例如由氨基酸序列SEQ ID NO：2组成的金黄色葡萄球菌蛋白)的抗体。该多肽不能通过二硫键形成共价二聚体。

本发明提供一种包含本发明的多肽的免疫原性组合物。该组合物可以是水性形式，此时理想情况下其pH为5至8。该组合物还可包括佐剂，例如铝盐。

在本发明的一些实施方式中，该免疫原性组合物还包含其他抗原，该抗原可以是多肽和/或糖。例如，其还可包括一种或多种金黄色葡萄球菌荚膜糖偶联物，例如针对血清型5和/或血清型8菌株。在其他实施方式中，该组合物不包含其他葡萄球菌多肽抗原。在其他实施方式中，该组合物不包括其他葡萄球菌抗原。在另一个实施方式中，该组合物不包含其他抗原。

本发明还提供了本发明的免疫原性组合物的冻干物。该冻干物可使用水性材料重建以提供水性的本发明的免疫原性组合物。为进行给药，对冻干物使用合适的液体稀释剂(例如缓冲液、盐水溶液、用于注射的水(WFI))重建。该液体稀释剂可包括佐剂，例如铝盐或水包油乳液佐剂。Sta006

“Sta006”抗原以有用的免疫原的形式公开于参考文献5中。其最初标注为“铁色素结合蛋白”，且在文献[7]中也称为“FhuD2”。在NCTC 8325菌株中，Sta006是SAOUHSC_02554且具有氨基酸序列SEQ ID NO：1(GI：88196199)。在Newman菌株中，它是nwmn_2185(GI：151222397)。Sta006的突变形式可参见参考文献8。已知的Sta006抗原在其可发生脂化的成熟形式中具有N端半胱氨酸。野生型含半胱氨酸的Sta006可以单体或寡聚体(例如共价二聚体)的形式存在。

本发明使用了无法通过二硫键形成共价二聚体的Sta006的变体形式。该多肽不含有任何游离的巯基(在还原条件下)。其能够引发识别野生型Sta006抗原(例如SEQ ID NO：2)的抗体(例如在给予人时)。该多肽可包含与SEQ ID NO：4、5、6和7中任一条序列具有80％或更高(例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)相同性的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是SEQ ID NO：1的氨基酸残基19-302。与SEQ ID NO：4相比，SEQ IDNO：5在N端具有额外的氨基酸残基“X”，其中“X”是不含有游离巯基的氨基酸。与SEQ ID NO：4相比，SEQ ID NO：6在N端具有Met-Ala-Ser序列。与SEQ ID NO：5相比，SEQ ID NO：7在N端具有Met-Ala-Ser序列。包含SEQ ID NO：4、5、6和7中任一条序列的Sta006多肽可用于本发明。

有用的Sta006变体形式可包含至少一个点突变，所述点突变取代、修饰或删除了野生型抗原形式中存在的半胱氨酸残基。例如，Sta006多肽可含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中可以取代、修饰或删除SEQ ID NO：3第4位上的半胱氨酸残基。优选地，可使用丝氨酸或丙氨酸残基进行取代。或者，可删除半胱氨酸残基(例如提供SEQ ID NO：6)。

杂交多肽

本发明所用的抗原可以单独多肽的形式存在于组合物中。然而，使用一种以上抗原时，它们不必须以单独多肽的形式存在。相反，至少两种(如2、3、4、5或更多种)抗原可表达成一条多肽链(“杂交”多肽)，如参考文献5中所述。理想情况下，本发明所用的杂交多肽不含有游离的巯基(在还原条件下)。

由两种、三种、四种或更多种抗原的氨基酸序列组成的杂交体是有用的。具体地，优选由两种、三种、四种或五种抗原(如两种抗原)的氨基酸序列组成的杂交体。

不同的杂交多肽可以在单一制剂中混合在一起。如本文他处所述，杂交多肽也可与偶联物或非金黄色葡萄球菌抗原组合。

有用的是，这些杂交多肽可引发抗体(例如给予人时)，该抗体识别杂交体中存在的各野生型葡萄球菌蛋白。

在一些实施方式中，单个杂交多肽中的抗原通过接头氨基酸序列连接在一起。接头氨基酸序列一般较短(如20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。示例包括促进克隆的短肽序列或聚甘氨酸接头。其它合适的接头氨基酸序列对本领域技术人员而言是显而易见的。

本发明所用多肽

本发明使用不形成二硫键的金黄色葡萄球菌抗原的变体形式。含有游离巯基(例如半胱氨酸氨基酸)的金黄色葡萄球菌抗原可形成寡聚体，包括标准缓冲液中的共价同源或异源二聚体。共价二聚体通常通过半胱氨酸残基的巯基的氧化生成，所述氧化导致形成二硫键(即形成胱氨酸)。为消除共价二聚体的形成，本发明的多肽不含有任何能够发生反应以形成二硫键的游离巯基(在还原条件下)。游离巯基也称作未保护的巯基或游离或未保护的-SH，具有反应活性硫原子。半胱氨酸残基具有游离巯基(在还原条件下)，因此本发明的多肽不含有任何半胱氨酸残基。可对半胱氨酸残基进行衍生化使得巯基得到保护且不能发生反应以形成二硫键，例如通过添加巯基保护基团。巯基保护基团是本领域已知的，例如硫醚、硫酯或其衍生物[9]。因此，本发明的多肽可含有衍生化的半胱氨酸氨基酸残基，前提是该衍生化的半胱氨酸氨基酸残基不含有能够形成二硫键的游离巯基(在还原条件下)。

在一些例外的实施方式中，多肽可包含巯基，但该巯基不是半胱氨酸残基中侧链的一部分。然而，在理想情况下，多肽不包含任何巯基。

优选地，该多肽不含半胱氨酸或胱氨酸。

在一些实施方式中，该多肽可含有氨基酸“X”。“X”可以是任意氨基酸，前提是其不含游离巯基。该氨基酸可以是天然或非天然氨基酸。天然氨基酸是本领域已知的，例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。半胱氨酸具有游离巯基，因此“X”不可以是半胱氨酸残基。非天然氨基酸可以是衍生或修饰的氨基酸。“X”可以是不含游离巯基的衍生的氨基酸，例如甲基半胱氨酸。

本发明所用多肽可采取各种形式(如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非肉豆蔻酰化多肽、单体、多聚体、颗粒、变性多肽等)。

本发明所用多肽可通过各种方式制备(如重组表达、由细胞培养物纯化、化学合成等)。优选重组表达的蛋白，特别是杂交多肽。

本发明的组合物中的抗原分离自其中表达该抗原的生物体。因此，在使用前以纯化或基本纯化的形式提供Sta006多肽，即基本不含其他葡萄球菌或宿主细胞多肽。在用于本发明前，Sta006多肽一般是至少约80％纯(以重量计)，且通常至少约90％纯，即小于约20％且优选小于约10％(例如小于5％)的Sta006组合物是由其他多肽组成的。

本发明所用优选的多肽具有N端甲硫氨酸，但在一些实施方式中，在初生多肽N端处存在的甲硫氨酸不存在于本发明的组合物中的多肽内。

本发明所用多肽优选是葡萄球菌多肽。

术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链聚合物，可包含修饰的氨基酸，可被非氨基酸打断。该术语也包括天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以单链或结合链的形式出现。

本发明提供了包含序列-P-Q-或-Q-P-的多肽，其中：-P-是上述氨基酸序列，-Q-不是上述序列，即本发明提供融合蛋白，前提是该多肽不含任何游离巯基。-P-的N-末端密码子不是ATG且此密码子未出现在多肽的N末端时，它将被翻译成该密码子的标准氨基酸，而不是Met。然而，当该密码子位于多肽N末端时，它将被翻译成Met。-Q-部分的示例包括但不限于：组氨酸标签(即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)、麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。

虽然可以在葡萄球菌中表达本发明多肽，但本发明通常使用异源宿主进行表达(重组表达)。该异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。其可以是大肠杆菌(E.coli)，但其他合适的宿主包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分支杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。与编码本发明多肽的野生型金黄色葡萄球菌基因相比，改变密码子以优化这类宿主中的表达效率而不影响编码的氨基酸是有帮助的。

核酸

本发明提供了编码本发明多肽和杂交多肽的核酸。还提供包含编码一种或多种本发明多肽或杂交多肽的核苷酸序列的核酸。

本发明提供了生产本发明的核酸的方法，其中使用化学方式部分或完整地合成该核酸。

本发明提供了包含本发明的核苷酸序列的载体(如克隆或表达载体)和使用这类载体转化的宿主细胞。

操纵核酸和表达编码的蛋白的方法是本领域已知的，且包括参考文献43和67中所述的那些。可使用另一个氨基酸的密码子取代半胱氨酸的密码子来对核酸序列进行修饰。可使用任何其他氨基酸取代半胱氨酸，包括丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸或者不具有游离巯基(即不能容易地形成二硫键)的氨基酸的修饰形式。或者，可简单地从序列中删除半胱氨酸残基。因此，删除必须是从核酸序列中移除半胱氨酸的密码子而不引入移码。用于在具有已知序列的核酸的预定位点处进行取代和删除突变的技术是已知的，且包括但不限于引物诱变和其他形式的定点诱变。

本发明也提供所含核苷酸序列与这些核苷酸序列有序列相同性的核酸。序列之间的相同性优选通过上述史密斯-沃特曼同源性搜索算法确定。这类核酸包括使用替代密码子编码相同氨基酸的那些核酸。

本发明的核酸可采取各种形式(如单链、双链、载体、引物、探针、标记等)。本发明的核酸可以是环状或分支的，但通常是线性的。除非另有说明或要求，利用核酸的本发明任何实施方式可采用双链形式和构成该双链形式的两条互补单链形式中的每条链。本发明的核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其它核酸(如不含天然产生的核酸)，特别是不含其它葡萄球菌或宿主细胞核酸，通常其至少为约50％纯(以重量计)，通常至少为约90％纯。本发明的核酸优选为葡萄球菌核酸。

可以多种方式制备本发明的核酸，例如，完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、由基因组或cDNA文库制备等。

术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体。它也包括DNA或RNA类似物，如含有经修饰主链(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或经修饰碱基的类似物。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分枝核酸、质粒、载体、探针、引物等。当本发明的核酸采取RNA形式时，其可能具有或不具有5′帽。

本发明的核酸可以是载体的一部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建体的一部分。载体可以是，例如，设计用于分离、增殖和复制所插入核苷酸的“克隆载体”、设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”、设计用于产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”或具有一种以上载体类型的属性的“穿梭载体”。优选的载体是质粒。“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是外源核酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，这些后代与原始亲本细胞(在形态或总DNA互补方面)不必完全相同。宿主细胞包括使用本发明的核酸体内或体外转染或感染的细胞。

应理解，当核酸是DNA时，RNA序列中的“U”被DNA中的“T”所替代。相似地，应理解当核酸是RNA时，DNA序列中的“T”被RNA中的“U”所替代。

用于核酸时，术语“互补”或“互补的”指沃森-克里克碱基配对。因此，C的互补物是G，G的互补物是C，A的互补物是T(或U)，T(或U)的互补物是A。也能使用诸如I(嘌呤肌苷)等碱基，例如与嘧啶(C或T)互补。

菌株和变体

可使用GI编号从NCTC 8325和/或Newman金黄色葡萄球菌菌株的公共序列数据库中容易地找到本文所述抗原的示例性氨基酸和核苷酸序列，上文仅用于举例，但本发明不限于NCTC 8325和Newman菌株的序列。可获得数种其他金黄色葡萄球菌菌株的基因组序列，包括MRSA菌株N315和Mu50[10]、MW2、N315、COL、MRSA252、MSSA476、RF122、USA300(剧毒)、JH1和JH9的基因组序列。可使用标准的搜索和比对技术在这些(或其他)基因组序列中鉴定来自Newman和NCTC 8325菌株的任意特定序列的同源物。而且，可使用可获得的来自Newman或NCTC 8325菌株的序列来设计引物以扩增来自其他菌株的同源序列。因此，本发明不限于这些两种菌株，而是可以包括来自其他金黄色葡萄球菌菌株的这类变体和同源物，以及非天然变体。通常，特定SEQ ID NO的合适变体包括其等位基因变体、其多态性形式、其同源物、其直向同源物、其旁系同源物、其突变体等，前提是其不含任何游离巯基。

因此，例如，与本文中的SEQ ID NO相比，本发明所用多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9个等)氨基酸取代，如保守取代(即用具有相关侧链的另一氨基酸取代某氨基酸)，前提是新的氨基酸残基不含游离巯基。本发明的多肽不含有任何半胱氨酸残基。遗传编码的氨基酸通常分为四类：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)无电荷极性，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、色氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起归类为芳族氨基酸。通常，这些家族内部的单个氨基酸的取代不会对生物活性产生重要影响。不可以使用半胱氨酸取代本发明的多肽。相对于SEQ ID NO序列，该多肽还可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)单个氨基酸的缺失。相对于SEQ ID NO序列，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9等)插入(如各1、2、3、4或5个氨基酸)，前提是插入的氨基酸残基不含任何游离巯基(例如插入的氨基酸不是半胱氨酸)。

类似地，本发明所用多肽可包含具有以下特征的氨基酸序列：

■与序列表公开的某一序列相同(即100％相同)；

■与序列表公开的某一序列具有序列相同性(如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；

■与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单个氨基酸改变(缺失、插入、取代)的序列，这些改变可以位于不同位置或连续出现；以及

■用逐对比对算法与序列表中的特定序列比对时，每个从N-末端向C-末端移动的x个氨基酸的窗口(使得在p(p＞x)个氨基酸上比对时，存在p-x+1个这种窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；如果x·y不是整数，则四舍五入至整数。优选的成对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[11]，使用默认参数(如缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[12]；

前提是多肽不含任何游离巯基。

使用杂交多肽时，杂交体内的单个抗原(即单个-X-部分)可来自一种或多种菌株。例如，当n＝2时，X₂可来自与X₁相同的菌株，或来自不同菌株。当n＝3时，该菌株可以是(i)X₁＝X₂＝X₃(ii)X₁＝X₂≠X₃(iii)X₁≠X₂＝X₃(iv)X₁≠X₂≠X₃或(v)X₁＝X₃≠X₂等。

在(c)组内，缺失或取代可在N末端和/或C末端，或者可以在两个末端之间。因此，截短是缺失的一个例子。截短可包括在N末端和/或C末端缺失多达40个(或更多个)氨基酸。N末端截短可移除前导肽，从而例如有利于在异源宿主中重组表达。C末端截短可移除锚定序列，从而例如有利于在异源宿主中重组表达。

通常，当抗原包含与来自序列表的完整金黄色葡萄球菌序列不同的序列时(例如，当它包含序列相同性＜100％的序列或包含其片段时)，在各种单独情况下，优选地，该抗原可引发抗体，该抗体识别相应的完整金黄色葡萄球菌序列。

与糖组合

本发明的免疫原性组合物还可包含糖抗原(例如，已知的糖抗原包括金黄色葡萄球菌的外泌多糖，其为聚-N-乙酰氨基葡萄糖(PNAG)，和金黄色葡萄球菌的荚膜糖，其可以来自例如5型、8型或336型)。在一些实施方式中，组合物不包含金黄色葡萄球菌糖抗原。

与非葡萄球菌抗原组合

本发明的免疫原性组合物还可包含非葡萄球菌抗原，特别是具有来自与医院感染相关的细菌的抗原。例如，该免疫原性组合物还可包含选自下组的一种或多种抗原：艰难梭菌(Clostridium difficile)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色念珠菌(Candida albicans)和肠外致病性大肠杆菌(Escherichia coli)。与本发明的葡萄球菌抗原联用的其他合适抗原列于参考文献13的第33-46页。

优选的组合物

在一些实施方式中，该组合物可包含一种或多种其他多肽。如果该组合物不包括一种或多种其他多肽，优选这些多肽不含任何游离巯基。优选地，所述其他多肽是葡萄球菌多肽，例如参考文献5中公开的金黄色葡萄球菌多肽。

当采用式(K)的TLR7激动剂时，本发明的组合物尤其有用。这些激动剂在参考文献14中有详细描述。

其中：

R¹是H、C₁-C₆烷基、-C(R⁵)₂OH、-L¹R⁵、-L¹R⁶、-L²R⁵、-L²R⁶、-OL²R⁵或-OL²R⁶；

L¹是-C(O)-或-O-；

L²是C₁-C₆亚烷基、C₂-C₆亚烯基、亚芳基、杂亚芳基或-((CR⁴R⁴)_pO)_q(CH₂)_p-，其中L²的C₁-C₆亚烷基和C₂-C₆亚烯基任选被1至4个氟基团取代；

各L³独立地选自C₁-C₆亚烷基和-((CR⁴R⁴)_pO)_q(CH₂)_p-，其中L³的C₁-C₆亚烷基可任选被1至4个氟基团取代；

L⁴是亚芳基或杂亚芳基；

R²是H或C₁-C₆烷基；

R³选自C₁-C₄烷基、-L³R⁵、-L¹R⁵、-L³R⁷、-L³L⁴L³R⁷、-L³L⁴R⁵、-L³L⁴L³R⁵、-OL³R⁵、-OL³R⁷、-OL³L⁴R⁷、-OL³L⁴L³R⁷、-OR⁸、-OL³L⁴R⁵、-OL³L⁴L³R³和-C(R⁵)₂OH；

各R⁴独立地选自H和氟；

R⁵是-P(O)(OR⁹)₂，

R⁶是-CF₂P(O)(OR⁹)₂或-C(O)OR¹⁰；

R⁷是-CF₂P(O)(OR⁹)₂或-C(O)OR¹⁰；

R⁸是H或C₁-C₄烷基；

各R⁹独立地选自H和C₁-C₆烷基；

R¹⁰是H或C₁-C₄烷基；

各p独立地选自1、2、3、4、5和6，以及

q是1、2、3或4。

式(K)的化合物优选是式(K′)：

其中：

P¹选自H、C₁-C₆烷基，其任选地被COOH和-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)取代；

P²选自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基和-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)；

前提是P¹和P²中至少一个是-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)；

R^B选自H和C₁-C₆烷基；

R^X和R^Y独立地选自H和C₁-C₆烷基；

X选自共价键、O和NH；

Y选自共价键、O、C(O)、S和NH；

L选自共价键C₁-C₆亚烷基、C₁-C₆亚烯基、亚芳基、杂亚芳基、C₁-C₆亚烷基氧基和-((CH₂)_pO)_q(CH₂)_p-，其各自任选地被1至4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、OH、C₁-C₄烷基、-OP(O)(OH)₂和-P(O)(OH)₂；

各p独立地选自1、2、3、4、5和6；以及

q选自1、2、3和4。

在式(K′)的一些实施方式中：P¹选自C₁-C₆烷基，其任选地被COOH和-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)取代；P²选自C₁-C₆烷氧基和-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)；R^B是C₁-C₆烷基；X是共价键；L选自C₁-C₆亚烷基和-((CH₂)_pO)_q(CH₂)_p-，其各自任选地被1至4个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、OH、C₁-C₄烷基、-OP(O)(OH)₂和-P(O)(OH)₂；各p独立地选自1、2和3；q选自1和2。

本发明所用的优选的式(K)的化合物是3-(5-氨基-2-(2-甲基-4-(2-(2-(2-膦酰乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯乙基)苯并[f][1，7]萘啶-8-基)丙酸，或化合物“K1”：

该化合物可以游离碱或药学上可接受的盐(如精氨酸盐)的形式使用。

可将式(K)的化合物与不溶性金属盐(优选铝盐，如氢氧化铝)混合，且该化合物通常吸附至金属盐。Sta006抗原(以及可选地，组合物中的其他抗原)也可吸附至金属盐。因此，优选的组合物包含(i)本文所限定的Sta006抗原、(ii)式(K)的TLR7激动剂(如式(K1))和(iii)不溶性金属盐(如氢氧化铝)。TLR7激动剂和Sta006抗原优选吸附至金属盐。

稳定化添加剂

在本发明的一些实施方式中，免疫原性组合物包含稳定化添加剂。这类添加剂包括但不限于：二价金属阳离子的螯合剂(如EDTA，乙二胺四乙酸)、糖(如二糖，如蔗糖或海藻糖)、糖醇(如甘露醇)、游离氨基酸(如精氨酸)、缓冲盐(如磷酸盐、柠檬酸盐)、多元醇(如甘油、甘露醇)或蛋白酶抑制剂。

EDTA是优选的添加剂。本发明的免疫原性组合物中EDTA的终浓度是约1-50mM、约1-10mM或约1-5mM，优选约2.5mM。

缓冲剂是另一种有用的添加剂，用于控制组合物的pH。这在冻干材料重建后特别重要。本发明的组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂或柠檬酸盐缓冲剂。优选磷酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般为5至20mM的范围。本发明的水性组合物的pH优选为5至8，例如5.5-6.5，或5.9-6.1，或pH为6。

糖或糖醇(或其混合物，例如甘露醇/蔗糖混合物)也是有用的，尤其是采用冻干时。合适的材料包括但不限于甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖等。特别优选使用蔗糖。这类材料可以约每单位体积1％(以重量计)的浓度存在，或每单位体积约3％至约6％(以重量计)，或最多每单位体积约10％或约12.5％(以重量计)，优选每单位体积约5％(以重量计)。

冻干

储存本发明的免疫原性组合物的一种方式是以冻干的形式储存。使用该方法时可以添加或不添加金属螯合剂(如EDTA)。发明人还证明，EDTA对于疫苗的热学特性没有显著影响，且不会引入任何不需要的增塑效应，因此表明可对含有EDTA的组合物进行冻干以进一步增强储存稳定性。

因此，通常本发明还提供了一种冻干物，其包含二价金属阳离子螯合剂(如EDTA)和至少一种抗原(如至少一种多肽抗原)。

本发明还提供了本发明的水性免疫原性组合物的冻干物。这可通过对本发明的水性组合物进行冻干来制备。随后可使用水性材料对其进行重建以提供本发明的水性免疫原性组合物。冻干的材料中存在的材料仍保留在冻干物中且因此也存在于重建后，例如缓冲盐、冻干保护剂(例如蔗糖和/或甘露醇)、螯合剂等。如果使用比冻干前小的体积的材料对材料进行重建，则这些材料会以更浓缩的形式存在。重建的冻干物优选含有冻干保护剂(例如蔗糖和/或甘露醇)，其浓度为最多每单位体积约2.5％(以重量计)，优选每单位体积约1％至约2％(以重量计)。理想情况下，冻干前组合物中存在的EDTA的量为至少0.75mM，且优选为至少2.5mM。最多可考虑50mM。

用于重建冻干物的液体材料包括但不限于：盐溶液(如生理盐水)、缓冲剂(如PBS)、水(如wfi)。其pH通常为4.5至7.5，例如6.8至7.2。重建的冻干物的pH优选为5-6.5，例如5.8-6.2，或5.9-6.1，或pH为6。用于重建的液体材料可包括佐剂，例如铝盐佐剂。佐剂的水性悬浮液(可选包括缓冲剂，如组氨酸缓冲剂)可用于同时重建和吸收冻干的多肽。在其他实施方式中，该液体材料不含佐剂。通常该冻干物不包含不溶性金属盐佐剂。

本发明还提供了包含EDTA和至少一种抗原的冻干物。

免疫原性组合物和药物

本发明免疫原性组合物可用作疫苗。本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但通常是预防性疫苗。

因此，组合物可以是药学上可接受的。除抗原外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献40。

组合物通常以水性形式给予哺乳动物。然而在给药前，该组合物可以是非水性形式。例如，虽然一些免疫原性组合物被制备成水性形式然后以水性形式填装、分配和给药，但其他免疫原性组合物在制备过程中被冻干，并在使用时重建成水性形式。因此，本发明组合物可以是经干燥的，例如冻干制剂。

当本发明的组合物包括一种以上多肽时，各不同多肽的质量可以是相同或不同的。理想情况下，它们可以基本相等的质量存在，即其各自的质量在全部多肽平均质量的±5％以内。在两种抗原以杂交多肽形式存在的实施方式中，杂交体被视为单个多肽以用于该目的。影响多价制剂中所包含多肽量的因素包括足以引发免疫应答的多肽量和引起(与本身或与其他多肽发生)聚集或影响其他多肽稳定性的量。通常，免疫原性组合物中的多肽质量为1-100μg。

该组合物可包含防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，该免疫原性组合物优选应基本不含(即含有小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选不含汞的组合物。特别优选不含防腐剂的组合物。

为了提高热稳定性，组合物可包含温度保护剂。这类试剂的更多详情如下所述。为了控制张力，优选包含生理盐(如钠盐)。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可以是1至20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。

组合物可含有一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂(尤其是含氢氧化铝佐剂时)或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般为5至20mM的范围。该缓冲剂优选是10mM磷酸钾。

该组合物的pH优选是约5至约8，且更优选是约5.5至约6.5，且最优选是约6。

该组合物优选是无菌的。该组合物优选是无热原的，如每剂量含有小于1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量小于0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即“多剂量”试剂盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，该组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。

人疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。

本发明的免疫原性组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。佐剂可包括TH1佐剂和/或TH2佐剂，详述见下。因此，该免疫原性组合物还可包含佐剂，如铝盐佐剂(例如一种或多种抗原可以吸附至铝盐)。更普遍地，在本发明的组合物中使用的佐剂包括但不限于已在参考文献5中列出的那些。这些包括含矿物质的佐剂和水包油乳液。

含矿物质的佐剂

含矿物质的佐剂包括矿物盐(如铝盐和钙盐或其混合物)。优选地，该组合物含有铝盐佐剂。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝等，所述盐取任何合适形式(如凝胶、晶体、无定形态等)。钙盐包括磷酸钙(如参考文献15公开的“CAP”颗粒)。优选吸附于这些盐(例如所有抗原可被吸附)。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[16]。

可采用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名字是常规的，但是为方便使用，不是现有的实际化学化合物的一个具体描述(如见参考文献17第9章)。本发明可使用广泛用作佐剂的“氢氧化物”或者“磷酸盐”的任何一个。称为“氢氧化铝”的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。称为“磷酸铝”的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。其可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。

氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的pI通常为约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力为每mg Al⁺⁺⁺1.8-2.6mg蛋白质。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al摩尔比通常为0.3-1.2，优选0.8-1.2，更优选0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形羟基磷酸铝，包含0.6mg Al³⁺/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微镜照片上观察到的板状形态)。任意抗原吸附后颗粒直径一般是0.1-10μm(如约0.1-5μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5mg蛋白质/mg Al⁺⁺⁺。

磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度逆相关，且这种取代程度可根据用于通过沉淀制备该盐的反应条件和反应物浓度而变化。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0至7.0，更优选为5至6.5，例如约为5.7。

用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以但不必定含有缓冲剂(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲剂)。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可含有氯化钠。

优选的铝盐佐剂是氢氧化铝佐剂。

本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝多于氢氧化铝，例如重量比为至少2∶1，例如，大于等于5∶1、大于等于6∶1、大于等于7∶1、大于等于8∶1、大于等于9∶1等。

给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如小于等于5mg/ml、小于等于4mg/ml、小于等于3mg/ml、小于等于2mg/ml、小于等于1mg/ml等。优选的范围是0.3至1mg/ml。优选最大值0.85mg/剂量。

矿物盐通常可具有吸附于其上的TLR激动剂，如TLR7激动剂(参见例如参考文献18)。吸附的TLR7激动剂通常是上文所述式(K)的化合物。

油和水乳液

在本发明中适用于作为佐剂的油乳液组合物包括水包油乳液，如MF59(参考文献17的第10章；也可参见参考文献19)和AS03。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

已知各种水包油乳液佐剂，且它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，该油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定的乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

该乳液可以包含如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。也可使用例如从霍霍巴豆中得到的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不是天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备。来源于哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是本文可使用的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，其是本文特别优选的。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可以使用油的混合物。

表面活性剂可以按其“HLB”(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB值为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EO/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如Tergitol^TM NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是适用的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂含量(重量百分比)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。

优选乳液佐剂的平均液滴大小为小于1μm，例如小于等于750nm、小于等于500nm、小于等于400nm、小于等于300nm、小于等于250nm、小于等于220nm、小于等于200nm或更小。可通过某些技术(如微流化)方便地获得这些液滴尺寸。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

●角鲨烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯的亚微米乳液。这三种组分可以10∶1∶1的体积比或39∶47∶47的重量比存在。该乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％去水山梨糖醇三油酸酯。以重量计，这些比率变为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％去水山梨糖醇三油酸酯。这种佐剂称为“MF59”[20-22]，参考文献23的第10章和参考文献24的第12章更详细地描述了该佐剂。该MF59乳液优选包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲剂。

●角鲨烯、生育酚和聚山梨酯80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％聚山梨酯80，且角鲨烯：生育酚的重量比优选小于等于1，因为这能使乳液更稳定。角鲨烯和聚山梨酯80可以约5∶2的体积比或者约11∶5的重量比存在。因此这三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80)可以1068∶1186∶485或约55∶61∶25的重量比存在。可通过以下方法制备一种这样的乳液(“AS03”)：将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0.5-10mg角鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[25]，例如，以上述比例。

●角鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸盐缓冲剂。

●含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括抗原中这些组分的任意贡献。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下文)。水相可包含磷酸盐缓冲剂。

●角鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“Pluronic^TM L121”)的乳液。该乳液可用pH7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与苏氨酰基-MDP一起用于“SAF-1”佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烯、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)中[26]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如在“AF”佐剂(5％角鲨烷、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)中[27]。优选微流体化。

●含有角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或“司盘80”)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)小于200nm[28]。该乳液也可含有一种或多种以下物质：糖醇、低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)和/或烷基糖苷。该乳液可包含TLR4激动剂[29]。这类乳液可以是冻干的。

●角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[30]。佐剂化的疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5％角鲨烯、4％泊洛沙姆-105(普流罗尼克(pluronic)多元醇)和2％Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。

●含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献31所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

●不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献32所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

●皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[33]。

●包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[34]。

●包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[34]。

在一些实施方式中，可在递送时临时将乳液与抗原混合，因此佐剂和抗原可分开保存在包装或分散的组合物中，以便在使用时配制成最终制剂。在其它实施方式中，在生产过程中将乳液与抗原混合，因此该组合物被包装成液体佐剂化形式。该抗原通常采用水溶液形式，从而最终通过混合两种液体来制备组合物。两种液体的混合体积比可变(例如5∶1至1∶5)，但通常为约1∶1。在上述具体乳液说明中给出组分浓度时，这些浓度通常用于未稀释的组合物，因此该浓度在混合抗原溶液后会降低。

当组合物包含生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。生育酚可取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。用于老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的组合物中宜包含生育酚，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答具有积极作用[35]。它们也具有抗氧化特性，这种特性有助于稳定该乳液[36]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，此种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。

特别优选使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂，且抗原通常吸附于这些盐。

本发明的组合物可引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。此种免疫应答优选诱导能在接触金黄色葡萄球菌时迅速作出应答的持续性(如中和性)抗体和细胞介导的免疫。

该免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答之一或全部两种。免疫应答优选提供增强的TH1应答和增强的TH2应答之一或全部两种。

增强的免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答之一或全部两种。该免疫应答优选提供增强的全身免疫应答和增强的粘膜免疫应答之一或全部两种。优选粘膜免疫应答为TH2免疫应答。粘膜免疫应答优选包括IgA生成增加。

金黄色葡萄球菌感染可影响机体的各个部分，因此可将本发明组合物制备成各种形式。例如，可将该组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体载剂的固体形式(如冻干的组合物或喷雾冻干的组合物)。该组合物可以制备成用于局部给药，例如油膏、乳膏或粉末。该组合物可制备成用于口服给药，如制备成片剂或胶囊、制备成喷雾剂或制备成糖浆剂(任选调味)。该组合物可制备成采用细粉或喷雾以经肺部(例如通过吸入器)给药。该组合物可制备为栓剂或子宫托。该组合物可以制备用于鼻部、耳部或眼部给药，例如作为滴剂。可将该组合物设计为试剂盒的形式，从而在临对患者给予之前重建合并的组合物。这种试剂盒可包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种冻干抗原。

临用前制备组合物(例如，以冻干形式提供组分时)并以试剂盒形式存在时，该试剂盒可包括两个药瓶，或者可包括一个填充好的注射器和一个药瓶，注射器内容物用于在注射前重激活药瓶内容物。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。“免疫有效量”是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(如非人灵长动物、灵长动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验确定的较宽范围内。组合物中包含一种以上抗原时，存在的两种抗原的剂量可以相同或不同。

如上所述，一种组合物可包含温度保护剂，此种组分可能在佐剂化组合物(特别是含有矿物质佐剂，如铝盐的组合物)中特别有用。如参考文献37所述，可将液体温度保护剂加入水性疫苗组合物中以降低其凝固点，例如将凝固点降低至0℃以下。因此该组合物可以储存于0℃以下但在其凝固点以上，以抑制热分解。温度保护剂也允许在冷冻组合物的同时保护矿物盐佐剂在冻融后不发生团聚或沉降，还可在较高温度下(例如40℃以上)保护组合物。可混合初始的水性疫苗与液体温度保护剂使液体温度保护剂占最终混合物体积的1-80％。合适的温度保护剂应该是对人给药安全的、易于混溶/可溶于水并且不应破坏组合物中其它成分(如抗原和佐剂)。示例包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适PEG的平均分子量可为200-20,000Da。在优选实施方式中，聚乙二醇的平均分子量可以约为300Da(“PEG-300”)。

治疗方法和疫苗的给予

本发明还提供了一种在哺乳动物中产生免疫应答的方法，该方法包括将本发明的组合物给予哺乳动物的步骤。该免疫应答优选为保护性免疫应答，并优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。该方法可以产生加强的应答。

响应根据本发明给予的多肽而产生的至少一些抗体应为保护性的。

本发明还提供了Sta006抗原的变体形式在生产用于在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的用途，前提是该变体不含任何游离巯基。也可涉及佐剂的使用。

通过这些应用和方法在哺乳动物中产生免疫应答，能保护该哺乳动物对抗金黄色葡萄球菌感染，包括医院感染。更具体地，可保护哺乳动物对抗皮肤感染、肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合症和/或败血症。

本发明还提供了包含第一组分和第二组分的试剂盒，其中第一组分和第二组分均不是上文所述的本发明的组合物，但可将第一组分和第二组分合并以提供上文所述的本发明的组合物。该试剂盒还可以包含含有下列一种或多种物质的第三组分：说明书、注射器或其它递送装置、佐剂或药学上可接受的制剂溶液。

本发明还提供了一种预填充本发明免疫原性组合物的递送装置。

该哺乳动物优选是人。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选为青少年或成人。旨在用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。通常可按照本发明进行免疫接种的其他哺乳动物是牛、狗、马和猪。

检测治疗性治疗的功效的一种方式包括在给予本发明的组合物后监测金黄色葡萄球菌感染。一种检查预防性治疗的功效的途径包括在给予组合物后监测针对本发明组合物中抗原的全身免疫应答(如监测IgG1和IgG2a产生水平)和/或粘膜免疫应答(如监测IgA产生水平)。通常，在免疫后但在攻击前测定抗原特异性血清抗体应答，而在免疫后和攻击后测定抗原特异性粘膜抗体应答。

另一种评价本发明组合物免疫原性的方式是重组表达蛋白，用于通过免疫印迹和/或微阵列筛查患者血清或粘膜分泌物。蛋白和患者样品之间的阳性反应表明患者已经产生针对受试蛋白的免疫应答。该方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或抗原中的表位。

通过用免疫原性组合物刺激金黄色葡萄球菌感染动物模型(如豚鼠或小鼠)可在体内测定免疫原性组合物的功效。具体地，有三种用于研究金黄色葡萄球菌感染疾病的有用的动物模型，即：(i)鼠脓肿模型[38]、(ii)鼠致死感染模型[38]和(iii)鼠肺炎模型[39]。脓肿模型观察静脉内刺激后小鼠肾脏的脓肿。致死感染模型观察由静脉内或腹膜内途径感染正常致死剂量的金黄色葡萄球菌后存活的小鼠数量。肺炎模型也观察存活率，但使用鼻内感染。有用的免疫原性组合物可对这些模型中的一种或多种有效。例如，对于一些临床情况，需要对抗肺炎而不需要阻止血液传播或促进调理作用，在其他情况中主要需要阻止血液转播。不同抗原和不同抗原组合可有利于有效的免疫原性组合物的不同方面。

本发明的组合物通常直接给予患者。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)，或通过粘膜，如通过直肠、口腔(如片剂、喷雾)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜给药途径完成直接递送。

本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。

增强的全身和/或粘膜免疫优选表现为提高的TH1和/或TH2免疫应答。增强的免疫应答优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA生成增加。

可通过单剂量方案或多剂量方案来进行给药。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各剂量，例如采用胃肠外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠外加强免疫等。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。

根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人患者可以不到1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(如大于等于50岁，大于等于60岁且优选大于等于65岁)、儿童(如小于等于5岁)、住院患者、保健护理人员、武装人员和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷的患者。然而该疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。

可将通过本发明生产的疫苗与其它疫苗基本同时给予患者(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)，例如与流感疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗等基本同时给予。适于共同给予的其他非葡萄球菌疫苗可包括列于参考文献13的第33-46页的一种或多种抗原。

概述

除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，参考文献40-47等。

上文使用“GI”编号。GI编号，或者“基因信息识别号(GenInfo Identifier)”，是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。

当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。这类表位可凭经验确定(例如，使用PEPSCAN[48，49]或类似方法)，或者可对其进行预测(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[50]、基于矩阵的方法[51]、MAPITOPE[52]、TEPITOPE[53，54]、神经网络[55]、OptiMer和EpiMer[56，57]、ADEPT[58]、T位点(Tsites)[59]、亲水性[60]、抗原性指数[61]或参考文献62-66公开的方法等)。表位是由抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并与之结合的抗原某部分，它们也称作“抗原决定簇”。

当抗原“结构域”被省略时，可以包括省略信号肽、胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域等。

术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x±10％。

两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献67的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献68中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。不同长度的两条序列之间的序列相同性百分数优选基于较长序列的长度进行计算。

本发明所用含磷佐剂可以多种质子化和去质子化形式存在，取决于周围环境的pH值，例如溶解它们的溶剂的pH值。因此，尽管可说明特定形式，但这些说明仅是代表性的并且不限于特定的质子化或去质子化形式。例如，在磷酸基的情况下，磷酸基被表示为-OP(O)(OH)₂，但是该定义包含可能在酸性条件下存在的质子化形式-[OP(O)(OH₂)(OH)]⁺和-[OP(O)(OH)₂]²⁺以及可能在碱性条件下存在的去质子化形式-[OP(O)(OH)(O)]^-和[OP(O)(O)₂]^2-。

化合物可以药学上可接受的盐的形式存在。因此，化合物(例如佐剂)可以其药学上可接受的盐(即生理或毒理上可耐受的盐)的形式使用，该盐在合适的时候包括药学上可接受的碱加成盐和药学上可接受的酸加成盐。

词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。

附图说明

图1显示了标准化的含半胱氨酸和半胱氨酸缺陷型Sta006抗原的解链曲线。

图2显示了在37℃储存4周后Sta006 Cys(-)抗原的尺寸排阻色谱(RP-HPLC)曲线。未经历储存条件的Sta006 Cys(-)抗原的RP-HPLC曲线用作对照。*表示在37℃储存4周后Sta006 Cys(-)抗原的附加峰。

图3显示了使用含Sta006 Cys(+)抗原或Sta006 Cys(-)抗原的疫苗免疫的CD1小鼠中的抗Sta006抗体效价。还显示了对照组的免疫原性数据。

具体实施方式

热变性试验

下文所述实验中使用的Sta006 Cys(+)抗原表示为SEQ ID NO：3，而Sta006 Cys(-)抗原表示为SEQ ID NO：6。两种抗原都是从大肠杆菌中纯化的重组蛋白。

通过差异扫描荧光测定(DSF)比较了Sta006含半胱氨酸Cys(+)抗原和Sta006半胱氨酸缺陷型Cys(-)抗原的热稳定性。在Strategen Mx3000p实时PCR仪器中在受控的条件下以1℃/分钟的温度变化速率加热含有抗原的样品(10μM，在PBS中)。使用染料SyproOrange5x，并监测荧光的变化。在10-100℃的温度范围中进行试验。

图1报道了所测试抗原的解链曲线。其显示，与Cys(+)抗原相比，Cys(-)抗原的峰略向顶部和左侧偏移。通过拟合实验曲线的一阶导数来测定解链温度(Tm)。Sta006 Cys(+)抗原的Tm是50.16℃，而Sta006 Cys(-)抗原的Tm是49.62℃。

因此，Sta006 Cys(-)抗原的热稳定性曲线与Sta006 Cys(+)抗原相当。通过删除或取代半胱氨酸残基对抗原进行的修饰没有对Sta006抗原的热稳定性产生显著影响。

纯化方法

Sta006 Cys(+)抗原的纯化步骤如下文所示。

1.裂解和澄清-细胞裂解和澄清；加入减少DNA、内毒素和蛋白杂质的絮凝剂(PEI)。

2.SPFF色谱-去除HCP和其他杂质。

3.氧化二聚化反应-氧化步骤。

4.cHT色谱-去除HCP和其他残留杂质并从二聚体中分离单体。

5.最后的10kDa透析-在最终缓冲液中透析。

为纯化Sta006 Cys(-)，不再需要氧化二聚化反应步骤，因为抗原可以单体的方式进行纯化。还可简化cHT色谱步骤，因为不再需要从二聚体中分离单体。

测定了由上文所述方法获得的Sta006Cys(-)和Cys(+)抗原的纯度和产量，结果如表1所示。使用检测器PDA 214nm测定纯度。通过总蛋白(mBCA含量(mg/ml))x纯度(RPC(％)214nm)计算产量。

表1：Cys(-)和Cys(+)抗原的纯度和产量

纯化的Sta006 Cys(-)抗原具有与Sta006 Cys(+)抗原相当的纯度和产量。分析组(analytical panel)与内部说明书限制(in-house specification limit)相符。删除半胱氨酸使得Sta006抗原的纯化过程具有更高的灵活性。还可对纯化过程进行优化以提高纯度和产量。

稳定性评价

对基于参考文献5公开内容的疫苗组合中Sta006 Cys(-)抗原的稳定性进行了研究。抗原以72μg/mL的浓度存在。疫苗组合暴露于以下温度：2-8℃、15℃、25℃和37℃，持续0至4周。测试的最高温度(37℃)低于Sta006 Cys(-)抗原的Tm(约50℃)。因此，由蛋白解折叠驱动的蛋白不稳定不是该实验中的影响因素。

使用RP-HPLC对样品进行分析，还分析了pH和渗透压(在各温度和时间点上在3个不同药瓶中进行3次测定)。渗透压和pH随时间变化保持恒定并在可接受的范围内。在2-8℃、15℃和25℃下储存4周后Sta006 Cys(-)抗原是稳定的。然而，在37℃下储存4周后，出现了20-30％的抗原损失。图2显示了在37℃下储存4周后Sta006 Cys(-)抗原的SEC曲线，其具有小的附加峰(*)，表明存在降解产物。附加峰的面积占总面积的2.9％。因此，在2-8℃、15℃和25℃下储存最多4周后Sta006 Cys(-)抗原仍是稳定的。

还评估了含氢氧化铝佐剂的Sta006 Cys(-)的稳定性。观察到Sta006 Cys(-)抗原完全吸附在铝盐上，吸附率超过96％。在任何测试条件下解吸样品中均未出现附加峰。对于解吸，25℃使用300mM KH₂PO₄pH 6.8过夜处理样品。在所有时间点上使用相同条件处理样品(假定：没有制剂老化的影响)。

小鼠中的免疫原性研究

将Sta006 Cys(+)抗原的免疫原性与Sta006 Cys(-)抗原比较。抗原用于基于参考文献5公开内容的组合。

以14天的间隔使用疫苗进行初免-加强注射腹膜内免疫5周龄的CD1小鼠。在临首次免疫前和其后23天时对动物进行取血，使用Luminex技术检测血清中针对纯化的蛋白的IgG抗体。测试读取值是对荧光强度的测量，表示为任意相对Luminex单位(RLU/mL)。

图3报道了免疫后小鼠的抗体效价。Sta006抗原的抗体效价在Sta006含半胱氨酸Cys(+)抗原和Sta006半胱氨酸缺陷型Cys(-)变体之间没有显著差别。

在进一步研究中，比较了含有Sta006 Cys(-)和Sta006 Cys(+)抗原的单价疫苗。使用氢氧化铝作为疫苗的佐剂。各疫苗含有30μg的抗原和2mg/ml的氢氧化铝。

对16只CD1小鼠(5周龄)进行三次皮下免疫(在t＝0、14和28天时)。在临首次免疫前和首次免疫后13、27和42天时对动物进行取血。使用Luminex技术检测血清中针对纯化的蛋白的IgG抗体。测试读取值是对荧光强度的测量，表示为任意相对Luminex单位(RLU/mL)。

研究发现，含有相应Cys(-)和Cys(+)抗原的单价疫苗特异性引发抗体。单价Sta006 Cys(-)和Sta006 Cys(+)疫苗之间没有显著差异。

应理解，仅以实施例的方式描述了本发明，对之进行的修改仍在本发明的范围和精神内。

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[68]Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489.

序列表

<110> 诺华股份有限公司（Novartis AG）

<120> 用于针对金黄色葡萄球菌的免疫的稳定化的蛋白质

<130> PAT055151-WO-PCT

<140> PCT/EP2013/

<141> 2013-08-29

<150> US61/695,723

<151> 2012-08-31

<160> 7

<170> SeqWin2010, version 1.0

<210> 1

<211> 302

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）

<400> 1

Met Lys Lys Leu Leu Leu Pro Leu Ile Ile Met Leu Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Ala Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser

20 25 30

Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys

35 40 45

Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu

50 55 60

Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val

65 70 75 80

Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val

85 90 95

Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr

100 105 110

Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val

115 120 125

Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys

130 135 140

Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu

145 150 155 160

Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln

165 170 175

Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr

180 185 190

Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe

195 200 205

Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly

210 215 220

Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp Tyr

225 230 235 240

Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr

245 250 255

Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys

260 265 270

Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe

275 280 285

Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys

290 295 300

<210> 2

<211> 285

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 2

Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser Tyr

1 5 10 15

Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys Arg

20 25 30

Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly

35 40 45

Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val Glu

65 70 75 80

Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr Asp

85 90 95

Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val Asp

100 105 110

Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys Ile

115 120 125

Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu Glu

130 135 140

Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln Asp

145 150 155 160

Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr Tyr

165 170 175

Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe Gly

180 185 190

Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly Trp

195 200 205

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210 215 220

Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr Asn

225 230 235 240

Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys Val

245 250 255

Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe Met

260 265 270

Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys

275 280 285

<210> 3

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌蛋白变体

<400> 3

Met Ala Ser Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr

1 5 10 15

Lys Ser Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp

20 25 30

Pro Lys Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys

35 40 45

Lys Leu Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser

50 55 60

Lys Val Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly

65 70 75 80

Asp Val Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr

85 90 95

Ser Thr Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val

100 105 110

Val Val Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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Ala Phe Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys

195 200 205

Ala Gly Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly

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Val Lys Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu

260 265 270

Asp Phe Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys

275 280 285

<210> 4

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌蛋白变体

<400> 4

Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser Tyr Lys

1 5 10 15

Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys Arg Ile

20 25 30

Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Ala

35 40 45

Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val Leu Lys

50 55 60

Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val Glu Lys

65 70 75 80

Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr Asp Lys

85 90 95

Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val Asp Tyr

100 105 110

Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys Ile Val

115 120 125

Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu Glu Thr

130 135 140

Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln Asp Ala

145 150 155 160

Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr Tyr Gly

165 170 175

Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe Gly Leu

180 185 190

Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly Trp Ala

195 200 205

Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp Tyr Ile Val

210 215 220

Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr Asn Met

225 230 235 240

Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys Val Asp

245 250 255

Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe Met Arg

260 265 270

Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys

275 280

<210> 5

<211> 285

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌蛋白变体

<220>

<221> Xaa

<222> 1

<223> 不含游离巯基的任何氨基酸。

<400> 5

Xaa Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser Tyr

1 5 10 15

Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys Arg

20 25 30

Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly

35 40 45

Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val Glu

65 70 75 80

Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr Asp

85 90 95

Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val Asp

100 105 110

Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys Ile

115 120 125

Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu Glu

130 135 140

Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln Asp

145 150 155 160

Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr Tyr

165 170 175

Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe Gly

180 185 190

Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly Trp

195 200 205

Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp Tyr Ile

210 215 220

Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr Asn

225 230 235 240

Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys Val

245 250 255

Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe Met

260 265 270

Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys

275 280 285

<210> 6

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌蛋白变体

<400> 6

Met Ala Ser Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys

1 5 10 15

Ser Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro

20 25 30

Lys Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys

35 40 45

Leu Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys

50 55 60

Val Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp

65 70 75 80

Val Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser

85 90 95

Thr Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val

100 105 110

Val Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly

115 120 125

Lys Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp

130 135 140

Glu Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly

145 150 155 160

Gln Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr

165 170 175

Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala

180 185 190

Phe Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala

195 200 205

Gly Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp

210 215 220

Tyr Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser

225 230 235 240

Thr Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val

245 250 255

Lys Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp

260 265 270

Phe Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys

275 280 285

<210> 7

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌蛋白变体

<220>

<221> Xaa

<222> 4

<223> 不含游离巯基的任何氨基酸。

<400> 7

Met Ala Ser Xaa Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr

1 5 10 15

Lys Ser Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp

20 25 30

Pro Lys Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys

35 40 45

Lys Leu Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser

50 55 60

Lys Val Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly

65 70 75 80

Asp Val Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr

85 90 95

Ser Thr Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val

100 105 110

Val Val Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu

115 120 125

Gly Lys Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp

130 135 140

Trp Glu Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile

145 150 155 160

Gly Gln Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu

165 170 175

Tyr Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln

180 185 190

Ala Phe Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys

195 200 205

Ala Gly Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly

210 215 220

Asp Tyr Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu

225 230 235 240

Ser Thr Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile

245 250 255

Val Lys Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu

260 265 270

Asp Phe Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys

275 280 285

Claims (16)

1.一种多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：4具有至少90％相同性所述多肽不含游离巯基且能够引发识别SEQ ID NO：2的抗体。

2.一种杂交蛋白，包含权利要求1所述多肽。

3.一种核酸分子，包含编码前述权利要求中任一项所述多肽或权利要求2所述杂交蛋白的核苷酸序列。

4.一种载体，包含前述权利要求中任一项所述核酸分子。

5.一种宿主细胞，包含前述权利要求中任一项所述核酸分子或权利要求4所述载体。

6.一种用于制备前述权利要求中任一项所述多肽或权利要求3所述杂交蛋白的方法，所述方法包括在表达所述蛋白的条件下培养权利要求5所述宿主细胞并回收由此产生的所述蛋白。

7.一种免疫原性组合物，包含前述权利要求中任一项所述多肽。

8.如权利要求7所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含一种或多种以下物质的偶联物：(i)金黄色葡萄球菌外泌多糖和(ii)运载体蛋白。

9.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含一种或多种以下物质的偶联物：(i)金黄色葡萄球菌荚膜多糖和(ii)运载体蛋白。

10.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含佐剂(如氢氧化铝佐剂)和/或糖(如蔗糖)。

11.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含稳定化添加剂。

12.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其为冻干形式。

13.如权利要求7-11中任一项所述的免疫原性组合物，其为水性形式。

14.一种用于制备权利要求13所述组合物的方法，所述方法通过使用水性材料重建权利要求12所述的组合物。

15.一种药物组合物，包含前述权利要求中任一项所述多肽或免疫原性组合物。

16.一种在哺乳动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的前述权利要求中任一项所述多肽或组合物的步骤。