JPS624300A - 改良型ヒトガンマインタ−フエロンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野］ 本発明は新規で効力の高い改良型ヒトガンマインターフ
ェロンに係る。

［従来技術］ ヒトガンマインターフェロン（以下ＩＦＮ−γ）は既に
均質な物質として生産されており、治療適用上の有用性
が示されている。この物質をより深く理解するために、
またその実体と作用モードを更に明瞭にするために研究
が続けられている。たとえばグレイ（Ｇ　ｒａｙ）らは
、ネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、第２９５巻、第５０
３頁（１９８２年）において組換えＤＮＡ技術を用いた
研究の結果得られたＩＦＮ−γについて記載している。

この論文に記載されている１つのＩ　ＦＮ−γは、１４
６個のアミノ酸がぎちんと配列されたポリペプチドと説
明されていた。

特開昭５８−９０５１４号公報にはＩＦＮ−γ（この公
報中では当時採用されていたようにヒト免疫インターフ
ェロンといわれている）に関する同様な記載がある。こ
れは、上記公報の第５図に示されているような一定の配
列中に１４６個のアミノ酸を有するＩＦＮ−γの他に、
活性の点では変わらない対立変異（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖ
ａｒｉａｔｉｏｎｓ）を含む他の分子やその他の誘導体
を包含している。

［解決すべぎ問題点］ 上述のヒトガンマインターフェロン種は一般に生物学的
活性が高いとはいうものの、より高い生物学的活性とと
もにさらに向上した安定性を有するヒトガンマインター
フェロン種を取得することが望まれている。したがって
本発明の目的は、安定性が改良されかつ生物学的活性が
高められたＩ　ＦＮ−−γを取得することである。

［問題を解決するための手段］ 本発明は、スルホ化されているかまたは別の方法で酸化
されているシスティン残基を有するヒトガンマインター
フェロン種、ならびにこのような種を製造する方法およ
びこれにイ４随する全ての態様に関する。

本明細吉中で使用する［ヒトガンマインターフェロン種
］という用語は、本来ヒト組織中に存在するＩＦＮ−γ
（の活性部分）に活性の点で相当する生物活性形態のヒ
トガンマインターフェロン類を意味する。個体間には天
然の（対立）変異が起こりまた実際に存在するというこ
とは理解されよう。このような変異は、全配列中のアミ
ノ酸（複数のこともある）の相違、またはこの配列中の
アミノＦ１！（複数のこともある）の欠失、＠換。

挿入、逆位もしくは付加として現われるであろう。

また、グリコジル化の位置と程度は、これらの種を製造
する際に選択した出発化合物の性質に依存するであろう
。組換えＤＮＡ技術を使用すると、たとえば基本ＤＮＡ
の変異誘発をｌ指した部位で１個または複数個のアミノ
酸を置換、欠失、付加または交換することによって様々
に改造した各種ヒトガンマインターフェロン誘導体の製
造が可能である。

本発明の改良型ヒトガンマインターフェロンを好ましく
製造するにはシステイン残基を有するＩＦＮ−−γをス
ルホ化またはその他の方法で酸化する。原料となるシス
ティンを含有するヒトガンマインターフェロン種は、た
とえば前記のグレイ（Ｇ　ｒａｙ）らによる文献（特開
昭５８−９０５１４号公報）やリンダークネヒト（Ｒ１
ｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ）らのジャーナル　オブ　バイオ
ロジカル　°ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｌｏａｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５９
巻、第６７９０頁（１９８４年）に記載されているよう
にして製造される。このＩ　Ｆ　Ｎ　−γに含まれてい
るシステイン残基を種々の可能な割合と程度にスルホ化
または他の方法で酸化する。

Ｎ−末端領域に存在するシステイン残基をスルホ化する
のが好ましい。「Ｎ−末端領域」という用語はある所与
のガンマインターフェロンポリペプチドの最初のアミ・
ノ酸数個を含む広い意味を有し、特に、前記のネイチャ
ー（Ｎ　ａｔｕｒｃ）の論文や特許出願公開公報に記載
されている特定種の第１アミノ酸と第３アミノ酸をさす
。これらの刊行物中でＩＦＮ−γは第１番目と第３番目
にシスティン残基を有づるものと記載されている。しか
し、ＩＦＮ−γの上述したような対立変異やその他の誘
導体の骨格ペプチド鎖に沿って上記とは別の位置に存在
し得るシスティン残基をスルホ化または他の方法で酸化
することら本発明の範囲内である。

言い換えると、前述のようなく対立）変異型やグリコジ
ル化型のスルホ化誘導体またはその伯の酸化誘導体およ
び種々の改変によって生成するヒトガンマインターフェ
ロン１９体は全て、これらが「ヒトガンマインターフェ
ロン種」の定義に入りかつ活性の点で天然のヒトガンマ
インターフェロン類の特徴を有する限り本発明の範囲内
に包含される。

スルホ化システィン残基（システィン残基の−Ｓ　Ｈが
−５−ｓｏ５になっている）を有する改良型ヒトガンマ
インターフェロンのうち最も好ましいのは添付の第１図
に示した化学式をもつものである。この改良型（以下「
完全配列」という）は１４６個のアミノ酸を有している
。しかし、安定性と生物学的活性が実質的に保持される
限り、この完全配列のＣ−末端領域に存在するアミノ酸
残基を１個以上欠失させることができる。変異の別のタ
イプは置換であり、これも本発明の範囲内である。すな
わち、完全配列のアミノ酸１個以上を別のアミノ酸で置
換することができる。このような置換の１例は第９番目
のＬＹＳをＧＬＮに置換したものである。また、本発明
の改良型ヒトガンマインターフェロンはＮ−末端にメチ
オニン残基がついていてもよい。このように、本発明の
改良型ヒトガン、マインターフェロンは約１４６個のア
ミノ酸を有するのが好ましい。

システィン残基のスルホ化または他の酸化は公知の方法
に従って行なわれる。これらの方法はたとえば次の文献
に示されている。Ｃ，Ｈ。

Ｗ、ハース（Ｈｉｒｅ）編、メソツズ　イン　エンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｗｏｌｏ
ｇｙ）、第ＸＩ巻、エンザイム　ストラフチャ−（Ｅ　
ｎｚｙｍｅＳ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ）、特に第２０６〜２
０８頁、アカデミツクブレス社（Ａ　ｃａｄｅｎｉｃ　
Ｐ　ｒｅｓｓ、　ニュー　３−り）刊。

１９６７年；Ｇ、Ｅ、ミーンズ（Ｍ　ｅａｎｓ）および
ＲｏＥ、フィーネイ（Ｆ　ｅｅｎｅｙ）編、り゛ミカル
　モディフィケーション　オブ　プロテインズ（Ｃｈｅ
ｍｉ−ｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　　ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）、特に第１４９〜１７４頁、ホールデ
ツーデイ社（Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄ　ａＶ。

）ｎｃ、、ザンフランシスコ）刊、　１９７１年：Ｊ、
Ｌ。

ペイ！Ｊ　−（Ｂａｉｌｙ）およびＲ，Ｄ、　コール（
Ｃｏｌｅ）、ジャーナル　オブ　バイオロジカルケミス
トリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、）　、第２３
４巻、第１７３３頁（１９５９年＞　：Ｗ、Ｗ、Ｃ，チ
ャン（Ｃｈａｎ）、バイオケミストリー（１３１０ｃｈ
ｅｌｌｌｉｓｔｒｌ／）。

第７巻、第４２４７頁（１９６８年）。

従来システィン残基はジスルフィド架橋を介して所与の
ポリペプチドの立体構造の決定に密接に関与するのが最
も普遍的であり、このような三次構造が生物学的活性に
基本的な関連暮有すると信じられていたことに反して驚
くべきことに、前記スルホ化または他の酸化型ヒトガン
マインターフェロン種は高い生物学的活性と安定性を示
すことが発見されたのである。すなわら本発明は、スル
ホ化その他の酸化中心で首ぎ賛えることによって上記の
予想されるジスルフィド架橋が形成しないようにされて
いる新規な改良型ヒトガンマインターフェロン種を提供
する。

したがって本発明は、基本的な−・面で改良型ヒトガン
マインターフェロン種そのものに関する。

更に本発明は、抗ウィルスまたは抗腫瘍活性のように本
発明の種が特に有用性を示す生物学的効果を必要として
いる宿主に投与するのに適した組成物中に配合された前
記種に関する。

以下に本発明の改良型ヒトガンマインターフエ［１ンを
製造する際の好ましい手順の１例を記載する。以下の手
順Ｊ３よび後述の実施例では本発明のヒトガンマインタ
ーフェロン種を製造するのに大Ｉ！菌（旦、亜旦）宿主
培養系を使用する。しかし、他の真核および原核細胞も
同様に本発明の方法に適している。

Ａ、ＩＦＮ−ｍＲＮＡの ヒト供血者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を白血球泳動法
（Ｉｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって採取した。

フィコール−ハイバック（Ｆ　１ｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａ
ｑｕｅ）勾配遠心によってＰＢＬを更に精製し、次いで
ＲＰＭ　Ｉ　１６４０．　１％Ｌ−グルタミン、　２５
１ＭＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン
溶液（ギブコ社（Ｇ　１ｂｃｏ）、グランドアイランド
（Ｇｒａｎｄ　　Ｉ　５ｔａｎｄ　）、ニュー３−り）
中５ｘ　１０６コ／ｄの濃度で培養した。ブドウ球菌 （５ｔａｐｈｙ＋ｏｃｏｃｃｕｓ）のエンテロトキシン
Ｂ（ＩＩＪ！Ｉ／ＩＩＩＩｌりをマイトジェンとしてこ
れらの細胞を誘発してＩＦＮ−γを産生させ、５％Ｃｏ
２中３７℃で２４〜４８時間培養した。培養したＰＢＬ
にデスアセチルサイモシン−α−１（０，１埒／ｍｅ）
を添加してＩＦＮ−γ活性の相対収量を増大させた。

Ｂ、メツセンジャーＲＮ　　の 培養したＰＢＬからほぼバージｔ　−（Ｂ　ｅｒａｅｒ
）。

Ｓ、Ｌ、ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ
ｓ−ｔｒｙ）、第１８巻、第５１４３頁（１９７９年）
に記載のようにして全ＲＮＡを抽出した。細胞を遠心分
離によってペレットにし、その後１０１Ｍ　　ＮａＣ１
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ）　　（１）Ｈ７，５
）、　１．５　ｎ＋ＭＭ（ｌ　Ｃ；１２および１０　ｍ
Ｍリボヌクレオシドバナジル複合体中に再度懸濁した。

ＮＰ−４０を添加（最終濃度１％）して細胞を溶解し、
遠心して核をベレットにした。上清に含まれている全Ｒ
ＮＡを多数回のフェノールおよびクロロホルム抽出によ
って更に精製した。水相のＮａＣ１１０＋良を０．２Ｍ
にし、次いで２倍容のエタノールを添加して全ＲＮＡを
沈澱させた。同じ方法で未誘発の（刺激していない）培
養物からＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ調製物からｌｌｌ
ＲＮＡを精製するにはオリゴ−ｄＴセルロースクロマト
グラフィーを用いた。

典型的な場合の収量は、培養したＰＢｌ　１〜２１につ
き全ＲＮＡが５〜１０ｍｇ、ポリ（△）＋ＲＮＡが５０
〜２００埒であった。

Ｃ，ｍＲＮＡのザイズ分画 ｍＲＮΔＲＮＡを分画するには２種類の方法を用いた。

これらの方法は（−緒にではなく）別々に用いた。どち
らの方法でもＩＦＮ−γｉＲＮ　Ａがかなり濃縮された
。

変性剤としてホルムアミドを存在させたショ糖密度勾配
遠心法を用いてＩＩＩＲＮ　Ａを分画した。７０％ホル
ムアミド中の５％→２５％のショ糖密度勾配を１５４，
０ＯＯＸ　Ｑ　、　２０℃で１９時間遠心した。次いで
連続画分（０，５ｄ）を勾配頂部からとり、エタノ−、
ルで沈澱させ、−・部をアフリカッメガエル（及肚並ｕ
ｓ　　１ａｅｖｉｓ）卵母ｌｌｌ胞に注入してｍＲＮ　
Ａを翻訳させた。室温で２４時間経過侵、水庖口内炎ウ
ィルス（インディアナ株）またはＷＩＳＨ（ヒト羊膜）
細胞に対する脳心筋炎ウィルス（ただしザンブルはウィ
ルスに感染する前（４時間の代わりに）２４時間ＷＩＳ
Ｈ細胞と共にインキユベートした）を用いる標準的な細
胞変性効果阻害アッセイによってインキュベーション培
地の抗ウィルス活性を検定した。シ］糖密度勾配で分画
したＲＮＡに２つの活性ピークが一様に観察された。一
方のピークは１２８と計算される。サイズで沈降し、注
入したＲＮＡＩ／１９につぎ（ＩＦＮ−α標品に比較し
て）１００〜４００単位／ｄ！の抗ウィルス活性を有し
ていた。他方の活性ピークは１６８のサイズで沈降し、
ゆっくり沈降する方のピークの活性のほぼ半分を有して
いた。これらの活性ピークはいずれもＩ　ＦＮ−γに起
因するものと思われる。というのは、同じ画分をＩＦＮ
−γによって保護されないウシの細胞株（ＭＤＢＫ＞で
検定すると活性が全くみられなかったからである。

このＭＤＢＫアッセイではＩ　ＦＮ−α活性もＩＦＮ−
β活性も容易に検出されるはずである。

一方、酸尿素アガロースゲル電気泳動法でも１＋ｌＲＮ
　Ａ　（２００埒）の分画を行なった。スラブアガロー
スゲルは１．７５％アガＯ−ス、　　０．０２５Ｍクエ
ン酸プ川・リ用ム、　　ｐｌ−１３，８，および６Ｍ尿
素で構成した。電気泳動は２５ｎ＋Ａ、４℃で７時間行
なった。次いでカミソリの刃でゲルを分割した。各々の
切片を１０℃で融解し、フェノールで２回、クロロホル
ムで１回抽出した。次に画分をエタノールで沈澱させ、
その後アフリカッメガエル（反吐匹Ｂｌａｅｖｉｓ）卵
母ｌ１１１１ニ注入して１ＦＮ−γｍＲＮ　Ａと抗ウィ
ルス活性を検定した。ゲル　゛分画したサンプルでは活
性ピークが１つだりみられた。このピークは１８Ｓ　　
ＲＮＡと共に移動し、注入したＲＮＡ１埒当り６００単
位／−の活性を有していた。この活性もＭＤＢＫ細胞を
保護しなかったためＩＦＮ−γに特異的であると思われ
た。

ショ糖密度勾配でみられた活性ピーク（１２Ｓと１６８
）と酸尿素ゲルでみられた活性ピーク（１８Ｓ）の間の
サイズの相違は、これら個々の分画方法が完全な変性条
件下では実施されないという観察によって説明し得る。

Ｄ、ＩＦＮ−を　−るコロニー−− ゲル分画したｍＲＮ　Ａを３埒用いて標準的手法によっ
て二？１ａｃＤＮＡを調製した。このｃＤ　Ｎ　Ａを６
％ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画した。２つの
サイズ画分、すなわち８００〜１５００ｂｐ（１３８ｎ
ａ）と＞　１５００ｂＤ　（２０４ｎＯ）が電気溶出さ
れた。各サイズのｃＤ　Ｎ　Ａの−・部（３５Ｐｇ）に
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
を用いてデオキシＣ残塁をつなぎ、同様に処理してｐｓ
Ｂ部位にデオキシＧＶＪＬ基をつないであるプラスミド
ｌ）Ｂ　Ｒ３２２（３００ｎＱ）と共にアニールした。

次にアニールした各混合物を用いて大腸菌（Ｅ。

止具）Ｋ１２株２９４を形質転換した。８００〜１５０
０ｂｐｃＤ　Ｎ　Ａでは約ａｏｏｏ個、　＞　１５００
ｂｐ　ｃＤ　Ｎ　Ａでは４００個の形質転換体が得られ
た。

Ｅ、　　　Ｃに　するコロニーライブラリーＬＢ＋５埒
／ｄテトラサイクリンを含有するマイクロタイタープレ
ートのウェルにコロニーを別々に接種し、ＤＭＳＯを７
％まで添加した後−２０℃で保存した。コロニーライブ
ラリーの２種のコピーをニトロセルロースフィルター上
で堵殖させ、各コロニーから得られるＤＮＡをグルンス
タイツーホグネス（Ｇ　ｒｕｎｓｔｅｉｎ　−）−１ｏ
ｇｎｅｓｓ）法によってフィルターに固定した。

誘発したＰ　Ｂ　Ｌの培倦物と誘発しなかったＰＢＬの
培養物からゲル分画した１８８のサイズの―ＲＮＡを用
いて３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブを調製した。オリゴ
”　１２−１８をブライマーとし、既にゲデル（Ｇ　ｏ
ｅｄｄｅ　Ｉ　）らによりネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｃ
）、第２８７巻、第４１１頁（１９８０年）に記載され
ている反応条件を用いた。カットサイズが６００〜１５
００ｂｐのｃＤ　Ｎ　Ａから得た形質転換体８０００個
とカットサイズが＞　１５００ｂｐのＣＤＮＡから得た
形質転換体４００個とを含むフィルターを２０×１０６
ｃｐ識の誘発３２Ｐ−ＣＤＮＡとハイブリダイズさせた
。別の−・組のフィルターを２０Ｘ　１０６ｃｏＩｌｌ
の非誘発３２Ｐ−ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。ハ
イブリダイゼーションはフリツチュ（Ｆｒ１ｔ３ｃｈ）
らがレル（Ｃｅｌ＋）、第１９巻、第９５９頁（１９８
０年）に記載している条件を用いて１６時間行なった。

フィルターをよく洗浄した後、デュポン社のライトニン
グ−プラス（Ｄｕ　ｐｏｎｔ　Ｌ　１ｏｈｔｎｉｎ（１
−Ｐ　Ｉｕｓ　）増感スクリーンを密着したコダック社
（Ｋｏｄａｋ）のＸＲ−５Ｘ線フイルムに１６〜４８時
間露出した。

各コロニーの２種のブＯ−ブとのハイブリダイゼーショ
ンパターンを比較した。コロニーの約４０％は明らかに
両方のプローブとハイブリダイズしたが、コロニーの約
５０％は一方のプローブとはハイブリダイズしなかった
。１２４個のコロニーが誘発プローブと有意にハイブリ
ダイズしたが非誘発プローブとは検出できない程弱い反
応しか示さなかった。これらのコロニーをそれぞれ別々
にマイクロタイタープレートのウェルに接種し、増殖さ
せてニトロセルロースフィルターに移し、上記と同じ２
種のプローブとハイブリダイズさせた。また、これらの
コロニーの各々から単離したプラスミドＤＮＡもニトロ
セルロースフィルターに固定して誘発プローブおよび非
誘発ブＯ−ブにハイブリダイズさせた。２２個のコロニ
ーから得たＤＮＡが誘発プローブだけとハイブリダイズ
した。これを「誘発」コロニーと名付けた。

Ｆ、誘　コロニーの　　゛ ５個の誘発コロニーからプラスミドＤＮＡを調製してＣ
Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物の特外決定に用いた。５個の誘発プラ
スミド（Ｄ６７、　ｐ６８．　ｐ６９．　ｐ７１　、　
ｐ７２）の制限エンドヌクレアーゼマツピングによると
、このうちの４個が同様な制限ヌクレアーゼンツブを有
すると思われた。これら４個（ｐ６７、ｐ６９．ｐ７１
．ｐ７２）の各々がそのｃＤ　Ｎ　Ａ挿入物中に［）ｄ
ｅ１部位を４個。

ＨｉｎｆＩ部位を２個、ｌ’（ｓａ１部位を１個有して
いた。第５番目のプラスミド（１）６８）は共通のＤｄ
（３Ｉ断片を含有しており、他の４個に比べて短いｃＤ
　Ｎ　Ａクローンであると思われた。制限ヌクレアーゼ
マツピングで示唆された相同性はハイブリダイゼーショ
ンで一確認された。プラスミドｐ６７のｅｏｏｂｐ堕Ｉ
断片から３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブを調製して他の誘
発コロニーのハイブリダイゼーションに使用した。前記
の制限フタレアーゼでマツピングしたコロニーは５個全
てがこのプローブとクロスハイブリダイズし、誘発／　
ＪＩ　Ｍ発スクリーニングで選択した１２４個のコロニ
ーのうちの他の１７個も同様に反応した。これらクロス
ハイブリダイズするプラスミドの各々に含まれるｃＤ　
Ｎ　Ａ挿入物の長さをｐｓｔ■消化とゲル電気泳動によ
って決定した。

後に詳述するように３種の別々の発現系で抗ウィルス活
性を示す発現産物が産生されたことによって、ｐ６７が
含むｃＤ　Ｎ　Ａ挿入物はＩＦＮ・−γｃＤ　Ｎ　Ａで
あることが示された。

Ｇ、　　ＩＦＮ　−の　　　　　　　Ｅ、ｃｏｌｉプラ
スミドｐ６７５０埒をＪ２ｎＩで消化し、６％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により１２５０ｂｌ）の挿入物
を単離した。この挿入物的１０ｐ３をゲルから電気溶出
した。このＪ２ｎＩ断片５Ｊｉ９を３単位のＢＳｔＮＩ
（ベテスダリサーチラボ（３ｅｔｂｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ　ＬａｂＳ）製）によッテ３７℃テ１５分間部分
消化し、反応混合物を６％ポリアクリルアミドゲルで精
製した。所望の１ｉｏｏｂｐ　　江１’Ｊ　Ｉ−１旦Ｉ
断片を約０．５ｕｇ回収した。２種のデオキシオリゴヌ
クレオチド、すなわら５’　−ｄＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧ
ＴＴＡＴＴＧＴＣと５’　−ｄＴＧＡＣＡＡＴＡＡＣＡ
ＣＡＴＧをホスホトリエステル法によって合成し、以下
のようにしてリン酸化した。

６０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＯ２）　　（１）Ｈ８）
　、　１０１ＭＭｇＣρ　、　１５　ｍＭ　　β−メル
カプトエタノールおよび２４０μＣｉ（γ−５２Ｐ）Ａ
ＴＰ（アマ−ジャム（Δｎ＋ｅｒｓｈａｉ）、　５００
０Ｃｉ　／ｍｍｏｌ）３０　ｐｉ中で２種のデオギシオ
リゴヌクレオチドを１００１００ｐずつ合わせた。１２
単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて３７℃で
３０分間反応さＵた。１０　ｍＭＡＴＰを１成加え、更
に２０分間反応させた。φ・−〇Ｈ／ＣＨＣｆ１３抽出
後オリゴマーを１１００ｂｐ比旦ＮＩ−Ｐ旦工断片０．
２５＃と合わせてエタノール沈澱した。これらの断片を
、２０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　−１」Ｃ４’　　（ｐ＋　
　７．５）　、　１０　ｍＭ　　Ｍ、ＯＣ１２。

１０　ｍＭジチＪ］−レイトール、０．５ｍＭ　　ＡＴ
Ｐおよびｉ　ｏ　ｔｔｔ位の７４ＤＮＡリガ一ゼ３０Ｉ
Ｊｉ中２０℃で２時間連結した。この混合物を、（付着
末端同士の連結による重合を阻止するために）３０単位
のｐｓｔ工と３０単位のＥＣ０ＲＩとで１時間消化し、
６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。

電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｔｌｔｉＯｎ）によって
１１１５ｂｐの生成物（１１０，０００ｃｐｍ）を回収
した。

プラスミドＩ）Ｌｅ　Ｉ　ＦＡ　ｔｒｐ　１０３はプラ
スミドｐＬｅ　Ｉ　ＦＡ２５［ゲデル（Ｑ　ｏｅｄｄｅ
ｌ　）ら、ネイチｖ　−（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、第　２８
７巻、第４１１頁（１９８０年）］の誘導体であり、Ｌ
ｅＩＦＡ遺伝子から遠いＥＣｏＲＩ部位が除去されてい
る。ｐＬｅｌＦΔｔｒｐ　１０３３ｐ９を２０単位のＪ
Ｅ！ＲＩと２０単位のｐｓｔ工によって３７℃で９０分
間消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た。電気溶出によって大きいベクター断片（約３９００
塩基対）を回収した。こうして調製したベクター０．１
５ｑに１１１５ｂｐのＥ並ＲＩ−１旦Ｉ　　ＩＦＮ−γ
ＤＮＡ断片を連結した。大腸菌（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）　
Ｋ−１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ、　３１４４６）　ヲ
Ｊ［１ｍ１ｉｔルトテトラザイクリン耐性コロニーが１
２０個得られた。これらの形質転換体６０個からプラス
ミドＤＮＡを調製してＥＣ０ＲＩとｐｓｔ■で消化した
。これらのプラスミドのうち３個が所望の１１１５　ｂ
ｌｌ　Ｅ　ｃｏＲＩ　−１且Ｉ断片を含有していた。Ｄ
ＮＡ配列解析によって、これらのプラスミド／／ユｎプ
ロモーター。

合成りＮＡおよびｃＤ　Ｎ　Ａの間の結合部に所望のヌ
クレオチド配列を有していることが確認された。

これらのプラスミドのうちの１個ｐＩＦＮ−γｔｒｐ　
６７を選択して更に研究した。このプラスミドを用イテ
大腸菌（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）　Ｋ　、−１２株Ｗ　３１
００（Ａ　Ｔ　ＣＣＮ　０．２７３２５）を形質転換し
た。

Ｈ，Ｌｉｌ　　　の：製 ／Ｌ、　ＩＪ　／’培地（１−ｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ）
　＋　５１１９／ｍＡデトラサイタリン中で−・晩培養
した大腸菌（旦、幻とり、）Ｗ３１１０／　ＤＩ　Ｆ　
Ｎ　−７ｔｒｐ　６７を用いて、０．２％グルコース、
０．５％カザミノ酸および５埒／ｒｄテトラサイクリン
を含有するＭ９培地に希釈度１：１００で接種した。Ａ
３５ｏが０．１〜０．２のときにインドールアクリル酸
を最終濃度２０ＩＩ９／　ｄまで加えた。Ａ３５ｏ＝１
．０のときに遠心して１０ｄの試料をとり、直らに１１
１１Ｌ’ｄ！ウシ血清アルブミンを含有するリン酸塩緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ−ＢＳ、Ａ）１ｄ中に再懸濁した
。細胞を超音波で破砕し、遠心で残骸を除去して清澄に
した。」１漬をアッセイ（検定）にかけるまで４℃に保
存した。上清中のインターフェロン活性は細胞変性効果
（ＣＰＥ）阻害アッセイでＩ　ＦＮ−α標品と比較して
２５０単位／−であった。

１、ｕ Ｉ　ＦＮ−−γを例えば細菌から精製することができる
方法の１つは次の一般的手順からなる。

１．［Ｉ菌を高導電性の溶菌バッファー（ｐＨ約８）で
高圧のホモジナイザー中に通し、流出物を水浴中で冷却
することによる抽出。

２、撹拌下、例えば４℃でポリエチレン−イミンを添加
することによるＤＮＡの沈澱。

３．１ＦＮ−γは再度溶液中に残留せしめながらの細菌
性タンパク貿のｐＨ沈澱。

４．４℃での遠心による固体の分離。

５、（１）Ｈ再調整後の）限外Ｆ１過による上清の濃縮
。

６、低導電性のバッファーに対する濃縮物の透析。

７．１ＦＮ−γは溶液中に残留せしめながらの遠心によ
る固体の除去。

８、イオン強度を増加する勾配で溶出するカルボキシメ
チルセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィー。

９、イオン強度を増加する勾配で溶出するリン酸−カル
シウムゲル上のクロマトグラフィー。

１０、弱い変性条件下での、イオン強度を増加する勾配
で溶出するカルボキシメチルセルロース上でのイオン交
換クロマトグラフィー。

１１、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分離。

上記の方法によって９５％より純度が高い物質を得るこ
とが可能になる。

Ｊ、改　型ヒトガンマインターフェロンの［Ｊシスティ
ン残基を有するＩＦＮ−γを適当な酸化剤の存在下ｐ１
１７〜８．５で０．１〜０．２　ＭＮａ　　８０３によ
って処理した。反応は室温で１〜２時間未満で完了する
が、反応を完全にするためには数時間を越えて数日まで
継続することができる。限外濾過によって反応混合物を
濃縮し、遠心して不溶物を除去した。セファクリル（Ｓ
　ｅｐｈ−ａＣｒＶＩ）＞　８−２００を用いるＧＰＣ
の後改良型ヒトガンマインターフェロンが得られた。

以下の実施例中、スルフヒドリル（非改良型）組換えヒ
トガンマインターフェロンはＳ　Ｈ−ＩＦＮ−ガンマま
たはＳＨタイプと指称し、スルホ化（改良型）組換えヒ
トガンマインターフェロンはＳ−８０３−Ｉ　ＦＮ−ガ
ン？ｔｆはＳＯ３タイプと指称し、インターフェロンは
ＩＦＮと表わす。

１五璽ユ 特開昭５８−９０５１４号公報の方法に従って製造した
ＳＨ−Ｔ　ＦＮ−ガンマ（Ａ　　　＝　２．９）の０．
５Ｍ８Ｏ Ｎａｃｐ含有２０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　（＋）Ｈ８）水
溶液３ｄニＴｒｉｓ　ハッ７Ｆ−ヲ６ｄ、　　１００　
ｉＭ　　ＥＤ−ｒＡ（最終１１１１Ｍ）を０．１ｄ加え
た。

Ｎ　ａ２８０３　ヲ２００１（］　ＳＮ　ａ２８４０６
　ヲ１００ＩＱ含有する水溶液１ｄ　（不溶分は遠心除
去）を上記のタンパク貿溶液に加えた。反応混合物を室
温に８時間放置し、更に１１時間４〜８℃に保った。

不溶物を遠心除去した。反応混合物を限外濾過して濃縮
し、再度遠心分離して沈澱を除去した。

セフ７クリル（Ｓ　ｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ−２００カ
ラム（１，５ｘ　１１０ｃｍ）に通すことによって媒質
を９１１１９／　ｒｄＮａＣ４）含有１１Ｇ／ｄリン酸
ナトリウムバツフアー　（ＤＨ７）と交換した。Ｓ−８
ｏ３−　Ｉ　ＦＮ−ガンマを含有する両分をプールし、
Ａ３４９細胞とＥＭＣウィルスを用いるＣＰＥ法によっ
て抗ウイルス活性アッセイを実施した。生物活性の回収
率は１３１％、全タンパク質回収率は７３％であった。

１１亘ユ 実施例１と同様に、ただしテトラチオン酸ナトリウムを
存在させずにＳＨ−Ｉ　ＦＮ−ガンマのスルホ化を実施
した。トリプシン消化サンプルを逆φ 相ＨＰＬＣ（０，１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配）にかけ
てＮ−末端のペプチドを分析することで反応の経過を追
跡した。スルフヒドリル型のＮ〜末端ペプチドは室温で
２４時間以内に消失し、新たにスルホ化Ｎ−末端ベブチ
ド（Ｓ−８ｏ３−　Ｉ　ＦＮ−ガンマ）が生成した。１
〜リプシン消化したペプチドを分析する前に２−メルカ
プトエタノールで還元するとスルホ化型は容易にスルフ
ヒドリル型に戻った。

えＩ　ｆ？Ｉユ 実施例２で製造したＳ−８ｏ３−Ｉ　ＦＮ−ガンマの分
子量を非還元性の５Ｏ３−ＰＡＧＥ　［Ｕ。

Ｋ、レムリ［−ａｅｌｌｌｌ＋）、ネイチｖ　−（Ｎ　
ａｔｕｒｅ）。

−第２２７巻、第６８０頁（１９７０年）］で９分した
。次表に示されているようにダイマー（二量体）より大
きいオリゴマーの含有率はスルホ化により著しく減少し
た。

ＩＦＮの相対量。

実施例２で製造した５−ｓｏ３−　Ｉ　ＦＮ−ガンマの
安定性を検討した。結果を次表に示す。

Ｎａ２ＳＯ３を１１ｇ／Ｉ１１存在させｒ　ｐｌｌ　７
で保存すると安定であり、１３遍後６Ｍ塩酸グアニジン
を存在させてＴＳＫゲル上でＧＰＣによって分析した゛
ところダイマー型の含有率は変ってぃなかった。

分　　子　　量 最初（０）　　　　９６％　　　　４％　　　１００％
１９７χ　　３％ ２２００％ ５１２５％ １３９６％　　４％ ｕ Ｓ−８ｏ３−　Ｉ　ＦＮ−ガンマとＳ　Ｈ−Ｉ　Ｆ　Ｎ
　−ガンマ（両方とも実施例１で製造したもの）の血清
中および下記培地中での安定性を比較した。

１００成のＩＦＮ溶液（４ｘｌＯ’　ｕ　　Ｉ　ＦＮ／
ｄ）　’Ｆｒ、９００成の予じめインキュベ−１−（０
℃または３７℃）した新鮮なじト血清、新ｉＴなラビッ
ト血清、または５％新生仔牛血清と１０ｍＭ　　ＨＥＰ
ＥＳを含有するイーグルズ（Ｅ　ａｑｌｅ’ｓ）　Ｍ　
Ｅ　Ｍ培地（ｐＨ７，２１日水）に添加した。各混合物
を０℃または３７℃で下記表１に示した時間インキュベ
ートした。

インキュベーション後各サンプル５０屑をイーグルズ（
Ｅ　ａｏｌｅ’ｓ）　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地９５０／１１と混
合し、Ｆ［細胞とシンドビスウィルスを用いる５０％細
胞変性効果減少法によって抗ウイルス能を測定するまで
一８０℃で保存した。

下記表１に示した結果かられかるように、これらのＩＦ
Ｎはヒト血清またはラビット血清と共にインキュベート
するとその抗ウイルス能ｉよ増大し、その程度はＳＨ−
Ｉ　ＦＮ−ガンマよりもＳ−８Ｏ３−ＩＦＮ−ガンマの
方が著しがった。試験した全試験条件下で後者の方が前
者よりも安定であった。

衷」Ｕ１旦 インビトロ（０■肛刀でのＩＦＮの抗細胞増殖作用は、
インビボ（ｉｎ　　ｖｉｖｏ）でのＩＦＮの抗ｍ瘍効果
のメカニズムに対する仮説の１つである［ビリＢ　−（
Ｂｉｌｌｉａｕ）　、　Ａ、、ユーロビアンジＶ−ナル
　オブ　キャンサー　アンド　クリニカル　オンＤロジ
ー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｌ１ｎ。

０ｎｃｏ１．）、第１７巻、第９４９−９６７頁、　１
９８１年］。

Ｓ−３ｏ３−　ｉ　ＦＮ−ガンマと５ｌ−１−ＩＦＮ−
ガンマ（両方とも実施例１で製造したもの）の相対抗細
胞増殖効果を１８種のヒト腫瘍細胞株で比較した。Ｉｌ
！瘍細胞（５ｘ１０　　／ｍｆｌ／ウェル）を、種々の
ＩＦＮ１１１１αで３７℃の００２インキユベーター中
で６日間インキュベートした０６日１にコールタ−（Ｃ
ｏｕｌｔａｒ）カウンターを用いＣ細胞を３１数した。

抗細胞増殖活性は、対照コントロールと比較して細胞数
を５０％減少するのに必要とされる。

ＩＦＮ単位数として表わした（ＩＣ５ｏ、単位／ｄ）［
イダ（Ｉｄａ）、Ｎ、、ウニニジ（Ｕｅｎｉｓｈｉ）　
、　Ｎ、。

カジタ（Ｋ　ａｊｉｔａ）、　Ａ　、およびサト−（Ｓ
ａｔｏｈ）　。

Ｙ、、ガン（ＧＡＮＮ）、第７３巻、第９５２−９１３
０頁（１９８２年）］。結果をまとめて表２に示す。

Ｓ−３ｏ３−ＩＦＮ−ガンマの抗細胞増殖スペクトルパ
ターンは５）−１−ＩＦＮ−ガンマと類似しているが、
ＩＦＮに敏感な細胞株では相対効率が異なっていた。８
種のＩＦＮに敏感な細胞株のうち６種ではＳ０３タイプ
による増殖抑制の方がＳＨタイプよりかなり強かった。

Ｓ−５Ｏ３−ＩＦＮ−ガンマの優れた効果は、ＭＫＮ−
１とＳＥＫ　Ｉ−Ｆで１０倍、ｌ−１ｅｌ−ａｒ５倍、
Ｊ、−１１１゜ＫＢ、ＨＭＶ−１ｒＧ、１２〜３倍Ｆ　
Ｊ’５　ツｔｃ。

１直４１ 悪性黒色腫（ＳＥＫ　Ｉ−Ｆ、ＨＭＶ−１）　、鼻咽腔
筋（ＫＢ）、喉頭癌（Ｈ，Ｅｌ）　−２）または胃癌（
ＭＫＮ−１）のヒトＩｎ塊をメートマウス＜ＢＡＬＢ／
ｃ、バックグランド）に接種した。！！瘍塊が直径約５
ｍ＋１まで増殖したところでマウスをグループに分けて
ぞの胛瘍内に実施例１で製造した５−ＳＯ３〜Ｉ　ＦＮ
−ガンマ（６×１０”単位／頭／日）またはそのベヒク
ルを２０日問投与した。週に２回はさみ尺（５ｌｉｄｅ
　ｃａｌｉｐｅｒｓ）でｌｌ瘍のサイズを測定して推定
ｌｒａ重量を次式によって計算した。

腫ｍ重量＝長さ×（幅）２／２ 最後にＩＦＮで処置してから３日後実際のｌｌ！瘍重伍
も測定した。結果を下記表３に示す。５ＥＫ１−ＦとＫ
Ｂでは増殖抑制がみられなかったが他の３種のＩＩ！瘍
はヌードマウス体内でＳ−５Ｏ３−ＩＦＮ−ガンマ処置
に対して敏感であり腫瘍の増殖が抑制された。特にＨＭ
Ｖ−１の場合には、いくつかの接種した腫瘍塊が２０日
間のＩＦＮ処置で消失した。

”　Ｐ＜　０．０１　、　　Ｐ＜　０．００１　（スチ
ューデント（Ｓ　ｔｕｄｅｎｔ　）のｔ−テスト）宋Ｉ
Ｌ旦 ＩＦＮの重要な生物学的作用の１つは細胞内２−５八合
成酵素の６性増大である。

いくつかのヒト細胞株を用いてＳ−５Ｏ３−ＩＦＮ−ガ
ンマとＳＨ−［ＦＮ−ガンマ（両者とも実施ＶＡ１で製
造したもの）の活性増大能を比較した。

プラスチック類の皿に細胞（５×１０５１５ＩＩＩｌ培
地／皿）を播種してＣ０２インキユベーター中３７℃で
１晩インキユベートした。次にＩＦＮを１×１０３単位
／ｄの最終濃度で加えてその後２４時間インキュベート
した。インキュベーション後、培地を吸引して除き、細
胞をすすいでリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した。ｍＷ
ａを回収し、２−５八合成酵素アッセイ用の細胞抽出物
を調製するまで一８０℃に保存した。清水と宗用の方法
（Ｓ　ｈｉｍｉｚｕ、　Ｎ　、およびＳｏｋａｗａ、　
Ｙ　、　、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミス
トリー（Ｊ。

Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、　）、第２５４巻、第１２
０３４−１２０３７頁。

１９７９年）に従って２−５八合成酵素活性の検定を実
施し、その酵素活性を細胞抽出物のタンパク質１００埒
当たりの３Ｈ−Ａ　Ｔ　Ｐ転換率として表わした。タン
パク質含有率はセドマツクとグロスベルブの方法（Ｓｅ
ｄｍａｋ、Ｊ　、　Ｊ　、およびＧ　ｒＯ３ｓｂｅｒ（
＋。

Ｓ、Ｅ、、アナリティカル　バイオケミストリー（Ａ　
ｎａｌ、　Ｂ　１ｏｃｈｅｔ　）、第１９巻、第５４４
−５５２頁。

１９７７年）によって決定した。結果をまとめて表４に
示す。テストした細胞株全部で２−５八合成酵素活性が
ＩＦＮ処置によって増大した。Ｓｏ３タイプはＳＨタイ
プよりＰ　Ｃ−１２で約４倍、ＨＭＶ−１で約３倍効力
が優れていた。

牢平均士標準編差（ｎ−３） 火コ１ｆｉｉ ＩＦＮのＮＫ（ナチュラルキラー細胞）−活性増大能は
その種々の免疫調節活性の中でも典型的なものである［
ホー（Ｈａ）、Ｍ、、ファーマコロジカル　レビｌ−（
Ｐ　ｈａｒｎ＋ａｃｏ１．Ｒｅｖ、　）、第３４巻。

第１１９−１２９頁（１９８２年）］。したがって、ヒ
トＮＫ活性に対するＳ−５ｏ３−　Ｉ　Ｆ　Ｎ−ガンマ
（実施例１で製造したもの）の効果を５１１−ＩＦＮ−
ガンマと比較して検討した。標的細胞として５１Ｃ「−
標識Ｋ　−５６２細胞〈慢性骨髄性白血病患者に由来す
る骨髄ＩＩｌ胞株）を用いる５１Ｃｒ−放出アッセイに
よってＮＫ活性をインビトロ（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ）で
測定した。エフェクター細胞として使用した単核細胞は
、リンホブレップ（Ｌ　ｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）を使用す
るワンステップ勾配分離法によってヒト末梢血から調製
し、９５％空気−５％ＣＯ２湿潤雰囲気中３７℃でＩＦ
Ｎ溶液またはコントロール溶液によって２０時間処置し
た。単核細胞浮遊液（３ｘ１０　　細胞）１００成と５
１Ｃ「−標識に−５６２ｇ胞浮遊液（ｉｘｉｏ’細胞）
　　１００／ｌｌｊ！をヌンク（Ｎ　ｕｎｃ）プラスチ
ック組織培養プレートの各ウェルに加えた。このプレー
トを９５％空気−５％ＣＯ２湿性雰囲気中３７℃で４時
間インキュベートした侵、タイターチック（■１ｔｅｒ
ｔｅｋ）自動化装置によって上清を分離して公知のタイ
プのガンマカウンターで放射能を測定した。

３人の供与者で得られた結果を表５に示す。

Ｓ−８ｏ３−ＩＦＮ−ガンマとＳＨ−Ｉ　ＦＮ−ガンマ
は両者とも等しくヒトＮＫ活性を少し増大さぜた。

８値は３人の供与者の平均を表わす。

友１」しり ＩＦＮのＡＤＣＣ（抗体依存性ｍｉ媒媒介飽飽障害活性
増大能はその重要な免疫調節活性のひとつであることが
知られている［ホー（ＨＯ）。

Ｍ、、ファーマコロジカル　レビュー（ｐ　ｈａｒｆｎ
ａ−ｃａｌ、　Ｒｅｖ、　）、第３４巻、第１１９−１
２９頁（１９８２年）］。

したがって、ヒトＡＤＣＣ活性に対するＳ−８Ｏ３−Ｉ
　ＦＮ−ガンマ（実施例１で製造したもの）の効果をＳ
Ｈ−Ｉ　ＦＮ・−ガンマと比較して検討した。ＡＤＣＣ
活性は標的細胞として５１Ｃ「−標ＩＥｃ’ＲＢＧにワ
トリ赤血球１１１１１）を用いる５１Ｃｒ−放出アッセ
イによってインビトロ（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ）で測定し
た。エフェクター細胞として使用した単核１ＩＩＩｉは
実施例９に記載したように調製してＩＦＮ溶液で処理し
た。単核細胞浮遊液（細胞数３ｘ１０５）１００ｇ、　
”Ｃｒ　　−標識ＣＲＢＣ浮遊液（細胞数ｉｘ　ｉｏ’
　）　５０成、および１／２５００に希釈したラビット
抗−ＣＲＢＣＩａ　Ｇの抗体溶液５０成をヌンク（Ｎｕ
ｎｃ）のプラスチック製組織培養プレートの各ウェルに
加えた。このプレートを３７℃で６時間インキュベート
し、実施例９に記載したのと同様にして放射能を測定し
た。

３人の供与者で得られた結果を表６に示す。

Ｓ−８ｏ３−　Ｉ　ＦＮ−ガンマとＳＨ−Ｉ　ＦＮ−ガ
ンマは両者とも同程度（すなわちコントロフルに対して
１３８〜１５１％）にヒトＡＤＣＣ活性を増大し　１こ
　。

実施例１１ ガンマインターフェロンはマクロファージ活性化因子（
ＭＡＦ）の１種であることが報告されている（リー（Ｌ
ｅ）、Ｌ、、ブレンスキー（ｐ　ｒｅｎｓｋｙ）、　Ｗ
　、　、イップ（Ｙｉｐ）、Ｙ、に、、チャンク（Ｃｈ
ａｎａ）、　Ｚ　、　、ホフマン（１」ｏＮｍａｎ）、
　Ｔ　、　、　ステイーブンンン（３ｔｅｖｃｎｓｏｎ
）、　Ｈ、Ｃ、、バラズス（Ｂ　ａｌａｚｓ）、　　Ｉ
　、　、サドリク（Ｓａｄｌｉｋ）、　Ｊ　、　Ｒ。

オヨヒビルセク（Ｖ　１ｌｃｅｋ　）、　Ｊ　、、ジャ
ーナル　オブ　イミュノロジ−（Ｊ　、　　Ｉ　ｍｎ＋
ｕｎｏ１．　）、第１３１巻。

１２８２１−２８２６３Ｎ　（１９８３年）　］　、　
Ｓ−８０３−ｒＦＮ−が、ンマがマクロファージを活性
化できるかどうかを明らかにするために、ヒトＡＤＭＣ
（抗体依存性単球媒介細胞障害）活性に対するＳ−３Ｏ
３−Ｉ　ＦＮ−ガンマ（実施例１で製造したもの）の効
果をＳＨ−Ｉ　ＦＮ−ガンマと比較して検討した。ＡＤ
ＭＣ活性は標的細胞として５１Ｃｒ−標識ＣＲＢＧ　に
ウトリ赤血球細胞）を用いる５　１　ｃ　ｒ−放出アッ
セイによってインごトロ（ｉｎｌで測定した。エフアク
タ−細胞として使用した卓球は、マクロファージ分離プ
レート（Ｍａｃｒｏｐｈａａｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ
　Ｐ　ｆａｔｅｓ）に結合させることによって、単核１
ｌＩＩｉ浮遊液（実施例９に記載のようにして調製）か
ら分離し、９５％空気−５％ＣＯ２の湿性雰囲気中＆７
℃でＩＦＮ溶液またはコントロール溶液によって２０時
間処理した。　Ｏｒ−標識ＣＲＢＣ浮遊液（細胞ＩＸ　
１０’　）　５０成と１／　２５００に希釈したラビッ
ト抗・−ＣＲＢＣＩｏＧ抗体溶液５０成を、Ｉ　ＦＮ−
処理または未処理単球（３Ｘ１０４）が単層として付着
しているヌンク（Ｎ　ｕｎｃ）のプラスチック製組織培
養プレートの各ウェルに加えた。このプレートを３７℃
で６時間インキュベートし、実施例９に記載したのと同
様にして放射能を測定した。

３人の供与者で得られた結果を表７に示す。

１０〜１０００単位／Ｉ１１の範囲のｓ度の５−ｓｏ３
−ＩＦＮ−ガンマはヒトＡＤＭＣ活性を大幅に増大せし
め、その値はコントロールに対して５９０〜２７７０％
であった。この増大効果は５Ｈ−ＩＦＮ−ガンマよりも
優れていた。

【図面の簡単な説明】

添付の第１図は、本発明の改良型ガンマインターフェロ
ンのアミノ酸配列の−・例を示す。図中、ＣＹＳ＊はス
ルホ化したシスティン残基である。 ０　リ　　　　　　ＱＩＯ）４　　　　　　　匡−ミ　
　　＝　甲　　　　　　４ ０　ト リ １／）　　　　　　　　匡　　　　　　　１−Ｉ　　　
　　　　Ｑ２　　　　　　工　　　　　　＜　　　　　
　瞑−ト〉　　　　　　　べ ｚ　　　　　　　−ｚ　　　　　　り 切　　　　　　＜−ト く　　　　　　〉　　　　　　Ｑ　　　　　　−区　　
　　　　　区　　　　　　　闇　　　　　　　じ国　　
　　　　国　　　　　　Ｉ−１国司　　　　　　ｔＱ　
　　　　　　Ｈ＜＝　　　　　　氏　　　　　　：）　
　　　　　り　　　リ　２リ　　　　　　　ζ　　　　
　　　に）　　　　　　　冶　　　　寸　−＜　　　　
　　　Ｅ−１ｑ　　　　　　　ｑ、−＋　　じ１）　　
ロ　２　　　　　　０　　　　ＯＨ区工　　　０　切　
　　　　　−ｒｖ′Ｉ　　−国ｆＱ　　ｒ−４＜（ｊ　
　Ｈじ　　ψ 国　　　　　　匡　　　　　　の　　　　　　匡　　　
　　　く工　　　平　　　Ｈ閃　　　国 山　　　　　　　Ｅ−１ｚ　　　　　　　Ｅ−４Ｉ／）
′Ｏ閲　　　　　　　ＬＱ　　　　　　　　じト　　　
　　　目　　　　　　−３国 −−１−１４４゜ ｑ　　　　　　　Ｃ＋’）　　　　　　　＜　　　　　
　　＜　　　　　　　ａ＜　　　　　　８　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　氏〉Ｉ−１離　　　闘　
　　く ２　　　　　　コ　　　　　　（１）＜トリ　　　　　
　−３−− ＜　　　　　　０　　　　　−　　　　　　く　　　　
　　リ０Ｆ−１ｕ　　　　Ｏｔ：）　　　　　　　ＯＯ
（Ｊ工　　　Ｈ氏　　　　　　区　　　！　匡基　　　
、　　□べ　　　、　　８く 山　　　　　　ＱＩ　　　　　　　Ｚ　　　　　　　匡
　　　　　　国史　　　　　　Ｌ／）　　　　　　　−
国　　　　　　田＜　　　　　　＜　　　　　　じ　　
　　　　Ｌ／）　　　　　　　山コ　　　　　　ｐ コ　　　　　　Ｑｌ　　　　　　　日　　　　　　国　
　　　　　国−切 リフ〉−− Ｃ／）　　　　　　　Ｕ　　　　　　　Ｚ　　　　　　
　コ　　　　　　ト２　　　　　　匡　　　　　　川　
　　　　　−国−＜　　　　　　＜　　　　　　０　　
　　　　Σｒｑ　　　　　　　ｕ”＋　　　　　　　フ
　　　　　　ベ　　　　　　２一：８　　　　Ｌｉ２　
　　　躍　　　、。 １−１　＋−１４

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）スルホ化システイン残基または他の酸化システイ
   ン残基を有する改良型ヒトガンマインターフェロン。
2. （２）前記システイン残基が１位と３位を占めているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の改良型ヒ
   トガンマインターフェロン。
3. （３）Ｎ−末端にメチオニン残基が結合していることを
   特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の改良型ヒトガ
   ンマインターフェロン。
4. （４）約１４６個のアミノ酸を有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の改良型ヒトガンマインタ
   ーフェロン。
5. （５）添付の第１図に示される配列またはその対立もし
   くは分子変異に基づく前記配列と等価な配列を有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の改良型ヒ
   トガンマインターフェロン。
6. （６）本質的に、スルホ化システイン残基または他の酸
   化システイン残基を有する改良型ヒトガンマインターフ
   ェロンから成る組成物。
7. （７）システイン残基を有するヒトガンマインターフェ
   ロンをスルホ化または他の方法で酸化することからなる
   方法。