JPS60100599A - 修飾インタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規な修飾インターフェロンの設計および合成
への組換えＤＮＡ技術の利用に関する。さらに詳しくは
、本発明はウィルス性および新生物疾患、ならびに免疫
抑制および免疫欠損状態に対する使用な意図した、天然
には知られていないインターフェロンに関する。

従来の技術 インタ−フェロンはを椎物動に産生される２群の蛋白質
で、病原に対する抵抗性の増大、細胞の生育の制限およ
び免疫系の調節を含む細胞機能の生物学的調整因子とし
て作用する。インターフェロンの最も研究が進んでいる
性質は細胞を抗ウイルス状態に変換する能力である。こ
の間、細胞はウィルスの複製に対する抵抗性を増す（Ｌ
ｅｎｇｙｅｌ：Ａｎ、ｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
５１：２５１．１９８２）。

標的細胞に抗ウィルス活性を付与するほか、インターフ
ェロン（工ＦＮ）は抗増Ｍ（抗生長）作用を有する（Ｓ
ｔｅｗａｒｔ：Ｔｈｅ工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｙｓｔｅ
ｍ。

８ｐｒｉｎｇｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９７９）。天然に
産生したインターフェロンが抗ウィルス剤および抗増殖
剤として作用することは明確なものとされている（Ｇｒ
ｅｓｅｅｒら：ＢｉｏｃｈｉｍＢ１０ｐｈｙｓ、Ａｃｔ
ａ、、５１（５：２６１．１９７８；Ｊ、ＥｘｐＭｅｄ
、１４４：１３１６．１９７６）。

１ＦＮはその抗原性、生物学的性質および物理化学的性
質によって６種に分類される。Ｉ型、ＩＦＮ−α（白血
球）およびＩＦＮ−β（線維芽細胞）；ならびにＨ型、
工ＦＮ−ｒ（免疫）である（Ｅｌｔｅｗａｒｔら：Ｎａ
ｔｕｒｅ、２８６：１１０ｓ１９８０）。■型および■
型工ＦＮのｒノミツクＤＮＡおよびｃＤＮＡクローンは
いずれもＡｉＩｌｌ：され、配列決定され、その蛋白配
列本推論されている（たとえばＰｅ５ｔｋａ：Ａｒｃｈ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＢｉｏＩ＋、ｈｙｓ、。

２２１：１．１９８３）。一方、ヒトでは１個のＩＦＮ
−βオヨヒ工ＦＮ−γ遺伝子のみが知られているが、ヒ
トエＦＮ−αは少なくとも２０個の遺伝子からなる複遺
伝子系によって特定される。ＩＦＮ−βと工ＦＮ−αを
Ｉ型インターフェロンとして分類するのは、ひとつには
相同性が著しく高く蛋白レベルで〉２６チであることに
」る（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら：Ｎａｔｕｒｅ、２８５：
５４７．１９８０）。

インターフェロンの作用機構は完全には解明されていな
いが、ある種の生理活性または酵素活性はインタ一フェ
ロンの存在に応答する。これらの活性にはＲＮＡおよび
蛋白の自戒がある。インターフェロンによって誘導され
る酵素に、クー５′結合オリゴヌクレオチドを生成する
（２’−５’）（Ａ）ｎシンテターゼがあり、これらの
オリゴヌクレオチＶは不活性のエンドリボヌクレアーゼ
、ＲＩＪＡθｅＬヤ活性化し、これが１本鎖ＲＮＡた２
二えばメツセンジャーＲＬ（Ａ、（ｍＲＮＡ）やりボゾ
ームＩＩＮＡ（ｒＲＮＡ）ｋ分解する。また工ＦＮは、
少なくとも１個のペプチド鎖の開始因子をホスホリル化
するプロティンキナーゼを誘導し、これが蛋白合成な阻
害する（Ｌｅｎｇｙｅｌ：１ｆ）ｉｄｓ２５３）、、Ｉ
ＦＮは（クー５′）Ａｎｎシンテターゼ活性調整に」：
り細胞の生育の負の調整因子であることが示されている
（０ｒｓａｓｅｙら：ＭＯｌ、０ｅｌｌＢｉｏｌ、３：
７ＱＱ、１９８３）。

工ＦＮ−βは抗ＩＰ’Ｎ−β抗体の使用により、誘発因
子の非存在下に細胞サイクルの正常な調整に関与してい
ることが間接的に明らかにされている。同様に、工ＦＮ
が分化（Ｄｏｌｅｉら：Ｊ、（）ｏｎ、Ｖｉｒｏｌ、＋
４６：２２７．１９８０）や免疫調節（Ｇｒｅｅｓｅｒ
：Ｃｅ１ｌ工ｍｍｕｎｏｌ、３４＝４０６．１９７７）
にある役割を果たしていることも示されている。最後に
、工ＦＮはｍＲＮＡのメチル化パターン促変え、また膜
ホスホリピド中の脂肪酸の役割な変え、したがって細胞
膜の剛性を変化させるとも考えられている。

以上の機構やその他の機構は、インターフェロン様ポリ
ペプチドの構造により程度は異なるがインターフェロン
様分子に応答するものと考えられる。初期的な知見（英
国特許ＯＢ２０９０２５８Ａ）としては工Ｆ’Ｎ−α複
遺伝子系のメンバーによりその抗ウィルス活性の程度お
よび特異性は変化することが示唆されている（Ｐｅ日ｔ
ｋａ、１ｂ１ａ）。たとえば工ＦＮ−αＡと工ＦＮ−α
Ｄの結合で生じたハイブリッド遺伝子はいずれの母体分
子とも異なる抗ウイルス性な現わす（Ｗｅｃｋら：Ｎｕ
ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ’Ｒｓｓｒ９：６１５３．１９Ｆ３１
；ＤｏＬａＭａｚａら：Ｊ、ＩＦＮＲｅｓ、３：３５−
９、１９Ｆ３６；Ｆｉｓｈら二ＢｉｏｃｈＯｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、ＲＯｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１１２：５’ろ７
１１９８５；Ｗｅｃｋら：工ｎｆｅｃｔ、’、［ｍ＋ｎ
ｕｎｏ、、３５：６６０．１９８２）。しかしながら、
ヒト細胞活性／特異性が著しく増大したハ・１ブリツド
ヒト工ＦＮはまだ開発されていない。Ｊ：Ｆ’Ｎ−β／
αハイブリッドについて記述している特許が１件ある（
ＰＣＴ／ｕｓ８３／０００７７）。この特許には３つの
例が記載されているが、活性が有意に改善されているも
のはない。この６例は２個の天然に生じた制限部位を用
いて構成さＪしたもので、得られたハイブリッドインタ
ーフ、ツーロンは１）α１（１７ろ）−β（７４−１／
）６）、２）β（１−７３）−α、（７４−１６６）お
よび３）α６□Ａ（１−４１）−β（４３７１６６）で
ある。

この３例は本発明の例とは構造的に異なる。しかもこの
６例は２個の制限部が偶然に結合し７こことによるもの
で、本発明のＤＮＡ：ｔ、ｔよびアミノ酸配列のように
意図的に設計されたものではない。

修飾されたインターフェロンが新しい有利な表現型を与
えるであろうと予想される。ＩＦＮ−βの一部分と他の
アミノ酸配列から構成された新しいインターフェロン様
ポリペプチドの股引および合成が以下の理由から有利で
ある。

１、正常なインターフェロン銹発生化学経路の一部のみ
の選択的活性化から抗ウィルスに対し抗細胞増殖活性が
大きい（またはその逆）の新しい工ＦＮが得られる可能
性がある。

２、ハイブリッドまたは修飾工ＦＨの細胞表面レセプタ
ーに対する親和性は天然のインターフェロンと異なると
思われる。これはインターフェロンによる特定細胞型の
選択的または差別的標的化またはレセプターへの親和性
の増加な可能にし、特定のウィルス疾患または悪性腫瘍
に対する効力を増大させることが考えられる。

３、治療係数が大きい新規なＩＦＮを設ｎ１することが
可能で、天然の１ＦＮの使用を制限することになる望ま
しくない副作用を排除できる可能性がある（Ｐｏｖｌｅ
ｄｇｅ、Ｔ、Ｍ、；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２：
２１４、）Ａａｒｃｈ１９８４）。

４、新規の工ＦＨには微生物合成時の蛋白分解に対する
安定性を増大させるよウシ、「構造を設計中に包含させ
ることができる。

５、新規な１ＦＮはｉｎ１．ｖｏＬζ−１６ける溶解性
または安定性を増大させ、細胞または組織との非特異的
疎水性相互作用を防止するように設計できる。

６、新規なＩＦＮは微生物培養−上澄液または抽出液か
らの回収を容易にし、また精製を容易にするように設計
できる。

その他の関連特許出願 英国特許ＧＢ２１１（Ｓ５６６Ａ、−一一物動インター
フェロンおよびその製造方法 米国特許第４ｉ１４１５０号−一ハイブリッドヒ）白血
球インターフェロン 発明の要約 組換えＤＮＡ技術を、修飾β−１１ンターフエロン様ポ
リペプチド、と、Ｉｔらの修飾β−インターフェロンを
コードする核酸（ＤＮＡｆ、たはＲＮＡのいずれか）、
修飾β−インターフェロンをコートスルＤＮＡを含有す
るプラスミドの製造およびこれらの修飾β−インターフ
ェロンの合成操作に応用して成功した。ヒトβ−インタ
ーフェロンのアミノ酸１〜５６を個々に任意の他のアミ
ノ酸で置換してもよい。この置換は３個から５６個まで
のアミノ酸群として行うこともできる。好ましい一態様
においてはヒトβ−インク・−フェロンのアミノ酸２か
ら７および９から１５６までそれぞれが他のアミノ酸で
置換される。他の好ましい態様においてはβ−インター
フェロンのアミノ酸９から５６までが４個から４７個ま
での他のアミノ酸で置換される。β−インターフェロン
のアミノ酸２から７までおよび９から５６までな相轟す
るヒトα−インターフェロンのアミノ酸で置換してもよ
い。α−インターフェロンにはα１、α２およびα□が
ある。任意の動物起源のα−およびβ−インターフェロ
ンを使用できる。たとえばヒトもしくは他の霊長類動物
、ウマ、ウシ、ヒツジ、ウリ°イ、ラットおよびマウス
を挙げることができるがこれに限定されるものではない
。本発明の一態様においては、ヒトβ−インターフェロ
ンのシスティン１７まプこはメチオニン３１をセリン１
７（またはロイシン１７）および／またはりシン６１で
置換してもよい。ある例では、たとえばｏｒＮｘ４１０
（第３ｄ図）の場合、１７位の上流に挿入されたアミノ
酸の数が１個少ないので、１７位のシスティンまたはロ
イシンは１６位に読みｌＪ）えられている。

さらに本発明の他の態様には、非修飾β−インターフェ
ロンの活性とは抗ウィルス活性、細胞増殖訓整活性また
は免疫調節活性の１種または２種以上が異なる修飾β−
インターフェロンの使用がある。とくに好ましい態様は
工ＦＮＸ−４０２，４０３，４０４，４０６，４０７，
４０１３，４０９，４１０゜４１５．４１９および４２
０のアミノ酸配列である。さらに他の好ましい態様と１
．て、本発明は工ＦＮＸ４０２．４０３．４０４．４０
６．４０７．４０８．４０９．４１０，４１５．４１９
および４２０の合成なコードするＤＮＡ４たけＲＮＡ配
列を包含する。さらに他の態様には［ＦＮＸ４０２．４
０３．４０４．４０６．４０７．４０Ｂ、４０９．４１
ｏ１４１５．４１９および４２０の合成をコードできる
ＤＮＡを含有するプラスミドまたは細胞がある。

さらに本発明の他の態様には有効量のＩＦＮＸ４０２．
４０３．４０４．４０６．４０７．４０８．４０９．４
１０．４１５．４１９および４２０を含有する医薬組成
物がある。最後に、本発明の態様として、修飾β−イン
ターフェロンを含有する医薬組成物の、ウィルス感染の
治療、細胞生育の調整または免疫系の調節における利用
がある。

アミノ酸残基１７のシスティンからセリンへの変化は大
腸菌で産生される工ＦＮ−βの特異的抗ウィルス活性を
著しく増大させると報告されている（ＴＮＯ工ｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎＭθｅｔｉｎｇ、ＲｏｔｔｅｒｄＰＬｍ。

Ａｐｒｉｌ１９８３）。本発明ではこの結果は確認され
なかった。生物学的活性の変化は、５ｅｒ１７によらず
新規な工ＦＮの一部（第１表から第１６表参照）におい
て認められた。残基１７（または第３ｄ図の残基１６）
には他のアミノ酸たとえばシスティン、ロイシンまたは
アラニンが存在してもよい。

本発明では１７残基のアミノ酸はシスティン、セリンま
たはロイシンのいずれでもよい。

本発明においては、新規な、修飾工ＦＮで生物活性の増
大が認められた。ウィルスまたは新生物疾患あるいは免
疫抑制または免疫欠損状態の治療により高い効果を示す
。ｉｎｖｉｔｒｏで測定できる活性（たとえば抗ウィル
ス、抗細胞増殖または免疫調節活性）の１個またはその
他が消失している新規な改良工ＦＮもみられる。

生物学的活性が増大または減少、あるいは標的細胞特異
性が増大した新規な修ａｒＩＦＮでは治療係数が改善さ
れている可能性がある。これにより天然１ＦＮをヒトに
使用した場合に起こる副作用の一部を排除できることに
なる。

本発明は、ヒトのとくにつ・ｆルス感染、悪性腫瘍およ
び免疫抑制または免疫欠損状態の予防または治療処置に
適した、新規な、活性および／または特異性の高いイン
ターフェロン様分子の十分量の製造に関する。

好ましい態様の説明 緒言 エフＮ−β遺伝子は独特の遺伝子であるが、複遺伝子工
ＦＮ−α系に著しい相同性な示す（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉ
ｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａａｔａ、６９
５：５．１９８２）。８ｔｅｒｎｂｅｒｇと０ｏｈｓｎ
（工ｎｔ、Ｊ。

Ｂ１０１Ｂ１０１−Ｍ１ＯｒＯ＋４：１３７．１９８２
）は１ＦＮ−βとＩＦＮ−αＩＫ類似の二次構造な提案
している。構造予測１究では右ねじの束にパックできる
４個へリツクスが示唆されている（第１図参照）。

これは数種の無関係の蛋白のＸ線結晶解析で認められた
構造と類似している。本発明における修飾インターフェ
ロンの一部の設計は、ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ−０ｏｈｅｎ
のモデルの発明者らによる解釈から生まれたものである
。工ＦＮは細胞表面で同一のレセプターに結合すると考
えられているので、工ＦＮ−βの特定領域を工ＦＮ−α
のセグメントまたは任意の他のアミン酸配列で置換する
ことにより工ＦＮ−βに変異性を導入することが可能に
なる。これらのインターフェロンの構築により、新規な
、生物学的性質の異なるハイブリッドインターフェロン
が得られた。これらのインターフェロンはすべである程
度は活性を示したが、挿入アミノ酸配列の性質によるか
なりの変動が示唆さＪシ、活性な分子の発見されたので
ある。

本発明では１から５６の領域の各アミノ酸を任意の他の
天然アミノ酸で置換することができる。

天然アミノ酸の種類およびその略号は次のとおりである
。

アラニン（Ａｌａま７こはＡ）、バリン（Ｖａｌまたは
Ｖ）、＊イシン（’ＬｅｕまたはＴＪ）、インロイシン
（工１ｅまたは工）、プロリン（ＰｒｏまたはＰχフェ
ニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、）リゾトファン（Ｔ
ｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、グリ
シｙ（ｃｉ１７または〔］）、セリｙ（Ｂａｒマタは８
）、ステレオニン（１°ｈｒまたはＴ）、システィン（
０７日−１：たはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、
アスパライン（ΔｓｎＪＪたはＮ）、グルタミン酸（Ｇ
ｌｕまたはＫ）、リジン（ＬｙｅまたはＫ）、アルゲニ
ン（ＡｒｇまたはＲ）、ヒスチジン（Ｈ１θまたはＨ） 本発明の分野は、したがって、ＩＰ’Ｎ−βのアミ蛋白
配列、あるいは哺乳類動物および他のを椎物動にみられ
る工ＦＮ−α、工ＦＮ−βもしくは１Ｆ’Ｎ−γの配列
に類似の配列で置換されたインターフェロン様分子の設
計、合成および性質の解明である。

ハイブリッドエＦＮ−αの結合体（α、とα２．５ｔｒ
ｅｕｌｉら：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、７８：２８４８．１９８１）であるが、１ＦＮ
−αのレセプター結合部位に関与する遺伝型の数および
性質を解析する試みがなされている。結合部位？構成す
るものとして２部位が提唱されていて、１個は工ＦＮ−
αのアミノ末端の半分に、もう１個はカルボキシ末端の
半分にあるという。工ＦＮ−αと工ＦＮ−βの間の部分
相同の２つの大きな領域がアミノ酸残基２８−８０およ
び１１５−１５１にあり、これが上述の遺伝型に相当す
るものと思われる。

２８−８０領域がレセプター結合に重要である可能性の
証拠には、ＩＦＮ−α２アミノ酸２４−８１からなる合
成ペプチドに対して生成するポリクロナール抗体が工Ｆ
Ｎ−α２に結合し、そのペプチドが細胞レセプターに作
用するのを阻害するという所見（Ｄｒｅｉｄｉｎｇ：Ｔ
ＮＯ工ｎｔｅｒｒｏｒｏｎＭｅｅｔｉｎｇ。

Ｒｏｔｔｅｒａａｍ、１９８３）がある１１本発明の修
飾インターフェロン、たとえば工ＦＮＸ４０２（工ＦＮ
−β〔β（９−５６）→α１（７−・５４）ではヒト細
胞抗ウィルス活性および天然のキラー細胞活性が抗増殖
活性に比し劇的に低下している。ＩＦＮ−β残基〜９お
よび〜５６の間のアミノ酸を変えたＩＦＮ−β由来の新
規インターフェロンの他の例には、とくに工ＦＮ−βの
アミノ残基９から５６までを工ＦＮ−α、の残基７から
５４中でで置換した合成重ＦＮ−β〔β（９−５６）→
α□（７−５４）がある。これらの例は本発明な例示す
るものであって、いがなる意味でも本発明な限定するも
のではない。以下に、ヒトエＦＮ−β遺伝子の１〜５６
領域へのＤＮＡフラグメントの挿入、設計および化学合
成に用いた技術について説明する。アミノ酸置換な１〜
５６の領域に行った新規なＩＦＮ、群Ｈの一部では抗ウ
ィルス活性の低下または抗細胞増殖作用の増大が認めら
れた。以下に述べる技術は本技術分野の熟練者には慣用
のものである（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ（！ｌｏｎｉｎｇ、
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ。

Ｍａｎｉａｔｉｇほか編、Ｃｏ１ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ参照）。

合成遺伝子フラグメントの段組 各合成りＮＡフラグメン）（ｉ２ａおよび２ｂ図）のヌ
クレオチド配列は以Ｔｖ′）基準によって設計した。

１、コドンの利用（天然ＩＩＦＮ−β遺伝子配列のどこ
から取出すか）はＢ、ｃｏｌｉにおける表現について至
適化した。新規な１ＦＮの表現レベルがプラスミドｐａ
ｃ１０からのＩＦＮ−βの場合と同じになるように可能
な限り天然工ＦＮ−β遺伝子配列を用いた（第１表参照
）。ＰＧＯ１０（〜４．４４０Ｊ））は天然１ＦＮ−β
遺伝子を高レベルで発現し、リポゾーム結合部位が第４
図に示されたとおりであること〜５４６ｂｐＢｇＩＩｆ
−ＢａｍＨエフラグメントの欠失を除きｐｉ／２４（英
国特許出願ＧＢ２０６８９７ＯＡ）と同じである。

２、化学的に合成されたフラグメン）・（第２図）のア
ッセンブリー内で互いにアニールする可能性がおる配列
は設計中に含ませブよかった（遺伝子コード内の重複に
より許容される限界内で）。

遺伝子フラグメントの化学的合成 オリゴデオキシリボヌクレオチドは制御多孔ガラス上（
Ｈ，に０８１；Ｏｒら＝１°ｅｔｒａｌｌＯｆＬｒｏｍ
、４０’１０６．１９８４）、ホスホシミダイト法（Ｍ
、Ｈ，Ｃ！ａｒｕｔｈθｒｓ：Ｃ！ｈｏｍｊ、ｃａｌａ
ｎａＫｎｚｙｍａ、ｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＧｅ
ｎｅＦｒａｇｍｅｎｔ’ｓ、Ｈ，Ｇ、Ｂａ５ｅｎおよび
Ａ、ｌＪａｎｇ編、ＶθｒｌａｇＣｈｅｍｌθ、１９８
２゜Ｐ７１）によ・つて合成した。完全に保護された２
′−デオキシリボヌクレオチＰ３′−ホスホラミダイト
は保護されたデオキシリボヌクレオチドとクロロ−Ｎ、
Ｎ−（ジインゾロビルアミノ）メトキシホスフィン刀＼
ら合成した（Ｔｒ、：Ｔ−ＭｃＢｒｉ、ａθおよびＭ、
Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｅ：’ｒｅｔｒａｈｅａｔ’ｏ＋
＋１ｊｅｔｔ、、２４：２４５．１９８６ならびにＳ、
Ａ、Δｄａ＋ｕＢら：ＪＪＢＯｈｏｍＢｏｃ、、’ｌ０
５：６６１．１９８３）。制御多孔ガラス支持体は文献
に従って合成しくＦ。

ＣｈＯｗら：ＮｕｃｌＡｃ１ｄｓＲｅｓ、９：２８０．
７．１９８１）、１ｇにつきデオキシヌクレオシド３０
〜５０μｍｏｌが得られた。

機能化制御多孔ガラス（５０ｒｎ９）を室温にお〜・て
ガラスろ耳中で処理し、ついで １、ジクロロメタン（６虹、１０８） ２、ジクロロメタン中３％（ｖ／ｖ）ジクロロ酢酸（２
ｍｌ、１２０ｓ） 乙、ジクロロメタン（３ｍ７！、１０８）４、無水７セ
）；）ｌＪル（３ｍＣ，１０ｓ）５６ホスホラミダイト
モノマー（０，０６Ｍ）７テトラゾール（０，２３Ｍ）
、無水アセトニトリル中（１ｍｌ、１２０ｓ） ６、アセトニトリル Ｚジメチルアミノｔリジン（０，０７Ｍ）ＩＪＩＥ。

氷酢酸：２．６−ルチソン：アセトニトリル（１：２：
６、■／／ｖ）中（１：２：６ｖ／／ｖ）８．７セ）＝
）す／ｌ／（３ｒｕｅ、１０日）９、ヨウ素（０，２Ｍ
）、２．６−ルチシン：テトラヒドロンラン：水（１：
２：２、ｖ／ｖ）中（１＋ａ／、３Ｑθ） １０、７セトニトリＮ（５＋＋＋／、１０ｓ）で順次処
理した。

適当なホスホラミダイトモノマーを用いて、免疫性鎖が
完成するまで上記サイクルな反復した。

各カラプリラグ効率は遊離したジメトキシトリチルアル
コールを１０（ｗ／ｖ）ｌ・ジクロロ酢酸／ジクロロメ
タン中５０４ｎｍにオ、丁い°Ｃ分光法でモニターした
。合成完了後、保膿基り除去し、以下６％（Ｖ／ｖ）ジ
クロロ酢酸／ジクロロメタン（１２０ｅ）、チオフェノ
ール／トリエチルアミン／ジオキサン（１／１／２ｖ／
’ｖ）（１ｈ）および７０℃でアンモニア（４ｈ）によ
り順次処理して支持体からオリゴマーを分離させた。保
獲基を除去したオリゴヌクレオチドｋＰａｒｔｉｓｉｌ
ＩＱＳＡＸカラム上トリエチルアンモニウム酢酸塩ｐ）
４４．９の１Ｍから４Ｍまでの勾配ＨＰ］’、＋Ｃ’ｊ
ｆ、たは変性１５チポリアクリルアミドゲル（＋Ｊ１８
．３’）上電気泳動を用いて精製した。

オリグーと！−リ９」！兄ｚ！、９連結オリゴヌクレオ
チド５００ｐｍｏＩＱｆと’）、１００００１／ｐｎｎ
ｏｌｅ［”Ｐ］Ｔｒ−ＡＴＰ（２，５Ｃ！ｉ／ｍｍｏｌ
ｅ）、１００μＭスペルミジン、：２０ｍＭＤＴＴ％１
０ｍＭＭｇＯ１２，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ、（ｐＨ
９，０）およびＱ、１ｍＭＫＤＴＡ含有溶液２０μｌ中
、３７℃で６０分間、Ｔ４誘発ポリヌクレオチドキナー
ゼ１単位によってホスホリル化ヒた。つし・で混合物を
凍結乾燥し、各オリゴヌクレオチドを変性１５チポリア
クリルアミドデル（ｐ）］８．３）で精製した。ビルか
ら溶出後、放射能をカウントして回収率なめ１こ。

各ホスホリル化成分２５ｐｍｏｌｅｆ相補鎖からのホス
ホリル化されていないオ＋Ｊビマー等モル量と合し、ブ
ロック（長さ６０〜５０塩基）をアッセンブルした。混
合物な凍結乾燥し、ついで水１５ｔｔｌｌと１０ｘすが
一ゼ緩衝液（ＴｒｉＧＨ（４５００ｍＭ、ｐＨ７，６；
１００ｍＭＭｇＣＪ□）２ｐ１３の混合物中にとる。ブ
ロックを１００℃で２分間アニーリングし、ついで徐々
に室温（２０°Ｃ）まで冷却した。２ＱＱｍＭＤＴＴ２
μｌおよび１０ｍＭＡＴＰＯ１５μｌを加えて、最終濃
度ｔ２０μｌ中ＤＴＴ２０ｍＭ％ＡＴＦ２５０ｔｔＭと
した。Ｔ、ＤＮＡリガーゼ１．２５単位も加えた。２０
℃に゛１８時間放置したのち、生成物を変性条件下に１
５％ボリアクリルアξドｒ／Ｉ／で精製した。

次ＩＣ一本鎖ビースから二重ブロックを構成させた（１
５０塩基対および７５ｊ力基対）。各ブロック１．５ｐ
ｍｏｌｅをとり、混合物な凍結乾燥した。水１５μｌお
よび１０メリガーゼ緩仙１液２μｌの混合物中、１００
℃で２分間アニ・−リングを行い、ついで徐々に１０′
Ｃに冷却した。２００ｍＭＤＴＴ２ＢｌＩＱｍＭＡＴＰ
Ｑ、５ＡｌオよびＴ、Ｉ）ＩＪＡ１，１カーセ１．２５
単位り加えた。１０℃で１８時間反応させた。生成物も
ｒｉｏ％生ポリアクリルアミドｒル中で精製した。

最終生成物は２個の二重鎖０．４ｐｍｏｌｅ％−結合さ
せてアッセンブルした。混合物シ（凍結乾燥し、ついで
水１５μｌと１０Ｘリガーゼ緩衝液２μｌの混合物にと
り、５０℃で２分間アニーリングし、除徐に１０°ＣＶ
Ｃ冷却した。２０ｍＭＤＭ２ｔＪ、１（）ｍＭＡＴＰＱ
、５μノおよびリガーゼ１．２５単位を加え、化ポリア
クリルアミドデルで精製した。溶出し、エタノールで沈
殿させたのち、生成物を水１０珂にとった。０．５μｅ
ｔｔ回収率の計算の１こめのカウント測定に用いた。残
りに１０に！Ｊガーゼ緩衝液２ｔｔｌｌｓ２００ｍＭＤ
ＴＴ２ｔｔｌｌｓ１ｍＭスペルミジン２Ｉ’ｌｌｓ１０
ｍＭＡＴＰ１μｌｊ、水３ｔｔｌｌおよびキナーゼ０．
５単位を加えた。６７℃で１時間反応させ、９０°Ｃに
２分間加熱して反応り停止させた。最終生成物はエタノ
ールで沈殿させた。

新規な修飾インターフェロンに表現するシラスミドの構
成 本項にはＩＰ′Ｎ−βコード領域への合成りＮＡフラグ
メント（第２図）のクローニングに用いたベクター、挿
入に用いた制限酵素部位および４１り成の根拠について
述べる。制限酵素部位は群ＩＶの新規１ＦＮ遺伝子の全
コードヌクレオチド配列（第３図）に対する相対位置で
示す。ＩＰ’Ｎ−β（または新規ＸＢ’Ｎ）：１．−ド
領域は太線で示し、左から右へ翻訳されるものとした。

ＢａｍＨ１部位とｍａｏｉｔ１部位の間の配列はｐＡＴ
１５３におり゛る配列に等しい（７０５ｂｐ其狙１１フ
ラグメントが欠失したｐＢＲ３２２に相当−一マツブ上
ヌクレオチド１．６４６−２．３５１）。ｐの代わりに
ｎ＋％でイリしたベクターはＥｃｏＲ１部位とＢａｍＨ
１部へｒの間のＭ１３ｍｐ８配列を示す。ｆｉ：、ｃｒ
＋ｌｉｔｒｐ７リロ９−−一ター（第４図）はＷａｏＲ
７部位とＤ△」部位の間（工ｙｎｘ−４０７，４０８，
４０９では相当値ｒＭ、）に存在する。

ｌ」 Ｊ、ＦｌｌＸ４Ｑ７工ＦＮ−β〔β０−５６−１α７−
５４）Ｃｙｓ”７が１＋ｓｕ”ＩｔＣ変１ヒＬ’ＴＴイ
ロコノＩＦＮＸ、４Ｑ７は残基１７の抗ウィルス活性お
、Ｊ：び抗細胞増殖活性への影響を検討す、５ためにＲ
９：Ｎｔした。

出発ベクター：ｐＭＮ３９−１ ９−１ＴＪ９−１は〜５４６ｂｐノ埴−ＩＩ−とＨｌフ
ジグメントが欠失しているはｙｐはｐｔ／２４（英国特
許出願ａｓ２０６８９７０八）と同一である。

合成オリビヌクレオチド（第２ａ図）をＨｌｎｆｌとａ
ｇａ１部位の間に挿入して、第６ａ図に示したヌク１／
オチド配列な得た。工ＦＮＸ４０７はプラスミドｐＪＡ
２９から表現される。

例２ ＩＩＸ４（１３工１−β〔β４４ｈ６−＋Ｃ１１４２−
６４〕、［：０ｙｓ１７−＞Ｓｅｒ） これは工ＦＮＸ４０４から誘導され、残基１７を（！ｙ
ｓからＳｅｒに変えた場合の効果お検討するために設計
されｌご（工ＦＮ−βのＢｅｒｌ’Ｆｉ換体はＣθｔｕ
ｓ（！Ｏｒｐ：ＴＮＯ工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎλ／Ｌｅｅ
ｔｉｎｇ、ＲｏｔＪｅｒｄａｍ。

Ａｐｌ・１３．１９８３によってはじめで報告された）
。

ｌｉｔ’２７−Ａ−：ｐｘｘ４Ｑ４ ｐＫＸ４０４は工ＦＮ−βアミノ酸残基／ｌ４−５６が
ＩＦＮ−α、残基４２−５４で置換さ蛙ているほかはｐ
ｔ／２４（英国特許用１ｎＧＤ２０６８９７ＯＡ）と同
一である。

ｖｏｃｔ、ｏｒ−＋Ｃ３ｐｒｉｍｅｒｖｅｃｔｏｒｐＸ
Ｘ’４０４へのＣ７θ１フ→Ｓｅｒ変化はオリデヌクレ
オチド指示（または部位指示）ムタｒネーシスによって
実施した（Ｚｏｌ’ｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ：Ｎｕｃｌ
、Ａｃｉ＋ｉｓＲａｇ、１０：６４８７．１９８２）。

ＦｉｃｏＲｌ−ＢａｍＨｌ（〜１．１７６ｂｐ）フラグ
メントはプライ＝ｒ−５’−ｃＴＧＡにＴＱＴＧＡＡＡ
Ａｉ、’ＴＧ−３’を用いてムタｒノーシスのためにＭ
１３ｍｐ８中でサブクローン化し、Ｍ２Ｓ組換えｍＪ’
Ａ８ｆ得た。コードン１７の配列が５’−ＡＧＴ−３’
（Ｓｅｒ）であるクローンを単離しくｍＪＡ９）、ｍｃ
ｏｌｔ（−ＢｇｌｌｌフラグメントｋｐＸＸ４０４のＫ
ｃｏＲ（−ＢａｍＨＩベクターフラグメントにサブクロ
ーン化してＩＦＮＸ４０８表面、プラスミド、ｐＪＡ２
７（第６ｂ図）を得た。

例６ ＩＦＮＸ４Ｑ９１ＦＮ−β［：／４２−５６−ｅ（ｙ、
４０５４〕ＣＣｙｅ１７−＋５ｅ１−） ＩＦＩＪＸ４０９＆！ＩＦＮＸ４０８（ｉ、ｓヨヒＩＦ
ＮＸ４０４）の類縁体でアミノ酸残基４２の＋１１ｕ％
（Ｇｉｎで置換し、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ配列（残基
４２〜４４）が好ましくないと思われることから、予想
される二次構造の変化による影響を検討するために設計
された。

出発ベクター：ｍＪＡ９（上記参照） このプラークＭ１３ベクターはｍＱＯＲｌ−ＢａｍＨ■
プラグメント上に工ＦＩＸ４０８の全コード配列を有す
る。

ｍＪＡ９に対するＧｌｕ４２→Ｇｌｎの変換は上述のよ
うにプライマ−５’−ＡＡＡＣ！ＴＣ！ＴＴＯＴＴ（）
Ａ−ＧＧＧＡＴＧＴＯ−３′髪用いオリデスク１／オチ
ド指示ムタデノーシスによって行った（ＮｏｒｒｉＩｉ
Ｉら：Ｎｕｌｌ、八ｃｉｄＩｌ＋Ｒｅｅ、１１：５１０
３．１９８３の１呈告の改良法）。

コドン４２の配列が５’−ＯＡＡ−３’（（）：ｔｎ）
であるクローンを単離し、ｐＸＸ４０４のＫｃｏＲｌ−
ＢａｍＨｌベクターフラグメントにＫｃＯＲ（−Ｂｇｌ
１１〜６２０ｂｐフラグメントをサブクローン化 な表現するプラスミドｐ、ＴＡ３１り得た（第３Ｃ図）
。

例４ ＩＦＮＸ４１ＱＩＦＮ−β〔β２−）→α２１−５〕〔
β９−５６−＊ａ、フー５４〕この修飾、新規１ＦＮは
２個の異なる工ＦＮ−αから１つの分子配列を組合せる
ことによって付加、相剰あるいは他の効果が得られるか
どうかな検討するために構築された。

工ＦＩＸ４１０は工１１’ＮＸ４０２Ｋ類似する。

出発ベクター：ｐＭＮ４７ このベクターはｐｔ／２４０（ｐｔ／２４ｏは第４図に
下線な施した部分を除けばｐｔ／２４と同一である）の
０１ａＩおよびＢａｍＨ１部位の間に全合成工ＦＮ−β
遺伝子（第３ｊ図）シ挿入したものである。

合成オリイチクレオチｒ（第２ｂ図）をＣａｌ（“およ
びＮｒＪ部位の間に挿入し、第６ｄ図に示したヌクレオ
チド配列な得た。工ＦＮ４１０はプラスミドＰＡＳ２１
５から表現される。

例５ ＩＦＮＸ４１５ＩＦＮ−β〔β２Ｂ４６→α、２Ｂ−４
６］［０７ｓ１７−＋８ｅｒ〕（：Ｍｅｔ３１４Ｌｙｓ
〕この新規な修飾ＩＦＮはＩＦＮ−βの９〜５６領域に
おける置換の一般的影響、その程度を試験するために設
計した。抗ウィルス活性は低下し、他のＩＦＮ活性は上
昇または低下した。

出発ベクター：ｐＡＰ４ ｐＡＰ４は工ＦＮ−βを表現し、アミノ酸残基７４およ
び７５がＴＣＣおよびＴＯＧでコードされているほかは
ＰＧＣ！１０と同一である。独特のＸ）１０１部位を導
入して合成りＮＡの挿入を容易にする１こめに、これら
のセリンのコードをＴＱＡおよびＴＯ’ｌ’に変化させ
た。この操作は、ミスマツチプライマー：５’−０ＡＧ
ＴＧＯＴＯＧＡＧ（）ＡＡ−ＴＯＴＴＧＴＯ−３’な用
い、オリイヌクレオチド指示ムタｒネーシスによって実
施した。

合成オリ？ヌクレオチド（第２Ｃ図）をｐＡＦ４のＯｌ
ａ１％とＸｈｏｌ“部位の間に挿入し、第３ｅ図に示し
たヌクレオチド配列を得た。工ｙＮｘ４１５はシラスミ
ドｐＡＰ７から発現さメ１．る。

例６ エＦＮＸ４０２工ＦＮ−Ｊ：β９−５ｉ惰ｌ、フ゛５４
］（１θｕ１７−リｙ８１７１この新規、修飾工Ｆｉは
１ＦＮ−βのある領域をＩＰＮ−αｌで置換した場合の
抗ウィルス活性、抗増殖活性および免疫刺激活性の比に
対する影響を横側する目的で設計された。

出発ベクター：ｐＬ／２４（−１＝述のとおり）これは
成熟、天然ヒトエＦＮ〜β遺伝子に含有し、これはｔｒ
ｐプロモーターの制御下に発現される。

合成オリイヌクレオチド（第２ｄ図）をｐｔ／２４のＨ
ｌｎｆｌ”およびＨｇａｌ”部位の間＆Ｃ挿入し、第６
ｆ図に示したヌクレオチド配列な得た。工ＦＮＸ４０２
はシラスミドｐＸＸ４０２から発現される。

〜５４（５ｂｐＢｇ’ｌｌ−ＢａｍＨｌフラグメントな
欠失させ、高レベルの表現が達成される。

例７ ＺＩＸ４１９工ＦＮ−β〔βＱ−４２．α１７−４０’
）この新規な修飾１ＦＢ＋は１ＦＮ−βの９〜５６領域
の置換の一般的影響、程度を試験するために投首１・し
、抗ウィルス活性の低下と他の工ＦＮｆ占＠ｔ：（Ｑ上
昇ｖｇメ＊。置換の位置がＩＦＮＸ４０２とＩＦＮＸ４
０４の間の差を反映している。

出発ベクター：ｐＧｏ１０ 合成オリゴヌクレオチド（第２θ図）をｐＧＯｌｏのＯ
ｌａｌおよびＰｖｕ１部位の間に結合させ、第３ｇ図に
示したヌクレオチド配列を得た。

ＩＦＮｘ４１９はシラスミドｐＡＰ６から表現される。

例８ 工ＦＨＸ２Ｑ工ＦＮ、６１［／２１−４２→α□ＩＧ’
−４０］［□ｙｓ１）−＋ｓｅｒ：］構築の理由は工Ｆ
ＮＸ４１５の場合と同じである。

変化したアミノ酸配列は工ＩＦＮＸ４１９（α１７−４
０）の変化したアミノ酸配列の一部である。合成オリイ
ヌクレオチド（第２ｆ図）をｐＭＮ４７のＣ１ａｌ“部
位とＦｖｕｌ［％部位の間に結合させ、第３１１図に示
したヌクレオチド配列を得た。工ＦＩＸ４２０はプラス
ミドｐＮＷ２５かし）表現される。

’ＩＩ！’ＮＸ４Ｑ４ＩＩＱＩ−β〔β４４−５６、−
＋α、４２−５４］この新規な修飾ＩＩＦＮは、工ＦＮ
−βＫＴ、ＦＮ−α１（つある′領域な置換することに
よる抗ウィルス活性、抗増殖活性および免疫刺激活性の
比に夕・ｉする影響な検討するために設計された。

出発ベクター：ｐＬ／２４ 前述のとおりである。

合成オリビヌクレオチｒ（第２ｇ図）ｋｐｔ／２４のＤ
ｉｅｌ’部位とＩ（ｇａｌ”１３位の（川に４中入して
、第！１１図に示したヌクレオチド配夕１」をイ月だ。

つ（為で−５４６ｂｐＢｇｌｌ−ＢａｍＨｌフラグメン
トを、高レベルの表現を得るために欠失させた。

新規な修飾工ＦＨの大腸簿における１μ−−□□−□□ １０１内で０Ｄ６０００．５までの低レベルのトリシト
ファンの存在下に増殖した。メジウム（２００ν）は、
Ｍ９塩、０．５％グルコース、０．１ｍＭＣｔｈＣ１２
，０，５％カサミノ酸、１ｍＭＭｇＳＯ４、０−１１１
Ｑ／ＦｒｔＡビタミンＢ１．２−５μｇ／ｍ／！）リゾ
トファンおよび１００μｇ／ｍｌカルベネシリンな含有
させた。

トリプトファン４２．５μｇ／ｍｓを４在させたほかは
上述と同じメジウム中、激しく通気しながら６７℃で生
育させ１こ各クローン（宿主に、ｃｏｌｉｌｌＢ１０１
）の−夜培養液２〜４ｍｌなメジウム２００ｍＡに接種
した。ｏＩｌ、ｏＱＯ，５で１Ｅ：、ｃｏｌｉす」−プ
ロモーターのインデューサー１なゎち工ＦＮ合成のイン
デューサーでもあるインドールアクリル酸を２０１部ｇ
、／ｒｒＬｉ加えた。誘発４〜５時間後に、培養液３ｍ
ｌをとり（０Ｄ６ｏＯハ０．７５−１．２＋’）［１ｆ
ｆｌ）、次のように分けた。１威は総１’ｎ１溶化、Ｊ
工ＦＮ抗ウィルス活性または抗細胞増殖活性（活性は変
性／り元サイクル後しこ再現した）の評価に、１肩ｊは
ポリアクリルアミドデル中の総蓄積−Ｊｃｏｌｉ蛋白プ
ラスＩＦＮの表示に使用した。

ａ）総「可溶化」工Ｆｌｌｉ抗ウィルス活性の評価総「
可溶化」ＩＦＮ抗つ・イルレス活性の回収のため、ペレ
ットな培養液１ｍｌあブこりの０Ｄ６００１Ｊ、１に対
してライシス緩衝液（５１を尿素、’６０ｍｕ１Ｊａ（
Ｊ、５０ｍＭＴｒｉｇ−Ｈ（ＪｐＨ７，５，１９１＋８
ＤＩ３１％２−メルカプトエタノール、１φＵＳＡ）２
Ｑμβ中で攪拌した。混合物を９０°Ｃに２〜６分間加
熱し、−７０℃で１５分間凍結し、解凍し、１７Ｋｒｐ
ｍで２０分間遠心分離した。上澄液＆ｌｏｇ１０間隔で
１：１０５まで希釈し、ｉｎｖｉｔｒｏのマイクロプレ
ート定量システムな用い、ＥｉＭＱウィルスの細胞毒性
作用に対しＶｅｒｏ細胞な認められる防禦効果によって
工ＦＨの抗ウィルス活性を評価した（たとえばＤａｈｌ
およびＤｅｇｒｅ：ＡｃｔａＰａｔｈＭｉｃｒｏ’ｂｉ
ｏｌＦＥｃａｎ６．１３８０：８６３．１９７２参照）
。希釈液には５ＱｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪｐ）（７，５，
３０ｍＭＮａ（Ｊ、１部％ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ
）を用いた。

ｂ）総ボリペゾチＶのポリアクリルアミドデル電気泳動 培養液１−からの細胞を０Ｄ６０００．１／ｍｅにつき
最終サンプル緩衝液（５Ｍ尿素、１チ８ＤＳ、１チ２−
メルカゾトエタノール、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪｐ）
Ｉ７．５．３ＱｍＭＮａＣ１および０．０５％ブロモフ
ェノールブルー）１０μｔと混合した。混合物な９０℃
に５分間加熱し、１０分間遠心分離し、５〜７μｔを１
５チアクリルアミド／’０．４％ビスアクリルアミド゛
＋Ｌａθｍｍ１ｉ”デルにロードした。電気泳動は７０
Ｖで１８時間行った。ｒルン固定し、Ｏｏｏｍａｅｓｉ
ｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕθで染色し、乾燥し、撮影
１−だ。

性質 培養液１１を誘発し、０Ｄ６００’１〜２になるまで上
述のように生育させた。、ｌ１ｌＩ胞ペレツトを３０＃
Ｉ／’の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ、ｒｊＪＢ−Ｑに肖
懸濁し、氷上、１００Ｗで４に１分超音波処理ｉ−１つ
いで１５Ｋｒｐｍで１時間遠心分離した。６υＪｎｌの
煮沸抽出溶液（５（ＪｍＭＴｒｉＢ−１１（ＪｐＨ８，
υ、５０ｍＭＤＴＴおよび１〜２％ＳＤＢ）ｌ加え、混
合し、溶液を超音波処理した。溶液なついで５分間煮沸
し、１５Ｋｒｐｍで１時間遠心分離し、上澄液に（ＮＨ
４）２Ｓ０４を４０％飽和まで加え１こ。１５分後、１
０Ｋｒｐｍで２０分間遠心分離して沈殿を集めた。５ｍ
／１ｔ７）温５０ｍＭＴｒｉｓ−ｆ（Ｃｌ４Ｊｌ（３，
Ｑを加えてペレットヲ再溶解した。１時間１５Ｋｒｐｍ
で回転させたのち、溶液を５ＱｍＭＤＴＴ中で５分間煮
沸して再還元した。

ＩＦＮｙＬＫＢＡ（！Ａ４４ｆ）２．３５ｃｍｘ７０ｃ
ｎｔｎシカラム上、１％ＳＤＳ、５ＱｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＪｐＨ８，０で分画し、ＩＦＮ１〜２〜を含むピーク
画分な集めた。

ＳＤＳ＋ｉ除去し、パイロジエンな消失させるため、ａ
）蛋白なアセトンで沈殿させ、５０係ギ酸、１０％イソ
プロピルアルコール（溶媒Ａ）に再溶解するか、ｂ）ギ
酸６部とインプロピルアルコール１部をあらかじめ混合
し、サンプル６部に加える、のいずれかの操作な行った
。混合物１ｃｍ１８Ｓｅｐ−Ｂａｋ（量３ダ以上）また
はＣ−１８ＢｏｎｄｇｌＱｔ（Ａｎａｃｈｅｍ）に適用
した。カラムを最初、溶媒Ａ（２〜４１）で洗浄し、Ｉ
ＦＮを５０チギ酸、５０％イソプロピルアルコールで溶
出した。

溶出したＩＦＮｉ水に対して透析しギ酸を除き、ツイテ
ＧｕＨｃＪＶ、（６Ｍ）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ，
１，Ｐ）１８．０にとる。工ＦＮを正常に戻１−ためサ
ンプルを１ＱｍＭＤＴＴ中１００℃で還元し、ついで１
００ｍＭＴｒｉｓＨＣＪｐＨ８−ＯＮ２００ｍ”ｃＪ、
、１ｍＭＥＤＴ八および０．１％Ｔｗθθｎ２ｏまたは
１％Ｈ８Ａ中に１００倍に希釈した。生物学的定量前に
蛋゛白な評価した。

精製修飾インターフェロンの抗ウイルス性霊長類細胞中
の抗ウィルス活性を測定するためニ単一ウィルス（脳心
筋炎ウィルス−ｇＭａ）？＜用い７こ。

サル（Ｖｅｒｏ）およびヒト（Ｏｌｔａｎｇｃｏｎｊｕ
ｎｃｔｉｖａおよび５ｅａｒｌｅ１７／１線維芽細ｎ＜
＋）起源の細胞にチャレンジさせたのち、ウィルスの細
胞毒性作用（ｃｐθ）を測定しり（Ｄａｈｌ：ｔｄＪ−
ヒＤｅｇｒｅ、１ｂ１ｄ）。

鵠！乳凭光４Ｌ〕不迂−−７−！’、、！−４７ｉ：増
殖作用抗増殖作用は６種のヒト細胞系列の複製の阻害能
によって評価した（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら：５ｃｉ
ｅｎｃｅ１２０６：１０９１．１９７９）。スナわチＤ
ａｕｄ１（リンパ芽球）、ＨＩＰ−２（カルシノーマ）
およびＲＤ（横絞筋肉腫）髪用いた。Ｄａｕｄｉ細胞（
対数期）ン各種希釈度のインターフェロンの存在下、９
６ウエルプレートで６日間培養した。メジウム中のフェ
ノールレッド指示薬は細胞の生付進行とともに赤から黄
（酸性）に変化する。大気に触れてＰＨが変化するのな
防止するため液体パラフィンな加え、メジウム中のＰＨ
をＤ７ｎａｔｅｃｈプレートリーダーで比色測定した。

インターフェロンの細胞増殖阻害は色の変化の対応する
低下となって現りれる。対数期のａｇｐ−２およびＲＤ
はインターフェロンの存在下、９６ウエルプレートで６
日間培養した。細胞をついで０．２５％ゲルタールアル
デヒドで固定し、メチレンブルーで染色した。エタノー
ル抽出後、色の強さｆＤｙｎａｔｅｃｈプレートリーダ
ーで測定し７こ。この場合も色の強さは細胞の生育に比
例すると考えることができる。粗細菌抽出液中の新規、
修飾１ＦＮのｉｎＶｉｔｒＯでの抗増殖活性も測定した
（Ｄａｕｂｉ細胞系列のみ）。

新規、修飾インターフェロンによる抗体依存細胞餉特−
−−―ｉ−□−−−１□□□−→→６．峠、い３．１１
６．□性細胞毒性（ＡＤＣ！Ｏ）の刺激 ΔＤＣＣは免疫学的に特異的な細胞系でその作用は抗体
によって仲介される。この定量にはいくつかの変法があ
る。グループ００個体からの血清を用い抗Ａ抗体で感受
性な高めたＩｉ１０ｒ−標識ヒト赤血球（ＧｐＡ、Ｒｈ
−＋−ｖｅ）ｋグループ０の個体からの軟層細胞ととも
にインキュベートした。軟層細胞との一夜インキュベー
ション後、インターフェロンを評価するため平行して実
験した非処置対照と比較した（ＭｃＯｕｌｌａｇｈら：
Ｊ、ＩＦＮＲｅｓ、、３：９７．１９８３）。

第１表に粗細菌抽出液中における群Ｈの新規な修飾工Ｆ
Ｈの表現レベル、抗増＃ｌ活性および抗ウィルス活性を
示した。活性の範ＩＪｉｌ４１生物学的システムまたは
アッセーにおける通常の変動な示すものである。表中の
活性は上述の」：うにＳＤＳ／尿素／メルカプトエタノ
ール処理後、抽出液を１俤ヒト血清アルブミンに希釈す
ると再現する。

第１表から、対照、ＩＦＮ−βの抗ウィルス（ＡＭ）お
よび抗細胞増殖（ＡＰ）活性の変動は４倍の範囲内であ
ることを示している（実験１２０以上）。

ＡＰ活性や表現に対してＡＶ活性が、工ＦＮ−βに比べ
て低下した例は、工ＦＮＸ４０７および工ＦＮＸ４１９
である。工ＦＮＸ４０７は工ＦＮ−βに比し、約２から
９倍低いＡＶ活性と２倍未満低下したＡＰ活性を有する
。さらに大きな変動がＩＦＮＫ４１９の場合に認められ
た。ＡＶ活性は工ＦＮ−βの７．７から５７倍に低下し
たが、ＡＰ活性には変化が認められていない。

結論として、細菌抽出液中に存在する新規な修飾工ＦＮ
は、ＡＰおよびＡＶ活性の比を相互にあるいは１ＦＮ−
βと比較すると著しい序を示す。新規１ＦＮと工ＦＮ−
βの間の生物活性の差をさらに正確にυＩ１１定するた
め、上記サンプルの一部は蛋白精製に付しプこ。以下の
定量は新規な月１’Ｈに細胞特異性の変ｆヒしたものが
ないかをも明らかにするために設計されたものである。

第２表は精製ＩＦＭＸ４ｉ５トｉ：ＦＮ−βオヨヒＩＦ
ｌｉＸｆ３Ｑ５ノ、５ｍノ異ナル＃ｌｆｌｌ１ｉｔ！系
列ｔｆ）ＥＭＯ’ｙイルスに対するｉｎＶｉｔｒＯ抗つ
づルス活性な比較した結果である。ＩＦＮＸ４１５）Ｊ
、ａｕＡＮＧ細胞系列でのみ抗ウィルス活性の増加な示
している（６〜７倍）。すなわち、本発明の修飾Ｉ１１
’Ｈの抗ウイルス特異性はＩＦＮ−／や工ＦＮＸ８（］
５とは異なることを示している。Ｍ３表は精製ｒ、ｎｉ
ｘ４０７と工ＦＩＸ４０８＜ｒ）ＩＦＮ−βと比較した
別個の実験の結果である。工ＦＩＸ４０７は３種の全系
列に対して特異的な工ＦＮ−βより弱い抗ウィルス活性
を示したが、ＩＦＮＸ４Ｑｆ３は工ＦＮ−βと類似して
いる。

第２表 新規な修飾インターフェロン（精製）のお 細胞系列 −１６１７／１０ｈａｎｇＶｅｒ。

５１．８Ｘ１０５３．ｌＸ１０６３−３Ｘ１０５１．３
×１０５５．１Ｘ１０５７．／）Ｘ１０５ｘ８０： 比 に４１５／ＩＴＡ１．４６．１０．４ Ｘ４１５／Ｘ８０５２．４７．００．８Ｘ８０５／Ｂ］
Ｍ”八〇、６Ｑ、９０．６第６表 新規な修飾インターフェロン（精＆ｌ）の抗ウィルス活
性（単位／１りより′Ｎ蛋白）細胞系列 工Ｅ’ＮＸ１６１７／１０ｈａｎｇＶｅｒ。

ｊ’−４０７（５，１ｘ１０”９．５ｘ１０”１．９ｘ
１０’Ｘ４０８４．２ｘ１０５４．６に１ｏ１１１．２
に１０６ＢルＴＡ１ｔ、９ｘ１０’７．２に１０”ｑ、
１に１０５比 Ｘ４０７／ＢＥＴＡ（０，０２０，０１０，０２第４表
は精製ＩＦＮＸ４１５の抗増殖活性を６種の異なる形質
転換細胞系列につ（・て工ＦＮ−βおよび工ＦＮｘ８０
５とｉｎｖｉｔｒｏで比較した結果である。

工ｖｙｘ８０５およびＩＦＨ−βはすべての細胞系列に
対して類似の活性な示したが、ｘｙｍｘ４１５はＤａｕ
ａｉ細胞に対して著しく高い活性鉗示した。すなもち、
工ＦＮＸ４１５のｉｎｖｉｔｒｏＩ／Ｃおける抗増殖活
性の特異性は、工Ｆ’Ｎ−βおよび工ＦＮＸ８Ｑ５の場
合とは異なるものと思われる。第５表は精製工ＦＮＸ４
０７と工ＦＮＸ４０８をＩＦＮ−βと比較シタ別個の実
験の結果である。工ＦＮＸ４０７はＨ１！ｉＰ−２およ
びＲＤ細胞系列に対しては明らかに１ＦＮ−βより低い
抗増殖活性を示したが、Ｄａｕｄｉ細胞系列においては
ＩＦＮ−βと類似の活性を示ず。工ＦＮＸ４０８は工Ｆ
Ｎ−βと類似している。

第４表 新規な修飾インターフェロン（Ｍ製）の細胞系列 Ｘ４１５２．２ｘ１０’２．２ｘ１０’１．９ｘ１０５
ＢＦｊＴＡ８．９ｘ１０３６．５１［］”１．４に１０
’Ｘ８０５５．４ｘ１０３４．３ｘ１（Ｆ１．２ｘ１０
’比 Ｘ４１５／ＢＩ！ｉＴＡ２．５３．４１５．６Ｘ４１５
／に８０５４．１５．１１５．８Ｘ８０５／ＢＫＴＡＯ
，６０，７０，９第５表 新規な修飾インターフェロン（精 Ｍ）の抗増殖活性（単位、／即ＩＦＮ蛋白）Ｘ４０７（
５，６ｘ１０１（２，０ｘ１０２１．０Ｘ１０５Ｘ４０
８８．９Ｘ１０３１．０ｘ１０’３．１に１０５ｓ１０
５ｓ、３ｘ１０’１．９ｘｌＯ’２．５ｘ１０５比 ｘ４Ｑ７．／ｓｇ’ｒＡ＜０．００２＜０．０１０．４
Ｘ４０ａ／ＢＥＴＡＯ，７０，５１，２第６表は精製工
ＦＩＸ４１５のｔｎｖｌｔｒｏｔｌ）活性に８０５と比
較した結果である。概して、工ＦＮｘ４１５．１１１Ｎ
Ｘ１３０５オ、ＬびＩＦＮ−βの、５群のドナーからの
軟層細胞プレバレージョンＡＤＣＯ活性の刺激能には有
意な変動＆ｊなかった。これはＱＨＡＮＧ細胞における
ＡＶ活性内増大やＤａｕｄｉ細胞におけるＡＰ活性の増
大が工ＦＮＸ４１５に認められたこと（第２表、第３表
）と対照的である。第７表には工ＦＮＸ４０７と工１’
ＮＸ４０Ｂｋ比較Ｌタ別個の実験の結果な示す。ＩＦＮ
Ｘ４Ｑ７のＡＤＯＯ活性は低くて正確な測定は不可能で
あり、工ＦＮＸ４０８は工ＦＮ−βに比べてわずかに低
い特異的活性を示した。

第６表 新規な修飾インターフェロン（精製）の免ｒｔ調節（ｈ
Ｄｏｃ）ｉ性（単位／ｍｙＩＦ１１Ｉ蛋白）ドナー Ｘ４１５１．３ｘ１０’２．３Ｘ１０’７．ｌＸ１０２
６．３に１０”１．２Ｘ１０”ＢＥＴＡ１．０に１０３
１．９ｘｌＯ”１．１ｘ１（１”１．１に、１０４１．
７Ｋ１０３Ｘ８０５４．５ｘ１０２−３．２Ｘ１０２１
．５に１０２１．８Ｘ１０”５．８Ｘ１０”比 Ｘ４１５／ＢｆＣ−ＫＡ１．３１．２６．５０．６０．
７Ｘ４１ゾ８Ｇ５２．９７．２４．７３．５２．ＩＸ＆
］Ｆｙ４３ＥＴＡＯ，５０，２、１，４０，２０，３工
ＩＩ′ＮＸ４［１２オよび工ＩＦＮＸ４Ｑ４１Ｑ精製と
生物学的表現工Ｉｉ′Ｎ蛋白をドデシル硫酸子トリウム
を補助的に用いてＥ、ｃｏｌｔから抽出し、へＣへ４４
上クロマトグラフィーによってＮ製した。辿りアクリル
７Ｓトｌ’、Ｉｔ／霧気泳動（ＰＡＧＦｉ）、５析によ
ハば、ＩＦＮＸ４０１の純度は７０〜９０チと評価さハ
ている。

新規なインターフェロンはその特異的抗ウィルス活性、
抗増殖活性および免疫調節作、１［１ン以下の定量系に
よって測定した。

］）抗ウィルス活性の測定 （ａ）脳心筋炎ウィルス（ＫＩＪＱ）を用いた細胞毒性
（０ＰＲｉ）の測定：この方法はＥＭＣウィルスの細胞
前性作用に対する細胞単層のインターフェロンによる保
股能を測定する標準的な方法がある。使用した細胞系列
は、Ｖθｒｏ（アフリカミトリサル上皮）、Ｗ工ＳＨ（
胎児上皮）、ＭＲＯ−５（胎児肺線維芽細胞）および１
７−１（胎児肺線維芽細胞）である。細胞単層は、２係
のドナーウシ血清子グルタミンおよび抗生物質を含むＤ
ＭＫＭメジウム中、９６ウエルの平底ミクロタイター仮
中に調製した。

１系列２希釈のインターフェロンン細胞と６７°Ｃで１
８〜２４時１１ｊｌインキュベ−１・し、上澄液な捨て
適当なチャレンジ用ｍ・のＫＭＯウィルスをメジウム中
に加えた。３７°Ｃで２４時間インキュベートしたのち
、上澄液を捨え、単１ｔ”ｉＳ・ホルマリン／食塩水ｋ
Ｃ固定し、クリスタルバ・イ第１／ットで染色した。プ
レー１−を肉眼で観察し、細胞毒性作用の５０多阻害を
示すインターフェロンの希釈率を決定した。

（ｂ）プラーク低下測定法：ｌ１ｏｒｐｅｓｓｉｍｐｌ
ｅｘ２型（ＥＩＳＶ−２）１７（Ｖｏｒｏ（サル）、ｃ
ｈａｎｇ（ヒト）およびＭＤＢＫ（ウシ細胞）に対して
用いる。融合性の単層細胞を９６ウエルの平底ミクロタ
イター板に調製した。希釈インターフェロンと３７℃で
１８時間インキュベートしたのち、細胞に適当数のプラ
ーク形成単位のウィルスも：チャレンジさせた。これを
０．５チカルがキシメチルセルロース０．５％に含むメ
ジウムで覆い、３７℃で２４時間インキュベートした。

プラークを固定し染色したのち、プラークを顕微値で数
え、非処置対照ウェルの平均最大プラークに対する５分
率で表示した。

インターフェロン力価は１ウエルあたりのプラーク数の
５０チ低下を与える希釈率の逆数である。

ＩＩ）抗増殖活性の測定 Ｄａｕｄｉ細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏの改良ｇａｇ１ｅｇ
メジウム（ＤＭｆｆｉＭ）にとり、９６ウエルの組織培
養板に２ｘ１０５／ｍＡ（２００ｔｔｔ）接種した。接
種時にインターフェロンな加え、５％００２の湿大気中
６７°Ｃで細胞をインキュベートした。２２時間後にト
リチウム化チミジンを加え、細胞なさらに２時間インキ
ュベートＬ、Ｆ１ｏｗ細胞ハーベスタ−上に収穫し、洗
浄し、５チドリクロロ酢酸で処理した。

酸不溶性放射能をカウントし、チミジン取り込み阻害な
インターフェロンの抗増殖作用の評価に用いた。

ヒト末梢血液からＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ沈降法
によって分離した軟層細胞な補足ＲＰＭＩ１６４０メジ
ウムに懸濁し、希釈インターフェロンとともに一夜、３
７℃でインキュベー＋−シｒ、ニー。インターフェロン
を除去する１こめに洗浄したのち、これらのエフェクタ
ー細胞を５１０ｒ−標識に５６２細胞とともに、エフェ
クター細胞と標的細胞の割合が２０：１または１０：１
になるようにして３７℃でさらに４時間インキュベート
した（Ｋ５６２）−！、ヒト腫瘍由来の細胞系列である
）。遠心分離後、上澄液の一部をとり、放出された放射
能を測定した。

最大５１Ｃｒ放出は標的細胞懸濁液の解凍−凍結をくり
返したのちの値と、エフェクター細胞を加えないで標的
細胞をインキュベートした場合の対照ｌ々ラックラウン
ドからめた。結果は５１（Ｈｒの特異的放出の百分率で
示した。

試験サンプル−バックグラウンド 一□−−−−−−−−−−ｘｉｏ。

最大放出−バックグラウンド ２、結果 Ｉ）抗ウィルス活性 （ａ）Ｑ１’Ｊ１ｉアツセー−１％ＭＯウィルス第８表
にはｖｅｒｏおよび４種のヒト細胞系列中でのＨＭｃウ
ィルスに対するハイブリッドｘ４０１および組換え体由
来工ＦＮ−βの活性を掲げる。活性は単位／Ｍ９蛋白で
表示する。

第８表に含まれる異なる細胞型における個々のインター
フェロンの値および全細胞についてまとめた値から、工
ＦＩＸ４０２と工ＦＩＸ４０４４０抗ウイルス活性は１
ＦＮ−βよりも一定して低く、この低下は工ＦＩＸ４０
２で著しい。分散分析では、工ＦＮＸ４０２の総合抗ウ
イルス活性平均値は工ＦＮ−βの値の１チ以下である。

工ＦＮＸ４０４の活性は１ＦＮ−βの５〜１５％である
。

比較の目的で、線維芽細胞工ＦＮ−βオｄよび白血球Ｉ
ＦＮ−αの活性（単位／ｍ／）ｌ第９表に示す。

天然のインターフェロンは精製された形では得られない
ので、定量は大量の非インターフェロン蛋白な含んだ希
釈溶液な用いた。したがって、天然の工ＦＮ−βおよび
工ＦＮ−αの結果は単位／ｍｇでは表示できず、第９表
の結果なそのまま第８表の結果とは比較できない。しか
し、両天然インターフェロンは１種のインターフェロン
内では５稲の細胞系列に共通にほぼ一定の値な維持して
いることがわかる。ただＷＩ８Ｈが１ＦＮ−β、工ＦＮ
−αのいずれに対してもわずかに感受性が高いように思
われる。

（ｂ）プラーク低下７ツセーｕｓｖ−２プラーク低下ア
ツセーにより■ｓｖ−２で得られた抗ウィルス活性につ
いての類似の結果な第１０表に示す。この場合、実験は
ヒト○ｈａｎｇ細胞、す、＋Ｖｓｒｃ）細胞、つ、シＭ
ＤＤＫ細胞に限定された。工ＦＮＸ４０２および工ＦＩ
Ｘ４０４はヒトおよびサル細胞における抗ヘルペス活性
は低かつ１こ。一方、ウシ細胞系列では、工ＦＮＸ４０
４はＱｈａｎｇおよびＶｅｒ。

の場合と同様に低い活性な示したが、ＩＦＮＸ４０２の
この細胞ラインにおける活性は、蔦りべきことに工ＦＮ
−と変化がなかった。分散分析により工ＦＩＸ４０２と
ｘ４０４のＶｅｒｏおよびＯｈａｎｇ細胞における活性
の低下は著しく有意で、また工ＦＮＸ４０２のｃｈａｎ
ｇとＭＤＢＫ細胞の活性の間にも有意差がある。

天然の工ＦＮ−βおよび工ＦＮ−αのこの３種の細胞ラ
インにおけるＨ８Ｖ−２に対する活性のパターンな第１
１表に示す。この場合も、工ＦＮが不純な特異的活性で
なく単位／Ｗｔｌで示されている。他の実験室での結果
とは異なり、本発明者らのＭＤＲＫ細胞では工ＦＩＪ−
βがかなりよく反応し、ｖｅｒｏおよびＱｈｌＬｎｇ細
胞の場合ヒはぼ回じ希釈率で抗ウィルス活性な示してい
る。一方、１．ＴＪ’Ｎ−α標品はｖｅｒｏおよびＯｈ
ａｎｇ細胞のいず、Ｊｌの場合よりＭＤＢＫ細胞で高い
活性が認められに。このコントロール値から、Ｏｈａｎ
ｇおよびｖｅｒｏ細胞における工ＦＮＸ４０２の活性の
低下、ならびにＭＩＪＢＫ細胞における活性の維持は、
これらの細胞ラインにおける天然ＩＦＮ−αの反応に類
似するといえる。

第１０表 組換えインターフェロンのｌｌ８Ｖ−２に対する抗ウィ
ルス活性（プラーク低下アツセー）細胞ライン エＦＮ−β１．２Ｘ１０５４．７に１［１５２，５Ｘ１
０’ＩＦＮＸ４０２１．１ｘ１０３１．３ｘ１０３３．
４に１０５ＩＦＮＸ４０４７．０ｘ１０”９．９ｘＩＤ
３４．４ｘ１０３第１１表 天然インターフェロンのサル、ヒト、 ウシ細胞におけるＨ８Ｖ−２に対する抗ウイルス活性比
（プラーク低下アツセー）インターフェロン単位／Ｔｎ
！。

細胞ライン 白血球由来５９９０６．８ＸＩＬｌ” 工ＦＮ−α 上述の細胞におけるＲＮＡおよびＤＮ八へィルスに対す
る抗ウィルス活性の結果をまとめる。第１２表にはＯｈ
ａｎｇおよびＶθｒｏ細胞におけるＥＭＣおよびｕｓｖ
−２に対する組換えおよび天然インターフェロンの活性
を示す（データは第８表〜第１１表から）。２種のウィ
ルス型の一方または他方に対するＩＦＮＸ４０２の好ま
しい活性についての結果には異論は認められない。この
２組の定量結果Ｕきわめてよく一致し、有意差はない。

したがつ１第８表に示した關Ｃウィルスに対する抗ウィ
ルス活性を分散分析により評価した子均抗つィルスη性
は、抗ヘルペス活性の評価の場合も同様であ２ことが確
認され、工ＩＦＮＸ４０２の判異的抗ウィルス活性を支
持するものである。

第１２表 組換えおよび天然インターフェロンのヒト、ザル細胞で
測定した廃石筋炎ウィルスおよびＨ８Ｖ−２に対する抗
ウィルス活計の比較組換えインターフェロン（単位／〜
蛋白）平均抗ＢＭＯウ平均抗Ｈ８Ｖ−２ イルス活性活性（ｖｅｒｏおよ （第１表から）びＯｈａｎｇ細胞） 工ＦＮ−β２．４に１０５３．５Ｘ１０５工ＦＮＫ４０
２１、１ｘｌｏ”１、２ｘ１０３ＩＦＩＪＸ４０４８．
９に１０３８．５に１０３、（Ｃ）非定型ａｈ艷ソノ町
唄５４７ｙＣ−ｇＨ−：’ｂ−４喜久先冬高いパッセー
ジ（約×１６０）を維橿寺するＱｈａｎｇ結膜細胞の１
ラインの突名敢変異性４ｊ、１１’Ｎ−、βに感受性が
高＜、′Ｊ再′帛用℃・られる７ぐツセＰＩＱ、低い正
常Ｏｈａｎｇ細胞の約６倍１Ｄ（直を示ｌ−０同時に非
定型高継代性Ｃｈａ、ｎｇｍＦ！＆ｉ（ｌｔｙＪ？ツセ
ージの一母体ｃｈａｎｇ細胞に比し工ＦＮ−αＣｒ）感
受性を１００倍増加させる。したがって、高およびイ氏
７ぐツセージＯｈａｎｇ細胞しておけろ抗ウィルスｉ古
性を比較すれ６′ｆＳ特定の組換え体のα様性質＋Ｑ程
度を知ること力１できる・ この方法における組換え工Ｆ’ＮＸ分子＋ｒ）プロフィ
ルを第１３表に示す。工ＦＮＸ４０２＆まα２活性力１
顕著である。

第１６表 郭定型０１１ａｎｇ細胞におりる組換★および天然イン
ターフェロンの抗ウィルス活性ＣｈａｎｇＵｊｌａｎｇ
０ｈＡ１０ｈ （高パッセージ）（通常の低パ比 単位／ｍｌ １ＦＮ−β１．６ｘ１０’５．２と１１１５３工ＦＮ１
４０２１．３Ｘ１０’４．１ｘ１０２３１７０工ＦＮＸ
４０４５．６ｘ１０’１．８に１０’３単位／ｍｌ Ｄａｕｄｉ！ｊンパ芽球細胞に対−する生育阻害活性を
各種組換えインターフェロンについて、それぞれ少なく
とも４回反復測定した。結果は平均値として第１４表に
示す。活性は非処置対照卸１胞における最大チミジン取
り込みの５０％阻害に必要な蛋白濃度として表示した（
より５ｏ）。抗ウィルス活性の弱い工ＦＮＸ４Ｑ２は工
ＦＮ−βと同じ生長調整活性を示した。一方、ＩＦＨＸ
４０４の生長調整活性は消失してい１と。

第１４表 Ｄａｕｄｉヒトリンパ芽球細胞で測定した組換えインタ
ーフェロンの抗増殖活性 より５０（μｇ／献） 補正平均９５チ信頼 測定回数ＩＤ５ｏ限界 １ＦＮ−β４３．８１．５〜９．８ 工ＦＮＸ４０２６３．２１．４〜６．９工ＦＮＸ４０４
４４４．７１７．４〜１１４．８（Ｉｌｌ）免疫調節活
性−ＮＫアツセー組換えインターフェロンについて、天
然キラー（ＮＫ）細胞活性を増加させる能力をくり返し
測定し、計９〜１１の定量結果な）Ｆ均して第１５表に
示す。抗増殖活性の場合と同様【Ｃ１特異的ＮＫｉ＋ｊ
ｌ激活性は５０チの効果を生じる蛋白用量濃で表示しに
（”Ｄｓｏ）。

ＩＦｌｌＪＸ４０２もほとんどＮＫ刺激活性がなく、そ
の活性は母体の工ＦＮ−βの約６５分の１である。

１１＋’ＮＸ４Ｑ４も活性は低下しているが、約４分の
１である。こ第１．らの差は分散分析によ〜り有意であ
る。

゛第１５表 ヒトＮＫ細胞で測定した組換えイン 測定回数補正平均９５チ信頼 ５Ｄ５ｏ限界 １Ｆトβ１１３．４２．１−５．４ 工ＦＮＸ４０２９１１７．０３３９ 工ＦＮＫ４０４１０１５．１９．３−２４．３３、結論 各インターフェロンの抗ウィルス活性、抗増殖活性、免
疫調節活性の平均値を第１６表にまとめる（抗ウィルス
活性は数字が大きいほど高いが、より５０および５Ｄ５
ｏの値は大きいほど活性が低いことになる）。参考に、
第１６表の下段には母体の工ＦＮ−βとの比として結果
な示す。

第１６表 組換えおよび天然インターフエ 抗ウィルス活性抗増殖活性免疫調節活性（Ｕ／ｉ９）（
より５ｏ４Ａ’ｕＦ１）（ＳＤ５０４４１）工ＦＮ−β
２．４に１０５３．８３．４ｎｒＮｘ４０２１．１ｘ１
０”３．２１９５．０比（１ＦＮ−β＝１００） 工ＦＨ−β１００１００１００ １ＦＮＫ４０２０．５１００（１１８）３工ＦＮＸ４０
４３．７９．２３ 図中０内の数字は真の計１．値である。１００との間に
有意差はない。他はすべて、１００との差が有意である
。

工ＦＮＸ４０２は１ＦＮ−βと回じ抗増殖活性を有ずろ
が、抗ウィルスおよび免疫ψり激活性は著しく低下して
いる。

工ＦＮＸ４Ｑ４は３種の生物活性はすべて低い。

こ九らの分析から得られた最も４（べき結果はＩＦＮＸ
４０２で活性の分離が行わＡｔていることである。この
所見は全く予期できなかったが、きわめ゛〔興味深い。

“ｌ−１よりら、この分子には完全な抗増殖活性が残っ
ているのに、他の作用はほとんど消失しているが、これ
は抗ｍ（す削としては有効で、しかも前件や望ましくな
い副作用は低下することが期待させる。

上番でまとめた生な結論は、ヒトの細胞系における結果
に基づいている。ＭＤＩＩＫ（ウシ）およびＯｈａｎｇ
（非定型ヒト）では、ＪＦ’ＮＸ４０２ヘの感受性の増
大がみられる。ヒト正常細胞でこのハイブリッドにみら
れた抗ウィルス活性の低下は上述の異種性または非定型
システムでは認められて−・ない。したがって、ＭＤＢ
Ｋとヒトまたはサル細胞の間での抗ウィルス活性の比（
第１０表）ある（ＳはＯｈａｎｇＡと正常Ｃ！ｈａｎｇ
細胞の間の抗ウィルス活性の比が、ＩＦＮＸ４０２では
著しく大きく、工ＦＮ−βや他のハイブリッドとは異な
っている。

ＭＤＢＫ／ＯｈａｎｇまたはＯｈａｎｇＡ、／Ｏｈａｎ
ｇ比の上昇番よ、天然の白血球工ＦＮ−αの特徴である
（第１１表および第１３表）。この点で、工ＦＮＸ４０
２ノ・イブリッドはα様の性格をもっているといえる。

本発明の新規な修飾インターフェロンは医薬組成物につ
いて公知の方法により製剤化することｈ″−できる。こ
の場合、活性インターフェロンは特定の投与方法に応じ
て、医薬的に許容された担体と混合して配合される。本
発明のインターフェロンの供給に適当な組成物および製
剤につ（・ては、たとえばＲｅｍｉｎｇｔＯｎのＦｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ５ｃｉｅｎｃｅ（ｌｉｔ、Ｗ、
Ｍａｒｔｉｎ）の記載が参考になる。たとえば非経口投
与製剤では、通常、生理的に許容される液体、食塩水、
平衡塩溶液等のビークル？用いる注射液とする。経口投
与製剤としては、固体製剤たとえば錠剤ま１こはカプセ
ル、液体溶液または懸濁液り挙げることができる。

本発明の新規な修飾インターフェロンはヒトまたは他の
動物に投与することができる。これは各種投与経路たと
えば経口、経静脈、筋肉内、腹腔内、経鼻的、経皮的ま
たは皮肉投与によって動物（Ｑ細胞に効果を発揮する。

この・ｆンターフエロン組成物は免疫抑制があるまたは
１．ｃい悪性腫瘍または新生物患者、免疫調節または抗
ウイルス治療な必要としている患者に処方することがで
きる。投与Ｊ’ｔｔは天然インターフェロンによる慣用
の治療の場合と同様で、１日約１０５〜１０８単位であ
る。

長期投与または急性の短期投与では上述の値より高いま
たは低い投与量を採用することができる。

新規な修飾インターフェロンはｆｌｌの治療とあるいは
他の化学療法剤または化学阻害剤と併用して、上述の疾
患および状態またはそｉｔが有効な他の状態に使用する
ことができる。

本発明の実施に際しては上述の方法の改変が可能である
。たとえば他のベクター、仙の表現コントロールシステ
ム、他の宿主微生物、新規なインターフェロンの他の治
療的もしくは関連した使用が制限なく可能である。これ
らは本発明の技術分野、生物工学、製剤学、医学および
／または関連分野の通常の熟練者には自明のとおりであ
り、これらは特許請求の範囲内に包含されるものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図はβ−およびα、−インターフェロンの二次およ
び三次構造の予想図、ＳｔθｒｎｂθｒｇＣＯｈｅｎ３
Ｄモデル（工ｎｔ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ、
。 ４：１３７．１９８２）を示し、工ＦＮ−βの９〜５６
領域（アミノ末端から）には陰影？付している。第２ａ
図から第２ｇ図までは、新規な修飾工ＦＮ遺伝子の構築
に用いられる結合オリコツクレオチドで、順次重ｐｎｘ
４０７．４１０．４１５．４０２．４１９．４２０．４
０４の製造に用いられる。第６ａ−１図から第３１図ま
では新規な修飾ＩＦＮ遺伝子の全ヌクレオチド配列とコ
ードされたアミノ酸配列で、順次ＩＦＮＸ４０７．４０
８．４０９．４１０、４１５、４０２、４１９、４２０
．４０４の製造に用いられる遺伝子の全ヌクレオチド配
列および合成工ＦＮ−β遺伝子の全ヌクレオチド配列で
ある。第４図は新規な修飾インターフェロン遺伝子の転
写開始に用いられるｔｒｐプロモーターのヌクレオチド
配列（工ＦＮ−β発現プラスミドｐｌ−２４／ＱｔＱｔ
ｒｐプロモーター領域のヌクレオチド配列）である。 代理人浅村皓 図面の浄：（内容に変更なし１ ＦＩＧ、１ いＱト■αヒｈ田０■αトいαト ＨｃｅＣ４：ｌｍｕＪｃＪｑ：ｌ：ｌ−ＬＯ）−（ｋｕ
Ｊ（Ｊ＜Ｌ）Ｃ／））−乙）−）−１−のＨ 舎匣畦２虜１肝璽辻 ２いフＱ■フ（ＪＩＡＣりＣＪ■田ヒい２ＣＪＬ１．Ｊ
Ｊ＋−へ田トｈαＱいエヒ■のくＭｊｌ−ｊ（ｊ（（Ｊ
ＣＬＩ−＜＜ ｚ（Ｊ：）（！：ｌｌ１ｌｌ−（Ｊ２：０２：ＣＤのく
田トの（ｊ（Ｃｊ（（ ＜＜ｊｃＪ＜（４０（ｆｌ（Ｊ■Ｑ ゲＣＪｌ−（りト（Ｄ２←フ０ ２くｕト田ヒの＜−ト トヒニくΣ（＜＜ｊ（Ｊ ♂２＋いのく♂コＣＤ１．ｎ＜（Ｊ■田Ｑいｏく■のく
■Σ（（ＮＬＩＪヒト）ｊ（Ｊい」ト■匡■＜（、−１
」（、−１ｊＣＪＨ＜ｌり＋−＜ｒ−１（（ＪフΦフ（
Ｃｅ（ＪコＱ」（りαＱ ＬｔＪｌ−」＜ＬＩＪｃｏ１ｉＪ）−＜←とく」００Φ
（イ）く」■＞リヒｉ− フ０コ■トＱα（Ｊ（Ｄｃｆ−ΣＨ ｕＪｌ−田ヒＬＪＩ−Σくａリ」■ 」（ＪｊｔＪｇ（１−１−＜＜ＣＤ（５２：（Ｊ」Ｑコ
ＣＪＣ／ｌｌ−−（ＪＯ？＜ωくくヒＬｕ１−←（＜＜
ｈ：Ｉ：ＣＪ＜＜）（）ｊｃＪ工Ｑ＞リＨく いフ０■αくいに）く♂コＱハｕくＳコヒω」（＋！Ｄ
：Ｉ：（Ｊ＋＋＞＜Ｎ’ｔＩｌｌｌ−３ｊｈｕ）田Ｈ■
ｂ、＠Ｉ−＜ｒ−１」＜、−１１ＣＪ＋−＜ｒ−１ｊ（
Ｊ」ヒｃ／）■’＞＜ｕ＋ｓｏ＝＋ｗ＜ くヒΣ＜」（５ｊｌ−’：Ｃリα０ ＞ｅ、ｊ（（５ＣＤＷ＜ヒ＜＜＜ −ヒ］Ｑリ（ＤＱＱＣＬＣｏ２：ＣＪ ｊｌ−Ｌｌヒｃｒ：ｃりＱ？（ＪＱｌ：Ｉ、Ｏ（／＋（
１：、−＜」■＜く＜＜Ｈｈ＜＜ ♂ｚ１−いｕく♂龜ヒ１ｎ区Ｈ■のＵいαＱωのく■ｊ
＋ｒ−ＩＣ／）＜へΣくζ−（ＩＪ＋ｔΣく＜＜−＜ｓ
＜ｔｖｒ−１１−１−ｒ＋：ｌ：ｕ＋−１）−）−ＣＬ
（４：ｌ２：Ｌ）コく（りくαト田ヒαＩＤ、、Ｊ（１
：、−Ｊ（［：二Ｑ田Ｑ工Ｈ）−１−（）ＣＪ（Ｊ（）
＜＜のく乙Ｈ）−〇ψ）−りくφく二りｚＯ 」Φ−くΣくΣくΣくωく ＱΦ工０−１く」くヒトくく αヒαヒコＯコ０フリ００申く ＝０＞＜」＜ＩＩＪＩ−」＜ＺＱ＊０ ト＜トヒＱ■」００リ＜＜＊ヒ ＣｅＣＪ」（Ｊコ（り’Ｃ／）■ωリフ（ｚ（Ｊｕ、＋
ｃＤ＜＋ｕ、＋Ｓｘ＜＞＜田Ｈのくの（＞ＣＤ」Ｌ）！
（Ｊ」＜、ＪＬ）（１：（ｎ甲に潟簑渥５甲に出辿冒ｐ
６０＊湧冒乙ヒ１−１−乙トトヒψト＜＜ α（ＪＬ）Φコ０コΦｚくコ０ ゝ”ｗｏ３宕ヨ３出＝ｄ３円１ Ｉ−１ＣＩ）＜ ＣｅｔＪ区トコＱΣトヒ０区ヒ ＬＬＩＣＤｕＪＬ）Ｌｌｌ−−（ＤｕＪ＋−工ＣＪ■＜
トー〉の（」（ＪＣＤＩＤΣ＜ト＜ＨΦｚＬ）（１）Ｌ
）ＣＬＣＪ：）Ｌ）Ｃｅ（Ｊ田ト」＜ΣΦの＜−＜ＬＩ
Ｌ） 二くΦ（Ｊ（Ｊト＜（ＤΦΦωく 鴎ρ詳冒ヨ旨優５８泗出ミ８冨已 Ｈ」＜ｒ−１」ＩＪｒ−１（’■ｒ−１１−１（ｒ−１
（ＣＪフくαトψＱコくコ０ 」＜ＬｉＪｗ＞＜」＜ＬＩＪＩ− ００の＜」＜００−Ｑ コくαＣＪ：ｌ（り」ｅαＱ −（ＩＪＪ！Ｌｌ）−（ヒΣく ΦＣの（１：ｊＬ）＞ｃｚｌ−ヒ コΦ）−〇二（Ｊｏ＜Σト Ｌｌｌ−ＬＡＪ）−ΣくαΦ」０ ｊＱ１＜１−Ｌ−（ｃｃｔｖｗ 」（Ｊ：）（Ｊのｌ−ｊ（ＪＣｒ：（１：くヒＬＪＪｌ
−−（（ヒエＱ 〉Ｑ」０工ＣＪ＞（り）−（Ｃ ミ匪唾日詫奨鯖弓巳巨ミ曇雪弓し Ｃ／）ｌ−ｃ？（Ｊ）−ＬＤ（ＣＪＬｌ）−一く工０」
Φ−〇」ト ＝（Ｊｌ−（１：ＣＤＬＤ（１：（り−（Ｃ２ｃＤフく
０くαト田ト ｊ＜ｊｃｃｃｅｃｐＬＩＣＤ＝）− （ＤＬ）（０■くく（イ）＜ＣＬ← Ｈ哨−ト■りｃりい（Ｑ♂αト Ｎ”ＩＨ：Ｃ）−Ｎ”ｌＬＬＩｌ−３ｊＬ）ｌｊｌ＞（
Ｕ２ｃＬ）−」ＱｃＤロトド ＋１ｓ！＜いｚト♂２Φいく０ 角ｒ−１，、ｊ（ＣＮ諭３５．．７３Ｌｎ曜吊ｌｉｎ：
）Ｌ）♂コＱ哨乙Ｑ♂田ト 冑出ｉＣ″出巴２埠３１臣に ω２（ＪＣ／）（４コＣ／）（Ｊ２（りのくΣ＜−（」
＜ １６．」６エ。。０ ｚＣｅＬ）２：（、ＤＣり（ＪｚＬ） ＬＬびｄ３５３，４３ エトフＱコくαＱフＬ）」（，０α０ 将３２：Ｉ巴ｄ品冒罐円＝５眺ζ督 ５吐Ｓ＝占＝ロぽチ冒β３）臨 Φ（ＪＪＬ）」（ＪＥ（［：ｌ−ト（１：（１：ＣＤＣ
Ｄの（ｚＱｊ（Ｊ：）（Ｊ（１））−ｊＬｊＣ１：（煙
宕η３５眺、円ロ；已５眺面寝 ｅｓ１１．ｌＪＱいコＱ■αくいのく■）Ｑい田くｇフ
トｈ：Ｃ）−００」＜ａ工ｔＪｒ−１＞（Ｉ＾ＩＪＪ）
−３ｊｌ−■ｕＪ）−乙１−ＣりΦＨＳくＨ」く１−Ｈ
−ＪＱＩＨＨくＨ」Ｑ出ｉ曜ｌ箕寝こ３題に臣８β話 ＋−＋（１：：＞ｔＤ」（ＣＬ）ＩＪ）−ａ（１：ト（
［：（１：（１：（）−ＬｌヒコΦ（ＤＣ４０Ｌ）（４
０１ＬＯ２（Ｊ」Ｑ」ヒＬｌｌ−（？（ｊ）二（りＱ？
Ｌ）（Ａ＜くΦ−（ｊ（Ｊ＜＜＜（＋−）−＜＜ ＬＬＩ）−ごＩ−のト二ＱΣＱくＱωト臣に層冨壬３面
皺沼沼４冨ヨミ ｕＪＬ）フΦｚ（ＪωＣＪ了）−（１））−ＬＩＪ（Ｊ
−！ミｄ３埒３臣にｒ層乙＝臣に い２Ｑ♂２←い田く♂エト１＾αト♂ψ０いα０″。オ
耳ｏｏ埠訃ｃｎヨ肇冊η已；（にご昌冨已昌仁督１２：
（りＣＬＱ２：（り：）＜（り＜ＣＣｅ）−Ｌ＋Ｊ←」
くαΦ」＜」＜α（ＤｕＪΦエト ΦＱトドＬ３０ΦΦくくのくエト コ０）−〇ωトのくφく匡（Ｊｚ（Ｊ ＬＪＪ）−ｊΦ−くΣくΣくΣくψく 」υＬ）Ｌ）工Ｌ）」（」＜←ト＜＜ トｃりごＩ−α←コ０コ■）００ψ傘くＬｔＪＩ−工（
Ｊ＞＜ｊ（１，Ｕｌ−」＜Ｃｅ！ｓｓ！Σくヒ＜１−１
−Ｌｏｔりｊ（ｊＬ）Φくく傘トＬＩ＋ＩＣりＩ−ＩＳ
二ｌ−Ｌ／’ｔＬｌｃｊ１３Ｑ？）−ＬｎＱ：１−ｒ−
１ｃｅ（りＮ＋ｌ田（Ｊ３工１−ｔｏ＞（ＮＬｔＪ（Ｊ
（（ＪＣ／）ｌ−乙１−）−１−Ｃ／））−ゝき渥８５
罐沼＝５５ −（１）＜ＣＤＣ／））−Ｌ）（Ｊｊ（Ｊ（４０（Ｊ（
Ｊ：ｌ（ＪＬｌ＜Ｃ）ｌ−Ｌ＋Ｊ）−ＬＤ＜ＬｔＪ）−
ｊ）−ｃｅｔＪｊ）−Ｃｔ？Ｌ）〜」ｔＪＷ＜ＣＬＣＪ
Ｗ＜＜＜ α（Ｊ）−（４０１−Ｌ）’！）−コ０に翻罎１罎ミ詮
坏出口 α（Ｊ（１）Ｉ−コＣΣ０トΦ 田Ｌ））−（りＬＬＩＩ−ｊΦ−Ｈ の（ＣＣＪ）−ｊ（Ｊ（ＤＬ）Σく １−ＬＯｃｅＣＪ（１）（Ｊｌ）−コＯｕト工ＩＪ）−
Ｌ）Ｃ／）＜」＜ Σ＜）−（ＣＪ）−＜ＩＤＣりＣＤ Ｅｌｇロバ湧ｇウ＜Ｌｌｌ（Ｊｌ＜ トΦｚＯヒＱ 田ヒ」くｕト 田ヒα（ＪＦｌ”ｌαｏ５３ヨ耳 〕Ｌ）ＣＬΦいΦＱ −ＪＣＪｌ−）−（Ｌ）ΦＱＯΦ ＵυコΦ乙０コ０♂αＵ 臣に３０罐３−１５白０仁督 −一〜−一詫咥疋１づ鳶冒目 ＞ＱＩｓ１コＯ （り（りｊ（Ｊ ］（り（Ａ＜コ０いφくα← ｕＪｌ−）−（ＣｕＪＩ−ζΣく工Ｏ ｊｔＪｊ（」Ｌ）」（１−（ ＩＡ：）ｃり２ＩＤ（１）（ＪＬｕｔＪ：ｌＬ）田ヒ」
（）−ＣりＪｌ−Ｌ＋Ｊｌ− 口」ＯｃＤｏ０ヒ−く」Ｑ ２ＬＪ（１）（Ｊ♂αＱコ＜＜Ｑ のｄ：＞Ｌ）Ｎ”１）−＜ｊ＜」（Ｊ ｌ＜＜（Ｊ）−）−）−ＣＤ、Ｃ４：）＜ｃりふａ１ 手続補正１１）。８゜ １１１１１’＋＋５９年り月？７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ｎｌ（ａ＋５９イトｔ！Ｉａ’ｒ願第１３７０７９号２
、発明の名称 修飾インターフェロン ３、補正をする者 り１１′１との関係特、：′１出５Ｉ人５、補＋ｌ命令
の日イＪ 昭和年月１１ ６、補１１−により増加する発明の数 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和１γ年特許Ｅ！第７３に２１号 ２、発明の名称 〃ケな沖号ンｌシーづ１ン ３、補正をする者 事件との関係持ｉｉ’ｌ’ｉＬｉＫイ１人住所 ４、代理人 ５、補正命令の「１イリ 昭和す７年／θ月３θ口 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）β−インターフェロンのアミノ酸１から５６まで
   の６個から５６個までが６飼から５６個までの他のアミ
   ノ酸で置換されたβ−インターフェロンのアミノ酸から
   なる修飾β−インターフェロン（２）置換されたβ−イ
   ンターフェロンアミノ酸は２から７までと９から５６ま
   でＣある特許請求の範囲第１項記載の修飾β−インター
   フェロン（３１ｆｆｆ換されたβ−インターフェロンア
   ミノ酸は９から５６までである特許請求の範囲第１項記
   載）修飾β−インターフェロン （４）β−インターフェロンのアミノ酸９から５６まで
   の４個から４７個までのアミノ酸配列がα−インターフ
   ェロンのアミノ酸７かも５４までから選ばれる４個から
   ４７個までのアミノ酸配列がα−インターフェロンのア
   ミノ酸７から５４までかう選ばれる４個から４７個まで
   のアミノ酸配列で置換された特許請求の範囲第６項記載
   の修飾β−インターフェロン（５）β−インターフェロ
   ンアミノ酸４２から５６までの４個から１５個までのア
   ミノ酸配列がα−インターフェロンのアミノ酸４０から
   ５４までかう選ばれる４個から１５個までのアミノ酸配
   列で置換された特許請求の範囲第６項記載の修飾β−イ
   ンターフェロン （６）β−インターフェロンアミノ酸９かう４２までの
   ４個から６６個までのアミノ酸配列が請求の範囲第６項
   記載の修飾β−インターフェロン（７）β−インターフ
   ェロンアミノ酸２８から４６までの４個から１９個まで
   のアミノ酸配列がα−インターフェロンのアミノ酸２８
   から４６まで力・ら選ばれる４個から１９個までのアミ
   ノ酸配列で置換された特許請求の範囲第６項記載σ）修
   飾β−インターフェロン （８）β−インターフェロンアミノ酸２カ）ら７までお
   よび９かｇ：）５６までがα、−インターフェロンアミ
   ノ酸１から５までおよび７から５４までにより順次置換
   された特許請求の範囲第２項記載の修飾β−インターフ
   ェロン （９）β−インターフェロンアミノ酸９から５６まテカ
   α−インターフェロンアミノ酸７から５４までによって
   置換された特許請求の範囲第４項記載ノ修飾β−インタ
   ーフェロン θωβ−インク・−フエロンアミノ酸４２かう５６まで
   がα、−インターフェロンのアミノ酸４０から５４まで
   によって置換された特許請求の範囲第５項記載の修飾β
   −インターフェロン （Ｉｌｌβ−インターフェロンアミノ酸９から４２まテ
   カα１−インターフェロンの”１ミノ酸７かう４０まで
   によって置換された特許請求の範囲第６項記載の修飾β
   −インターフェロン ｒｔＸ！ｌβ−インターフェロンアミノ酸２１から４０
   までがα１−インターフェロンのアミノ酸１９から４０
   までによって置換された特許請求の範囲第６現記載の修
   飾β−インターフェロン ａ３β−インターフェロンアミノ酸２８かう４６マテカ
   α、−インターフェロンのアミノ酸２８力）ら４６まで
   によって置換されて（・ろ特ｉｆ’Ｆｔｉｊ’Ｊ求の範
   囲第７項記載の修飾β−インターフェロンＩβ−インタ
   ーフェロンアミノ酸１０力）ら５６までがα１−インタ
   ーフェロンのアミン１駿１カ・ら５６までによって置換
   されて（・る特許請求の範囲第１項記載の修飾β−イン
   ターフェロン鱈α−インターフェロンはヒト起源（Ｖも
   ＋７）である特許請求の範囲第３項記載の修飾β−イン
   ターフェロン （ＬＧＩβ−インターフェロンはヒト起源υつものであ
   る特許請求の範囲第１項記載の修飾β−インターフェロ
   ン αηα−およびβ−インターフェロンを１．ｌ、・ずオ
   ｔもヒト起源のものである特許請求の範囲Ｕ’Ｇ４項記
   載の修飾β−インターフェロン ｌ１８１システィン１７がセリン１７＆Ｃよつ゛？：置
   換されている特許請求の範囲第１項記載の修’ＩＭｔβ
   −インターフェロン ａ９システ、イン１７がセリン１７シ〔よって置換され
   ている特許請求の範囲第６項Ｈ己載の修飾β−インター
   フェロン ［相］ロイ７／１５がシスティン１５によって置換され
   ている特許請求の範囲第３項日己載の修飾β−インター
   フェロン ＱＢメチオニン６１がリジン６１なζよって置換されて
   いる特許請求の範囲第３’ＪＪ４ｔｉｅ載の修飾β−イ
   ンターフェロン ｔ２２．ｘＦＮｘ４０６の配列のアミノ酸カーらなる特
   許請求の範囲第１４項記載の修飾β−インターフェロン （ハ）工ＦＮＸ４１Ｑの配列のアミノ酸からなる特許請
   求の範囲第８項記載の修飾β−インターフェロン （２滲工’Ｆ’ＮＸ４０７の配列のアミノ酸からなる特
   許請求の範囲第９項記載の修飾β−インターフェロン （ハ）ロイシン１５がシスティン１５で置換され、工Ｆ
   Ｎ１４０２の配列のアミノ酸である特許言青水の竺曲＃
   ｔｏ栖囁２饋＾雀他インターフ二〇７（２ｅα、−１ン
   タ一フエロンアミノ酸配列がロイシン１５はシスティン
   １５で置換されたα２−インターフェロンアミノ酸配列
   で置換さＪｔｌ工ＦＩＸ４０３のアミノ酸配列である特
   許請求の範囲第９項記載の修飾インターフェロン Ｑ’ＱＩＦ″ＮＸ４０４のアミノ酸配列からなる特許請
   求の範囲第１０項記載の修飾β−インターフェロ／ 困システィン１７がセリン１７で置換され、工ＦＮＸ４
   ０８のアミノ酸配列からなる特ｔ’ｎ’＋Ｊ求の範囲第
   １０項記載の修飾β−インターフェロン（２３ＸＦＮＴ
   、４１９のアミノ酸配列からなる特許請求の範囲第１１
   項記載の修飾β−インターフェロン （７）システィン１７がセリン１７で置換され、工ｖｙ
   ｘ４２０のアミノ酸配列からなる特許請求の範囲第１２
   項記載の修飾β−インターフェロンＣ３１）システィン
   １７がセリン１７で置換され、メチオニン３１がリジン
   ３１で置換され、工ＦＮＸ４１５のアミノ酸配列からな
   る特許請求の範囲第１３項記載の修飾β−インターフェ
   ロンＣ１り抗ウィルス活性、細胞増殖調整活性および免
   疫調節活性の１種または２ｆｍ以上が非修飾β−インタ
   ーフェロンの活性とは異なる特許請求の範囲第１項記載
   の修飾β−インターフェロンα着特許請求の範囲第１項
   記載のポリペプチドの合成をコードする核酸配列 ０４）核酸配列はＤＮＡである特Ｗ１′８１４求の範囲
   第３３項記載の核酸配列 Ｃ３！ｌＦＤＮＡ＋’ｉ、ポリペプチドＩＦＮＸ４０２
   （１）合成を特徴とする特許請求の範囲第３４項記載の
   ＤＮＡ配列（３［ＱＤＮＡは力？リペノチドエＩＴ′ｘ
   ｘ４０３の合成を特徴とする特許請求の範囲第６４項記
   載のＤＮＡ配列（３７）ＤＮＡハポリベゾチド１ＦＮＸ
   ４０４（１）合成ｆコードする特許請求の範囲第６４項
   記載の囲Ａ配列（至）ＤＮ八はポリペプチド１ＦＮＸ４
   ０６の合成なコードする特許請求の範囲第５４項記載の
   ＤＮＬ配列０！ｉＤＮＡ＆’Ｌｉｔ’ＩＪヘゾチドエＦ
   ［４０７の合成を特徴とする特許請求の範囲第６４項記
   載のＤＮＡ配列１［ＩＭＡはポリペプチドエＦＮｘ４０
   ８の合成なコードする特許請求の範囲第６４項記載のＤ
   ＮＡ配列（４１）ＤＮＡはポリペプチドエＦＮＸ４０９
   の合成を特徴とする特許請求の範囲第６４項記載の１）
   ＮＡ配夕１（４２）ＤＮＡはポリペプチドエＦＮＸ４１
   Ｃｌ（Ｉ）合成ｆ：：１−ドする特許請求の範囲第３４
   項記載のＤＮＡ配列（４３ＤＮＡはポリペプチドエＦＮ
   Ｘ４１５０合成を特徴とする特許請求の範囲第６４項記
   載のＤＮＡ西己列（４（イ）ＤＮＡはポリペプチドエＦ
   ＮＸ４１９の合成なコードする特許請求の範囲第３２項
   記載のＤＮＡ配列（４５１ＤＮＡはポリペプチドエＦＮ
   Ｘ４２０の合成を特徴とする特許請求の範囲第３２項記
   載の１’ＪＮＡ配タリ（４Ｇ）複製クローニングビーク
   ルな特許請求の範囲第６６項記載のＤＮＡ配列と結合さ
   せた組換えシラスミド （４７）ＤＮＡ配列がＩｎ＋Ｘ４０２．４０３．４０４
   ．４０６．４０７．４０８．４０９．４１０．４１５．
   ４１９または４２０の合成促コードする特許請求の範囲
   第４６項記載の組換えブラスミ１ζ（４ね特許請求の範
   囲第４７項記載の組換先シラスミドによって形質転換さ
   れた細胞 （４俤特許請求の範囲第４８項記載の細胞を生育させ、
   生成したポリペプチドを単）力（トする修飾β−イ／ク
   ーフヱロンの製造方法 ５０１特許請求の範囲第１項記載の修飾β−インターフ
   ェロンの有効−川を医薬的にｉ′１；容される担体と混
   合してなる医薬組成物 ６］）特許請求の範囲第１項記載の修飾β−インターフ
   ェロンの有効量を医薬的Ｖζｔｔｌｒ、δされる担体と
   混合してなる医薬組成物 ０５；ＩＩＦ’ＮＸ４０２の有効量と医薬的に許容され
   る担体と２混合してなる医薬組成物 ｒ５３）ＩＦＮＸ、４０３の有効量と医薬的に許容され
   る担体とを混合してなる医薬組成物 ５４）ＩＦ’ＮＸ４０４の有効量とし、楽曲に許容され
   る担体とり混合し、でなる医薬組成物 ５５１ＩＩ”ＮＸ４０６の有効量と医薬的に許容される
   担体とを混合してなる医薬組成物 （ト）工ｐ°Ｎｘ４０７の有効量と医薬的に許容さｊｔ
   、る担体とを混合してなる医薬組成物 ６７）工１１’ＮＸ４Ｑ３の有効量と医薬的に許容され
   る担体とな混合してなる医薬組成物 １５枠工ＦＮＸ４Ｑ９の有効量と医薬的に許容される担
   体とな混合してなる医薬組成物 ５３１ＦＮＸ４１０の有効量と医薬的に許容される担体
   とを混合してなる医薬組成物 １０１ＩＦＮＫ４１５の有効量と医薬的に許容される担
   体とを混合してなる医薬組成物 Ｉｆ）工ＦＮＸ４１９の有効量と医薬的に許容される担
   体とな混合してなる医薬組成物 ［２ＩＦＮＸ４２０の有効量と医薬的忙許容される担体
   とな混合してなる医薬組成物 岐特許請求の範囲第１項記載の修飾β−インターフェロ
   ンの有効量を投与するウィルス感染の治療方法 ｆｌＩ４）特許請求の範囲第１項記載の修飾β−インタ
   ーフェロンの有効量な投与する細胞増殖の調整方法 （へ）特許請求の範囲第１項記載の修飾β−インターフ
   ェロンの有効量を投与する免疫系の調節方法