JPS60143000A - 改変ベ−タ−インタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 １、　発明の分野 本発明は新規改変インターフェロンのデサ゛インおよび
合成のための組換ＤＮＡ技術の使用を記載する。より具
体的には、本発明は、ウィルスおよび新生物による病気
、および免疫抑制および免疫欠如の状態における使用の
ための、天然には知られていないインターフェロンにＩ
Ｎ　１−　ル。

２、　従来法の記載 インターフェロンは、咄乳動物に存在し、病原体に対す
る抵抗性の増大、細胞増殖の制限および免疫系の調整を
含めた細胞機能の生物学的調節物質として作用する。イ
ンターフェロンについ”Ｃ４つとも研究された性質は、
細胞を°′抗ウつルス状態″に変える能力で、そのあい
だに細胞はウィルスの増殖に対し抵抗性となる（　Ｌｅ
ｎｇｙｅｌ−、ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ　ｏ　ｆ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｚｒｙ＋　５１　＋　２５１　＋１９
８２）。標的細＠に抗ウイルス抵抗性を与えることに加
えて、インターフェロン（ＩＦＮｓ　）は、抗増殖（抗
発育）性を有する（　Ｓｔｅｗａｒｚ、　１９７９゜Ｔ
ｂｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５ｙｓｔ；ｅｍ、　Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ、　Ｂｅｒｌｉｎ　）。天然に産生きれる
インターフェロン、抗ウィルスおよび抗増殖剤として作
用することが示された（　Ｇ　ｒ　ｅ　Ｓ　Ｇ、ｅ　ｒ
　等、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ
　、５１６　。

２３１　、１９７８　；　Ｊ’、Ｅｘｐ、１Ｍｅｄ、、
　１４４．１３１６゜１９７６）。

ＩＦＮｓは、それらの抗原性、生物学的、物理化学的性
状により、６群、つまり、タイプ１．ＩＦＮ−α（゛白
血球′”）およびＩＦＮ−β（゛線維芽パ）；タイプ’
、１１　、ＩＰ’Ｎ−γ（″免役”）に分類される（　
Ｓｔ；ｅｗａｒｔ、等、Ｎａｔ、ｕｒｅ、　２８６　、
１’　１０　。

１９８０）。タイプｌおよびタイプ０■のＩ　Ｆ’Ｎの
ケゝツム性ＤＮＡおよびｃＤＮＡ　のクローンが分離さ
れ配列が決められ、可能性のある蛋白質配列も推定され
た（たとへは、Ｐｅ５ｔ、ｋａ、　Ａｒｃｈ　、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ　、Ｂｉｏｐｈｙｓ、。

２２１．１．１９８３）。ヒトでは、ひとつだけのＩＦ
Ｎ−βおよびＩＦＮゴ遺伝子が知られているが、ヒ）　
ＩＦＮ−αは、少なくとも２０個の遺伝子を包含する多
遺伝子鵬として規定された。ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−
αのタイプｌインターフェロンとしての分類は、それら
が蛋白質レベルで、著しい程度、〉２６％に相同である
ことがひとの根拠になっている（　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
等、Ｎａｔｕｒｅ、２８５，５４７゜１９８０）。

インターフェロンの作用機構は完全には理解されていな
いが、ある種の生理学的および酸素的反応にはインター
フェロンの存在が対応している。

これらの活性にはＲＮＡおよび仇白質合成か含まれる。

インターフェロンにより誘橋される酵素には（２’−５
′）　（Ａｎ）ｎ合成酵素があり、これは、クー５′連
結オリゴヌクレオチドを生成させ、そして、これらは、
ついで柵柱エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ５ｅＬ　を活性
化し、これは、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）
およびリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ　）のような１本鎖
ＲＮＡを切断する。さらに、１．ＦＮ　ｓ　により訊導
されるものには、少なくともひとつの蛋白質鎖開始因子
をリン酸化する蛋白質キナーゼがある。

このことは蛋白質の合成を阻害する（　Ｌｅｎｇｙｃｌ
・同上、２５６頁）。　ＩＦＮｓは、（２’　−５’　
）Ａｎ合成酵素の調節により、細胞のマイナスの発育調
節剤であることが分った（、　Ｃｒｅａｓｅｙ等、Ｍｏ
１．ａｎｄＣｅｌｌ　Ｂｊ、ｏｌ、＋’３　、７８０　
、１９８３’）。ＩＦＮ−βが誘導物質の不在で細胞サ
イクルの正常な調節に関与することは、抗ＩＦＮ−β−
抗体の使用で間接的に示された。同様に、ＩＦＮ８　０
分化における役割（Ｄｏｌｅｉ等、Ｊ、Ｃ）ｅｎ、Ｖｉ
ｒｏｌ、＋　４６　＋　２２’７　＋１９８０）および
免役調整における役割（０ｒｅｓｓｅｒ、Ｃｅ１１．１
ｍｍｕｎｏ１．　３４　＋　４０６　＋１９７７）が示
された。さらにＩＦＮ８はｍＲＮＡのメナル化パターン
が膜リン脂質中の脂肪酸の割合を変え、それにより、則
戦膜の強さを変える。

コレらおよび他の機構は、インターフェロン様ポリヘプ
チドの構造に応じて種々の程度に、インターフェロン分
子に対して応答する。予備的な証拠（Ｕ　Ｋ％許願ＧＢ
２０９０　２５８Ａ）は、マルテイジーンＩＦＮ−α群
の構成員の抗ウィルス活性の桟度および特異性が変動す
ることを示した（　Ｐｅ５ｔｋａ＋上記）。たとえば、
ＩＦＮ　−ａＡとＩＦＮ　−αＤを組合わすと、親分子
のいずれとも異なる抗ウィルス活性を示す“′ハイプリ
ドパ遺伝子を生ずる（　Ｗｅｃｋ　智、Ｎｕｃｌ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　９　＋　６１５３　＋１　’９８
１　；　Ｄｅ　Ｌａ　Ｍａｚａ等、Ｊ、ＩＦＮ　Ｒｅｓ
、、３１３５９　、１９８３　；　Ｆｉｓｈ等Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１１２　ｒ　５６７．１９８
３；Ｗｅｃｋ等、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｒｒ＋ｎ１ｕｎ、＋
　３５　＋　６６０　＋１９８２）。しかし、これまで
のところ、ヒト細１胞活性／特異性の著しくζ増加され
たハイブリドヒ）　ＩＦ’ＮＩｇ　はまだ開発されてい
ない。ＩＦ’Ｎ−β／αバイブリドを記載した特許が坑
われている（　ＰＣＴ／ｕｓ８３１０００７７）。この
特許は６つの例を記載しているが、いずれも著しく改良
された活性は示さない。これらは、２つの天然に存在す
る制限サイトを用いて檜築された。生成バイブリドイン
ターフェロンは、１）アルファー１＜１−７３）−ベー
ター（７４−１６６）；　２）ベーター（１−７６）−
アルファー１（７４−１６６）；および６）アルファー
６１Ａ（１−４１）−ベーター（４３−１６６）であっ
た。これら６つの例は、本発明の例と構造的に異なる。

これら６つの例は２つの制限サイトの偶然的な位置を根
拠にしており、本発明の、計画的にデサ゛インされたＤ
ＮＡおよびアミノ酸配列とは異１よる。

ある改変されたインターフェロンがある有利なフエノタ
イプを現わすことが予想される。ＩＦＮ　−βの諸部分
および他のアミノ酸配列より成立つ新規インターフェロ
ン様ポリペゾテドのデザインおよび合成はつぎの理由か
ら有利である。

１、　正常のインターフェロンで誘導される生化学的経
路のうちあるもののみが選択的に活性化されることから
、抗増殖活性が抗つィルス活性より太きいもの（そして
逆のもの）である、新規ＩＦ’Ｎｓを創出しうる。

２、　バイブリドまたはｉｍＩＦＮｓの細戦表層しセゾ
ターに対する親和性は、天然に存在するインターフェロ
ンとは異るであろう。その結果としてインターフェロン
が特定の細胞タイプを選択的にまたは差別して標的とす
ることが可能となり、または、レセプターへの親和性が
増〃口し、特定のウィルス病または憇性睡爆に対し活性
をｔｌｉ！１加させ５る。

６、　治療係数が増加し、使用を制限′１−るような天
然ＩＦＮ８の望ましからぬ副作用をなくす。

４、新規ＩＦＮｓには、微生物で合成される間、蛋白分
解による分解に対する安定性を可能とする構造をデずイ
／しうる。

５、　インビボ−での可溶性および安定性を増加させ、
細胞および組織と非特異的疎水性相互作用をする、新規
ＩＦＮｓをデずインしうる。

６　微生物の上清またレエ抽出物五り容易に採取でき、
そして容易に精製されうる新規ＩＦＮｓをデずインしう
る。

ＵＫＩ′ＶｋＬＧＢ２１１６５６０Ａ−動物インターフ
ェロンおよびそれらの製造方法 ｕｓｆｆｉ４　４１４　１５０−ノ・イブリドヒト白血
球インター７エロノ ＵＫｌｌｌｋＬＧＢ２０６８９７０Ａ−ヒトインターフ
ェロンに類似する蛋白質調製のための組換えＤＮＡ技術
本発明の要約 改変すれたベーターインターフェロン様ホリペプチド、
これらの改ｆ３れたベーターインターフェロンをコード
する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ　）　、変型ベーターイ
ンターフェロンをコードするＤＮＡ　含有シラスミドお
よびこれらのベーターインターフェロン合成のために操
作に、組換えＤＮＡ技術を首尾よく用い得た。ヒトベー
ターインターフェロンのアミン＠８０−１１３位−のそ
れぞれを、個別的に、任意の他のアミノ酸でおきかえう
る。このおき代えは、４から６６個のアミノ酸をひとま
とめにして行い５る。ひとつの有利な具体例は、ヒトベ
ーターインターフェロンの８２から１０５位アミノ酸の
４から２４個を、４から２４個の他のアミノ酸でおき代
えることである。他の有利な具体例は、ベーターインタ
ーフェロンアミノ酸１０６から１１２位を４から１０個
の他のアミノ酸でおき代えることである。別の有利な具
体例は、ベーターインターフェロンアミノ酸１０３から
１１２位を４から１０個の他のアミノ酸でおき代えるこ
とである。

ベーターインターフェロンアミノ酸１０３−１１２位を
対応するヒトアルファーインターフェロンアミノ酸で順
次におき代えうる。灼応は、本発明中の用い方により規
定してゆく。アルファーインターフェロンはアルファー
１、アルファー２、およびアルファーＨがある。咄乳動
物のいずれからのアルファーインターフェロンも用いら
れ、ヒトまたは他の霊長類、馬、牛、羊、ウサギ、ラッ
トおよびマウスがあるが、これらに限定されない。

本発明のひとつの具体例として、ヒトベーターインター
フェロンの８４位のロイ７ンを、選ぶならは、プロリン
でｉ＝５き代えうる。本発明の別の具体例はさらに別の
具体例は、抗ウィルス、細胞の発育調節、または免役調
整活性のうちひとつまたはひとつより多くが、未改変ベ
ーターインターフェロンと実質的に変化している改変イ
ンターフェロンの使用を記載する。特に有利な具体例は
、ＩＦＮＸ４０５．４２５および４２９のアミノ酸配列
である。さらに別に有利な具体例は、工ＦＮＸ４０５．
４２６または４２９の合成をコードするＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列である。さらに別の具体例はＩＰ’Ｎχ４０５
．４２ろまたは４２９の合成をコードし５るＤＮＡ配列
を含有するシラスミドまたは細胞である。本発明のさら
りこ別の具体例は、Ｉｐ″ＮＸ４０５．４２’３または
４２９の有効量を含有する薬剤組成物である。Ｊ＆後に
、本発明の具体例は、ウィルス感染の治療、細胞発育の
調整または免疫システムの調整に、変型ベーターインタ
ーフェロンを＠勺する楽沖］組成物を用いることである
。

）二型サレｌこインターフェロンは、インビトロ−で測
定し５る、抗ウィルスまたは免疫調整活性を有する。標
的細胞の特異性も褒えうる。

増加した標的細胞の特異性で改良された治療係数を生じ
５る。それで天然に存在１−るＩＦＮ８をヒトに用いる
ことによる副作用のあるものも避けつる。

本発明は、ヒトの予防的または治療的処置、特に、ウィ
ルス感染、急性Ｉｌ＝ｍ、および免疫抑制または免役欠
如の状態に用いるに適当な、新規の、高度に活性のある
そして（または）高度に特異的なインターフェロン様分
子の十分量を生産１−ることである。

図および表につい℃の簡単な記載 第１図は、ａｌおよびβインターフェロンの　。

Ｓｚｅｒｎｂｅｒｇ−Ｃｏｂｅｎ　３Ｄモデルを示″１
’　（工ｎｚ、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｍａｃｒｏｍｏｌ、　４　、１３７　、１９８２　）。

第２図（ａからＣ）は新規、改９Ｘ　ＩＦｈｌＳを構築
する際に用いられる、連結されるオリゴヌクレオチドを
示す。

第６図（ａからｄ）は、新規、改変ＩＦＮａ伝子の完全
ヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示
す。

第４図は、新規の、改変された工ＦＮ遺伝子の転写を開
始さすに用いるｔｒｐプロモーターのヌクレオチド配列
を示す。

表１は、粗細藺抽出物に存在１″るＩＦＮＸ　４２３、
ｒＦＮｘ　４２９およびＩＦ’Ｎ−βについ−Ｃの発現
、抗ウィルス活性を比較している。

有利な具体例の記載 前置ぎ ＩＦＮ−β遺伝子は、独特の遺伝子であるが、マルテイ
ジーンＩＦＮ−α群とはある顕著な相同性を示す（１１
ｕｂｉ、ｎ５ｚｅｉｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａ、ｃｔ、ａ、６９５＋５．１（？８２）。Ｓｔ、
ｅｒｎｂｅｒｇおよびＣｏｈｅｎ　（Ｉｎｒ、　。

Ｊ、λ４ａ、ｃ：ｒｏｍｏ１．．４　、１３７　、１９
８２　）は、ＩＦＮ−βｉ＋ＴよびＩＦＮ−α１に類似
の２次構造を提出した。構造推定情死は、Ｘ−線結晶学
で決定したいくつかの無関係の蛋白質構造に観察される
と類似の、右廻りの束に“バンク″すれうる、４個のα
−，／＼リンクスを示唆する（第１図）。本明細書に記
載の改変インターフェロンのあるもののデずインは、Ｓ
ｚｅｒｎｂｅｒｇ／Ｃｏｈｅｎのモデルの我々の解釈に
白米している。ＩＦ’Ｎ、βおよびαを工細胞表層の同
じレセフ０ターに結合すると情ぜられるので、特定の部
分をＩＦ’Ｎ−α断片でおき代えることでＩＦＮ−βに
変化を与えることができる。

本発明の分ＩＪＪは、アミンＮ＆８２−１１５位が、任
意の仙のアミノ酸、無関係の蛋白質の配列、またに、咄
乳動物および他のを椎動物に見出だされるＩ　Ｆ’Ｎ−
α′８、ＩＦＮ−β−またはＩＦＮ−γに類似の配列で
おき代えられた、ＩＦＮ−βに類似のインターフェロン
様分子のデずイン、合成および特性づけである。

８０から１１３域の各アミノ酸は、任意の他の天然に存
在するアミノ酸でおき代えうる。天然に存在するアミノ
酸およびそれらの名称をつぎに示゛ず。アラニン（Ａ］
、ａまたはＡ　＞　；バリン（Ｖａ、ｌまたは■）；ロ
イシン（Ｌｅｕまたはｊ、）；イソロイシン（Ｉｌｅま
たは工）；プロリン（’　ＰｒｏまたはＰ）；フェニル
アラニン（ＰｈｅまたはＰ）；トリプトファン（’Ｉ”
ｒｐ　’！たはＷ）；メチオニン（ｋ４ｅｔ、またはＭ
）；グリシン（（）ｌｙ　ｆ、たはｏ　）　；セリン（
ＳｅｒまたはＳ）；スレオニン（’ｌ’ｈｒ　’ｆ、た
はＴ）；７ステイン（１：；ｙｓまたはｃ）；テロ７ノ
（ＴｙｒまたはＹ）：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）
；グルタミン酸、（）ｉｎまたはＱ）；アスパラキ゛ン
散（ＡｓｐまたはＩ））；グルタミン酸（Ｇｌｕまたは
Ｅ）；リシン（ＬｙｓまたはＫ　）　ｚアルギニ７　（
Ａｒｇ才たはＲ）　；およびヒスチジン（Ｈｉｓまたは
Ｈ）。

バイブリドＩＦＮ　−ａ’ｓ（ａｌおよびα２、Ｓ　Ｚ
　ｒ　ｅ　ｕｌｌ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ’Ａ　＋　７８　＋２８４８．１
９’８１　）Ｋより、ＩＦＮ−α８のレセプター結合サ
イトに含まれるイディオタイプ（１ｄｔｏｂｙｐｅ　）
　の数および性質を分市ｊしようと試みらＪまた。２つ
のサイトが結合サイトを構成するものとして提案された
。ひとつは、ＩＰ’Ｎ−αのアミノ酸末端の半分のうち
に、他はカルボキシ末端の半分のうちに存在する。ＩＦ
ｌｉ−ＣａとＩＦＮ−βとのあいたの部分的に相同な２
つの主な領域は、アミノハケ２８−８０および１１５−
１５１に存在し、それら（Ｊ−上記イディオタイプによ
く対応する。

２Ｂ−８０の領域がレセプターとの結合に′２１４袂で
あろうとする証拠は、ＩＦ’Ｎ−α２アミ４２４−８１
より成立つ合成ペプチドに対し作りあり゛たホリクロナ
ル抗体がＩＦＮ−α２に結合し、１ＦＮ−α２が細胞レ
セプターと結合するのを防ぐところから米ている（　Ｉ
ｌｒｅｉｄｉｎｇ、　ＴＮＯＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｍ
ｅｅｚｉｎｇ、１（ｏｒ、ｔ、ｅｒｄａｍｌ　９８３　
）。

コンピューターから予知されるα−へリンクス領域を含
むアミノ酸８２から１１５位（Ｓ　ｚｅｒｎｂｅｒｇお
よびＣｏｈｅｎ、Ｉｎｔ−ｊ、ＢｉｏｌｏＭａＣｒＯｍ
Ｏｌ−＋　４＋　１５乙１９８２）の、工ＦＮ−／　マ
タ’ｒ＠　ＩＦ’Ｎ　−ａ’ｓ　ｉＪｌ　ｊｉｌ　ノｉ
ｌｌ能または重要性（でついて、はとんど知らＪｌてい
プよ１、）。

しかし、１１０個のアミノ酸より成立つアミノ末端フラ
グメント（Ａｃｋｅｒｍａｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｍａｕｌ
。

Ａｃａｄ、’Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８１　＋　１０４５．
１９８４　）は少ない割合の抗ウィルス活性を保有して
いる。

Ｃ−末端フラグメントは不活性である。

つさ゛に、本発明を説明するための、ＩＦＮ−βの８２
−１１５領域のアミノ酸のおき代えられた新規、改変Ｉ
　Ｐ’Ｎ　８の例を示す。ただし、これらは本発明の範
囲を限ボするわけでない。ヒトの１ドＮ−β遺伝子の８
２−１１５ｉｆｆ城中でのＤＮＡフラグメントのデサ゛
イン、化学合成および挿入に用いる技術を下記に示す。

生ずる！ｌｒ規、改ｌ　ＩＦ’Ｎ８は以降グループ■１
のＩＦＮ８と記す。８２−１１５域でアミノ酸をおき代
えられたグループＩＩの新規ＩＦＮ８のあるものは減少
した抗ウィルスおよび（または）免疫刺激活性を有する
。用いる技術は、この方面の技術の専門家には明らかで
あろう［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ］、ｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｚｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｅｄｓ、Ｍａｎｉ
ａｚｉｓ等、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）（ａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔ、ｏｒｉｅｓ　）　。

合成遺伝子フラグメントのデザイン つきの基準を用いて、各合成りＮＡフラグメント（第２
ａ−ｃ図）のヌクレオチド配列を考案した。

１、　コド／（天然ＩＦＮ−β遺伝子配列より逸脱する
もの）は、Ｅ、　Ｃｏ１１中の発現がもつともよくなる
ように利用した。シラスミドｐＧｃＩｏよりＩＦｌ、ｌ
　−βの兄彷、と同程友に商い新規ＩＦＨの発現レベル
の得られるように、できるだけ天然のＩＦＮ−β遺伝子
を用いた（表１）をみよ。ｐＧｃＩｏ　（〜４．４４０
ｂｐ　）　は天然ＩＦ’Ｎ−β遺伝子を高レベルで発現
し第４図に示すリボゾーム結合サイトの配列および〜５
４６　ｂｐ　ＢｇＩ　ｌ　−Ｂａｍ）ＩＩ　フラグメン
トの欠失を除いてはｐｌ／２４と同じである。

２、　化学的に合成されたフラグメントの組上げにおい
て相互にアニーリングすることになりうる配列（第２図
）は、このデザインの対照としない（遺伝子コードにお
けるｒｅｄｕｎｄａｃｙにより許容されうる範囲内にあ
りうるものとする）。

遺伝子フラグメントの化学合成 調整された有孔ガラス（Ｈ，Ｋｏｓｚｅｒ　％、Ｔｅｔ
、ｒａｈｅｄｒ６ｎ、４０．１０３．１９８４　）上の
ホスホルアミダイト法（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｚｈｅｒｓ、
Ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｙｎ
１１ｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇ＋ｎｅｎｔ、
ｓ　”Ｈ，Ｇ、Ｇａ５ｅｎおよびＡ、Ｌａ、ｎｇ　ＩＭ
、Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｂｅｍｉｅ、　Ｐ。

７１．１９３２）で合成した。完全に保ｉｌｌれた２′
−デオキシリボヌクレオチド６′−ホスホルアミダイト
は、保護されたデオキシリボヌクレオチドおよびクロル
−Ｎ、Ｎ−（シイソグロビルアミカメトキシホスフイン
より合成された（　Ｌ、Ｊ、ＭｃＢｒｉｄｅおよびＭ、
Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒ８．ＴｅＺｒａｋｌｅｄｒＯｎ　
Ｌｅｔ＋ｔ、。

２４．２４５．１９８３および８．Ａ、Ａｄａｍｓ　％
、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　１０５．６６
１　、１９８３）。

調整された有孔ガラス担体は、記載（Ｆ、ｅｈｏｗ等、
Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓｌ（ｅｓ、、９．２８０７．１９
８１　）のように合成し、ダラム当たり３０−５０７１
１１１０１　デオキシヌクレオチドとした。

官能基を付した、調整有孔ガラス（５０〜）はグラスフ
ィルター中、１ｇ温で順欠つぎのよ５に処理した。

１．　ジクロルメタン（３１１Ａ！、１０回）２．６％
（ｖ／ｖ）ジクロル酢酸含有ジクロルメタｙ　（２”ｘ
　１２０）。

６、　ジクロルメタン（６ｍｌ、１０回）４、無水アセ
トニトリ／ｌ／　（３ｍｌ、　ｌ　ｏ回）５、　ホスホ
ルアミダイト単量体（０，０６Ｍ）／テトラゾール（０
，２３Ｍ　）含有無水アセトニド　リ　／し　（ｌｌｊ
’、１２０　回　）６、アセトニトリル（３ｍＪ　ｉ　
３回）Ｚ　ジメチルアミノピリジン（０，０７Ｍ　）含
有無水酊［１／２．６−ルチジン／アセトニトリル（１
／２／６　ｖ／Ｖ　）（１ｍ５．６０回）８、アセトニ
トリル（３ｍＡ％　１０回）シ　ヨー素（０，２Ｍ　）
含有２．６−ルチジン／テトラヒドロフラン／水（１／
２／２　ｖ／Ｖ　）（１ｒｒＩｌｓ３［］１回 ｉｏ、アセトニトリル（６祷、１０回）適当なボスポル
アミダイト単量体な用いてサイクルを反復し、オリゴヌ
クレオチド鎮を完結させた。１０％（”／ｖ）　）ジク
ロル酢酸／ジクロルメタン中５０４　ｎｍで遊離ジメト
キシトリチルアルコールを分光光度計で分析して、各サ
イクルのカップリング効率をみた。合成を完了後、保護
基ははづし、６％（ｖ／ｖ）ジクロル酢酸／ジクロルメ
タン（１２０回）、チオフェノール／トリエチルアミン
／ジオキサン＜　１／１／２　：ｊ／ｖ　）（１時）Ｉ
ＪＪ　）として７０℃濃アンモニヤ（４時間）で順次に
処理し、担体よりオリゴヌクレオチドをはつした。脱保
護したオリゴヌクレオチドは、Ｐｔｉ　４．９．５０°
Ｃで１Ｍから４Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート
のグラジェントを用いるＰａｒｚｉｓｉｌｌｏＳ、αカ
ラム上のＨＰＬＣかまたは変性性の１５％ホリアクリル
アミドデル（−８，６）上のｔ気泳動でオ自製した。

オリゴヌクレオチドプロンクの連結 １０００　Ｃｉ／ｐｍｏｌｅ［””Ｐ）γ−ＡＴＰ　（
２，５Ｃｉ／ｍＭｏ１ｅ　）、１００μＭスペルミジン
、２　［Ｊ　ｍＭＤＴＴ。

１Ｑ　ｍＭＭｇｃ１２　、５　［］　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　（ｐｌ（９，０）およびＱ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ
を含有する２０μｍの浴欣中で、６７°０６０分間、１
単位のＴ４誘尋ホリヌクレオチドキナーゼを用いて５０
０　ｐ＋ａｏｌｅ宛のオリゴヌクレオチドをリン酸化し
た。混合物は凍結乾燥し各オリゴヌクレオチドは変性性
１５％ポリアクリルアミドケ９ル（ｐＨ８，３）中で精
製した。ゲルから溶出後の回収率は、放射能のカウント
で測定した。

リン酸化された成分のそれぞれの２５　ｐｍｏｌｅを相
補鎖よりの非リン酸化オリゴマー０等モル量と組合わせ
て、ブロック（３０−５０塩基）を構成した。混合物は
凍結乾燥し、ついで、１５μｍの水および２μｌの１０
　Ｘ　ＩＪガーゼ゛緩衝液（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　、　ｐＨ７，６＋　１００　ｍＭのＭｇＣ１２）
に取った。ブロックは１００℃で２分間アニーリングし
、室縣（２０’Ｃ）までゆっくり冷却した。２μｍの２
００　ｍＭ　ＤＴ’、［’および０．５７１１のｉ　Ｑ
　ｍＭ　ＡＴＰを刀Ｕえ、２　ｏ’ｍＭ　ＤＴＴおよび
２５０　ｐＭ　ＡＴＰ　（２Ｑμｍ中）の最終ｆｆＡ［
とした。１．２５単位のＴ　４　ＤＮＡリガーゼも加え
た。２０℃で１８時間後、食性性条件で、１５％ポリア
クリルアミドデル中で生成物を精製した。

２つの２本鎖ブロックを１本領切片より構築した。それ
らは１５０塩基対および７５塩基対である。各ブロック
のｉ　、５　ｐｍｏｌｅを取り、混合物を凍結乾燥した
。１５μｍの水および２０　ｔｄの１０×リガーゼを緩
衝液中で１００℃で２分間アニーリングを行ってから１
０℃までゆっくり冷却した。

２０μｍの２０　Ｑ　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５　μｌの
１Ｑ　ｍＭ　ＡＴＰおよび１．２５単位のＴ　４　ＤＮ
Ａ　リガーゼを加えた。

１０℃で１８時間反応させた。生のままの１０％ポリア
クリルアミドデル中で生成物を精製した。

２つの２本釦の０．４　ｐｍｏｌｅを組合わせて最終生
成物を組立てた。混合物を凍結乾燥し、１５μｍの水お
よび２μｍの１０×リガーゼ緩衝液に取った。５０℃で
２分間アニーリングし、ついで１０℃にゆっくり冷却し
た。２μｍの２　Ｑ　ｍＭ　ＤＴＴ　。

０．５　ｐｌのｉ　Ｑ　ｍＭ　ＡＴＰおよび１．２５単
位のりガーゼを加え、１８時間１０°Ｃで反応さぜた。

５％の生のままのポリアクリルアミドダル中で最終生処
物な精製した。溶出しエタノール沈殿のあと、生成物の
１０μｍの水に取った。０．５μｍを取り、カウントし
、収率を計算するのに用いた。２μｍの１０Ｘリガーゼ
緩衝液、２１ｔ１の２０　口ｍＭ　ＤＴＴ　。

２７＋１のｊ　ｍＭスペルミジン、１μｍの１Ｑ　ｍＭ
　ＡＴＰ。

２μｌの水および単位のキナーゼを残りの分に加えた（
全各釦２０μｌ）。６７°Ｇで１時間反応させた。９０
°Ｃで２分間加熱し反応を止めた。最終生成物をエタノ
ール沈殿させた。

新規、改変インターフェロンを発現するプラスミドのイ
；・１築 この節で合成りＮＡフラグメント（第２図）をＩＦＮ−
β−コード域にクローン化するに用いるベクター、挿入
に用いる制限サイト、構築のための原理を示す。これら
のダイト　の位置は、グループ■、新規、改変ＩＦＮ遺
伝子の完全コードヌクレオチド配列に関して示す（第６
図）。太線のＩＦＮ−β（または新規ｉＦＮ　）コード
領域は左から右に翻訳すｉする。Ｂａｍ　ＨＩ　”ｊイ
トとＥｃｏ　ＲＩサイトのあいだのベクター配列はＰＡ
’ｒ　１５３におけると同様である（地図上のヌクレオ
チド１６４６−２３５１の７０’５　ｂｐ　Ｈａｅ　ｌ
のフラグメントの除去されたｐＢｕろ２２に相当）。Ｅ
、Ｃｏ１１　ｔｒｐプロモーター（第４図）は、Ｅｃｏ
）３ＩサイトとＣ１ａ　Ｉサイトとのあいた忙存在する
。

１、ＩＦ’ＮＸ４２３１ＦＮ−／［β８２−１０５→α
、８０−１０３］〔Ｌｅｕ８４→Ｐｒｏ〕この新規、改
変ＩＦＮは、コンピューターで予知されたＩＦ“Ｎ−β
のＣα−ヘリックスをＩＦ’Ｎ−α、でおき代えること
の抗ウィルス、抗増殖および免疫刺激活性に与える効果
（単および複数）をみるためにデヂインされた（　Ｓｔ
、ｅｒｎｂｅｒｇおよびＣｏｈｅｎ、　Ｉｎｔ、。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ、、　４　、１３７　
、１９８２　）。また、８４位にプロリンを導入１−る
ことによるこのα−へリンクスの短縮の効果はとうであ
ろうが？出発ベクター：　ｐＧＣ２０６゜このベクター
は、１部は天然の（アミノ酸１−４６）そして１部は合
成の（アミノ酸４７−１６６および第６０図）の遺伝子
よりＩＦＮ−βを発現する。このものは、ｐ四４７の２
５７　ｂｐ旦バ旦ＲＩ−腔エエフラグメノトを、ｐｌ／
２４ｃよりの相当するフラグメントでおき代えることで
構築された。ｐ’Ｍ１ｉ　４７は、完全に天然のＩＦＮ
−β遺伝子を含有するプラスミドｐｌ／２４　Ｃｏ）　
Ｃ１ａ　１．　：Ｆｏｉ　、ｌ：ヒ’Ｂａｍ　ＨＩ　９
イトノｈｌ、’だに挿入さ、ｌ（た完全に合成のＩＦＮ
−β遺伝子（第６ｃ図）を含有する。（’　ｐｌ／２４
　ｃは、第４図の下線の配列を除いては、ｐｌ／２４　
（ｕ　Ｋ特許願歯ＧＢ２０６８　９７ＯＡ）と同じであ
る。

ｐＯ（コ２０６ −−−す 合成オリゴヌクレオチド（第２ａ図）をｐＧＣ２０６の
Ｎｒｕｌ＊と５ａｃＩエ　サイトのあいたに挿入し、ｍ
３ａ図のヌクレオチドとした。生する工ｐＮｘ　４２５
は、−プラスミドｐＧＣ２１５より発現させた。

２、　ＩＦ’ｌ、ｌＸ４２９　ＩＦＮ−β〔β８２１°
５−α、８０１°３〕理由および出発ベクターは、上記
ＩＦＮＸ　４　’２３と同じである。ＩＦＮＸ　４２９
中の予知されるα−ヘリックス域（８２−１０５）は、
アミノ酸８４においてプロリンを導入することによる短
編はしなか′つた。

ｐＧＣ２０６のＮｒｕＩ＊および５ａｃＩＩ＊１′イト
のあいだに合成オリゴヌクレオチド（ｍ２ｂ図）を挿入
し、第３ｂ図のヌクレオチド配列とした。生ずるＩＦＮ
Ｘ　４２９遺伝子はプラスミドｐＧｃ　２１５４より発
現させた。

３、　ＩＦＮＸ４（］５　ＩＦＮ−β〔β１°３−ま１
２→α１　ま０↓−１１０〕この新規、改変ＩＦＮは、
比較的に変わりゃすい領域（Ｉ）ｉ’Ｎ−βとＩＦＮ−
Ｃ１）をおき代えることによる抗ウィルス、抗増殖およ
び免役刺激＠性への効果（単および複数）をみるために
デサ゛インした。

出発ベクター’　ｐｉ／２４ｃ このベクターは成熟ＩＦＮ−βを発現する。第４図中で
下線したりボゾーム結合サイト配列を除いてはｐｌ／２
４に同じである。

ｐｌ／２４ｃ ＥｃｏＲＴ　Ｃ１ａＩ　ＭｂｏＩＩ　ＭｂｏＩＩ　丸Ｉ
１．　Ｂａｍ１−ＩＩ合成オリゴヌクレオチド（第２　
ｃ図）（工、ｐ１／２４ｃの膨圧■１　サイトσ）あ〜
・た（アミノ酸ＩＣ１２および１１６に相当する防御（
４）−イト）に４申入して第６ｄ図に示すヌクレメーチ
ド自己夕１ｊとしｌこ。生ずるＩＰ’Ｎ又４０５は、フ
０ラスミドｐＸχ４０５より発現させた。

Ｅｓｃｂｏｒｊｃｌ＋ｉａ　ｃ：＋ｌｉ中の磐ｆ規、改
”ｉ　ＩＦＮ８θ〕ヅ６杉も上記フ０ラスミドの一″３
−べてヲ工、イ氏レベルσ）ト１ノフ０トファンの存在
で立、Ｃ旦しＨＢ　１０１　中テ発育−ａセ’　ＯＤｔ
＋ｏｏ　ｌ］、５とし、ＩＦ’Ｎ合成を詩導した。培地
レエ、’２　Ｄ　［）　ｍｌ中につぎσ〕酸成分含壱し
た。Ｍ９塩知、０．５％ダルコース、Ｑ、１ｍＭ　Ｃａ
、Ｃ１２，０，５優カーリ−ミノ酸、１ｍＭ　ＭｇＳＯ
４，０，Ｉ　Ｔｎ＆　／　ｍｅのビタミンＢ、、２．５
μｇ／罰トリシトファンおよび１００μ＆／ｍ乙のカル
ベネシリン。

２００ｍ１の培地には、４２．５　ｐＭ　／　ｍｌσ）
トリプトファンの存在以外は、上記組成σ）培地中に発
育させた各クローン（宿主旦、ｃｏ１．ｉ　ＨＢ　１’
　０　’１中）の１夜培養物の２−４ｍ１：を接種し、
飽しし・通気下に６７°Ｃで発育させた。ＯＤ６゜。が
０．５になったら、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｔ、ｒｐプロモータ
ー誘導物質で、工ＦＮ　Ｂ　５２の誘導物質でもあるイ
ンド−ＪＬ−アクリル酸を２０μｌ　／　ｍｌに〃０え
た。それから４−５時間後に、培養物（０Ｄ６００　＝
　０．７５−１．２の馳１相）θ）　３　ｍｌを取り出
し、つき゛のように分けた。１）１ｉ＋ｇは、全°゛司
浴化”　ＩＦ’Ｎ抗ウィルつ活！１：（俊Ｉ／Ｉ：／再
生ヤーイクル後に現われる活ｅ　）　；１ｗ１６１アク
リルアミ　ドケゞル中、全蓄＆Ｅ、ｃｏ１１蛋白質プラ
スＩ　Ｆ’Ｎの表示のために用いた。

１、　全′°可溶化”　ＩＦＮ抗ウィつス活性のＩ′価
全”可溶化″’　ＩＦＮ抗ウィつス活性の回収σ）ため
に、２０μｌ浴解（１ｙｓｉｓ　）用緩衝液／　０．１
０Ｄ６゜。

／　ｍ、ｌ培衣物でうす流にかくはんした。（″溶解緩
ｍｊ　Ｍ”は５λ４尿素、３０　ｒｎＭ　ＮａＣ１，５
０ｍＭ　’Ｉ’ｒｉｓ−）（Ｃ１、ＰＩ−１７，５，１
％ＳＤＳ、１％２−メチルカプトエタノール、１％Ｈ８
Ａ　）。混合物は９０’Ｃに２−６分加熱し、マイナス
７０°Ｃに１５分凍らせ、融解させ、１．７Ｋｒｐｍで
２０分遠心した。上清はビトロ−ミクロプレート分析シ
ステムで、ＥＭＣウィルスの細胞毒効果（Ｃｙｔ、ｏｐ
ａＺｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｂ）（ｃｐｅ）に対し、Ｖｅｒ
ｏ細胞に与える保護効果を記録した（たとえ（ｄＤａｂ
ｌおよびＤｅｇｒｅ、　Ａ、ｃｔ、ａ　、Ｐａｚｈ　。

Ｍｉｃｒｏｂｊ、ｏｌ、５ｃａｎ、、、　１３８０　、
８６３　、１９７２をみよ）。Ｓ釈剤は、５　Ｑ　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ７，５３［Ｊ　ｍＭ　Ｎａ
１ｌ　、　１％ヒト血血清アルミミノある（　Ｉ　Ｓ　
Ａ　）である。

２、　全ホリペフ０チドのポリアクリルアミド電気泳動 １ｍｌの培養物よりの細胞を、１［Ｊ　／ｌ１１１０．
１０Ｄ６０゜／　ｍＬ最終試料用級衝液（５Ｍ尿素、１
　％　ＳＤＳ、、　１％２−メルカプトエタノール、５
　Ｑ　ｍｌ４　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐｆ１７．５．３０
　ｍＭ　ＮａＣ１および０．０５　％ブロムフェノール
ブルー）と混合した。混合物は、９０℃で５分加熱し、
１０分遠心し、５−７μｍを１５％アクリルアミド１０
．４％ビスアクリルアミド”　Ｌａｅｍｍｌｌ’　”　
’／”　ルに柊ｔ７た。７０Ｖで１８時間泳動に処した
。ｒルは固定し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎ
ｔ　ｂｌｕｅで染色し、乾燥し、写真を取った。

６　改変、新規インターフェロンの抗、ｔ′＃殖試験抗
増殖活性は、新規Ｉ　Ｆ’ＮがＤａｕｄｉ　（淋巴芽）
セルライ／の増殖を阻害する能力で計価した（　Ｈｏｒ
ｏｓｚｅｖ１゛ｉｃｚ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２　（Ｊ　
６　、、１０９１　。

１９７９　）。Ｄａｕｄｉ細１］包（対数期）を朽’、
　ｋ　（’、）　ｆｌｉ　１５＜のインターフェロンの
存在で９６ウエルプレート中で６日培養した。細胞発育
が進むとフェノールレット指示薬は赤から黄に変じた（
より酸性）。

大気にふれることでのＰＨ変化を防、ぐために、数体パ
ラフィンを加え、培地中のＰｌ−１変化を、ＤｙｎａＴ
、ｅｃｈプレートリーダーで比色測定した。細胞発育の
インターフエロンによる阻害は、色変化の程度の減少に
反映された。

細菌抽出物でのＩＦＮ　ｆｆｌ白質の発現、抗ウィルス
活性および抗増殖活性の比較 弄１１工、粗細藺抽出物中のグルリ用グ川新規、変型１
ＦＮｓ　の発現レベルおよび抗増殖Ｊ６よび抗ウイルス
８性を示す。生物系ないしはアッセイにおける自然の変
動にともなう、活性の範囲も示す。活性は、上記のよう
に、ＳＤＳ／尿素／メルカゾトエタノール処理後、抽出
物を１％ヒト血精アルブミン中に希釈して再生したもの
の活性である。

表１から分るように、対照であるＩＦＮ−βにおいて、
抗ウィルス（ＡＶ）および抗増殖（ＡＰ）活性力変化は
４倍範囲を超えない（〉２０反復）。

工ＦＮＸ４２３のイン　ビトロ−抗増殖活性は工ＦＮ　
−βと有意差はないが、抗ウィルス活性は低い（〜６か
ら６０倍）。このことは、１部には、アミノ酸８４のプ
ロリンによるのであろう。というのは、８４位のロイシ
ン以外には工ＦＮＸ４２３に同じの工ＦＮＸ４２９は、
ＩＦＮ−βと類似の抗ウィルス活性２有するからである
。それで予想される＋Ｉ　Ｃ！　ＩＩα−へリツクスに
プロリン馨導入することで短かくすると、徂／−ビトロ
ー抗ウィルス活性が低下することが分る。要するに１　
工ＦＮＸ４２６およびＩＦＮＸ４２９は、それらの抗ウ
ィルス活性ン失なった、新規、改変工ＦＮｓＯ例である
。

工ＦＮＸ　４０５の生物学的性状 １、方　法 発現された蛋白質す、！ｌＣｏ１１より、ナトリウムｒ
デシルスルフェート（ＳＤＳ　）　）ｋ用いて抽出シＡ
ｃＡ　４４でクロマトグラフィーして精製した。

工ＦＮｓは、ポリアクリルアミＰｒルミ気泳動（ＰＡＧ
Ｆｉ）分析で７０−９０１純度と推定された。新規イン
ターフェロンの抗ウィルス、抗増殖および免疫調整活性
ケ試験した。つぎのアッセイシステムン用いた。

ｉ）抗ウイルス活性試験 （ａ）　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｅ　
（ＥＭＯ）ウィ／Ｌ／スで細胞毒効果（ａｐｇ　）　Ｙ
みた。これは、ｌｌ２Ｍ０ウイルスの細胞毒効果に対し
て細胞単層を保護するインターフェロンの能力を測定す
る標準試験法である。用いたセルラインはつぎのようで
ある。ＶｅｒＯ（Ａｆｒｉｃａｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎ
ｋｅｙ　ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ　）、Ｗ工ＳＲ（羊膜ｅ
ｐｉｔｈｅｒｉａｌ　）、ＭＲＣ−５（胎児肺線維芽）
および１７−１（胎児肺線維芽）。２チドナー牛血清プ
ラスグルタミンおよび抗生物質を含有するＤＭＫＭを含
む９６ウエル乎底ミクロタイタープレート中に細胞単層
を確立した。インターフェロンの２連の希釈物のうちの
フリース１乞、細胞と共に６７℃で１８−２４時間イン
キュベートした。

上清ヲすて、適当なチャレンジ量のＥＭＯウイルスを含
有する培地を加えた。３７°Ｃでさらに２４時間インキ
ュベートしてから上清をすて、単層をホルモニル／食塩
水で固定し、クリスタル？々イオレットで染色した。プ
レートは肉眼で観察し、細胞毒効果ケ５０係阻止するイ
ンターフェロン希釈率を測定した。

（１））　プラック減少試験　Ｖｅｒｏ　（す／ｌ／　
）　Ｏｈａｎｇ（ヒト）およびＭＤＢＫ　（生細胞）に
ＨｅｒｐｅＢ　８１ｍｐｌｅＸタイゾ２　（ａｓｖ　−
２）ウィルスを用いる。細胞のコンフルエント単層を、
９６ウエル平底ミクロタイタープレート中に確立した。

インターフェロンの希釈物と６７℃で１８時間インキュ
ベートしたあと、細胞には適当数のブラック形成単位を
チャレンジし、０．５％のカルボキシメチルセルロ−ス
を含有する培地７重層し、６７℃で２４時１綱インキユ
ベートした。固定し染色したあとブラック乞顕微鏡で数
え、未処理対照ウェル中ｆ）平均極大ブランク数のパー
セントとして表わした。インターフェロンタイターはブ
ラック数／ウェルを５０係減少させる希釈倍数の対数で
ある。

ＩＩ）　抗腫瘍活性試験 Ｄｕｌｔ＋ｅｃｃｏｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｆｉａｇｌ
ｅ８　Ｍｅｄｉｕｍ　（　ＤＭＢＭ　）中Ｄａｕａｉ細
胞を、９６ウ工ル組織培養プレート中２　Ｘ　１　０”
／ｍｌ　（　２　０　０　Ｉｌｌ　）　宛接種１，り。

インターフェロンは接種時に添加し、加湿５　４　ａｏ
２中で６７℃でインキュベートした。２２時間後トリチ
ル化チミジンを加えさらに２時間インキュベートしてか
らＦ１０ｗセルハーベスタ−上で細胞を採取し、洗い、
５％トリクロル酢酸で処理した。酸不酵性の放射活性を
カウントし、チミジンの取り込みの阻害からインターフ
ェロンの抗増殖活性を判定した。

１１１）免疫調整活性（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
活性） ヒト末梢血よりＦｉｃｏｌｌ　／　Ｈｙｐａｑｕｅ沈降
により分けた１）ｕｆｆ７　ｃｏａｔ細胞を、補足ＲＩ
’Ｍ工１６４０培地中に懸濁させ、インターフェロン希
釈物を加えて６７℃で１夜インキユベートした。インタ
ーフェロン２除いてから、これらエフェクター細胞は、
５１Ｏｒ−ラペｋＫ５６２細胞（ヒト腫瘍由来セルライ
ン）と、エフェクターと標的細胞との比率が２０：１か
ら１０＝１となるようにして、６７°Ｃで４時間インキ
ュベートした。上清の１部を遠心したあとで、放出され
た放射活性’２　Ｉｌｌ定した。標的細胞の懸濁液の凍
結融解乞反復して、最大限の５１Ｃｒ放出を達成させた
。エフェクター細胞なしにインキュベートした標的細胞
より放出された”、（１！ｒχ測定してパックグランｒ
の対照とした。

結果は比５１Ｃｒ放出パーセントとして表わした。

最大放出−バックグランド ２、結　果 １）抗ウィルス活性 （ａ）　（：！ＰＫ試験試験−８ウＣウイ／ｌ／スは、
ｖｅｒＯおよび４種のヒトセルライン中のＥＭＯウィル
スに対して測定された、バイブＩＪ　Ｐ工ＦＮＸ４０５
および組換え生成物由来の工ＦＮ−βの試験平均値を示
す。活性は単位／ダ蛋白質で表わす。

表２に含まれる種々のセルタイプについてのそれぞれの
インターフェロンの平均値およびすべてのセルタイプの
データのゾールされたものより、種々のセルラインにお
いて工ＦＮＸ４０５は工ＦＮ−βと非常に類活の活性を
有することが分る。

表　２ ＩｎＭＯウィルスに対する工ＦＮ−βおよび工ＦＮＸ４
０５の抗ウィルス活性（　ＩＦＮ単位／■蛋白質）各セ
ルラインにおける平均活性 調製物　セルライン ＩＦＮ−βＫ　１．５ｘ１０５５．２ｘ１０５８．４ｘ
１０５１．５ｘ１０５７．１ｘ１０’ＩＦＮＸ４０５　
Ｘ　１．４Ｘ１０５　２．＋ｉｏ５１．ＯＸ１０６　１
．５Ｘ１０５　５．５ｘ１０’（３−５試行の平均値ｉ
） 調製物　ゾールされた平均　９５チ信頼限界（　ｕ　、
／ｍ９） ■ＦＮ−β　２．４ｘ１０５ｕ／Ｉｎ９１　、５−３．
９ｘ１０５工ＦＮＸ　４　０　５　１　、４Ｘ１０５　
ｕ／＃Ｉｆｉ’　０．８−２．３Ｘ１０５比較のために
、線維芽ＩＦＮ−βおよび白血球ＩＦＮ−αの調製物の
観察された活性乞表６に示す。

これらの天然インターフェロンは精製された形状では人
手しえず、大量の非インターフェロン蛋白質を含有する
希溶液として試験に用いられた。それで天然工ＦＮ−β
および工ＦＮ−αを用いた表６の結果（・ま単位／　ｍ
ｐでなく、表２の結果とじかに比較しえない。しかし、
５４重のセル、ラインについて、天然インターフェロン
の双方の活性は、インターフェロンとしての活性を保っ
ていることが分る。

しかし、ＷＩＳＨセルは、工ＦＮ−βおよび工Ｆ’Ｎ−
αの双方に、やや感受性であるようである。

表　６ ＶｅｒｏおよびヒトセルラインにおけるＥＰＣウィルス
に対する天然インターフェロン調製物の相対的白ｌ亀球
由来　２．５Ｘ１０２　１．５Ｘ１０２１．５に０３８
０　８０１ＦＮ−α　Ｘ （ｂ）７°ラツク減少試験）ＩＳＶ　−２７０ランク減
少試験により、ＩＳＶ−２ｑ用いて得られる抗ウィルス
活性の同様な評価ケ表４に示す。

この場合、実験は、ヒ）　Ｏｈａｎｇ細胞、霊長類ｖｅ
ｒ。

細胞、牛ＭＤＢＫ細胞を用いた。ＯｈａｎｇおよびＶｅ
ｒ。

では、工ＦＮＸ４０５は、工ＦＮ−βと類似の活性を示
した。しかし、ＭＤＢＫでは減少した。

これら６つのセルラインにおけるｕｓｖ　−２に対する
天然ＩＦＮ−βおよび工ＦＮ−αのパターンケ表５に示
す。不純工ＦＮＢのゆえに比活性でなく単位／　ｍｌで
表わした。他の実験室よりのいくつかの報告とは対照的
に、１ＦＮ−βは我々のＭＤＢＫセルラインとかなりよ
く反応し、ＶｅｒｏまたはＯｈａｎｇ細胞におけると大
体同じ希釈率で抗ウィルス活性７示す。他方、ＩＦＮ−
α標準は、ＶｅｒｏまたはＣｈａｎｇ細胞とより、ＭＤ
ＢＫ細胞と実質的によく反応した。

表　４ プラック減少試験で測定した、ＩＳＶ−２に対する工Ｆ
Ｎ−βおよび工ＦＮＸ４０５の抗ウイルス活性インター
フェロン　単位／ｍ９蛋白質 調製物　セ　ル　ラ　イ　ン Ｖｅｒｏ　ＯｈａｎｇＭＤＢＫ 工ＰＮ−βＸ　１．２Ｘ１０５　４．７Ｘ１０５　２．
５Ｘ１０”ＩＩ”ＮＸ４０５　Ｘ　ｓ、４ｘｉｏ’　２
．０Ｘ１０５１．８Ｘ１０’表　５ ブラック減少試験で測定した、ザル、ヒトおよびウシ細
胞でのＩＳＶ　−２に対する天然インターフェロンの相
対的抗ウィルス活性 インターフェロン　単位／　ｍｌ 調製物　セルラ　イ　ン それぞれのセルタイプにおけるＲＮＡおよびＤＮＡウィ
ルスを用いた抗ウィルス活性の結果を要約して、表６に
、ＣｈａｎｇおよびＶｅ　ｒｏ細胞中のＢＭＯおよびＩ
ＳＶ　−２に対する組換え生成物および天然のインター
フェロンの活性（表２−５のデータによる）を示す。こ
れらの結果で、２つの型のウィルスのひとつまたは他に
対して、ＩＦＮＸ　４０’５がより活性があるという様
子はない。２つの試験の結果は非常に似ていて、有意な
差はない、つまり、表２の分散分析に示される、ＫＭＯ
ウィルスに対するプールされた平均抗ウィルス活性は、
抗ヘルペス活性の評価でも同様にあてはまり、ＩＦＮＸ
、４０５の特異的抗ウィルス活性の全体的インディケー
タ−としても角い５るー 表　６ ヒトおよびサルセルラインで試験した、工ＦＮ−βおよ
び工ＦＮＸ　４Ｑ５　ノＫＭＯ＋フイ／Ｌ／スおよびＨ
ｓｖ　−２に対する相対的抗ウィルス活性 インターフェロン（単位／　ｍｙ　Ｗ　白’Ｉｔ　）Ｉ
ＦＮ　ゾールされた千　プールされた平調製物　均活１
生　均油性 Ｆｌ：ＭＯウィルスＨ８Ｖ−’１ （表１の試験より）　ＶｅｒＯおよび ａｈａｎｇ細胞 工ＦＮ−β　２．４Ｘ１０５　’　３．５Ｘ１０５ＩＦ
ＮＸ　４０５　１．４Ｘ１０５−　１．５Ｘ１０５（Ｃ
）　アテイビカルＯｈａｎｇセルラインを用いた比較抗
ウイルス試験のデータ 高通過敬（約ｘ１６０）で維持されて来たＣｈａｎｇ結
膜細胞は変異的変化を受けて、我々が７レーチンう の試験に用いたふ弗低連過数Ｑｈａｎｇ細胞より工ＦＮ
−βに約６倍感受性である。同時に、このアテイピカル
高通過数Ｑｈａｎｇ細胞は、親の低通過数Ｏｈａｎｇ細
胞に比しｃ、ｉｏｏ倍の感受性でＩＦＮ　−αを認識し
そして反応する。それで、高および低通過数（＋ｈａｎ
ｇ細胞における抗ウィルス活性の比率は、特定の組換え
生成物の”α一様′”の性状を示すのに用いうる。この
ようにして、ｎｒａＸ４Ｑ５組換え体の性質をみた結果
を表７に示す。

１１）抗増殖活性 工ＦＮ−βおよび工ＦＮＸ　４０５ケ、少なくとも４回
反復で、Ｄａｕｄｉ淋巴芽細胞に対し阻害活性を試験し
た。活性は、未処理対照細胞中への最大チミジン取り込
みの５０係を阻害するに必要な蛋白質濃度（より５０ｓ
阻害量５０）として表わす。これらの試験の平均を表８
に示す。わづかではあるが、工ＦＮＸ４Ｑ５の活性は減
少している。しかし分散分析の結果は有意である。

表　７ アテイビカルＣ！ｈａｎ１４細胞における、天然インタ
ーフェロンに比較したＩＦＩＪ−βおよび工ＦＮＸ　４
０５抗ウィルスｌ占１生 ＣｈａｎｇＡ　’　Ｏｈａｎｇ　（ふつ　比（高い通過
数）　うに用いる低連　Ｏｈ　１０ｈ過数） 単位／ｍ９ ＩＦＮ−β　ｉ、６ｘ１０６５．２Ｘ１０５　３工ＦＮ
Ｘ４［１５ろ、０ｘ１０５　２゜６Ｘ１０５　１単位／
ｄ 表　８ Ｄａｕｄｉヒト淋巴芽細胞で試験したＩＦＮ−βおよび
工ＦＮＸ４０５の抗増殖活性 阻害量５０　（μｔｔ、／ｍｌ） 調　製　物　試験反復数　補正平均　９５ｑｂ（ｎ）　
より　信頼限界 ０ 工ＦＮ−β　４　ろ、８　１，５−　９．８工ＦＮＸ４
（：１５　６　７．１　６．２−１５．５１１１）免疫
調整活性−ＮＫ試験 ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を強める能力につ
いて、■ＦＮ−βおよび工ｐＮＸ４０５’Ｙ反復試験し
た。全体で９−１１回反復して、表９とした。抗増殖活
性におけると同様に、５０チの効果を生ずる蛋白質処理
濃度（ＳＤ５０、刺激処理濃度５ｏ）で表現した。

工ＦＮＸ４Ｑ５のＮＫ刺激活性は、親王ＦＮ−βの約１
／／４であろうこの差は、分散分析により有意である。

表　９ ヒトＮＫ細胞を用いて試験した工ＦＮ−βおよび工ＦＮ
Ｘ４Ｑ５の免疫刺激活性 調　製　物　試験反復回数　補正平均　９５チ（ｎ）　
５Ｄ５０　信頼限界 工ＦＮ−β　１１　３．４２．１−５．４工ＦＮＸ４０
５　９　１４．５８．５−２４．５３、結　論 各インターフェロンの抗ウィルス、抗増殖および免疫調
整の平均比活性を表１０に要約する。

（留意すべきこととして、抗ウイルス試験では、数字が
大きくなると共に活性上昇するが、■Ｄ５゜および５Ｄ
５ｏ試験では、数字の小なほど活性が大きい）。便宜な
ように、親である工ＦＮ−βに対する活性の大き゛さを
表１０の下半分に示した。この試験から、工ＦＮＸ　４
０５は、抗ウィルス活性は工ＦＮ−βと同じであ−るが
、抗増殖活性および免疫調整活性は部分的に低下してい
ることが分る。

表　１０ 組換えおよび天然イ。ンターフェロンについての生物学
的データの比較の要約 調製物　抗ウィルス　抗増殖比活性　免疫調整比活性比
活性 ＩＦＮ−β　２．４Ｘ１０５３．８　３．４工ＦＮＸ４
０５　１．４Ｘ１０５　７．１　１４．５ＩＦＮ−＃：
（１’）比（ＩＦＮ−β＝１００）ＩＦＮ−β　１００
　１００　１００ ＩＦＮＸ４０５　１００（５８）　５４　２３かっこ内
の数字は実際の工ＦＮ−βに対する比では　′あるが、
１００に対しての有意差はない。他はすべて１００に対
する有意差乞示す。

薬剤処分物および投与 本発明の新゛規、改変インターフェロンは、薬剤組成物
に既知の方法で処分しうる。ここで活性インターフェロ
ンは、それぞれの投与方式により異なる、薬剤として許
容されうる担体と混合する。

本明細書で参考文献として引用する、ＬＷ、Ｍａｒｔｉ
ｎ著、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ａａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　は、本発明のインターフェ
ロンの投与に適当な組成物および処方を記載している。

たとえば、食塩水、バランスド　サルト　ツルージョン
または類似の生理学的に許容されうる液体をビヒクルと
した、注射しうる液をふつう用いる。経口用処方物は、
固体、たとえば錠剤、またはカプセル、または液体状溶
液または懸濁液でありうる。

本発明の新規、改変インターフェロンは、細胞に対して
有効であるような、ヒトまたは動物に、経口、静脈、筋
肉、腹腔、鼻腔、皮肉または皮下投与しうる。免疫が抑
制されているかまたはそうでない、悪生物または新生物
を有する患者、免疫調整を必要とする患者、または抗ウ
イルス治療に用いうる。投与量および投与の割合は天然
インターフェロンにふつう用いられる量、約１０５から
１０８単位／日とする。長期投与とか急性短期治療とか
の場合には、これらの量を増減し５る。新規、改変イン
ターフェロンは、他の治療と組合わせたり、他の化学療
法剤または化学予防剤と組合わせて、上記の病気および
状態の、または、効果乞示す他の状態の治療に用いうる
。

本発明を実施するための、非限定性の、上記方式よりの
変型、たとえば別のベクター、別の発現制御システム、
別の宿主微生物および新規インターフェロンの他の治療
および類似したことへの使用も、バイオテクノロジー、
薬学、医学および（または）類似の分野の専門家に明ら
かであろうが、それらも本発明の特許請求の範囲に含ま
るべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、α１およびβインターフェロンのＳｔｅｒｎ
ｂｅｒｇ　−０ｏｈｅｎ　３　Ｄモデ／Ｉ”Ｙ示す（工
ｎｔ、　Ｊ。 Ｂｉｏｌ、　Ｍａｃｒｏｍｏｌ　４．１３７．１９８２
）。〔タイプｌインターフェロン、■ＦＮ−α１　およ
び工ＦＮ−βの推定構造、工ＦＮ−βの８２−１１２領
域る際に用いられる、連結されるオリイヌクレオチドを
示す。（ａ）は工ＦＮＸ４２ろ、（ｔ））　ハＩＦＮＸ
　４２９、全ヌクレオチｒ配列およびコードされるアミ
ノ酸配列を示す。 第４図は、新規の、改変された工ＰＮ遺伝子の転写を開
始さすに用いる、ｔｒｐプロモーターのヌクレオチド配
列ヲ宗す（工ＦＮ−β発現デラスミＰｐ１−２４．／Ｃ
のｔｒｐプロモーター領域のヌクレオチド配列）。 代理人浅村　皓 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　ｌ た１旨勇國　ゴｇ　−１−、Ｊ　（、ＬｌＪ　）−トΦ
　２：（＃　ｌ−Φ Ｅ　（ｃＤＬＪ　Σく コＯＣＬ　Ｃ４：ｌ　Ｌｌ”ｌ　Ｌ）　（Ｊ　２：　＜
　コくＬＩＪＩ−Ｃｅ（Ｄ　Ｈ’＋ＣｅΦ　」＜−＜」
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ｘ　」ｔＪ　）−）−一一〜−一　詫ヨ疋１フ式　甲ピ ＞０♂コ０ ００　」０ コＣＣ／）（１：　コΦ　いψく　ビト田ト　洲＜ＬＩ
ＪＩ−３＞＜　工Ｕ 」（Ｊ　、Ｊ（」Ｌ）　Ｊ＜ｌ−（ 蕊　ａ１ いコく　♂フ（Ｄｌ、Ｊ＋ｔ　（ＣＣＪ■田０い０く♂
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Φ　Ｆ−１ｕ　ｃＪ　ｒ−１（１：　４４）　＋−１＋
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）−）−（Ｊｌ−Ｑ−１− 鴎″３＝　旨己５　鴎簑＝穿乙薯　獣簑渥−（１：　ｌ
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＜　αＱ　−ヒ　」く　ごΦ傘Ｏ Ｉ−ヒ　＜（Ｊ　ｕｃＪ　（ＤΦ　くく傘ト」υ　コ（
Ｃ／）ＣＪ　のΦ　コ（２ＣＪ＜ｌ−」（−（＞（１：
　ｕＪｌ−のく〉０　ΦΦ　工（Ｊ　」（」（Ｊ　（（
第１頁の続き ｏ発　明　者　ジョン　シー・スミス　イキリツク　１ ゛フイプ　１３０７ 手続補正書（方式） 昭和ど０年う　ノ］７１コ 特許庁長官殿 １、事件の表示 ＩＩＩ打１は７年１冒′１願第１３沙）ゝυ　号２、発
明の名称 ｔプ７女八゛へノーメンタ−４Ｌ１」ン３、補正をする
者 事ｆ’ｌとの関１石　持１．１出願人 住　所 ４代理人 【−−ノ ５　補正命令の１−１伺 昭和々７年／９月卯口 ６　補ｉ臼こより増加する発明の数 明細書第５５頁の上から９行目の［第６ａ−ヰ図から第
６ｄ−２図］欠「第３ａ−１図、第ろａ−２図、第３ｂ
−１図、第６ｂ−２図、第３ｃｍ１図、第３ｄ−１図及
び第６ｄ−２図」に訂正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ベーターインぞ−フエロンアミノ酸８Ｄがら１
   １２位までのうちの４から６３個が、別のアミノ酸の４
   から６６個でおき代えられている、ぺ−ターイ／ターフ
   エロンのアミノ酸配列からなる改変ヘーターインターフ
   ェロン。 （２）　おき代えられたベーターインターフェロンアミ
   ノ酸が８２から１０５位のものである、上記（１）項記
   載の改変ベーターイ／ターフエロン。 （３）　おき代えられたベーターインターフェロンアミ
   ノ酸が１０６から１１２位のものである、上記（１）項
   記載の改変ベーターインターフェロン。 （４）　ベーターインターフェロンアミノ酸の８２から
   １０５位までのうちの４から２４個の連続するアミノ酸
   が、アルファーインターフエ四ンアミノ酸の８０から１
   ０６位までのうちより選択された、４から２４個の連続
   するアミノ酸でおき代えられた、上記（２）項記載の改
   変ベーターインターフェロン。 （５＋工ＦＮＸ４２９のアミノ酸配列を包含する、ベー
   ターインターフェロンアミノ酸が、アルファー１インタ
   ーフエロンアミノ酸８０から１０６位によりおき代えら
   れた上記（４）項記載の改変ベーターインター７エロ／
   。 （６１ＩＦＮＸ　４２３のアミノ酸配列を包含する、ロ
   インン８４がプロリン８４でおき代えられた上記（５）
   項記載の改変インターフェロン。 （７）　ベーターインターフェロンアミノ酸１０３−１
   １２位の４から１０個の連続するアミノ酸が、アルファ
   ーインターフェロンのアミノ酸１０１−１１０位より選
   択した、４から１０個の連続するアミノ酸でおき代えら
   れた、上記（３）項記載の改変ベーターインターフェロ
   ン。 （８）　ＩＦＮＸ　４０５のアミノ酸配列を包含する、
   アルファーインターフェロンがアルファー１である上記
   （７）項記載の改変インターフェロン。 （９）　ベーターインターフェロンがヒトに由来スルも
   のである、上記（１）項記載の改変ベーターインターフ
   ェロン。 θ０）　アルファーインターフェロンがヒトに由来スる
   ものである、上記（４）項記載の改変ベーターインター
   フェロン。 旧）　アルファーインターフェロンがヒト由来のもので
   ある、上記（７）項記載の改変ベーターインターフェロ
   ン。 ０２１　アルファーおよびベーターインターフェロンが
   共にヒト由来のものである、上記（４）項記載の改変ベ
   ーターインターフェロン。 θ３）　アルファーおよびベーターインターフェロンが
   共にヒト由来のものである、上記（７）項記載の改変ベ
   ーターインターフェロン。 ０４Ｉ　抗ウィルス、細胞発育調節吐たは免投脚整活性
   のうちのひとつまたはひとつより多くが、未改変ベータ
   ーインターフェロンより実質的に変化した、上記（１）
   項記載の改変ベーターインターフェロン０ （１５１上記（１）項記載のポリペプチドの合成をコー
   ドする核酸配列。 （ｌｌｉ＋　核゛酸配列がＤＮＡである、上記　項記載
   の核酸配列。 （１７１ＤＮＡ力、ボ！Ｊ　ヘア’　５−ドＩＦＮＸ　
   ４０５．４２ろま赴は４２９の合成をコードする、上１
   ｉｅ（１６１項記載のＤＮＡ配列。 餞　上記（１６）項記載のＤＮＡ配列と組合わせた抄製
   するクローニングビヒクルを含有する組換えプラスミド
   。 Ｈ＋　ＤＮＡ　配列がＩＩｉ’ＮＸ　４０５．４２６ま
   たは４２９をコードする、上記（１８＋項記載の組換え
   プラスミド。 （絢　上記（１９）項記載のプラスミドで形質転換され
   た細胞。 ０１）　上記（２０）項記載の細胞の発育および生ずる
   改変ベーターインターフェロ／の分離を包＠する改変ベ
   ーターインターフェロンの製造方法。 （２２１上記（１）項記載の改変ベーターインターフェ
   ロンの有効量を薬剤として許容されうる担体と混合して
   含有する、薬剤組成物。 （２３１上記（４）項記載の改変インターフェロンの有
   効量゛を薬剤として許容されうる担体と混合して含有す
   る、薬剤組成物。 （財）上記（７）項記載の改変インターフェロンの有効
   量を薬剤として許容されうる担体と混合して含有する、
   薬剤組成物。 （２５）　ｘｐ′Ｎｘ　４０５の有効量を薬剤として許
   容されうる担体と混合して含有する、薬剤組成物。 （２Ｇｌ　工ｐ′Ｎｘ、　４２３の有効量を薬剤として
   許容され５る担体と混合して含有する、薬剤組成物。 （２７）ＩＦ′ＮＸ４２９の有効量を薬剤として許容さ
   れつる担体と混合して含有する、薬剤組成物。 （ハ）上記（１）項記載の改変ベーターインターフェロ
   ンの有効量を膜力することを包含する、ウィルス感染の
   治療法。 （２９１上記（１）項記載の改変ベーターインターフェ
   ロンの有効量を投与することを包含する、細胞発育の調
   節方法。 ■　上記（１）項記載の改変ベーターインターフェロン
   の有効量な投与することを包含する、大役システムの調
   節方法。