JPS60214800A - 改変ベ−タ−インタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 （１）発明の分野 本発明は、新規改変インターフェロンのデザインおよび
合成のための組換ＤＮＡ技術の使用を記載する。より具
体的には、本発明は、ウィルスおよび新生物による病気
、および免疫抑制および免疫欠如の状態における使用の
ための、天然には知られていないインターフェロンに関
スる。

（２）従来法の記載 インターフェロンは、哺乳動物に存在し、病原体に対す
る抵抗性の増大、細胞増殖の制限および免疫系の調整ン
含めた、細胞機能の生物学的調節物質として作用する。

インターフェロンについてもつとも研究された性質は、
細胞ン習抗つィルス状態田に変える能力で、そのあいだ
に細胞は、ウィルスの増殖に対しより抵抗性となる（　
Ｌｅｎｇｙｓｌ。

Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　５１　＋　２５１　ｒ１９Ｂ２）。標的細
胞に抗ウィルス抵抗性２与えることに加えて、インター
フェロン（ＴＦＮｓ　）は、抗増夕１１（抗発育）性乞
肩する（　Ｓｔｅｗａｒｔ、　１９７９　。

Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｓｐ
ｒｉｎｇｓｒ、　Ｂｅｒｌｉｎ　）。

天然に産生されるインターフェロンは、抗ウィルスおよ
び抗増殖剤として作用することが示された（　Ｇｒｅｓ
ｓｅｒ等、ＢＩＯＣｈｉｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃ
ｔａ＋　５１６　＋２３１．１９７８　ｐ　Ｊ’、　Ｅ
ｘｐ、Ｍｅｄ、、　１４４．１３１６゜１９７６）。

ＩＦＮ８は、それらの抗原性、生物学的、物理化学的性
状により、６群、つまりクイズ１．１ＦＮ−α（“白血
球ｌ）およびＴＦＮ−β（“線維芽′）；クイズ１１、
ＴＦＮ−γ（ｌ免疫１）に分類される（　Ｓ、ｔｅＷａ
ｒｔ等、Ｎａｔｕｒｅ、　２８６．　１１０．１９８０
）。

クイズＩおよびタイプ■のｒＦＮのケゞツム性ＤＮＡお
よびＤＮＡのクローンが分離され配列が決められ、可能
性のある蛋白質配列も推定された（たとえば、Ｐｅ５ｔ
ｋａ＋　ＡｒＣｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
Ｓ、２　２　１　、　１　＋１９８５）。ヒトでは、ひ
とつだけのＴＦＮ−βおよびＴＦＮ−γ遺伝子の知られ
ているがヒ）　ＩＦＮ−αは、少なくとも２０個の遺伝
子乞包含する多遺伝子属として規定された。ＴＦＮ−β
およびＴＦＮ−αのタイプ夏インターフェロンとしての
分類は、それらが、蛋白質レベルで、著しい程度、〉２
６％、に相同であることをひとつの根拠としている（　
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等、Ｎａｔｕｒｅｙ　２８５＋　５
４７ｙ　１９８０）。

インターフェロンの作用機構は先金に理解されていない
が、ある種の生理的および酵素的反応はインターフェロ
ンの存在に対応している。これらの活性にはＲＮＡおよ
び蛋白質合成が含まれる。インターフェルロンにより誘
導される酵素には、（２’　−５’　）　（Ａ）ｎ合成
酵素があり、これは２本鎖ＲＮＡで活性化される。この
合成酵素は、２’−５’連結オリゴヌクレオチドを生成
させ、これらはついで、１本鎖ＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）　
’ｌ切断する潜在エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓ、
Ｌ）　Ｙ活性化する。さらに、ＩＦＮｆ３により誘導さ
れるものには、少なくともひとつの蛋白質鎖開始因子ン
リン酸化する蛋白質キナーゼがある。このことは蛋白質
の合成を阻害する（　Ｌｅｎｇｙｅｌ＋同上２５６頁）
。ＩＦＮ、、は、（２’　−５’　）Ａｎ合成酵素の調
節により、細胞のマイナスの発育調節剤であることが分
った（　Ｃｒｅａｓｓｙ等、Ｍｏｌ。

ａｎｄｃｅｌｌＢｉｏｌ、、　５．　７８Ｌ　１９８６
）。ＴＦＮ−βが誘導物質の不在で細胞サイクルの正常
な調節に関与することは、抗ＴＦＮ−β−抗体の使用で
間接的に示された。同様に、ＩＦＮ８の、分化における
役割（Ｄｏｌｅｉ等、Ｊ’、　Ｇｅｎ、　ＶｉｒｏｌＢ
　４６　、　２２７　ｔｌ　９８０　）および免疫調整
における役割（Ｃ１ｒｅｓｓｅｉＣｅ１１．　Ｔｍｍｕ
ｎｏｌ、、　５４．　４０６＋　１９７７　）が示され
た。さらに、ＩＦＮ８はｍＲＮＡのメチル化パターンや
膜リン脂質中の脂肪酸の割合を変え、それにより、細胞
膜の強さを変える。

これらおよび他の機構は、インターフェロン様ポリペプ
チドの構造に応じて種々の程度に、゛インターフェロン
分子に対して応答する。予備的な゛証拠（［、ｌＫ特許
願（３Ｂ２０９０　２５８Ａ）は、マルテイジーンＴＦ
Ｎ−α群の構成員の抗ウィルス活性の程度および特異性
が変動すること２示した（　Ｐｓｓｔｋａ＋上記）。た
とえばＴＦＮ−αＡとＩＦＮ−６０７組合わすと、親分
子のいずれとも異なる抗ウイルス活性を示す榔バイブリ
ドー遺伝子ン生ずる（　Ｗｅｃｋ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　９ｙ　６１５５＊１９８１）。し
かし、これまでのところ、ヒト細ｌｊｌ！ｌ活性／特異
性の著しく増加した・・イブリドヒトＴＦＮｓはまだ開
発されてない。ＴＦＮ−β／α／Ｓイブリドを記載した
ひとつの特許が現われている（　ｐａＴ１０ｓ８３１０
００７７　）。この特許は６つの例′４を記載するが、
いずれも著しく改良された活性を示さない。これらの６
つの例は、２つの天然に存在する制限サイトン用いて構
築された。生成ハイプリドインクフエロンは、１）アル
ファー１（１−７５）−ベーター（７４−１６６）　；
　２）ベーター（１−７，５）−アルファーＩ　Ｃ７４
−１６＋５）；および６）アルファー６１Ａ（１−４１
）−ベーク−（４６−１６６）であった。これら６つの
例は、本発明の例とは構造的に異なる。これら６つの例
は、２つの制限サイトの偶然的な位置を根拠としており
、本発明の、計画的にデザインされたＤＮＡおよびアミ
ノ酸配列とは異なる。

ある改変されたインターフェロンがある有利なフェノク
イシン現わすことが予想される。ＴＦＮ−βの諸部分お
よび他のアミノ酸配列より成立つ新規インターフェロン
様ポリペプチドのデデイ／および合成は、つぎの理由か
ら有利である。

１、　正常のインターフェロンで誘導される生化学的経
路のうちあるもののみが選択的に活性化されることから
、抗増殖活性が抗ウィルス活性より太きいもの（そして
逆のもの）である、新規ＴＦＮｓを創出しうる。

２、　バイブリドまたは変型ＴＦＮ８の細胞表層レセプ
ターに対する親和性は、天然に存在するインターフェロ
ンとは異なるであろう。その結果として、インターフェ
ロンが特定の細胞タイプを選択的または差別して標的と
することが可能となり、またはレセプターへの親和性が
増加し、特定のウィルス病または悪性腫瘍に対しての活
性ケ増加させうる。

６、治療係数が増加し、使用ン制限するような、天然Ｔ
ＦＮ８の望ましからぬ副作用乞なぐす（’Ｐｏｗｌｅｄ
ｇｅ　＋Ｔ、Ｍ、　＋　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ７　
ｊ　２　ｙ　２１４　、５月１９８４）。

４、新規ＪＰＮ８には、微生物で合成される間、蛋白分
解による分解に対する安定性ン可能とする構造をデザイ
ンしうる。

５、インビボ−での可溶性および安定性を増加させ、細
胞および組織と非特異的疎水性相互作用ンする、新規Ｔ
ＦＮ、　Ｙデザインしうる。

６、微生物の上清または抽出物よりより容易に採取でき
、そしてより容易に精製される新規ＴＦＮ８を５′デイ
しうる。

その他の関連する特許願 ＵＫ魔Ｇ　Ｂ　２　１１．６　５６６　Ａ−動物インタ
ーフェロンおよびそれらの製造方法 υ８．．％４　４１４　１５０−ノ・イブリドヒト白血
球インターフェロン 本発明の要約 改変されたベーターインターフェロン様ポリペプチド、
これらの改変されたベーターインターフェロン乞コード
する核酸（ＤＮＡ　ｔ　１こに！ＲＮＡ）、変型ベータ
ーインターフェロンをコードするＤＮＡ　含エロン合成
のための操作に、組換えＤＮＡ技術を首尾ヨく用いえた
。ヒトベーク−インターフェロンのアミノ酸１−２８の
それぞれは、任意の他のアミノ酸でおき代えうる。交換
は、６から２８個までのアミノ酸ンひとまとめにしても
行ないうる。

ひとつの有利な具体例は、ヒトベーク−インターフェロ
ンのアミノ酸の１から８個乞、６から７個の他のアミノ
酸でおき代えろことである。別の有利な具体例は、ベー
ターインターフェロンアミノ酸２から２ＢＹ、６から２
７個の他のアミノ酸でおき代えることである。ベーク−
インターフェロンアミノ酸１から７および２から２８を
、相当するヒトアルファーインターフェロンアミノ酸で
おき代えうる。アルファーインターフェロンにはアルフ
ァー１、アルファー２およびアルファーＨがある。任意
の哺乳動物から得たインターフェロン７用いうる。たと
えば、馬、牛、羊、ウサギ、ラットおよびマウスに由来
するものでありうるが、それらに限定されない。本発明
のひとつの具体例として、ヒトベーターインターフェロ
ン中の１６位のシス７４７７選ぶならセリンでおき代え
うる。

本発明の別の具体例として、本発明は、抗ウィルス、細
胞の発育調節、または免疫調整活性のうちひとつまたは
ひとつより多くが、未改変ベーク−インターフェロンと
実質的に変化している改変インターフェロンの使用ン記
載する。特に有利な具体例はＩＦＮＸ　４０１．４１２
．４１６．４１４および４２１のアミノ酸配列である。

本発明のさらに別の有利な具体例は、ＩＦＮＸ４０１．
４１２．４１４および４２１の合成をコードするＤＮＡ
またはＲＮＡ配列である。さらに別の具体例は、ＴＦＮ
Ｘ４０１．４１２．４１３．４１４または４２１の合成
をコードしうるＤＮＡ配列ン含有するシラスミドまたは
細胞である。本発明のさらに別の具体例は、工ＦＮＸ４
０１．４１２．４１６．４１４．４２１の有効量を含有
する薬剤組成物である。本発明の最後の具体例は、ウィ
ルス感染の治療、細胞発育の調節または免疫系の調節に
、改変ベーターインターフェロン含有薬剤組成物ン使用
することである。

アミノ酸１７を、システィンよりセリンに変えることで
、Ｅ、　Ｃｏ１１中に産生されるＴＦＮ−βの特異的抗
ウィルス活性が著しく上昇することが報告された（　Ｔ
ＮＯＴｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｍ６＋３ｔｉｎｇ’＋　Ｒ
Ｏｔｔ＋Ｂｒｄａｍ＋Ａｐｒｉ１１９８５　）。本発明
では、この結果は確認されなかった。それで、新規ＩＦ
ＮＳのあるものの示す生物活性の変化は、Ｓｅｒ”によ
るものでない。

１７位には他のアミノ酸たとえばシスティン、ロイシン
またはアラニンが存在しうる。ある改変ＴＦＮｓ（第６
ｆ図７みよ）では、システィン、ロイシンまたはセリン
が１６位に存在しうる。このことは、挿入されるアミノ
酸の数が、おき代えられるＴＦＮ−βアミノ酸の数より
１個少ない時におこる。

インターフェロン活性の増加は、治療インデックスの改
良をもたらし５る。このような改良治療インデックスは
、天然のインターフェロンンヒトに用いることによりお
こる副作用の多くを減少さすか消失させる。

本発明は、ヒトの予防的または治療的処置、特に、ウィ
ルス感染、悪性腫瘍、および免疫抑制または免疫欠如の
状態に用いるに適当な、新規の高度に活性のあるそして
（または）高度に特異的なインターフェロン様分子の十
分量ビ生産することに関する。

表および図についての簡単な記載 第１図はβおよびα１インターフエロンの予想構造を示
す（ＳｔｅｒｎｂｅｒｇおよびＣＯｈ＋１ｌｌｎ＋　Ｔ
ｎｔ、　Ｊ’。

Ｂｉｏｌ、　Ｍａｃｒｏｍｏｌ、、　４．　１５７．　
１９８２　）。１−２８の領域は黒くしである。

第２図（ａからｅ）新規改変ＴＦＮｓの構築に用いる連
結されたオリゴヌクレオチＦ−＆示す。

第６図（ａからｆ）は、新規改変ＴＦＮ遺伝子の完全ヌ
クレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す
。

第４図は、新規改変ＴＦＮ遺伝子の転写ン開始さすため
に用いるｔｒｐプロモーターのヌクレオチドン配列を示
す。

表１は、粗細菌抽出物中に存在するＴＦＮＸ、４１４、
ＴＦＮＸ：　４２１およびＩＦＮ−βの、発現抗ウィル
スおよび抗増殖活性ン比較して示す。

有利な具体例の記載 前置き ＴＦＮ−β遺伝子は、独特の遺伝子であるが、マルテイ
ジーンＴＦＮ−α群とはある顕著な相同性を示す（Ｒｕ
ｂｉｎｓｔｅｉｎ＋　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ａｃｔａ＋６９５．５，１９８２）。８ｔｓｒ
ｎｂｅｒｇおよびＣｏｈｅｎ　（ｆｆｎｔ−、ｒ、　Ｍ
ａｃｒｏｍｏｌ、＋　４．　１５７．１９８２）は、工
ＦＮ−βおよび工ＦＮ−α１に類似の２次構造ン提出し
た。構造推定研究は、Ｘ−線結晶学で決定したいくつか
の無関係の蛋白質構造に観察されるのと類似の、右廻り
束に°バッグされうる、４個のα−へリックスを示唆す
る（第１図）。本明細誓に記載の改変インターフェロン
のあるもののデザインは、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　／　Ｃ
ｏｂｅｎモデルの我々の解釈に由来している。ＴＦＮｓ
β　およびαは細胞表層の同じレセプターに結合すると
信ぜられるので、特定の部分ンＴＦＮ−α断片で鉛き代
えることでＴＦＮ−βに変化ン与えることができる。Ｔ
ＦＮ１３Ｘ二４０１、ｘ４１２、Ｘ４１６、ｘ４１４お
よびｘ４２１の構築、生物学性質の変わった、新規、ハ
イプリドインターフェロンン与える。これらのインター
フェロンはすべて活性を有し、活性分子ン与えるような
、挿入アミノ酸配列の性質における変動性に大きな範囲
のあることを示す。

それで、本発明の分、野−は、　ＴＦＮ−β１から１８
の位置ｔ１任意の他のアミノ酸配列、無関係の蛋白質配
列または哺乳動物または他のを椎動物に見出だされるＴ
ＦＮ−α８およびＴＦＮ−β８に類似の配列でおき代え
られた、工ＦＮ−βに類似のインターフェロン様分子の
デずイン、合成および特性づけである。

１から２８におけるアミノ酸のそれぞれｔ１天然に存在
する任意の他のアミノ酸でおき代えうろ。

天然に存在するアミノ酸およびそれらの名称ケつぎに示
す。アラニン（ＡｈａまたはＡ）：バリン（Ｖａｌまた
はＶ）；Ｃｌイシン（ＬｓｕまたはＬ）；インロイシン
（Ｔｌｓまたは工）；プロリン（Ｐｒ。

またはＰ）；フェニルアラニン（ＰｈｓまたはＰ）ニト
リノドファン（ＴｒｐまたはＷ）：メチオニン（Ｍｅｔ
またはＭ　）　ｐグリシン（Ｇｌｙまたはａ）：セ！Ｊ
　ン（Ｓｅｒ　マフ、−はＳ）；スレオニン（Ｔｈｒま
たはＴ）；システィン（ＣｙｓまたはＣ）；チロシン（
Ｔｙｒまたはｙ　）　ｓアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ
）：グルタミン（０１ｎまたはＱ）：アスパラギン酸（
ＡｓｐまたはＤ　）　Ｊグルタミン酸（Ｇｌｕ［７Ｃは
Ｅ）：リジン（ＬｙｓまたはＫ）；アルギニ／（Ａｒｇ
またはＲ）　ｐおよびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）。

ハイゾリドＴＦＮ−α′ｓ（α１およびα２．５ｔｒｅ
ｖｌｉ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＴＪＳＡＩ　７８＋　２８４８＋１９８１）によ
り、ＴＦＮ−α８のレセプター結合ライｌに含まれるイ
ディオタイプ（ｉｄｉ○ｔｙｐｅ　）の数および性質Ｚ
分析しようと試みられた。２つのサイトが結合サイトを
構成するものとして提案された。ひとつは、ＩＦＮ−α
のアミノ末端の半分のうちに、他はカルボキシ末端の半
分のうちに存在する。ＴＦＮ−α′８とＴＦＮ−βとの
あいだの部分的に相同な２つの主な領域はアミノ酸２８
−８０および１１５−１５１に存在し、それらは、上記
イディオタイプによく対応する。

上記したＴＦＮ−α８およびそれらのあいだのハイブリ
ド（Ａ、Ｄ、Ａ／ＤおよびＤ　／　Ａ　）の相対的な抗
ウィルス（ＡＶ）および抗増殖（ＡＰ）活性は、いくつ
かの実験室で熱心に研究された（たとえばＷｅｃｋ等、
Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、ｍ　９　、　６１５５
　＋１９８１）。このデータはヒト細胞ＡＰおよびＡＶ
活性は、最初の６１個のアミノ酸で決まりうろことを示
した。しかし反応の程度は分子の残余の部分ン形成する
特定のＴＦＮ−α配列により明らかに変化する（　Ｄｅ
Ｌａ　Ｍａｚａ等、；ｆ、　ＴＦＮ　Ｒｅｓ、−わ５５
９．１９８５）。

限定されたエキソペプチダーゼ消化の研究は、ＴＦＮ−
βの方がＩＦＮ−α８よりもアミノ末端アミノ酸の除か
れにくいことン示した。しかし、消化の程度は測定され
なかった。それと対照的に、ＴＦＮ−βのアミノ末端ア
ミノ酸２−６の除去で、抗ウィルス活性の大男が消失す
ることが分った。

それで前記したように、ＩＦＮ−βのアミノ末端領域が
作用には重要である。

改変インターフェロンの命名の仕方は、本発明では、た
とえ、ばＴＦＮＸ　４０１　（ＴＦＮ−β〔β２−７→
、ｌ−５））のように表わす。この略号は、工ＦＮ−β
のアミノ酸２−７ｗ、ｒｖＮ−α２のアミノ酸１−５で
おき代えることを意味する。つぎの実施例で本発明乞説
明するが、本発明の範囲馨限定するつもりはない。ＤＮ
Ａフラグメントのデずイン、化学合成およびヒ）　ＴＦ
Ｎ−β遺伝子の１−２８域への挿入に用いられる技、術
な下記する。生ずる新規、改変ＴＦＮ８は、以降グルー
プＩ　ＴＦＮＥｌとして記載する。１−２８領域のアミ
ノ酸のおき代えられたグルー７°ＩＴＦＮ８のあるもの
で示される、変えられた性質は、増加した抗増殖活性で
ある。記した技術は、この方面の専門家がよく知ってい
るようである。たとえば、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ’ｌ
１０ｎ１ｎ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
Ｌｅｄｓ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙをみよ。

合成遺伝子フラグメントのデデイン つぎの基準Ｘ用いて、各合成りＮＡフラグメント（第２
ａ−２ｅ図）のヌクレオチド配列ン考案した。

１、　コドン（天然ＴＦＮ−β遺伝子配列より逸脱する
もの）は、Ｅ、　Ｃｏ１１　中の発現がもつともよくな
るようにと利用した。プラスミドｐＧｃｌｏよりＴＦＮ
−βの発現と同程度に高い新規ＴＦＮ８の発現レベルの
得られるように、できるだけ天然のＩＦＮ−β遺伝子配
列を用いた（表１７みよ）。ｐＧｃｌｏ（〜４，４４０
　ｂｐ）は天然ＴＦＮ−β遺伝子を高レベルで発現し、
第４図に示すリボゾーム結合サイトの配列および〜５４
６　ｂｐｐｌ　ＩＩ−Ｂａｍ　ＨＴフラグメントの欠失
を除いてはｐｌ　／　２４に同じである。

２、化学的に合成されたフラグメントの組上げにおいて
相互にアニーリングすることになりうる配列（第２図）
は、このデザインの対、照としない（遺伝子コードにお
けるｒｅｄｕｎｄａｃｙにより許容されうる範囲内にあ
りうるものとする）。

遺伝子フラグメントの化学合成 調整された有孔ガラス（Ｈ０ＫＯ８ｔｅｒ等、Ｔｅｔ、
ｒａｈｅｄｒｏｎ、　４０．　１０５．’　１９８４　
）上のホスホルアミダイト法（Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓ、　”Ｃｂｅｍｉｃａｌａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔ
ｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ＧｅｎｅＦｒａｇｍ
ｅｎｔｓ　’。

Ｈ，Ｇ、　Ｇａ５５ｎおよびＡ、　Ｌａｎｇ編、Ｖｅｒ
ｌａｇＣｈｅｍｉｅ。

ｐ、７１．１９８２）で合成した。完全に保映された２
′−デオキシリボヌクレオチド６′−ホスホルアミダイ
トは、保饅されたデオキシリボヌクレオチドおよびクロ
ル−Ｎ、Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフ
ィンより合成された（　Ｌ、　Ｊ’。

ＭｃＢｒｉｄｅおよびＭ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　
ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、＋　２４．２４５．
１９８３およびＳ　、Ａ、Ａｄａｍｓ等、Ｊ、　Ａｍ５
ｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、＋　１０５＋　６６１　＋
１９８５）。調整された有孔ガラス担体は、記載（Ｆ、
　Ｃｈｏｗ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　
９　、　２８　［１７＋１９８１）のように合成し、ダ
ラム当たり６〇−５０μｍｏｌデオキシヌクレオシドと
した。

官能基乞付した、調整有孔ガラス（５０１ｎ？）は、グ
ラスフィルター中、常温で順次つぎのように処理した。

１、　ジクロルメタン（６−１１０回）２、　６％　（
Ｖ／Ｖ）ジクロル酢酸含有ジクロルメタン（２−１１２
回） ３、ジクロルメタン（３ｔｎｔ、１０回）４、無水アセ
トニトリル（３ｍ、１０回）５、ホスホルアミダイト単
量体（０，０６Ｍ）／テトラゾール（０，２５Ｍ　）含
有無水アセトニトリル（１−１１２０回） ６、アセトニトリル（６−１１０回） ７、ジメチルアミノピリジン（０，０７Ｍ　）含有無水
酢酸／２，６−ルチジン／アセトニトリル（１／２／６
ｖ／ｖ　）　（１ｍｌ、　６０回）８、アセトニトリル
（６−１１０回） ９、　ヨー素（０，２Ｍ　）含有２，６−ルチジン／テ
トラヒドロフラン／水（１／２／２Ｖ／Ｖ　）　（１ｙ
ｄ。

６０回） １０、アセトニトリル（６−１１０回）適轟なホスホル
アミダイト単量体を用いてサイクル２反復し、オリゴヌ
クレオチド鎖Ｚ完結させた。１０　％　（Ｗ／Ｖ）　）
ジクロル酢酸／ジクロルメタン中５０４　ｎｍで遊離ジ
メトキシトリチルアルコール乞分光光度計で分析して、
各サイクルのカップリング効率ンみた。合成乞完了後保
護基ははづし、６％（ｖ／ｖ）ジクロル酢酸／ジクロル
メタン（１２０回）、チオフェノール／トリエチルアミ
ン／ジオキサン（１／１／２ｖ／ｖ）（１時間）そして
７０℃濃アンモニヤ（４時間）で順次に処理して、担体
よりオリゴヌクレオチドンはづした。脱保磯したオリゴ
ヌクレオチドは、ｐＨ４，９，５０°Ｃで１Ｍから４Ｍ
のトリエチルアンモニウムアセテートのグラジｚ７トＺ
用いるＰａｒｔｉｓｉｌ　１０　ＥｌｉＡＸカラム上の
Ｅ（ＰＬＣかま１こは変性性の１５％ポリアクリルアミ
ドｒル（ｐＨ８，５）上の電気泳動で精製した。

オリゴヌクレオチドブロックの連結 １０００　Ｃｉ／ｐｍｏｌｅ（”２Ｐ）ｒ−ＡＴＰ　（
２，５Ｃｉ／ｍＭｏ１ｅ）、１００　μＭスペルミジン
、２０　ｍＭＤＴＴ　。

１０　ｍＭＭｇｃ１２　、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　（ｐｉ−］　９．０　）およびＱ　、１ｍＭＥＤＴ
Ａ　Ｙ含有する２０μｍの溶液中で、６７℃で６０分間
、１単位のＴ４誘導ポリヌクレオチドキナーゼ乞用いて
、５００　ｐｍｏＡｅ宛のオリゴヌクレオチドｙｘリン
酸化した。混合物は、凍結乾燥し、各オリゴヌクレオチ
ドは、変性性の１５チポリアクリルアミドデル（ＰＨ８
，６）中で祠製した。デルから溶出後の回収率＆？　放
射能のカウントで測定した。

リン酸化された成分のそれぞれの’ｌ　５　ｐｍｏｌｅ
　Ｙ、相補鎖よりの非リン酸化オリイマーの等モル量と
組合わせて、ブロック（５０−５，０塩基）を構成した
。混合物は凍結乾燥し、ついで１５μｍの水および２μ
ｍの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５ＱＱｍＭＴｒｉｓ−Ｈｅ
ｌｐ）ｌ　７．６　、　１００　ｍＭのＭｇＣｌ２　）
に取った。

ブロックは１００℃で２分間アニーリングし、室温（２
０°Ｃ）までゆっくり冷却した。２μｌの２０　Ｃｌ　
ｍＭ　ＤＴＴおよび０．５　μｌのＩ　Ｄ　ｍＭＡＴｐ
　Ｙ加え、２０　ｍＭＤＴＴおよび２５０　、ＩＪＭＡ
ＴＰ　（２０μｌ中）の最終濃度とした。１．２５単位
のＴ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼも加えた。２０°０１８
時間後、変性性条件で、１５％ポリアクリルアミドデル
中で生成物ン精製した。

２つの２重鎖ブロック乞、１本鎖切片より構築した。そ
れらは、１５０塩基対および７５塩基対である。各ブロ
ックのｉ　、５　ｐｍｏｌｅ　Ｙ取り、混合物を凍結乾
燥した。１５μｍの水および２μｌの１０Ｘリガーゼ緩
衝液中で１００℃で２分間アニーリングン行ってから１
０’Ｃまでゆっくり冷却した。

２μｍの２００　ｍＭＤＴＴ　、　ｏ、ｓ　μｌの１Ｑ
　ｍＭＡＴＰおよび１．２５単位のＴ　４　ＤＮＡリガ
ーゼＺ加えた。１０℃で１８時間反応させた。生のまま
の１０％ポリアクリルアミドゲル中で生成物ン梢製した
。

２つの２本鎖の０．４　ｐｍｏｌｅ　ｑ組合わせて最終
生成物を組立てた。混合物を凍結乾燥し、１５μｍの水
および２μｌの１０　ｘ　ｙが一ゼ緩衝液に取った。５
０℃で２分間アニーリングし、ついで１０°Ｃにゆっく
り冷却した。２　μｌの２Ｑ　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５
μｍの１０　ｍＭＡＴＰおよび１．２５単位のりが−ゼ
乞加え、１８時間、１０℃で反応させた。５チの生のま
まのポリアクリルアミドデル中で最終生成物ン精製した
。溶出し、エタノール沈殿のあと、生成物７１０μｍの
水に取った。［１，５μｌｔ取り、カウントし、収率を
計算するのに用いた。２μｍの１０Ｘリガーゼ緩衝液、
２μｍの２００　ｍＭＤＴＴ　、’２μｍ０１ｍＭスペ
ルミジン、１　／１１のｉ　［１ｍＭＡＴＰ　、　２μ
ｌの水および０．５単位のキナーゼ乞残りの分に加えた
（全容量２０μｌ）。６７℃で１時間反応させた。９０
°０で２分間加熱し、反応を止めた。

最終生成物ンエタノール沈殿させた。

新規、改変インターフェロンビ発現するシラスミドの構
築 この節で合成りＮＡフラグメント（第２図）ＹＴＦＮ−
β−コード域にクローン化するに用いるベクター、挿入
に用いる制限サイト”、構築のための原理を示す。これ
らのサイト”の位置はグループ１１新規改変ＴＦＮ遺伝
子の完全コードヌクレオチド配列に関して示す（第６図
）。太線のＴＦＮ−β（または新規ＴＦＮ　）コー「領
域は、左から右へと翻訳される。Ｂｇｌ　ｉＩ（または
μ■ＨＩ　）サイトとＢｃｏＲＩサイトとのあいだのべ
りｌ−配列はＰＡＴ１５１におけると同様である（地図
上のヌクレオチド１６４６−２５５１の７０５　ｂｐ川
用ＩＩのフラグメントの除去されたＩ）ＢＲ５２２に相
当）。Ｅ、　ｃａｄｉ轡プロモーター（第４図）はを窯
凹サイトと９△エサイトととのあいだに存在する。

４＋ｌ＋　１ βに一７域における置換が抗増殖活性に影響するかどう
か乞みるためにＴＦＮＸ４１２ンデヂインする。この領
域ではζ　ＩＦＮ−α８中でＩＦＮ−αＨがもつとも明
確である。

（＊”、ｙｚ−７→αＨ１−５１は、ＴＦＮ−βアミノ
酸２−７ンＴＦＮ−αＨアミノ酸１−５でおき代えるこ
とン意味する）。

出発ベクター：ｐＧＣ２０５ このベクターは、ｐｌ／　２４　Ｃ（ｐ１／２４ｃは、
第４図の下線ン付した配列を除いては、ｔｒｐプロモー
ターより、天然ＴＦＮ−β遺伝子Ｚ遺伝子７リ現／２４
矢に同じである）のＣ１ａ　ｌ−Ｂａ＋ｎＨＩサイトの
あいだに挿入されたＣｙ８１７→Ｓｅｒ変化を有する、
完全に合成によるｆｆＦＮ−β遺伝子（第６ｅ図）ン含
有する。”ＧＢ２０６Ｂ　９７０Ａ ｐＧｃ２０５ → 合成オリゴヌクレオチド（第２ａ図）乞ｐｏｃ２０５第
６ａ図に示したヌクレオチド配列とした。ＴＦＮＸ４１
２はシラスミドｐｃｔ２より発現される。

例　２ ＴＦＮＸ　４１５は、ＴＦＮ−βの２−７領域Ｙ　ＴＦ
Ｎ−Ｃ２配列でおき代えるのみならず、１６位のシステ
ィンをセリンでおき代えることの抗増殖、抗ウィルスお
よび免疫刺激活性に及ぼす効果Ｙ　ＴＦＮＸ４０１と比
較して定めるために構築した。

出発ベクター：ｐＧＣ２０５、上記と同じ肚Ｅ””　Ｃ
１ａＩ’　ＸｍａＩＩビ　ＥａｍＨＴ合成オリゴヌクレ
オチド（第２ｂ図）　Ｙ、ｐ　ＧＣ２０５のＣ１ａ　Ｉ
”とＸｍａ　Ｉ　Ｉ　Ｉ％のあいだに挿入し第６ｂ図に
示すヌクレオチド配列とした。ＴＦＮＸ４１３はシラス
ミドｐｌＬ１２２．より発現させた。

例　６ ２および１６位のシスティン乞セワンでおき代えること
の抗ウィルス、抗増殖および免疫刺激活性乞みるために
、ＴＦＮＸ４１４ｖ構築した。モしてＴＦＮＸ４１５　
（例２）と比較した。

出発ベクターは、上記のようにｐＧｃ２０５である。

上記のＴＦＮＸ４１５におけるように、合成オリゴヌク
レオチド（第２Ｃ図）をＣ１ａ　Ｉ”およびＸｍａ　Ｉ
　Ｉ　Ｘ　”サイトのあいだに挿入した。例６Ｃに示す
ヌクレオチド自己列とした。ＴＦＮＸ　４　ｉ　４はプ
ラスミドｐ■Ｌ１２１より発現させた。

例　４ 巴４２１　ＩＦＮ−β〔β谷８〉与り１このバイブリド
は、予見される、ＴＦＮ−βがらのα−ヘリカルセグメ
ント（第１図）　Ｙ　ＩＦＮ−αｌの相当するセグメン
トでおきかえることの抗ウィルス、抗増殖および免疫刺
激活性えの影響？みるために構築した。

出発ベクターはＩ）ＡＰ４である。

ｐＡＰ　４　ハＴＦＮ−βを発現し、アミノ酸７４およ
び７５位でのセリンが、それぞれＴＣＣおよびＴＣ（］
でコードされている以外はｐＧｃＩＱに同じである。こ
れらのセリンコｒンは、合成りＮＡの挿入を容易にする
ためのＸｈｏ　サイ）Ｙ導入するため、ＴｃＡお□　工 よびＴＣＴより変えられた。それにはミスマツチプライ
？　−：　５’−ＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＴ
ＴＧＴＣ−６”ｖ用いる、オリゴヌクレオチドに向けら
れた突然変異生成を用いる（　ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍ
１ｔｈ、、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ。

Ｒｅｓ、、ｉｏ、６４８７．１９８２）。

νと・４ ＥｃｏＲＩ　Ｃ’ｌａｒ’　ＸｈｏＩ’　（ＢｇｌＩＩ
）ｄｅｌｅｔｅｄ−） 合成オリゴヌクレオチド（第２ｄ図）　ｗ　ｐｐｐ　４
の９５”およびＸｈｏ　Ｉ”サイトのあいたに押入し、
第６ｄ図に示すＴＰＮｘ　４２１のヌクレオチド配列と
した。ＴＦＮＸ　４２１はプラスミドＩ）ＮＷ５２より
発現される。

例　５ ＩＦＮＸ４０１　ＩＦＮ−β〔βピー〉Ｃ２と〕このハ
イゾリドは、ＩＦＮ−βのアミノ末端近くにＩＦＮ−Ｃ
２配列を挿入することの、抗ウィルス、抗増殖および免
疫刺激活性に対する効果をみるために構築した。

出発ベクター：ｐｌ／２４Ｃ プラスミドｐｌ／２４Ｃは天然のＩＦＮ−β遺伝子を発
現し、第４図に示すリボゾーム結合サイト配列を除いて
はｐ１／　２４に同じである。

ｐｌ／２４Ｃ 合成オリゴヌクレオチド（第２ｅ図）は、ｐ１／２４Ｃ
のＣ１ａ−とＨｌｎｆＩ”とのあいだに挿入し、４０１
はプラスミドｐｘｘ　４　Ｑ　ｌより発現させた。

ｇｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ　ｏ　ｌ　ｉでの新規、改
変ＩＦＮ８の発現上記プラスミドのすべては、低レベル
のトリプトファンの存在でＥ、ｃｏ、−、ｌｉ　ＨＢ　
１０１中で発育させ０Ｄ６０００．５とし、ＩＦＮ合成
を誘導した。培地は、２００ｄ中につぎの成分を含有し
た。

Ｍ９塩類、０．５％グルコース、Ｏ，ｌ　ｍＭｃａｃ１
２．０．５％カサミノ酸、１　ｍＭＭｇｓＯ４、ｏ、１
　ｍｙ／ｍｌ！ビタミンＢ１．２．５μｇ／−トリット
ファンおよび１００μｍ１７ＩＩＬｌカルペネシリン。

２００ｍ１の培地には、４２．５μｇ／ｍｌのトリシト
ファンの存在以外は上記組成の培地中に発育させた各ク
ローン（宿主ＩＪ、ｃｏ’、１１　ＨＢ　１０１中）の
１夜培養物の２−４ＴｒＬｌを接種し、激しい通気下−
こ３７℃で発育させた。ＯＤ６００が０．５になったら
、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｔｒｐプロモーター誘導物質で、ＩＦ
Ｎ合成の誘導物質でもあるインドールアクリル酸を２０
μｇ／ｍｌに加えた。それから４−５時間後に、培養物
（０Ｄ６ｏｏ　＝　０．７５−１．２の範囲）の６Ｍを
取り出し、つぎのように分けた。１）１１ＩＬｌは、全
１可溶化’　ＩＦＮ抗ウィルス活性（変性／再生サイク
ル後に現われる活性）；１廐はアクリルアミドデル中、
全蓄積Ｅ、　ｃｏｌｉ蛋白質蛋白ラフ０ラスＩＦＮのた
めに；そして６）１ｒＬ１３は、全１可溶化’　ＩＦＮ
抗増殖活性（変性／再生サイクルのあとに活性は再び得
られる）の評価のためにである。

１、全１可溶化’　Ｈ”Ｎ抗ウィルス活性の評価全１可
溶化’　ＩＦＮ抗ウィルス活性の回収のために、２０μ
ｌ”溶解（１ｙｓｉｓ　）用緩衝液１０．１０Ｄ６００
　／　ｍＡ’培養物中で、うす流にかくはんした。

（Ｗ溶解緩衝液１は５Ｍ尿素、３０　ｍＭＮａｃｌ、５
０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７，５，１％ＳＤＳ％１
％２−メルカプトエタノール、１％Ｈ８Ａ　）。混合物
は９０℃に２−６分加熱し、マイナス７０°Ｏｌこ１５
分凍らせ、融解させ、１７　Ｋｒｐｍで２０分遠心した
。上清は、１１ｊｏｇづつに１　：　１　［３５まて希
釈し、希釈物はすぐにＩＦＮ抗ウィルス活性を分析した
。つまり、イン　ビトロ−ミクロプレート分析システム
で、ＥＭＣウィルスの細胞毒効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉ
ｃｅｆｆｅｃｔ　（ａｐｅ）に対し、’Ｖｅｒｏ細胞に
与えられた保護効果を記録した。（たとえばＤａｈｌお
よびＤｅｇｒｅ。

Ａｃｔａ、　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃ
ａｎ、　＋　１６８０　＋　８６　’５＋１９７２をみ
よ）。希釈剤は、５０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７，
５，５［１ｍＭＮａｃｌ、１％ヒト血清アルゾミン（Ｈ
８Ａ　）である。

２、全ポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動 １ｍ１．の培養物よりの細胞を、１０μｍ１０．１ｏｎ
６０．）７ｍｇの最終試料用緩衝液（５Ｍ尿素、１％Ｓ
ＤＳ、１％２−メルカノトエタノール、５ｅｍＭＴｒｉ
ｓ　−ＨＣｌ　ｐＨ７−５，３０ｍＭＮａｃｌおよび０
．０５　％ゾロムフェノールプルー）と混合した。混合
物は、９０℃で５分加熱し、１０分遠心し、５−７μｌ
を１５％アクリルアミド１０．４％ビスアクリルアミド
”　Ｌａｅｍｍｌｉ　’ゲルに移した。７０Ｖで１８時
間泳動に処した。ゲルは固定しＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒ
ｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅで染色し、乾燥し写真を取っ
た。

６、全１町溶化’　ＩＦＮ抗増殖活性の評価抗増殖活性
は、新規ＩＦＮがＤａｕｄｉ　（淋巴芽）セルラインの
増殖を阻害する能力で評価した（　ＨｏｒｏｓＺｅｗｉ
ｃＺ等、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２０６．１０９１．１９
７９）。ｆ）ａｕｄｉ細胞（対数期）を種々の希釈のイ
ンターフェロンの存在で９６ウエルプレート中で６日培
養した。細胞発育が進むと、フェノールレッド指示薬は
赤から黄に変じた（より酸性）、大気にふれることでの
ｐｉ４変化を防ぐために、液体パラフィンを加え、培地
中のＰＨ変化を、Ｄｙｎａｔｅｃｈプレートリーダーで
比色測定した。細胞発育のインターフェロンによる阻害
は、色変化の程度の減少に反映された。細菌抽出物での
、ＩＦＮ蛋白質の発現、抗ウィルス活性および抗増殖活
性の比較衣１は、粗細菌抽出物中のグループＩ新規、変
型ＩＦＮ８の発現レベルおよび抗増殖および抗ウィルス
活性を示す。生物系ないしはアッセイにおける自然の変
動にともなう、活性の範囲も示す。活性は、上記のよう
に、ＳＤＳ’／尿素／メルカプトエタノール処理後、抽
出物を１％ヒト血清アルブミン中に希釈して再生したも
のの活性である。

び抗増殖活性は、ＩＦＮ−βの５倍に及んでいることが
分る。

ＩＦＮＸ　４　［１１の生物学的性状 １、方法 工ｙＮｘ、、　４　［］　１を、Ｌｃｏｌｉよりナトリ
ウムドデシルスルフェート（８ＤＳ　）を用いて抽出し
、ＡｃＡ４４でクロマトグラフィーして精製した。ＩＦ
ＮＸ４０１の純度は、ポリアクリルアミドダル電気泳動
（ＰＡｆｌＥ　）分析で７０−９０％純度と推定された
。

精ｆＪ　ＩＦＮＸ　４０１の抗ウィルス、抗増殖および
免疫刺激比活性を測定した。つぎの試験システムを用い
た。

１）抗ウイルス活性試験 （ａ）　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ　
（ＥＭＣ）ウィルスで細胞痺効果（ＣＰＥ）をみた。こ
れは、ＥＭＣウィルスの細胞毒効果に対して細胞単層を
保護するインターフェロンの能力を測定する標準試験法
である。用いたセルラインはつぎのようである。Ｖｅｒ
。

（Ａｆｒｉｃａｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎｋｅｙ　ｅｐｉ
ｔｈｅｒｉａｌ　）　、Ｗ工ＳＨ（羊膜ｅｐｉｔｈｅｒ
ｉａｌ　）　、ＭＢＣ−５（胎児肺線維芽）および１７
−１（胎児肺線維芽）。２％ドナー牛血清プラスグルタ
ミンおよび抗生物質を含有するＤＭ＝ＥＭを含む９６ウ
エル平底ミクロタイタープレート中に細胞単層を確立し
た。インターフェロンの２連の希釈物のうちのシリース
１を、細胞と共に６７℃で１８−２４時間インキュベー
トした。

上清をすて、適当なチャレンジ量のＥＭＣウィルスを含
有する培地を加えた。６７℃でさらに２４時間インキュ
ベートしてから、上溝をすて、単層をホルモール／食塩
水で固定し、クリスタルバイオレットで染色した。プレ
ートは肉眼で観察し、細胞毒効果を５０％阻止するイン
ターフェロンの希釈率を測定した。

（ｂｌ　ブラック減少試験　ｖｅｒｏ　（サル）　Ｃｈ
ａｎｇ（ヒト）およびＭＤＢＫ　（生細胞）にＨｅｒｐ
ｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘタイプ２　（Ｈ８Ｖ　−２）ウィ
ルスを用いる。細胞のコンフルエント単層を、９６ウエ
ル平底ミクロタイタープレート中に確立した。インター
フェロンの希釈物と３７℃で１８時間インキュベートし
たあと、細胞には適描数のブラック形成単位をチャレン
ジし、０．５％のカルボギシメチルセルロースを含有す
る培地を重層し、３７°Ｃで２４時間インキュベートし
た。固定し染色したあとブラックを顕微鏡で数え、未処
理対照ウェル中の平均極大ブラック数のパーセードとし
て表わした。インターフェロンタイターはブラック数／
ウェルを５０％減少させる希釈倍数の対数である。

＋１）　抗増殖活性試験 Ｄｕｌｂｅｃｃｄｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ
　Ｍｅｄｊｕｍ　（ＤＭＥＭ）中Ｄａｕｄｉ細胞を、９
６ウ工ル組織培養プレート中２Ｘ１０５／＃ＩＡ’（２
００μｌ）宛接種した。インターフェロンは接種時に添
加し、加温５％ｃｏｚ中で３７℃でインキュベートした
。２２時間後トリチル化チミジンを加えさらに２時間イ
ンキュベートしてから、Ｆｌｏｗセルハーベスタ−上で
細胞を採取し、洗い、５％トリクロル酢酸で処理した。

酸不溶性の放射活性をカウントし、チミジンの取り込み
の阻害からインターフェロンの抗増殖活性を判定した。

１１１）免疫調整活性（ナラチュラルキラ−（’Ｎｘ）
細胞活性） ヒト末梢血よりＦｉｃｏｌｌ　／　Ｈｙｐａｑｕｅ沈降
により分けたｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ細胞を、補足ＲＰＭ
Ｉ　１６４０培地中に懸濁させ、インターフェロン希釈
物を加えて３７℃で１夜インキユベートした。インター
フェロンを除いてから、これらのエフェクター細胞は、
５１Ｃγ−ラベルに５６２細胞（ヒト腫瘍由来セルライ
ン）と、エフェクターと標的細胞との比率が２０：１か
ら１０：１となるようにして、３７°Ｃで４時間インキ
ュベートした。上溝の１部を遠心したあとで、放出され
た放射活性を測定した。標的細胞の懸濁液の凍結融解を
反復して、最大限の５１Ｃｒ放出を達成させた。エフェ
クター細胞なしにインキュベートした標的細胞より放出
された５１Ｃｒを測定してパックグランドの対照をえた
。結果は、比５１　Ｃｒ放出パーセントとして表わした
。

２、結果 １）抗ウィルス活性 （ａ）　’　ＣＰＥアッセイ腹Ｃウィルス表２１こ、ｖ
ｅｒｏおよび４種のヒトセルライン中のＥＭＣウィルス
に対して測定するバイブリドＸ４０１および組換え由来
ＩＰＮ−βについてのアッセイ手段を示す。活性は単位
／ｍ９蛋白質で表わす。

表に示す種々のセルタイプにおける個別のインターフェ
ロンについての平均、すべてのセルタイプを通しての合
わせたデータから、異なるセルラインにおいて、ＩＦＮ
Ｘ４０１は、ＩＦＮ−βに非常に類似する活性を有する
ことが分る。

比較の目的で、線維芽ＩＦＮ−βおよび白血球ＩＦＮ−
αの調製物の観察された活性（単位／ｍＪ）を表６１こ
示す。これら天然インターフェロンは、精製状態で入手
されず、活性試験においては、大量の非インターフェロ
ン蛋白質を含有する希釈溶液中で用いた。それで、天然
のＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−αを用いる結果は、単位／
■で表わし得す、表３中の結果は表２とじかに比較しえ
ない。しかし、両方のインターフェロンの活性は保たれ
ているが、ＷＩＳＨセルがＨ”Ｎ−βおよびＩＦＮ−α
の両方にやや感受性であることが分る。

（ｂ）　ブラック減少試験Ｈ８Ｖ　−２ブラツク減少試
験により、ｎ５ｖ−２を用いて得られる抗ウィルス活性
の同様な評価を、表４に示す。この場合、実験は、ヒト
Ｃｈａｎｇ細胞、霊長類ＶｅｒＯ細胞、牛Ｍｒ）ＢＫ　
；ｉｌＪ胞を用いた。それぞれのセルタイプについて工
Ｆ’ＮＸ　４０１は、ふたたび、ＩＦＮ−βに匹敵する
活性を示した。

これら６つのセルライン中でのＨ８Ｖに対する天然ＩＦ
Ｎ−βおよびＩＦＮ−αのパターンを表５に示す。やは
り、工ＦＮｓは不純なので比活性でなくｕｎｉｔｓ／ｍ
ｌで表わす。他の実験室から報告された結果に比較して
１．　ＩＦＮ−βは我々のＭＤＢＫセルラインとかなり
よく反応し、ＶｅｒｏｔたはＣｈａｎｇ細胞と大体同じ
希釈で抗ウィルス活性を示す。他方、ＩＦＩＮ−αスタ
ンダードは、ＶｅｒｏまたはＣｈａｎｇ細胞よりは、Ｍ
ＤＢＫ細胞と実質的によりよく反応した。

表４ 組換エインターフェロンのブラック減少試験でのＨ８’
Ｖ−２に対する抗ウィルス活性 インターフェロン単位／ｍ９蛋白質 調製物　セルライン Ｖｅ　ｒ　ｏ　Ｃｈａｎｇ　Ｍｒ）ＢＫ工ＦＮ−β　ｘ
　１．２ｘ１０５４．７．ｘ１０５２．５×１０５ＩＦ
ＮＸ４０１　’　ｘ　１．４ｘ１０５２．２ｘ１０５１
．９ｘ１０δ表５ 天然インターフェロンのサル、ヒトおよびウシ細胞中Ｈ
８Ｖ　−２に対するブラック減少法による相対的抗ウィ
ルス活性 インターフェロン単位／ｍｌ 線維芽由来ＩＦＮ−βＸ　２．６Ｘ１０’　９．３．ｘ
１０’　１．９ｘ１０’白血球由来　５９　９０　６．
８ｘ１０・ＩＦＮ−α 相応するセルタイプ中でのＲＮＡおよびＤＮＡウィルス
との抗ウィルス活性の結果を要約して、表６は、Ｃｈａ
ｎｇおよびＶｅｒｏセル中の腹ＣおよびＨ８Ｖ−２に対
する組換えおよび天然インターフェロンの活性を示しで
ある（表２−５よりのデータ）。

これらの結果から、２つのタイプのウィルスのひとつ才
たは他に対して、ＩＦＮＸ４０１がより活性があること
は示されてない。２組のアッセイの結果は非常に似てい
て有意差はない。それで表２に分散分析として示された
ＥＭＣウィルスに対する、プールされた平均抗ウィルス
活性も、等しく、抗ヘルペス活性の評価として真実であ
りＩＦＮＸ４０１の比抗ウィルス活性の全体的インディ
ケータ−として用いうる。

−罵 （Ｃ）　アティピカルＣｈａｎｇセルラインを用いた比
較抗ウイルス試験のデータ 高通過数（約Ｘ１６０）で維持されて来たＣｈａｎｇ結
膜細胞は変異的変化を受けて、我々がルーチンの試験に
用いたふつうの低通過数Ｃｈａ邸細胞よりＩＦＮ−βに
約３倍感受性＼である。同時に、このアテイピカル高通
過数ｃｈａｎｇ細胞は、親の低通過数Ｃｈａｎｇ細胞に
比して、１００倍の感受性でＩＦＮ−αを認識しそして
反応する。それで、高および低通過数Ｃｈａｎｇ細胞に
おける抗ウィルス活性の比率は、特定の組換え生成物の
１α一様“性状を示すのに用いうる。このようにして、
ＩＦＮＸ４０１組換え体の性質をみた結果を表７に示す
。

表７ アテイピカルＣｈａｎｇセルにおける組換え天然インタ
ーフェロンの抗ウィルス活性 ＩＦＮ−β　１．６×１０’　５．２ｘｌＯ’　５ＩＦ
ＮＸ４０１　１．３ｘ１０６　６．５ｘ１０５　２Ｕｎ
　ｉ　ｔ　ｓ　／ｍｌ： １１）抗増殖活性 ＩＦＮＸ　４０１を、少なくとも４回の反復で、Ｄａｕ
ｄｉ淋巴芽細胞に対し阻害活性を試験した。これらの試
験の平均結果を表８に示す。活性は、未処理対照細胞中
への最大チミジン取り込みの５０％を阻害するに必要な
蛋白質濃度（ＩＤ５０　、阻害量５０）として表イっす
。ＩＦＮＸ、　４０１の抗増殖剤さしての活性は、わづ
かではあるが有意に増加している。

表８ Ｄａｕｄｉヒト淋巴芽細胞で試験した組換えインターフ
ェロンの抗増殖活性 阻害量ｓｏ（μｇ／ｍｉ　） ＩＦＮ−β　４　３．８　１．５−９．８ｒＦＮｘ４０
１　４　１．２　０．５−３．２１１１）免疫調整活性
−ＮＫ試験 組換えインターフェロンは、また、ナチュラルキラー（
’ＮＫ）細胞活性を強める能力について反復試験した。

全体で９から１１回′の試験で表９に示した結果を得た
。抗増殖活性の場合と同様に、５０％の効果を生ずる蛋
白質処理濃度（５ｒ）５０．刺激処理濃度ｓｏ）で表現
した。ＩＦＮＸ、４０１は、ＩＦＮ−βと同じＮＫ刺激
活性を示した。

表９ ヒトＮＫ細胞を用いて試験した組換えインターフェロン
の免疫刺激活性 調製物　試験反復回数　補正平均　９５％信頼限界（ｎ
）　Ｓｎ２゜ ＩＦＮ−１１３，４２，１−５，４ 工Ｆｔｖｘ　４０１　９　４．９　２．９−８．３６、
結論 各インターフェロンの抗ウィルス、抗増殖および免疫調
整の性質の平均比活性を表１０Ｉこ要約する。（留意す
べきこととして、抗ウイルス試験では、数字が大きくな
ると共に活性上昇するが、ＩＤｓ、および５Ｄ５ｏ試験
では、数字の小なほど活性が大きい）。便宜なように、
親であるＩＦＮ−βに対する活性の大きさを表１０の下
半分に示した。

この試験から、ＩＦＮＸ４０１の抗ウィルスおよび免疫
刺激活性はＩＦＮ−βに同じであるが、抗増殖活性は３
倍であることが分る。この程度の抗増殖活性の増加は小
さいけれども、有意である。

薬剤処理および投与 本発明の新規、改変インターフェロンは、薬剤組成物に
既知の方法で処方しうる。ここで、活性インターフェロ
ンは、それぞれの投与方式により異なる、薬剤として許
容されうる担体と混合する。

本明細書で参考文献として引用する、Ｅ、Ｗ、Ｍａｒｔ
ｉｎ著Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓは、本発明のインターフェ
ロンの投与に適当な組成物および処方を記載している。

たとへぼ、食塩水、バランストサルトソルーションオた
は類似の生理学的に許容されうる液体をビヒクルとした
。注射しうる液をふつう用いる。経口用処方物は、固体
、たとへば錠剤、才たはカプセル、または液体状溶液ま
たは懸濁液でありうる。

本発明の新規、改変インターフェロンは、細胞に対して
有効であるような、ヒトまたは他の動物に、経口、静脈
、筋肉、腹腔、鼻腔、皮肉又は皮下投与している。免疫
が抑制されているかまたはそうでない、悪生物才たは新
生物を有する患者、または、免疫調整を必要とする患者
、才たは抗ウイルス治療に用いうる。投与量および投与
の割合は、天然インターフェロンにふつうに用いられる
量、約１０６から１０８単位７日とする。長期投与とか
急性短期治療とかの場合には、これらの量を増減しうる
。新規、改変インターフェロンは、他の治療と組合わせ
たり、他の化学療法剤または化学予防剤と組合わせて、
上記の病気および状態の、才たは、効果を示す他の状態
の治療に用いうる。

本発明を笑施するための、非限定性の、上記方式よりの
変型、たとへぼ別のベクター、別の発現制御システム、
別の宿主微生物および新規インターフ・エロンの他の治
療および類似したことへの使用も、バイオテクノロジー
、薬学、医学および（または）類似の分野の専門家に明
らかであろうが、それらも本発明の特許請求の範囲内に
金談れるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、βおよびα１インターフエロンの予築に用い
る、連結されるオリゴヌクレオチドを示す。（ａ）はＩ
ＩＦＮＸ　４１２　、（ｂ）はＩＦＮＸ４１３、（Ｃ）
はＩＦＮＸ４１４、（ｄ）はＩＦＮＸ　４２１、（ｅ）
はＩＦＮＸ４０１についての子の完全なヌクレオチド配
列およびコードされるアミノ酸配列を示す。 第４図は、新規、改変ＩＦＮ遺伝子の転写を開始さすに
用いるｔｒｐプロモーターのヌクレオチド配列を示す（
ＩＦＮ−β発現プラスミドルｌ−２４／Ｃのｔｒｐプロ
モータ領域のヌクレオチド配列）。 代理人　浅　村　晧 図１１１１の浄＄（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１ 第２０−１図 ＩＦＮＸＩ４１２ Ｑ譲Ｉ　已匡１ ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣ
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ｏｃｚ　＊、（１：　、ｃ！　）−）−Ｃり已　５し　
ヨ昌　垢曜　：第１頁の続き ｏｌｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号＠発明者
　ジョン　シー・スミス　イギリス国パツ；−ジャム　
ヒル。 ０発　明　者　マイクル　ホウトン　アメリカ合衆国シ
ック　ドライブ トンガムシャー、ハイ　ウイコウム、アマエツジコート
　ハウス２ プリフォルニア州ダンビル、グリーンプル３０７ 手続補正書（方式） 昭和６０年２月７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和ｌデ年特許願第１３２ρ２Ｊ号 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日イ」 昭和４年７ｐ月θθ日 ６、補正により増加する発明の数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１ベーターインターフェロンアミノ酸１位から２８
   位までのうちの６から２８個ン、６から２８個の別のア
   ミノ酸でおき代えた、ベーク−インターフェロンのアミ
   ノ酸配列からなる改変ベーク−インターフェロン。 （２）おキ代えられるベーターインターフェロンアミノ
   酸が１から７位までのものである、上記（１）項記載の
   改変ベーターインターフェロン。 （３）　おキ代えられるベーク−インターフェロンアミ
   ノ酸が２から２８位までのものである、上記（１）項記
   載の改変ベーターインターフェロン。 （４）　ベーターインターフェロンアミノ酸１位から７
   位までの６から７個の連続するアミノ酸を、アルファー
   インターフェロンアミノ酸１かも７位より選択された６
   から７個の連続するアミノ酸でお話イで−ｔた−　ト看
   己（２）Ｊ自記載の改をベーターインターフェロン。 （５）該７　／ｌ／ファーインターフェロンアミノ酸配
   タリが、アルファー１インターフエロンのアミノ酸１位
   から７位より選択した４から７個のアミノ酸ケ包含する
   、上記（４）項記載の改変ベーターインターフェロン。 （６）ベーターインターフェロンアミノ酸を、アルファ
   −２インターフエロンアミノ酸１位から７位でおき代え
   た上記（５）項記載の改変ベーク−インターフェロン。 （７）　ベーターインターフェロンアミノ酸２から２８
   位ン、アルファーインターフェロンアミノ酸２から２８
   位でおき代えた、上記（３１項記載σつ改変ベーク−イ
   ンターフェロン。 （８）　ベーターインターフェロンアミノ酸６から２８
   位ンアルファー１アミノ酸２から２６位でおき代えた、
   上記（力項記載の改変ベーターインターフェロン。 （９）アルファーインターフェロンがヒトに由来する、
   上記（４）項記載の改変ベークーインターフエロン。 （１０）　ベーク−インターフェロンがヒトに由来する
   上記（１）項記載の改変ベーク−インターフェロン。 ０υ　アルファーおよびベーク−の両方のインターフェ
   ロンがヒトに由来する、上記（４）項記載の改変ベーク
   −インターフェロン。 凹　システィン１６をセリン１６でおき代えた、上記（
   １）項記載の改変ベーク−インターフェロン。 Ｑ３　システィン１６ビセリン１６でおき代えた上記（
   ４Ｊ　項記載の改変ベーク−インターフェロン。 ＱＤ　システィン１６ンセリン１６でおき代えた上記（
   力項記載の改変ベーターインターフェロン。 θＱ　抗ウィルス、細胞発育調節または免疫調整活性の
   うちのひとつまたはひとつより多く乞。未改変ベーター
   インターフェロンのそれより実質的に変化させた上記（
   １）項記載の改変ベーク−インターフェロン。 （ト）　ＩＦＮＸ、　４０１のアミノ酸配列Ｚ包含する
   上記（６）項記載の改変ペークーインタフエロン。 ０７）　ＩＦＮＸ　４１２のアミノ酸配列を包含する、
   上記０項記載の改変インターフェロン。 （至）　ＴＦＮＸ４１３のアミノ酸配列を包含する、上
   記［相］項記載の改変ベーターインターフェロン。 ＱＩ　ＴＦＮＸ４１４のアミノ酸配列を包含する、上記
   （至）項記載の改変ベーク−インターフェロン。 ｃＩｉＪＴＦＮＸ４２１のアミノ酸配列を包含する、上
   記（８）項記載の改変インターフェロン。 ＱＤ　上記（１）項のポリペプチドの合成乞コードする
   一核叡配列。 （イ）　核酸配列がＤＮＡである、上記Ｃυ項記載の核
   酸配列。 ＣＡＤＮＡがポリペプチド１ＦＮＸ４０１の合成をコー
   ドする、上記（４項記載のＤＮＡ配列。 （ハ）　ＤＮＡがポリペプチドエＦＮＸ４１２の合成ン
   コードする、上記（４）項記載のＤＮＡ配列。 に）　ＤＮＡがポリペプチドエＦＮ、Ｘ４１５の合成ン
   コードする、上記（イ）項記載の核酸配列。 に）　ＤＮＡがポリペプチドエＦＮＸ　４１４の合成乞
   コードする、上記（４）項記載のＤＮＡ配列。 ｅカ　ＤＮＡがポリペプチド■ＦＮＸ４２１の合成をコ
   ードする、上記（２）項記載のＤＮＡ配列。 鱒　上記（イ）項記載のＤＮＡ配列と組合わせた複製す
   るクロｉニングビヒクルン含鳴する組換えプラスミド。 ■　ＤＮＡ配列かＩＦＮＸ　４０１の合成？コードする
   、上記（ハ）項記載の組換えプラスミド。 に）　ＤＮＡ配列がＩＦＮＸ　４１２乞コードする、上
   記（ハ）項記載の組換えプラスミド。 （ＩＩ）　ＤＮＡ配列がＩＦＮＸ４１５の合成ヲコード
   する、上記（ハ）項記載の組換えプラスミド。 ３Ｊ　ＤＮＡ配列がＩＦＮＸ４１４の合成をコードする
   、上記（ハ）項記載のプラスミド。 ３：ｊ　ＤＮＡ配列が工ＦＮＸ４２１の合成乞コードす
   る、上記に）項記載のプラスミド。 Ｃ３優　上記翰項記載の岨換えプラスミドで形質転換さ
   れた細胞。 ０ω　上記（３４）項記載の細胞の発育および生ずるポ
   リペプチドの分離ビ包含する改変ベーク−インターフェ
   ロンの製造方法。 （支））上記（１）項記載の改変ベーターインターフェ
   ロンの有効量を薬剤として許容されうる担体と混合して
   含有する、薬剤組成物。 Ｃ３？）　ＩＦＮＸ４０１のＭ９；ｈ量乞薬剤として許
   容されうる担体と混合して含有する薬剤組成物。 ｃＢ　ＩＦＮＸ４１２の有効量乞薬剤として許容されう
   る担体と混合して含有する薬剤組成物。 ｔ３９Ｊ　ＩＦＮＸ４１５の有効量を薬剤として許容さ
   れうる担体と混合して含有する薬剤組成物。 （４０）　ＩＦＮＸ４１４の有効量ビ薬剤として許容さ
   れうる担体と混合して含有する薬剤組成物。 ｔ４ｊ　ＩＦＮＸ　４２１の有効量を薬剤として許容さ
   れうる担体と混合して含有する薬剤組成物。 （４榎　上記（１）項記載の改変ベーターインターフェ
   ロンの有効量を投与することｔ包含する、ウィルス感染
   の治療法。 （４３上記（１１項記載の改変ベーターインターフェロ
   ンの有効量を投与することを包含する、細胞発育の調節
   方法。 （４４）　上記（１）　項記載の改変ベーク−インター
   フェロンの有効量を投与することン包含する、免疫シス
   テムの調節方法。