KR100223255B1

KR100223255B1 - 개량된 알파 인터페론 조성물 및 인간 말초혈 백혈구로 부터의 제조 방법

Info

Publication number: KR100223255B1
Application number: KR1019940702747A
Authority: KR
Inventors: 다글라스테스타; 메이-쥰리아오; 키타린페렌츠-비로; 아바스라쉬드바이기; 마리오디파올라; 마니샤패드하이
Original assignee: 더글라스 테스타; 인터페론 싸이엔스 인코포레이티드
Priority date: 1992-02-10
Filing date: 1993-02-09
Publication date: 1999-10-15
Also published as: US5503828A; KR950700333A; AU674306B2; CA2129533A1; RU2129437C1; ATE179330T1; AU3660093A; JPH07503851A; EP0625991A4; DE69324671D1; EP0625991A1; PL176408B1; EP0625991B1; WO1993016107A1

Abstract

본 발명은 높은 비활성과 순도 95% 이상 및 인간에게 사용시 알파 인터페론 조성물에서 통상적으로 나타나는 부작용이 실질적으로 감소된 특징을 가진 신규의 개량된 알파 인터페론 조성물을 제공한다. 또한, 인간의 말초혈 백혈구로 부터 상기 조성물을 대량으로 제조할 수 있는 방법도 제공한다. 이 알파 인터페론 조성물을 면역 계통의 암 및 장해 및/또는 바이러스성 병인학 치료에 사용할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

개량된 알파 인터페론 조성물 및 인간 말초혈 백혈구로 부터의 제조 방법

[기타 출원과의 관련]

본 출원은 1992 년 2 월 10 일자 미합중국 특허출원 번호 제 835,030 호의 일부 계속 출원이다.

[기술분야]

발명은 알파 인터페론 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 높은 비활성, 95% 이상의 고순도 및 인체에 사용시 알파 인터페론 조성물과 통상적으로 관련된 부작용의 실질적인 감소 등의 특징을 가진 개량된 알파 인터페론 조성물 및 인간의 말초혈 (peripheral blood) 백혈구로 부터의 상기 조성물의 대량 제조 방법에 관한 것이다.

[발명의 배경]

인간 알파 인터페론은 항바이러스성, 생장 억제 및 면역 조절 등의 활성을 가진 15 가지 이상의 단백질로 구성되어 있다 [Pestka et a1., Ann. Rev. Biochem., 56 : 727(1987)]. 인간 알파 인터페론의 치료 효능은 인간의 암이나 바이러스성 질환에 대해 이미 확립되어 있다. 예컨대, 재조합 인터페론(IFN알파-2a, IFN 알파 -2b, IFN - 2c)세포계통 유래의 인터페론(IFN알파-nl) 및 백혈구 유래의 인터페론 (IFN 알파-n3)등은 현재 첨규습우(또는 첨규 콘딜롬 : Condyloma acuminata), 간염의 치료 [Weck et al., Am. J . Ned., 85(Supp1 2A): 159(1988); Korenman et al., Med., 114 : 629(1991); Friedman-Kien et al., JAMA, 259 : 533(198)], 몇가지 악성 종양의 감쇄 [Baron et al., JAMA, 266 : 1375(1991)], AIDS 관련 카포시 육종의 치료[Physicians Desk Reference, 47th edit., eds. Medical Economics Data, Montvale, NJ, p.2194 and 2006(1993)] 등에 사용되고 있고, 기타 항바이러스제와의 병용 또는 단독으로 인간의 AIDS 치료용으로 현재 고려되고 있기도 하다 [Hirsch, Am. J. Med., 85(Suppl 2A): 182(1988)].

재조합 인터페론은 유전공학 기법을 이용하여 예컨대 대장균(Escherichia coil)중에서 대량으로 제조할 수 있다 [Goeddel et al., Nature, 287 : 411(1980); Streuli et al., Science, 209 : 1343(1980)]. 그러나, 유전공학 기법으로 제조된 인터페론은 단일종으로만 구성되어 있어서 번역후에 변형이 전혀되지 않거나 천연 인터페론으로의 전환이 어려우므로 조성물의 생물학적 활성을 제안하는 경우도 있다. 예를 들자면, IFN-α2는 제품인 Intron A(IFN 알파-2b)[Schering Plough] 및 Roferon A(IFN 알파-2a)[Hoffman-La Roche] 의 기본종이다.

천연의 인터페론, 예컨대 인간 임파아세포종, Namalwa, 세포계통 유래의 것들 [Mizrahi, Meth. Enzymol., 78 : 54(1981); Phillips et al., Meth. Enzymol., 119 : (1986)]과 인간 말초혈 백혈수 유래의 것들[Mogensen et al., Pharmacol. Ther. Part C, 1: 369(1997); Cantell et al., Methods Enzymol., 78 : 29(1981); Horowitz, Methods Enzymol., 119 : 39(1986)] 은 구조와 생물학적 활성이 각기 다른 다중종으로 구성되어 있다.

천연 인터페론이 몇사람의 연구가들에 의해 재조합 인터페론보다 양호한 치료 효능을 주는 것으로 생각되고 있다. 예컨데, 천연 알파 인터페론은 재조합 인터페론 보다 4 배나 낮은 투여량에서도 콘딜롬을 치료할 수 있다 [참조 : 위에서 인용된 Physicians Desk Reference, pages 1879 and 2194]. 천연 백혈구 인터페론을 치료제로 사용할 때의 가장 현저한 장점은 인터페론 치료를 받는 환자에 있어서 면역성이 낮다는 것이다. 재조합 인터페론으로 치료 받은 환자와 임파아세포종 인터페론인 Wellferon IFN 알파 - nl [Burrougls Wellcome] 으로 치료받은 환자들에 있어서 인터페론에 대한 중화항체가 발현하였다는 보고가 있다. [Lok et al., Hepatology, 12 : 1266(1990); Jacobs et al., J. Biol. Resp. Mod., 7 : 447(1988); Weck et al., J. Interferon Res., 1(Suppl): S37(1989)]. 그러나, 백혈구 유래의 인터페론(IFN알파-n3 또는 Cantel1의 부분정제 인터페론 제제)으로 치료받은 환자들은 인터페론에 대한 검출 가능한 항체를 발생하지 않고 있다. [Von Wussow et al., Lancet, 2 : 635(1987); Liao et al., J. Intect. Dis., 165 : 757 - 760(1992)]. 중화 항인터페론 항체가 존재하면 인터페론의 치료 효과를 저지할 수 있기 때문에 임상치료에 있어서 중요한 인자이다. 그러나, 재조합 알파 인터페론에 내성인 이러한 환자들의 다수는 천연 알파 인터페론 치료에 반응을 보였다.

이미 보고된 바 있는 인간 말초혈 백혈구로 부터의 알파 인터페론의 제조 방법은 비효율적이고 극히 경비 소모적이다 [Mogensen et al., (1977); Cantell et a1., (1981); and Horowitz(1986), 모두 위에서 인용되었음]. 말초혈 백혈구로부터 천연 알파 인터페론을 제조하는 칸텔 (Cantel1)의 방법은 비교적 높은 세포 밀도(1×10⁷세포/㎖)에서 비교적 낮은 역가(60,000 CPE U/㎖)의 인터페론을 생성하게 된다.

천연 인터페론의 종래의 정제 방법은 각기 한정되어 있기도 하다. 예를 들자면, 칸텔 등은 문헌 [Meth. Enzymol, 78 : 499(1981)]에서 순차 침전법으로 인간 백혈구 인터페론을 다량으로 부분 정제할 수 있을 뿐이라고 하고 있다. 수득한 인터페론은 여러가지 인터페론종을 함유하고 있어서 그 순도는 약 1%정도이다. 베르그 등은 문헌 [Meth. Enzymol., 78 : 487(1981)]에서 Sepharose 4B결합 모노클로날 항체 친화성 크로마토그래피에 의한 인간 백혈구 인터페론의 정제 방법에 대해 보고하고 있다. 마지막으로 위에 나온 호로위츠[Horowitz(1986)] 는 말초혈 백혈구로 부터 인간 백혈구 인터페론의 대량 제조와 정제에 대하여 기술하고 있는데, 그는 칸텔의 침전법 또는 NK2항체 친화성 크로마토그래피를 사용하였다.

여러가지 징후의 환자와 임상 시험에 있어서 알파 인터페론 제제의 사용은 그 수가 증가일로에 있으나 환자들에 있어서 많은 부작용이 있다는 특징을 가지고 있다. 독감같은 증상은 열이나고 혈구 카운트가 적고 구토, 설사 등의 위장장해, 신장장해, 폐기능장해, 기관지경련 또는 과민증 또는 피부 발진 등의 알레르기 반응, 모발 탈모 및 감염 등을 수반하는데 이러한 것들은 시판되고 있는 알파 인터페론의 제품 설명서에서 확인되고 있다.

몇가지 부작용은 사소한 것이라 하더라도 장기간 상당량의 조성물을 투여 받아야만 하는 환자들에게 있어서는 심각안 충격을 줄 수 있다. 예를 들자면, 어떤 요법, 즉 AIDS관련 카포시 육종과 증후성 AIDS의 치료에 있어서 인터페론이 효능을 나타내는 투여량에 따라 어떤 단계에서는 질환의 효과보다 더 악화된 부작용을 나타낼 때가 있다. 이들 징조에 대한 임상 시험에서 부작용의 출현으로 인하여 장시간 있을 수 있는 잇점에도 불구하고 치료를 포기하는 환자가 있다. [H. C. Lane et al., Annals of Internal Medicine, 112 : 805(1990)].

따라서, 극히 독성이 적고 고순도이며 인터페론 요법을 실시하고 있는 환자들에 있어서 부작용이 극소화된 개량된 알파 인터페론 조성물에 대한 필요성이 대두되고 있다.

[발명의 요약]

한가지 특징에 있어서 본 발명은 천연의 인간 알파 인터페론종 또는 아종(subspecies)의 혼합물을 함유하는 순수한 알파 인터페론 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 이 조성물은 비활성이 약 4 ×10 U/mg로서 극히 높다는 특징을 가지고 있고, 알파 인터페론에 의한 부작용이 상당히 감소되면서 환자에게 치료 효과를 나타낼 수 있는 특징을 가지고 있다.

다른 특징에 있어서, 본 발명은 한가지 활성 성분으로서의 본 발명의 알파 인터페론 조성물 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체에 함유해서 된 의약 조성물을 제공하는 것이다. 이 의약 조성물은 선택된 질환 또는 장해의 치료에 유용한 기타 종래의 의약과 더불어 알파 인터페론 조성물을 함유하여도 좋다.

또 다른 특징에 있어서, 본 발명은 다량의 조성물을 효율적이고도 저렴하게 제조할 수 있는 몇가지 적정화된 유도 및 정제단계의 특징을 가지고 있는 인간 말초혈 백혈구로 부터 위에 나온 알파 인터페론 조성물을 제조하는 신규의 방법을 제공하는 것이다.

또 한가지 특징에 있어서, 본 발명은 본 발명의 정제된 알파 인터페론 조성물의 면역계통의 각종 질환 또는 장해, 암 및/또는 바이러스성 질환의 치료에 대한 용도에 관한 것이다. 이들 치료 방법에는 본 발명의 의약 조성물을 단독 또는 기타 의약과 더불어 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 기타 여러가지 특징과 장점에 대해서 본 발명의 바람직한 실시태양에 관한 구체적인 설명에서 알 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 인터페론 역가와 백혈구 생성능을 세포농도의 함수로서 나타낸 그래프. 생성능은 백혈구 10⁶개당 인터페론 IRMA 단위로 구한 것이다.

제2도는 인터페론 역가를 6ℓ 들이 넓적 바닥 플라스크중에서의 유도 배양 체적의 함수로 나타낸 그래프.

제3도는 Superose칼럼 크로마토그래피로 부터의 IFN α-n3a의 대표적인 용리 프로파일을 나타낸 그래프.

제4a도는 준예비 C4 칼럼(10 x 250 mm)으로 부터의 IFN α -n3a 의 대표적인 RP-HPLC 프로파일에 있어서 피이크 1a,1b 및 2 내지 6 을 나타낸 도면.

제4b도는 비교 블랭크 기울기 RP-HPLC 프로파일을 나타낸 도면.

제5도는 RP-HPLC 파이크에 있어서 단백질의 소수성과 생물학적 활성 사이의 관계를 나타낸 도면.

제6도는 비환원 조건하에서의 IFN α-n3a의 쿠우마시이 블루우 염색 처리된 SDS-PAGE 결과의 도면. 칼럼 A 는 예비 염색 처리된 저분자량의 마아커(Biorad)이고, 칼럼 B는 IFN α-n3a(미분획분)이고, 칼럼 C는 RP-HPLC 피이크 1a이며, 칼럼 D는 RP-HPLC 피이크 1b, 칼럼 E는 RP-HPLC 피이크 2, 칼럼 F는 RP-HPLC 피이크 3, 칼럼 G는 RP-HPLC 피이크 4, 칼럼 H는 RP-HPLC 피이크 5, 칼럼 I는 RP-HPLC 피이크 6이다.

제7도는 환원 조건하에서의 IFN α-n3a 의 쿠우마시이 블루우 염색 처리된 SDS-PAGA 결과의 도면으로서 칼럼 각각은 제6도에서 정의한 바와 같다.

제8도는 비환원 조건하에서의 IFN α-n3a의 면역 염색 처리된 웨스턴 블롯을 나탄낸 도면으로서 칼럼 각각은 제6도에서 정의한 바와 같다.

제9도는 환원 조건하에서의 IFN α-n3a의 면역 염색 처리된 웨스턴 블롯을 나타낸 도면으로서 칼럼 각각은 제6도에서 정의한 바와 같다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 개량된 알파 인터페론 조성물(이하, 간단히 IFN α-n3a 라함), 상기 조성물의 제조 방법 및 상기 IFN α-n3a조성물을 함유하는 알파 인터페론에 의한 치료에 민감한 질환의 치료를 위안 의약 조성물을 제공한다.

1.조성물

본 발명의 알파 인터페론 조성물은 천연의 인간 알파 인터페론종 및 그 아종의 정제된 혼합물이다. 아래에서 설명하는 바와 같이 본 발명의 이와 같은 조성물은 기타 천연의 알파 인터페론 제품과는 상이한데, 즉 항바이러스성 비활성이 5배 이상이고, 불순물은 최소한 5 배 이상 적으며, 파이로젠(pyrogen)활성은 5 배 이상 작다.

IFN α-n3a 단백질 집단에는 문헌에 보고된 인터페론 유전자 서열에 의해 확인되는 아미노산 서열을 가진 단백질을 함유하고 있다. 특히, IFN α-n3a 조성물에는 최소한 6 가지의 인간 알파 인터페론 단백질종의 혼합물이 함유되어 있다.

아래에 나오는 N 말단 서열 확인에 근거하여 2b, 2c 또는 이들 두가지의 조합으로 부터 최소한 한가지의 알파 인터페론을 선택한다. 최소한 두번째 인터페론종은 4a, 4b 및/또는 16 중의 하나 또는 이들의 조합에서 선택된다. 6 가지 인터페론중의 세번째의 것은 7a, 7b 및/또는 7c 중의 하나 또는 이들의 조합에서 선택된다. 네번째의 것은 8a, 8b 및/또는 8c 중의 하나 또는 이들의 조합에서 선택되고, 이 혼합물중에서의 다섯번째의 것은 10a이다.

최후로 이 혼합물중에서의 여섯번째 알파 인터페론은 17a, 17b, 17c, 17d, 21a 및/또는 21b 중의 하나 또는 이들의 조합이다. 이들 인터페론 모두의 서열은 Genbank데이터베이스[미합중국의 Intell Genetics, Inc., Mountain View, CA]를 비롯하여 시판되고 있는 각종 데이터베이스에서 얻을 수 있다. IFN α -n3a 에서의 단백질의 혼합물에는 IFN -α 14, IFN-α 2a, IFN-α 1 을 함유하고 있지 않다.

조성물중에서의 알파 인터페론의 위에 나온 종 또는 그 아종은 실시예 3에 상세히 나와 있는 바와 같이 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 상대적인 소수성 (hydrophobicity)에 따라 각각의 인터페론을 분리한다는 특징을 가지고 있다. IFN α-n3a 조성물은 RP-HPLC 칼럼에서 40∼60 % 아세토니트릴에서 용리되는 소수성을 가지고 있다. 위에 나온 알파 인터페론종 또는 아종의 N말단 및 C말단 서열은 실시예 6의 B와 D에서 상세히 나와 있는 바와 같이 이 조성물에서 확인되고 있다.

본 발명의 IFN α-n3a 조성물은 몇가지 생물학적 분석에서 그 활성을 가지고 있다는 특징도 가지고 있다. 실시예 4A에서 상세히 나와 있는 바와 같이 인간, 소 및 토끼 등의 세포에 대해 항바이러스 분석 [Linnette et a1., Cancer Therapy and Control, 1 : 109-120(1990)]을 실시하였다. 이들 분석에서 인간 세포와 소 세포에 대한 IFN α-n3a의 항바이러스 비활성은 1∼10×10⁸U/mg이고, 일반적으로 ≥ 2×10⁸U/mg이다. 이 분석에서 인터페론 단위는 50% 종점에서의 희석도의 역수로 정의되며 NIH 표준품 (Internationa1 Leukocyte Interferon Reference Preparation, Ga 23-902-530)으로 조정된다. 인간 HEp-2 세포에 대한 평균 항바이러스 비활성은 약 4×10⁸U/mg 이다.

아종 2b 및 2c로 나타내어지는 IFN-α2는 피이크 1a와 1b 에 존재하며 총 IFN α-n3a 단백질의 약 50%를 차지하지만 이들 피이크를 이 분석에서 별도로 측정할 경우 이 조성물의 총 항바이러스 활성의 약 25 % 에 불과하다는 것이 입증되었다 (표 4참조). 또한, 실시예 8에 상세히 나와 있는 바와 같이 단핵세포의 HIV에 대한 생체외 항바이러스 활성에 대해 IFN α-n3a는 재조합 인터페론 α2의 동일 농도 보다 10∼ 100배 더 강력하다.

실시예 4B 에 있는 바와 같이 인간 세포에 대한 항증식 분석(antiproliferative assay)에서 생물학적 활성도 측정되었다 [예 : Gil1is et a1, J. Immunol., 12 : 2027(1978)참조]. 비활성은 1∼ 10×10⁸U/mg 이고, 일반적으로 ≥ 1×10⁸U/mg 이다. 인간의 Daudi 세포에 대한 평균 항증식 비활성은 약 1.5×108 U/mg 이다. 이 분석에서 인터페론 단위는 50% 종점에서의 희석도의 역수로 정의된다.

항바이러스 분석에서 구한 조성물의 생활성 (bioactivity)(≥ 99 %)은 표준 중화분석에서 인간 백혈구 인터페론에 특이한 양의 폴리클로날 항혈청에 의해 중화할 수 있다(정제 IFN α-n3a까지 상승)[Y. Kawade, Meth. Enzymology, 119 : 558 ~ 573(1986)].

더욱이, 토끼의 파이로젠 시험 [Pyrogen Test, USP XXII/NF XVII United States Pharmacopeial Convention, Inc. p.1515(1990)] 에 있어서 약 0.2℃의 평균 토끼 체온 상승은 조성물중에 파이로젠 함량이 극히 적다는 것을 나타낸다. 실제로 이러한 결과는 IFN α-n3a의 결과 보다 적어도 5 배나 낮은 것이다.

본 발명의 조성물의 IFN α-n3a의 물리적인 성질도 측정하였다. 예컨대, 이 조성물은 실질적으로 순수한데, 즉 인간 알파 인터페론 단백질 약 95% 이상으로 구성되어 있다. 이 조성물중의 5% 이하에는 비인간 알파 인터페론 단백질, 기타 핵산 또는 효소, 리피드 등의 협잡물이 함유되어 있다. 특히, 이 조성물은 순수한 인간 알파 인터페론 단백질이 ≥ 98 % 인데, 가장 바람직하게는 약 99%이다.

이 조성물의 순도를 아래의 실시예 5 에서 상세히 나온 바와 같이 소디움도데실술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)과 웨스턴 블롯법(Western blot procedures)으로 측정한다. 아래에 나오는 제조 방법을 참조하여 이 정제법에서는 1 단계 NK2 친화성 정제에서는 약 8,000 배, 2 단계 Superose정제에서는 약 2배의 순도를 보이고 있다. IFN α-n3a의 총 순도는 아래에 나온 바와 같이 백혈구 유래의 조(粗)윈료로 부터는 약 12,000 배이다.

비환원 조건과 환원 조건하에서의 조성물의 웨스턴 블롯 분석 결과(제 8 도와 제 9 도)로 부터 모든 단백질 밴드는 미분획 인터페론의 약 1 % 이하인 불순물 함량을 가진 인간 인터페론으로 확인되고 있다. 그 후의 RP-HPLC에 의한 분획에서는 어떤 피이크에서도 불순물이 검출되지 않았다.

미분획 IFN α-n3a에 대한 2 차원 겔 분석에서는 모든 시료에서 복수개의 스폿(spot)이 검출되었는데, 이들은 모두가 LIT-1 모노클로날 항체로 확인되어(실시예 5의 A참조)이들이 인터페론 단백질이란 것을 알 수 있다. 이 조성물의 SDS-PAGE 겔로 측정한 겉보기 분자량은 16∼27 킬로돌턴(kilodalton)의 범위이고, 등전점은 5.0∼7.5, 보다 바람직하게는 5.5ㅡ6.5 인 특징을 가지고 있다. 각 피이크에서의 단백질의 분자량과 스폿의 수를 실시예 5 의 표 8 에 요약하였다.

본 발명의 인터페론 조성물의 아미노산 분석, 아미노 말단 및 카르복실 말단 서열분석으로 측정된 생화학적 성질은 실시예 6에서 상세히 설명한다. 아미노말단 및 카르복실 말단 서열분석에서 인터페론 조성물에는 1 분자당 약 165∼166 개의 아미노산 잔기로 구성된 윈래의 인터페론 분자가 함유되어 있음을 알 수 있다. 또한, 이 조성물은 두개의 디술파이드 결합을 가지고 있다.

이 생성물을 특징화하여 탄수화물, 즉 아미노당, 중성당 및 시알산(sialicacid)의 함유량을 측정하였다. 여기에 대해서는 실시예 6C 에 상세히 나와있다. 이 조성물은 O-결합 탄수화물 글리코실화의 특징을 가지고 있으며, 탄수화물 조성은 갈락토사민 (GalN), 글루코사민 (GlcN), 갈락토오스, 글루코오스, 만노오스 및 시알산으로 구성되어 있다. 평균적으로 이 조성물에는 인터페론 단백질 1몰당 ≤ 6몰의 당을 함유하고 있고, 평균 인터페론 1몰당 1∼3몰의 당을 함유한다. IFN α-n3a의 글리코실화는 IFN α-n3a가 IFN-α14를 함유하지 않고 Asn잔기에 N-글리코실화가 일어나는 알파 인터페론종만을 함유하고 있기 때문에 N-결합 글리코실화를 일으키는 Asn잔기 이외의 부위에서 일어나야 한다. O-결합 글리코실화의 부위는 효소분해 후의 아미노산 서열분석에 의해 결정하고 있다. 결과에 의하면 106번 위치의 트레오닌이 글리코실화의 부위이다 (실시예 6C 참조).

본 발명의 IFN α-n3a 조성물의 기타 생화학적 특성으로는 모노클로날 항체 NK2 [Celltech, U.K]의 결합 부위가 존재하는 것이다. NK2 는 알파 인터페론종의 아군(sub-group), 즉 α2(a/b/c), α8(a/b/c), α10a, α17(a/b/c/d), α7(a/b/c), α6 및 α21(a/b)만을 인식한다. 그러나, 인터페론종인 α1, α5, α10b, α14 또는 α-오메가1을 인식하지는 않는다. IFN α-n3a조성물 역시 pH 약 2∼9 사이에서 pH안정성을 가지며, 이 조성물은 56℃, ≥ 2 시간에서 열적 안정성을 가진다.

본 발명의 알파 인터페론 조성물인 IFN α-n3a는 현재 시판되고 있거나 임상시험에 사용되고 있는 재조합 및 천연의 알파 인터페론과는 전혀 상이하다. 가장 현저한 차이는 공지의 알파 인터페론 조성물에 비해 IFN α-n3a의 독성이 극히 낮다는데 있다. IFN α-n3a에 관한 자료와 문헌에서는 천연의 PBL유래 알파 인터페론 제품은 시험에 투입된 환자들중 많은 부분(%)에서 전형적인 알파 인터페론의 부작용을 나타내었다고 하고 있다.

기타 차이도 본 발명의 제품과 종래의 천연 알파 인터페론 사이에서 나타나고 있다. 임상 연구에 사용된 종래의 IFN α-n3a는 제품에 비하여 본 발명의 조성물인 IFN α-n3a는 항바이러스 분석에서 약 4×10⁸U/mg 라는 2 배나 높은 비활성을 가지고 있다. 본 발명의 조성물은 기껏해야 약 2% 정도의 불순물을 가지고 있는데 반하여 종래의 제품의 그 불순물 함량이 5∼10 % 이다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 약 0.2℃ 라는 극히 낮은 파이로젠 시험결과를 보이고 있으나, 종래의 IFN α-n3에서는 약 1℃ 의 결과를 보이고 있다. 또한 이들 두가지 제품의 제조 방법에서도 차이가 있다.

본 발명의 인터페론과 재조합 인터페론 사이의 독성의 차이는 훨씬 더 현저하다. 본 발명의 조성물은 여러가지 알파 인터페론종의 혼합물로 구성되어 있는데 반하여 종래의 것은 재조합 제품중에 단일종으로만 구성되어 있다는 사실외에는 천연 알파 인터페론은 재조합 인터페론 처럼 박테리아에서 생성되지 않기 때문에 인체에서 부작용을 일으킬만한 협잡 박테리아 무생물이 전혀 존재하지 않는다.

본 발명의 조성물에서 발휘되는 부작용 감소와 관련하여 실시예 7 에서는 세계보건기구(WHO)에서 종래부터 채용하고 있고 문헌 [W. B. Abrams et a1., in The Clinical Research Process in the Pharmaceutical Industry , G. M. Matoren, ed., Marcel Dekkev, Inc., Chap. 10, pp.195-216(1984)] 에 기재된 방법에 따라 본 발명의 조성물에 대하여 수행한 독성 연구결과를 상세히 설명하고 있다. 본 발명의 조성물을 투여한 환자에 대한 독성 연구결과로 부터 아무런 부작용이 없었음이 판명되었다.

실제로 표 16 은 종래 공지된 기타 알파 인터페론 제품에 대하여 보고된 부작용과 본 발명의 조성물의 임상 시험결과에서 나타난 부작용을 비교한 것이다. 이 데이터로 부터 본 발명의 조성물은 부작용이 현저히 감소되어 이 조성물을 장기간 환자에게 투여할 수 있다는 큰 장점이 있다. 더욱이, 이 조성물을 높은 투여량으로 환자에게 투여하여도 공지의 알파 인터페론 제품에 비해서 부작용이 훨씬 감소된 상태로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물이 이러한 놀라우리만치의 부작용이 감소된 이유에 대해서는 본 발명자들은 아직까지 정확히 알지 못하고 있다. 이론에 구애받고 싶은 것은 아니지만 본 발명자들의 생각으로는 본 발명의 조성물에 있어서 독성과 부작용의 실질적인 감소의 이유 및 이로 인한 치료 효과의 증대는 이 혼합물에 함유된 각종의 인간의 알파 인터페론이 본 발명의 조성물이 투여되는 환자의 세포에서의 하나 이상의 에피토프(epitope)또는 수용체에 결합하고 있다는 것이다. 또한, 본 발명의 조성물에 함유되는 협잡 불순물의 양이 극히 적다는것도 본 발명의 조성물의 괄목할만한 특징에 개입될 수 있다는 점이다.

더욱이, 항바이러스 분석과 항증식 분석에서의 비활성이 기타 알파 인터페론에 대해 알려진 것 보다 높기 때문에 환자에게 소량을 투여하여도 조성물의 유독성 투여량 이하의 양이어서 관계가 없다.

또한, 이 조성물의 단백질의 번역 후의 글리코실화에 의해 응집이 잘 일어나지 않으므로 부작용이 훨씬 감소된다. 처리 방법에 따라 알파 인터페론 단백질에는 산화가 거의 되지 않거나 화학적으로 변환이 되지 않는 아미노산 잔기가 존재할 수 있다. 알파 인터페론 단백질의 탄수화물은 본 발명의 화합물 제조 공정도중 인체의 천연 알파 인터페론 단백질과 유사하게 적절히 보존할 수 있다. 이 방법에 의하여 활성의 알파 인터페론 단량체의 생성이 많아지고 비활성의 인터페론 올리고머 또는 단백질 집합체의 생성은 감소된다.

2. 조성물 제조 방법

요약하면 본 발명의 알파 인터페론 조성물 제조 방법은 유도 공정과 정제 공정의 두가지를 포함하고 있다. 유도 공정 (induction process)에 대해서는 아래의 실시예 1 에서 상세히 설명되어 있고, 정제 공정에 대해서는 아래의 실시예 2 에서 상세히 설명되어 있다.

유도 공정에서는 인간 PBL현탁액을 센다이 바이러스로 유도함으로써 IFN α-n3a 를 제조한다. 말초혈 백혈구(PBL : pheripheralblood leukocyte)로부터 생성된 백혈구 알파 인터페론(IFN α-n3a)의 양에 현저하게 영향을 주는 주요 인자로서는 유도 도중의 세포 밀도, 유도 매체중의 탄산 수소 나트륨의 농도, 인간 무감마 혈청(agamma serum)의 농도, 프라이머의 농도와 종류, 유도시의 동력학, 플라스크내의 배양액의 교반 속도, 유도 온도, 배지의 조성 및 센다이 바이러스의 농도와 특성 등이다.

이러한 유도 공정에 의하여 건강한 사람의 공여자로 부터 혈액을 채취하여 연층(軟層:buffy coat)을 수거해서 적혈구를 염화 암모늄, 바람직하게는 0.83 % 염화 암모늄으로 용해시킴으로써 인간 PBL 을 제조한다. 이어서, 백혈구를 유도 배지중에 소요의 세포밀도로 현탁한다.

세포 밀도는 약 1∼10×10⁶세포/㎖의 범위로 한다. 알파 인터페론 생성의 상대적인 효율은 특정 세포 밀도에서의 세포 하나당 생성되는 알파 인터페론의 양으로 결정한다. 본 발명자들은 세포 농도 증가에 비례하여 알파 인터페론 생성량이 일반적으로 증가하지만 인간 백혈구로 부터 알파 인터페론의 최적 생산성은 세포 밀도 4× 10⁴세포/㎖ 에서 얻게된다는 것을 확인하였다. 이러한 생산성은 면역 방사계 분석법 (IRMA : Immunoradiometric Assay)[Celltech Ltd.] 또는 아래에 나오는 세변 변성 효과 (CPE : cytopathic effect)분석법으로 측정한다. 이들 분석법에 있어서 아래에 나오는 바와 같이 기준과 비교하여 역가를 IRMA단위/㎖ 로 보고하거나 CPE분석법의 경우에는 IU/㎖ (국제단위/㎖)로 보고한다. 유도 도중 1× 10⁷백혈구/㎖ 을 사용할 때 최대 인터페론 역가(악 50,000 IRMA 단위/㎖ 이것은 약 100,000 CPE 단위/㎖에 해당함)를 얻게 되지만, 4×10⁶세포/㎖ 에서는 최고의 인터페론 생산성 (약 43,000 IRMA 단위/㎖ 이것은 약 86,000 CPE U/㎖ 에 해당함)이 나타난다. 따라서, 세포 밀도 10⁷세포/㎖ 에서의 세포의 생산성은 4×10⁶세포/㎖ 에서 나타나는 것의 약 절반정도이다(제 1 도 참조).

유도용 배지의 바람직한 강도는 0.5X∼1.5X 이고 어얼염 (Earle's salt)을 함유하며 L-글루타민, 비필수 아미노산, 4.46㎎/㎖ 트리신(Tricine)및 24 ㎍/㎖ 네오마신 술페이트가 첨가된 pH 7.4 의 취소 필수 배지(MEM)이다. 기존의 데이터에 의하면 유도 역가는 0.85X∼1.15X MEM 농도에서 최고인데 이것을 생리학적 조건에 가까운 삼투물 농도(osmolarity)를 가지고 있다.

또한, 유도용 배지에는 알파 인터페론 생성을 위해 인간 IgG 가 실제로 제거된 혈청(무감마 혈청)을 함유해야 한다. 인터페론 생성을 위한 유효 혈청 농도는 0.1∼약1.5mg/㎖, 보다 바람직하게는 0.1∼약1.0mg/㎖인데, 바람직하게는 약 0.4 mg/㎖ 의 농도를 사용한다.

혈청제제중에 억제 인자가 존재할 수 있으므로 인터페론 제조에는 고혈청 농도가 유리한 것은 아니다. 이 제조 공정에서 확인된 최적 혈청 농도는 칸텔의 방법에서 귄장된 농도인 2.4 mg/㎖ 보다 훨씬 낮다. 유도시의 낮은 혈청 농도를 사용하면 그 다음의 인터페론 정제 공정에서 혈청 단백질의 오염을 현저하게 줄일 수 있다.

유도 공정은 배지중에 몇가지 기타 성분을 혼입해 주면 적정화 할 수 있다. 바람직하게는 유도 배지중에 탄산 수소 나트륨 (NaHCO₃)을 낮은 농도로 사용하거나 전혀 사용하지 않는 종래의 방법과는 반대로 고농도의 탄산 수소 나트륨을 함유 시키는 것이다. MEM에서 탄산 수소 나트륨의 농도를 증가시키면 인터페론의 생성 수율에 현저한 영향을 미친다(즉, 3∼4 배 증가). 바람직한 탄산 수소 나트륨 농도는 약 0.3∼약 2.5 mg/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 약 1.7 ∼2.2 mg/㎖ 이다. 탄산 수소 나트륨 농도가 최소한 2.2 mg/㎖ 이어야 본 발명에서 제조되는 인터페론의 역가를 2 배로 크게 할 수 있다.

PBL로 부터 인터페론 합성시 수율 안정 인자의 하나가 레어 미네랄, 비타민 또는 지방산 등의 필수 영양인자이다. 본 발명의 유도 배양에서 어떤 비타민을 첨가하면 인터페론 생성량이 증가하게 된다. 유도 배양액중에 비타민 C와 비타민 B₃(니아신)을 별도로 가해주면 이들 비타민을 가하지 않은 배양액에 비해 인터페론 수율이 20∼30 % 나 증가한다. 인터페론 생성량을 증대하기 위한 비타민 C 의 유효 농도는 약 0.0002 ∼약 2 mg/㎖ 인데, 2mg/㎖ 이상이 되면 PBL 로 부터의 인터페론 생성이 억제된다. 인테페론 생성량을 증대하기 위한 비타민 B₃의 유효 농도는 약 0.5∼약 1000 ㎍/㎖이다. 황산 제일철, 부티르산, 토코페롤 포스페이스, 토코페놀, 글루코오스 및 콜레스테롤 등의 기타 화합물은 알파 인터페론 생성에 전혀 영향이 없거나 억제 작용을 함이 확인되었다.

본 발명은 인터페론을 광범위한 체적으로 제조하는 방법을 제공한다. 플라스크 하나당 유도 체적은 150㎖∼6ℓ 또는 그 이상이다. 유도 배양액의 체적을 인터페론의 수율에 영향을 주는 일이 없이 유도용 플라스크에서 바라는 바의 완전 용량으로 크게 할 수도 있고 적게 할 수도 있다. 더욱이, 플라스크를 완전히 채울 수도 있으므로 본 발명의 방법에서는 플라스크의 수를 최소로 하면서도 인터페론을 다량으로 생성시킬 수 있기 때문에 인터페론 제조에 필요한 공간과 경비를 줄일 수 있다. 본 발명에서는 기재된 유사한 유도 조건하에서는 복수개의 대형 플라스크나 바이오리액터(bioreactor)를 사용하면 수천ℓ 까지의 대량 유도 처리를 할 수 있다.

이어서, 유도 배지중에 현탁된 PBL에다 미정제 또는 정제 백혈구 알파 인터페론을 프라이머(primer)로 해서 첨가한다. 프라이머로 사용하면 미정제 및 정제 천연 백혈구 알파 인터페론은 백혈구 세포로 부터 유사한 양의 인터페론을 유도 생성한다. 미정제 알파 인터페론 상청액 또는 정제 알파 인터페론 1∼약 100,000 국제단위 (IU)/'㎖, 바람직하게는 약 10∼100 IU/㎖ 으로 백혈구를 프라이밍 (priming)할 수 있다. '' 미정제 인터페론 '' 이란 유도방법으로 생성되는 미정제 생성물을 뜻하고, 정제 인터페론 '' 이란 유도 및 정제법으로 생성되는 IFN α-n3a를 뜻한다.

기타의 인터페론, 즉 IFN-베타, IFN-감마 등도 프라이머로 사용할 수 있고, 기타 사이토카 인류도 사용할 수 있다. 예컨대, 천연 인간 IFN-감마를 100 ~ 1,000 IU/㎖ 의 농도로 사용하면 알파 인터페론 생성을 촉진시킬 수 있으나 미정제 또는 정제 천연 알파 인터페론을 프라이머로 사용했을 때 보다 수율 증가의 폭은 작아진다.

최적 프라이밍 시간은 센다이 바이러스를 약 36℃ 에서 첨가하기전의 약 2∼3시간이다. 프라이밍 시간을 변동시키면 백혈구로 부터 분비되는 인터페론의 양을 현저히 변화시키게 된다. 백혈구를 1시간 이내로 프라이밍하면 인터페론 수율이 감소하고, 3시간 이상 프라이밍하면 그 수율은 현저히 증가하지 않는다. 바람직하게는 프라이밍 단계에서는 10⁷세포/㎖ 의 백혈구를 미정제 인터페론 20 IU/㎖ 으로 약 3 시간 프라이밍하는 것이다.

프라이밍 후에 인터페론의 중요한 유도체인 센다이 바이러스를 백혈구 현탁액에 가한다. 바이러스의 제제 또는 로트(lot)를 달리하여 유도하면 인터페론 생산성에 크게 차이가 난다. 인터페론 유도 생성에 차이가 나는 이유는 상이한 바이러스 제제중에 센다이 바이러스성 불량 간섭 (DI : Defective Interfering)입자의 양이 여러가지로 달리하여 존재하기 때문이다. DI 입자의 양이 많으면 인터페론 생성에 있어서 억제 역할을 하게 된다.

일반적으로, 백혈구에 센다이 바이러스를 흡착시키는 것이 고농도의 바이러스를 가진 높은 세포 밀도에서 가장 효과적이다. 최대의 인터페론 유도 생성에 필요한 최적의 바이러스 농도는 실험적으로 결정해야 할 것이지만 통상적으로 조직 배양액중에서 최종 농도가 약 50∼약 500 혈구 응집소 (HA)단위/㎖의 범위이고, 보다 바람직하게는 바이러스 농도가 50∼250 HA 단위/㎖ 이다.

고농도 세포 배양액을 희석하는 흡수/희석법을 채용하면 인터페론 생성량을 극대화 할 수 있다. 이 방법에 의하면 최종 농도가 약 375 HA 단의/㎖ 인 센다이 바이러스를 약 36℃ 에서 약 1시간 동안 10⁷세포/㎖ 의 세포 밀도로 백혈구에다 흡착시킨다. 바람직하게는 무감마 혈청이 첨가된 유도 배지로 배양액을 약 2.5 배 정도로 희석하여 최종 세포 밀도 4× 10⁶및 센다이 바이러스 농도 약 150 HA 단위/㎖ 가 되게 한다. 어떤 조건하에서도 흡착/희석법을 이용하는 유도 배양은 흡착/희석법을 이용하지 않을 때 생성된 역가 보다 약 10 % 높은 역가를 나타냄을 확인하였다. 희석 배지를 실온하에 두거나 36℃로 미리 가온하여도 좋으며 프라이머를 함유하거나 함유하지 않아도 좋다.

흡착/희석법을 이용하지 않고 유도를 임의로 실시하여도 좋다. 이 경우에 있어서 표시된 세포밀도 1 ~ 10×10⁶세포/㎖)의 백혈구를 미정제 인터페론으로 약 3 시간 프라이밍한 다음 표시된 농도의 센다이 바이러스를 첨가한다. 이어서, 배양액을 15∼16 시간 배양하여 인터페론을 마찬가지로 회수한다.

본 발명에 의한 인터페론 제조용의 백혈구 배양액의 배양 온도 범위는 약 35℃ ~ 약 37℃ 이지만 최적 배양 온도는 36℃ 이었다. 칸텔 방법에서는 인터페론 생성을 위한 최적 배양 온도를 37.5℃라 하고 있으나 [Mogensen et al.,(1997); Cantell et al., Methods Enzymol.,(1981); and Horowitz,(1986), 모두 위에서 인용된 것임], 본 발명자들이 확인한 바로서는 37℃ 이하의 온도에서 인터페론의 생성량이 많았다. 6ℓ 용량의 플라스크 3개에 각각 4 ~ 5×10⁶세포/㎖로 하여 35℃, 36℃ 또는 37℃ 에서 유도 배양한 결과에 의하면 전체 유도 공정을 통해 36℃에서의 배양에서는 35℃ 또는 37℃ 에서의 경우 보다 20 ~ 50% 더 많이 인터페론을 생성하였다.

유도 배양에서 자석 교반기의 교반 속도도 각 성분의 가장 적절한 통기 혼합을 유지하기 위해서 중요하다. 72 rpm 에서는 4×10⁶세포/㎖ 의 중간 크기 플라스크(500㎖)에서 약 17,000 IRMA U/㎖ 의 인터페론이 생성되고 교반 속도를 약 170∼250 rpm 으로 증가시키면 인터페론의 생성량은 약 30,000 IRMA U/㎖ 로 현저히 증가한다. 따라서, 교반 속도를 100∼300 rpm 바람하게는 약 170rpm 으로 하여야 유도 단계에서 인터페론의 생성량을 최대로 할 수 있다.

센다이 바이러스 첨가후의 총 배양 시간은 1∼48 시간, 바람직하게는 15 ∼22 시간이다. 36℃에서 적당히 배양한 후 현탁액을 약 2500 rpm 에서 원심분리하여 균체와 부스러기를 제거하고 미정제 알파 인터페론을 회수하였다.

아래의 표 1에는 알파 인터페론 유도를 위안 본 발명의 방법 (A)과 종래의 방법 [Catell et a1.,(1981), 앞서 인용된 바 있음](B)사이의 차이를 요약하여 두었다.

[표 1]

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유도 배양후 IRMA 키트 [Celltech Berkshire, U.K.] 를 사용하는 면역방사계 분석법에 의하거나 공지된 방법 [Linette et al., Cancer Therapy and Control, 1 : 109-120(1990)]에 따라 인간의 유표피(epidermoid)HEp-2 세포(ATCC CCL23)와 수포성 구내염 바이러스(VSV, Indiana strain ATCC #VR-158)를 공격 바이러스로 사용하는 세포 변성 효과(CPE)분석법에 의해 인터페론 역가를 분석한다. 미합중국의 NIH(the National Institutes of Health)의 백혈구 표준품 (Ga 23-902-530)과 비교하여 IRMA 분석법으로 구한 역가를 IRMA U/㎖ 로 나타내거나 단순히 U/㎖ 로 나타내고 CPE 분석법으로 구한 역가를 IU/㎖(국제 단위/㎖ 로 나타낸다. IRMA 분석법에서는 방사능 표지된 NK2 모노클로날 항체를 검출 항체로 사용한다. NK2에 의해 인식된 종에 근거하여 IRMA역가는 CPE 역가 보다 일반적으로 낮다. 일반적으로 관찰되고 있는 것으로는 유도 단계에서 생성된 미정제 인터페론의 IRMA 역가는 CPE 역가의 약 절반 정도라는 점이다.

b. 미정제 인터페론의 정제

미정제 인터페론을 실시예 2 에 상세히 기재되어 있는 프로토콜(protoco1)을 이용하여 정제한다. 즉, 이 방법은 다음과 같다. 먼저, 유도 배양에서 얻은 미정제 백혈구 배양액을 2900×g 에서 약 15∼20 분 동안 원심분리하거나 적당한 카아트리지 필터 시스템으로 여과한다. 카아트리지 필터 시스템은 예컨대 미리 살균된 Polygard-CR 고효율 0.1μ 기공 크기의 카아트리지 필터를 0.5 μ 기공 크기의 Polysep-TP필터에 직렬로 연결하여 된 것이다(미합중국의 Millipore 사제).

수득한 미정제 알파 인터페론 상청액을 접선 유동 필터 시스템을 이용하여 약 10∼100 배로 농축하는데, 50 배로 농축하는 것이 바람직하다. 농축된 상청액을 약 9000×g 의 조건에서 약 30 분간 원심분리 할 수 있다. 그러나, 여과 방법으로서 회수법을 이용할 경우에는 추가적인 원심분리는 필요없다.

이 단계에서 얻은 미정제 알파 인터페론 농축물을 1차 칼럼 크로마토그래피(NK2 항체 친화성 칼럼) 처리하여 철저히 세척한 후 알파 인터페론을 pH 2 에서 용리한다. 항체 친화성 크로마토그래피에 의해 대부분의 인간 혈청 단백질과 기타 불순물을 제거한다. 여기서, 인터페론 IRMA활성의 약 80∼ 90%가 회수되며 인터페론은 이 단계에서 8000배로 정제된다. 이 단계에서의 인터페론의 순도는 통상 90 % 이상이다.

용리된 알파 인터페론을 4℃ 에서 5 일간 산성 배양한 다음 중화하고 농축하여 겔 여과 칼럼 크로마토그래피 (Superose 12 칼럼 )함으로써 본 발명의 조성물을 얻는다. 겔 여과에 의해 NK2 칼럼에서 누설된 쥐의 IgG, 인간 IgG, 인터페론 올리고머 또는 변성 IFN 등의 고분자량 및 저분자량의 불순물이 제거된다.

제 3도에는 대표적인 겔 여과 크로마토그래피 용리 프로파일이 나와 있는데, 여기서 인터페론은 주흡광 피이크에서 용리되고 있다. 친화성 및 겔 여과 크로마토그래피 단계 후의 총체적인 정제 공정에서 인터페론 IRMA활성의 60∼70 % 가 회수되어 모두 약 12000 배의 순도를 얻게 된다. 최종 정제된 인터페론은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석법으로 측정한 결과, 그 순도가 약 99% 이었고 항바이러스 비활성은 약 4×10⁸IU/mg이었다(실시예 4A 참조).

3. 의약 조성물 및 방법

본 발명의 정제 알파 인터페론인 IFN α-n3a를 사용하여 면역계, 암 및/또는 바이러스성 질환 등의 각종 질환을 치료할 수 있다. 치료대상 증상으로서는 한정된 것은 아니나 첨규습우(Condyloma acuminata), B형 간염, C형 간염, 모상 세포성 백혈병, AIDS, 카포시 육종, 만성 피로 증후군, 생식기 헤르페스, 생식기 사마귀, 경부 이상 형성, 경부암 및 질 콘딜롬 등이 있는데, 이들은 본 발명의 알파 인터페론의 용도의 대상에 포함된다. 이 제제를 알파 인터페론에 의한 치료가 가능한 기타 여러가지 증상 치료를 위해 투여하여도 좋다.

본 발명에 따라 약제학적으로 허용되는 담체와 더불어 제조된 유효량의 알파 인터페론을 함유한 본 발명의 의약 조성물을 알파 인터페론에 의한 치료가 필요한 환자에게 투여할 수 있다.

따라서, 본 발명의 치료 및 의약 조성물은 치료 유효량의 IFN α-n3a와 약제학적으로 허용되는 담체로 되어 있다. 항바이러스, 항암 또는 면역조절 활성을 가진 의약 조성물을 액제, 시럽제, 에멀젼제, 주사제, 정제, 캡슐제,국소용 제제 또는 좌제 등의 종래 형식의 각종 제제에 사용할 수 있다.

적당한 담체로는 제약학 분야에 공지로 되어 있는 것들이다(Remington's Practice of Pharmacy 참조). 담체의 예로서는 멸균 식염수, 당류(예 : 크실리톨, 글리세롤, 락토오스, 수크로오스 등)등이 있고, 기타 담체 성분으로서는 인산 칼슘, 젤라틴, 덱스트린, 한천, 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스(국소용), 와셀린, 폴리에틸렌 글리콜, 펙틴, 땅콩기름, 올리브유, 참깨기름, 스쿠알렌, 물 등이 있다.

더욱이, 담체 또는 희석제에 속하는 것으로는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이드 또는 왁스와의 혼합물 등의 시간 지연 재료가 있다. 임의로 적당한 화학 안정제를 사용하여 의약제제의 안정성을 향상시켜도 좋다. 적당한 화학 안정제로는 이 기술분야에 공지로 되어 있는 것들인데, 즉 시트르산등의 pH 조절제, 킬레이트제 또는 포착제, 산화 방지제 등이 있다.

IFN α-n3a 를 함유하는 의약 조성물 제제를 단위제형으로 하여 종래 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 이 조성물을 생체내에서 서서히 방출되도록 공지 방법으로 제형화하여도 좋다. 이러한 모든 방법에는 한가지 이상의 보조 성분을 구성할 수도 있는 담체와 활성 성분을 혼합하는 단계를 포함한다.

특수한 장해 또는 증상 치료에 효과가 있는 정제품의 양은 장해와 증상의 특징에 따라 달라지는데 표준 임상기법에 따라 결정한다. 본 발명의 한가지 실시태양에 있어서 바람직한 것은 생체외에서 치료되는 종양의 세포독성을 측정한 다음, 시험전에 유용한 동물 모델에 대해 적용한 후 인간에게 사용한다는 것이다. 투여 방법은 한정된 것은 아니지만 병소내(病疎內), 피내(皮內), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 국소, 경구 및 비내(鼻內)등의 경로를 이용한다.

또한, 본 발명의 의약 조성물을 치료를 요하는 부위에다 국소적으로 투여하는데, 수술도중의 국부주입, 주사, 카테테르 이용, 이식 등의 방법에 의해 할 수 있다. 이식의 경우는 시알라스틱 멤브레인(sialastic membrance)등의 멤브레인 또는 섬유를 비롯하여 다공성, 비다공성 또는 겔 상의 물질을 사용한다.

또한, 본 발명은 리포좀, 미세입자 또는 마이크로캡슐을 통해 투여되는 INF α-n3a 함유 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 여러가지 실시태양에 있어서 이러한 조성물이 각 성분물질을 지속적으로 방출할 수 있도록 하는 것이다. 특수한 실시태양에 있어서 특수하게 확인되는 종양 항원(예 : 신경아세포종 또는 SCLC 에 대해 선택적인 세포 표면 항원)에 표적을 두어 항체를 통해 리포좀이 작용하도록 하는 것이다. [Leonetti et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 2448-2451(1990); Renneisen et a1, 265 : 16337-16342(1990)].

본 발명의 알파 인터페론을 본 발명의 방법과 조성물에 따라 사용할 수도 있는데, 조성물의 경우에는 암, 면역 장해 또는 바이러스성 질환의 직접 또는 보조적인 치료에 사용되는 기타 치료제 또는 진단시약과 조합하여 사용하거나 상기 조성물을 단독으로 사용한다. IFN α-n3a 을 항대사 물질, 알킬화제, 빈카 알칼로이드, 항종양성 항생물질, 백금 유도체, 치환 우레아, 부신피질 스테로이드, 사이토카인, 인터로이킨, AZT, ddI, ddC, 기타 인터페론, 기타 항바이러스제 또는 항종양제, 또는 항체 등과 병용할 수도 있다.

위에 나온 증상 치료 방법에서 IFN α-n3a 유효량을 투여할 때의 투여 방법은 약물의 작용과 관련이 있는 여러가지 인자, 즉 환자의 증상, 체중, 성별, 식이, 종양의 증상 정도, 투여 시간, 기타 임상학적인 인자들을 고려하여 의사의 결정에 따른다. 특수한 질환 치료에 사용되는 본 발명의 조성물의 투여량은 질환종류와 질환 상태에 따라 달라진다. 예컨대, 사마귀의 경우에는 사마귀 하나당 조성물을 IFN α-n3 투여량인 0.25 백만 단위 (MU)와 같거나 그 이하의 양을 투여한다. AIDS 또는 보다 공격적인 치료를 요하는 기타 질환의 경우에 있어서 적정 투여량은 현재 인정된 재조합 알파 인터페론에 대해 처방된 30∼36 MU 보다 작은 양이다. 특히, 이들 증상에 대한 투여랑은 약 1 백만 단위∼1500 만 단위이다.

일반적으로, 투여량을 1주에 3회 투여하여도 좋다. 기타 투여량 및 투여 방법은 이 기술분야의 전문인의 결정에 따를 수도 있다.

위에 나온 포유동물의 장해 치료외에도 본 발명의 방법과 조성물을 말, 돼지, 소, 개, 고양이, 닭 등의 동물의 암, 면역 장해 또는 바이러스성 질환 치료에도 사용할 수 있다. 이들 장해는 포유동물 장해 치료시에 사용되는 화합물의 투여량으로 치료할 수 있다.

다음의 실시예는 설명을 하기 위한 것일 뿐이고 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

IFN α-n3a의 제조 방법-유도

연층(buffy coat)을 제조하기 위하여 FDA 공인 혈액 센터로 부터 인간 PBL 500 단위를 구안 다음 적혈구를 위에 나온 칸텔 등의 방법 (1981)에 따라 염화 암모늄 처리하여 용해시켰다.

염화 암모늄 처리된 연층을 어얼염(Gibco 410-1500), L-글루타민, 비필수 아미노산, 4.46mg/㎖ 트리신(Aldrich), pH7.4, 2.2mg/㎖ 탄산수소 나트륨 (Fisher), 24 ㎍/㎖의 황산 네오마이신, 0.4 mg/㎖ 의 인간 무감마 혈청(NABI)을 함유하는 1×이이글 MEM에 재현탁한다.

백혈구(10⁷세포/㎖)를 1×MEM에 현탁시켜 미정제 알파 인터페론 20 단위/㎖ 을 프라이머로 하여 가한다. 미정제 알파 인터페론은 정제 처리하지 않고 유도 단계에서 생성된 생성물을 HCl 로 pH 2 로 조정하여 5 일 동안 외부에서 혼입된 시약 또는 바이러스성 협잡물을 실활시켜서 된 것이다.

이 현탁액을 6ℓ들이 멸균 유리 플라스크에서 배양하고, 백혈구를 36℃에서 3 시간 동안 프라이밍한 다음 최종 농도 150 HA 단위/㎖ 에서 센다이 바이러스(SPAFAS 로 부터의 Cantell 균주 ; Storr, CT)를 가한다.

1 시간 배양하여 바이러스를 부착시킨 다음 무감마 혈청, 탄산 수소 나트륨 함유, 프라이머 무함유의 동일한 배지로 백혈구를 4×10⁶세포/㎖ 희석(2.5배)한다. 이어서,다시 36℃에서 15시간 더 배양한 다음 세포와 부스러기를 2500 rpm 에서 원심분리(Beckman model J6-B)하여 제거한 후 위에 나온 IRMA 분석법 또는 CPE 분석법으로 인터페론 역가를 분석한다.

[실시예 2]

IFN α-n3a의 제조 방법-정제

모든 정제 단계들을 별달리 명시하지 않는 한 2∼8℃ 에서 실시한다.

A. 미정제 인터페론의 회수/농축

15∼20 시간 배양후 약 2,900×g 에서 15∼20 분간 원심분리함으로써 실시예 1의 유도 배양액으로 부터 백혈구를 제거한다. 상청액(미정제 인터 페론액)을 회수하고 백혈구를 버린다. 즉시 처리가 불가능할 경우에는 상청액을 멸균된 용기중에서 4℃ 에서 보관한다.

미정제 인터페론액을 배제 한계 분자량이 10,000 인 접선 유동 필터 시스템으로 50 배로 농축한다. 농축된 인터페론을 약 9,000×g 에서 약 30 분간 원심처리한다. 농축된 인터페론을 -70℃ 에서 저장할 수 있다.

B. 친화성 정제

(1) 크로마토그래피 칼럼 제조

이 정제 방법에서는 인간 알파 인터페론에 특이적인 모노클로날 항체, 즉 Celltech 사(영국)제조의 NK2 를 사용한다. 모노클로날 항체를 CNBr활성 Sepharose-4B(예 : Reselute NK2)에 결합시켜 4℃ 에서 보관한다. 친화성 칼럼의 크기는 각각의 제조시마다 결정되지만 인터페론에 대한 친화성 겔의 결합력에 따라 달라진다. 칼럼은 적당량의 Sepharose-항체 겔을 적당한 유리 칼럼속에 부어넣어 제조한다. 모노클로날 항체 칼럼을 약 5 칼럼 체적의 인산염 완충 식염수로 세척한 다음 0.1 M 시트르산과 0.3 M 염화 나트륨 함유 pH 2 의 용액 3 칼럼 체적으로 세척한다. 이어서, 3 칼럼 체적의 인산염 완충 식염수(PBS : phosphate buffered saline)로 세척함으로써 칼럼의 pH 를 7.4 로 중화한다. 이러한 예비 세척 처리를 여러번 반복하여도 종다.

(2) 미정제 IFN 농축액 제조

미정제 인터페론 농축액을 약 17,700×g 에서 60 분간 원심분리하여 청징화하여 적당한 카아트리지형 0.22∼0.45μ 필터를 사용하여 여과한 다음 모노클로날 항체 칼럼에다 가한다.

(3)친화성 정제

친화성 겔 1 ㎖ 당 미정제의 여과된 인터페론 약 150 MU 를 가한다. 친화성 인터페론 단위는 IRMA(Celltech 사)에 의해 측정한다. 칼럼을 약 1.5 칼럼 체적의 인산염 완충 식염수로 세척한 다음 50%(v/v) 에틸렌 글리콜과 1.5M 염화 나트륨 함유 20 mM 인산염 완충액(pH 7.4) 10 칼럼 체적으로 세척한다. 마지막으로 10∼30 칼럼 체적의 인산염 완충 식염수로 세척을 끝낸다. 0.1M 시트르산과 0.3M 염화나트륨 함유 용액(pH2)으로 친화성 칼럼으로 부터 인터페론을 용리한다.

(4) 친화성 칼럼의 재생

용리액의 pH가 중성이 될 때까지 3 ~ 5칼럼 체적의 인산염 완충 식염수로 모노클로날 항체 칼럼을 세척한다. 칼럼 보관을 위해 0.1% 소디움 아지드 함유 3∼5 칼럼 체적의 인산염 완충 식염수로 칼럼을 세척한다.

C. 산성 배양 및 중화

모노클로날 친화성 칼럼에서 용리된 인터페론액(약pH2)을 4℃에서 최소한 5 일간 배양한다. 이러한 산성 배양 HIV-1 등의 외래 인자를 실활 시키는데 필요하다. 5 일 동안 보관후 용액의 pH를 1.0 M Tris-HCl(히드록시메틸아미노메탄)로 7.4 로 조정하고 이 용액중의 인터페론 단백질을 약 1∼3 mg/㎖ 되게 농축한다.

D. 겔 여과

예비급의 Superose 12 비이드(Pharmacia 사제)를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피 처리를 한다. 칼럼 체적 5 % 의 인터페론 농축액을 가하고 인산염 완충 식염수로 용리한다. 인터페론 함유의 주 피이크를 구성하는 모든 획분을 무균적으로 회수하여 모아서 0.2 μm 이하의 필터 (low binding filter 사용)에서 정제 인터페론을 여과한 다음 -70℃ 에서 보관한다.

E. 결과

대표적인 정제 과정의 결과는 표 2 에 나와 있다. 이 표에서 정제 단계, 단백질의 총 체적 및 총 중량, 총 활성(이것을 10⁹단위를 곱한 수로 나타냄), 각 단계에서 회수된 총 IRMA 단위로 구한 수율(%), 백만 단위 (MU/mg)로 측정한 비활성 및 정제 배수가 각각 나타나 있다. 인터페론 활성은 검출 항체로서 방사능 표지된 NK2 를 사용하는 면역방사법 분석 [Celltech 사] 으로 구한 것이다.

[표 2]

대표적인 실험에서의 인터페론 정제 수율

[실시예 3]

RP-HPLC 분석

이 실시예에서는 조성물중의 알파 인터페론들을 RP(역상 : reverse phase)-HPLC 를 사용하여 이들의 상대적인 소수성(疎水性)에 따라 분리한다. [(Janssen et al., J. Chromatographic Sci., 22 : 234(1984); Stone et al., J. Chrom., 359 : 203(1986)]. 아세토니트릴 농도를 증가시키면서 분리를 하였다. 초기 피이크에서는 가장 소수성이 없는 인터페론이 용리되었고, 그 후 가장 소수성이 큰 인터페론이 용리되었다.

4 도에 있는 바와 같이 반 예비 칼럼 분획에서 다음과 같은 대표적인 RP-HPLC 프로파일을 얻었다. 즉, 약 1∼2mg의 정제 인터페론 IFN α-n3a를 반 예비 Vydac C4 역상(RP)HPLC칼럼(10 ×250 mm)에서 분획하였다. 반예비 C4 RP-HPLC에 사용된 용리 기울기는 표 3에 나와 있다. 각종 완충액, 즉

A : 90% H₂O/10% ACN/0.1% TFAv/v/w 및

B : 90 % ACN/10% H₂0/0.1% TFA v/v/w 을 사응했을 때의 기울기는 직선이었다.

[표 3]

_

정제된 인터페론을 분획하여 7개의 피이크, 즉 피이크 1a, 1b, 2, 3, 4, 5및 6을 얻었다. 첫번째 피이크는 두개의 부분적으로 중첩된 피이크, 즉 1a와 1b로 갈라져 나타냈는데, 이들 두개의 피이크는 모든 분석에서 각각의 특징을 나타내었다. 각 피이크의 단백질을 별도로 회수하였다.

표 4 에는 대표적인 RP-HPLC 프로파일에서 얻은 각 피이크의 상대적인 비율이 나와 있다.

[표 4]

위에 나온 바와 같이 피이크 2 와 4 에는 약간 정도의 물질이 함유되어 있다. 피이크 2는 아미노산 조성과 탄수화물 함량에 대한 그 이상의 특징은 없다. 피이크 4는 HC1 가수분해 후의 아미노산 함량에 있어 그 이상의 특징은 없다.

동결 건조후 각 피이크의 인터페론을 pH 7.0 의 25 mM Tris-HC1 완충액중에서 환원시킨 다음 모든 칼럼 분획으로 부터 한데 모아 분석을 하였다

[실시예 4]

[생물학적 분석]

A. 항바이리스성 군석

(1)인간 HEp-2(ATCC CCL 23), (2)소의 MDBK(ATCC CRL 6071)및(3)토끼 RK-13(ATCC CCL37)세포 등의 세가지 상이한 세포계를 사용하여 항바이러스성 분석을 하였다. 인터페론을 96 웰 플레이트(well plate)에서 2 배로 계열 희석한 다음 각 웰당 30,000 세포를 가하고 하룻밤 배양한 후 세포를 VSV(Indiana strain ATCC #VR-158)로 감염시켜 다시 하룻밤을 배양하였다. 세포 변성 효과(CPE)를 대조용 바이러스, 대조용 세포 및 표준 인터페론 처리 세로에 대해 현미경으로 체크하였다. 표준 인터페론을 함유하는 웰이 적당한 CPE 를 나타내었을 때 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 모든 샘플에 대해 육안으로 50%세포 변성 효과를 측정하고, 인터페론 역가를 NIH 인터페론 표준품(Ga 23-902-530)에 대해 미리 표정(標定)해둔 실험실 기준과 비교하여 구하였다. 그 결과는 아래의 표 5에 나와 있다.

B. 항증식 분석

인간 임피아세포종 Daudi 세포에서 항증식 분석을 한다. 인터페론을 96-월 플레이트에서 5 배로 계열희석(100 ㎕/웰)한 다음 각 웰당(100㎕ 중)104 Daudi 세포를 가하고 40 시간 배양후 세포를 3H-티미딘 1.5 μCi/웰(25 ㎕ 중)로 7 시간 처리한다. 세포를 수거하여 유리 섬유로 된 필터에서 물로 세포를 세척한 다음 신틸레이션 카운터로 방사능을 측정함으로써 티미딘 흡수량을 측정한다. 다시 실험실 기준에 대해 역가를 계산하고 보정한다.

C. 분석 결과

RP-HPLC 피이크와 미분획 IFN α-n3a 의 항바이러스 및 항증식 특징은 표 5 에 나와 있다.

[표 5]

IFN α-n3a의 RP HPLC 피이크의 비활성

생물학적 비활성은 증 단백질 1 ㎎ 당의 생물학적 단위의 수로 나타낸다. 표 5 의 데이터로 부터 인간 HEp-2 와 소의 MDBK 의 CPE 비활성은 각 피이크에서 유사함을 알 수 있다. Daudi 세포에서의 항증식 비활성은 각 피이크에서의 항바이러스 활성의 약 2 배 이하이다. 토끼 신장 세포 (RK-13)에 대해 인터페론을 분석한 결과 약간의 CPE 활성이 검출되었다. 비활성은 인간 세포 또는 소 세포에서의 경우보다 최소한 100∼1000 배 낮다. 흥미로운 것은 피이크에서의 인터페론이 RK-13 세포에 대해 최고의 비활성을 가지고 있다는 점이다. 또한, 표 5에 나온 데이터로 부터 피이크 1a와 1b같은 초기 용리 피이크들은 HEp-2, MDBK 및 Daudi 세포에 대한 비활성이 낮았다. 피이크 1(a 및 b)을 이 분석에서 시험했을때 IFN α-n3a 조성물 총 항바러스 활성의 약 25%에 불과 하였다. 후에 용리하는 피이크 6 은 최고의 비활성을 나타내고 있다. 실제로 비활성을 용리 기울기에서 아세토니트릴의 퍼센트에 대해 플로트하면(제 5도 참조), 알파 인터페론의 소수성의 상대적인 증가와 비활성의 증가 사이에 소수성이 많을 수록 비활성은 높아진다. 소수성이 많은 인터페론 변종일 수록 큰 친화성으로 인터페론 수용체에 결합하거나 세포 현상을 보다 효율적으로 개시하여 높은 비활성을 나타내게 된다.

[실시예 5]

IFN α-n3a 의 물리적인 성질

역상 HPLC 에서 분획된 7개의 피이크에서의 인터페론 단백질을 SDC-PAGE 로 특성화 하였다.

A. 1 차원 SDS-PAGE

(1)방법

Laemmli의 방법 [Nature, 277 : 680 (1970)]과 유사한 방법에 따라 1차원 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)분석을 하였다. 환원 조건과 비환원 조건하에서 IFN α-n3a 를 14.5% SDS-PAGE에서 분석하였다. 단백질 밴드를 쿠우마시이 블루우 염색을 하여 눈에 보이도록 하였다. 인간 알파 IFN에 특이적인 LIT-1쥐 모노클로날 항체로 복제 SDS 겔의 웨스턴 블롯(Western blot)을 면역 염색하여 전개하였다 [Towbin et al., Proc, Natl. Acad. Sci.(USA)76 : 4350(1979); and Haid et al., Meth. Enzymol., 96 : 192(1983)참조].

(2)결과

비환원 조건과 환원 조건하에서의 SDS-PAGE 프로파일의 데이터는 표 6과 표 7에 요약되어 있다. 더욱이 제 6도와 제 7도는 비환원 조건과 환원 조건하에서의 쿠우마시이 블루우 염색된 SDS-PAGE 프로파일을 나타낸 것이다.

[표 6]

SDS-PAGE(비환원 조건)

상대적인 분자량 및 면적 백분율

상대적인 면적 퍼센트(%)

[표 7]

SDS-PAGE(환원 조건)

상대적인 분자량 및 면적 백분율

상대적인 면적 퍼센트(%)

표 6 과 표 7 의 데이터로 부터 대부분의 피이크에서 불균일성(즉, 하나 이상의 단백질 밴드가 있음)이 있음을 알 수 있다. 환원 조건하에서만 피이크 6 이 이 방법에 의해 단일의 단백질 밴드를 가진 것으로 나타나고, 피이크 1a와 1b에는 환원 조건과 비환원 조건하에서 유사한 분자량을 가진 단백질을 함유하고 있다. 이들 두개의 피이크(1a,1b)도 부문 아미노산 서열 분석에서 알 수 있는 바와 같이 동일한 주요 인터페론인 IFN-α2b를 함유하고 있다.

각 피크에서의 인터페론 단백질 밴드의 상대적인 수를 레이저 농도계로 측정하였다. 상대적인 분자량은 분자량 마아커(marker)와 비교하여 계산하였다.

웨스턴 블릇 분석 결과는 비환원 조건과 환원 조건에 대해 각각 제 8 도와 제 9 도에 나와 있다. 이들 데이터로 부터 쿠우마시이 블루우 염색으로 검출 가능한 단백질 밴드는 LIT-1 모노클로날 항체에 의해 인식되었음을 알 수 있다. 이것은 각 피이크의 모든 단백질 밴드가 인간 알파 인터페론으로 확인되었음을 뜻한다. 미분휙 인터페론의 불순물 함량은 약 1 %이다. RP-HPLC 로 분획한 후의 불순물 함량은 어느 피이크에도 검출되지 않았다.

이어서, 2차원 겔 분석에 의해 특성화를 계속하였다.

B. 2차원 SDS-PAGE

(1) 방법

2 차원 겔 전기영동법에는 1 차원에서의 등전점 전기영동과 2 차원에서의 SDS-PAGE 를 포함하고 있다. 1 차원 분석에 있어서 각각의 RP-HPLC 피이크로부터 얻은 인터페론 5 ∼10 ㎍ 을 유리관(2×180 mm)속에 주입한 아크릴 아미드/우레아 겔에 가하고 유리관속의 겔을 400 볼트의 일정한 전압에서 16시간 처리한 다음 800 볼트에서 1 시간 처리하였다. pH 3∼10 인 앰플라인(ampholine ; Millipore 사제)을 사용하여 등전점 전기영동 분석을 하였다. 이어서, 유리관으로 부터 관모양의 겔을 압출하여 SDS 샘플 버퍼(sample buffer)로 평형화 한 다음 15 % SDS-폴리아크릴아미드 슬랩 겔(slab gel)위에 층상으로 올려 놓고 2 차원 분석을 하였다. pH8.3 의 Tris/글리신 완충액에서 35 mA 의 일정 전류에서 SDS-PAGE 를 실시하였다. 2-D겔의 단백질을 은염색하여 눈으로 볼 수 있게 하고 LIT-1 모노클로날 항체로 면역 염색함으로써 인터페론 단백질을 확인하였다.

(2)결과

미분획 IFN α-n3a 와 각 RP-HPLC 피이크의 단백질에 대한 2 차원 겔 분석 결과로 부터 모든 샘플에서 복수개의 스폿이 검출되었음을 알 수 있다. 미분획 IFN α-n3a 는 2-D 겔 분석에서 약 30 개의 스폿이 나타났다. 모든 스폿을 LIT-1 모노클로날 항체로 식별하였는데 실제로 인터페론 단백질이 존재하고 있었다.

2 차윈 겔 전기영동법에는 1 차원에서의 등전점 전기영동과 2 차원에서의 SDS-PAGE 를 포함하고 있다. 1 차윈 분석에 있어서 각각의 RP-HPLC 로 부터 얻은 인터페론 5 ∼10 ㎍ 을 유리판(2×180 mm)속에 주입한 아크릴아미드/우레아 겔에 가하고 유리관속의 겔을 400 볼트의 일정안 전압에서 16 시간 처리한 다음 800 볼트에서 1 시간 처리하였다. pH 3∼10 인 앰폴라인(ampholine ; Millipore사제)을 사용하여 등전점 전기영동 분석을 하였다. 이어서, 유리관으로 부터 관모양의 겔을 압출하여 SDS 샘플 버퍼(sample buffer)로 평형화 한 다음 15 % SDS-폴리아크릴아미드 슬랩 겔 (slab gel)위에 증상으로 올려 놓고 2 차원 분석을 하였다. pH 8.3 의 Tris/글리신 완충액에서 35 mÅ 의 일정 전류에서 SDS-PAGE 를 실시하였다. 2-D 겔의 단백질을 은염색하여 눈으로 볼 수 있게 하고 LIT-1 모노클로날 항체로 면역 염색함으로써 인터페론 단백질을 확인하였다.

(2)결과

미분획 IFN α-n3a와 각 RP-HPLC 피이크의 단백질에 대한 2차원 겔 분석 결과로 부터 모든 샘플에서 복수개의 스폿이 검출되었음을 알 수 있다. 미분획 IFN α-n3a는 2-D겔 분석에서 약 30개의 스폿이 나타났다. 모든 스폿을 LIT-1 모노클로날 항체로 식별하였는데 실제로 인터페론 단백질이 존재하고 있었다. 각 피이크의 단백질에 대한 스폿의 수와 분자량은 표 8 에 요약되어 있다. IFN α-n3a 의 모든 인터페론 단백질의 등전점 (pI)은 5.0∼7.5 의 범위내에 있다.

[표 8]

2-D 겔 프로파일의 분석

* 은 염색 및 면역 염색 처리한 것임

** 미분획

피이크의 1a와 1b의 2-D겔 프로파일은 극히 유사한 것으로 나타나고 있으면 분자 크기와 하전에는 차이가 거의 없다. 단백질의 몇가지 비하전 관련 변환으로 인해 RP-HPLC에서는 따로따로 용리하여도 좋다. 나머지 피이크에 대한 2-D겔은 서로간에 극히 상이하다. 각 피이크의 프로파일은 고유의 특징을 가지고 있다. 각 피이크에 복수의 스폿이 존재하는 것은 단백질의 불균일한 집단을 나타내는 것이다. 이러한 불균일성은 단백질의 면역의 차이 및/또는 면역후의 차이에 기인하는 것일 수도 있다.

[실시예 6]

IFN α-n3a의 생화학적 성질

A. 아미노산 조성

인터페론 단백질을 Pico-Tag 가열 블록내에서 6N HC1 중에서 104℃ 에서 24 시간 가수분해 하였다. 가수분해물을 감압 건조하고 70 % 에탄올, 10 % 물 및 10 % 트리에틸아민으로 된 용액중에서 10 % 페닐이소티오시아네이트(PITC)와 반응시켰다. 생성된 페닐티오시아네이트(PTC) 아미노산을 Pico Tag C18 HPLC 칼럼으로 분리하였다. 140 mN 아세트산 나트륨 (pH 6.4)과 0.05 % 트리에틸아민을 함유하는 물속에서 아세토니트릴의 0∼60 % 직성 기울기로 PTC-아미노산을 용리하였다. PTC 아미노산의 흡광도를 269 nm 에서 측정하였다. 각 분석에서 얻은 흡광도 데이터를 디지탈화하여 마이크로컴퓨터에 기억하여 두었다. 아미노산 잔기, 시스테인 및 트립토판은 이 반응에서 PITC에 의해 변환되지 않았으므로 시그날이 없다. 소프트웨어 패키지(Water's Expert software package)를 사용하여 이들 데이터를 분석하여 아미노산 확인과 정량 측정을 하였다.

알파 인터페론과 각 RP-HPLC 피이크의 아미노산 조성 분석 결과는 표 9 에 나와있다. 표 9 로 부터 일반적으로 각각의 피이크의 아미노산 조성은 NK-2 모노 클로날 항체가 인식한 것들 및 미분획 인터페론의 것과 유사함을 알 수 있다. 각 피이크의 조성을 N 말단 서열 분석에서 확인된 특수한 아종(亞種)의 이론적인 조성과 비교해보면 ± 1 잔기이내에서 일치하고 있다. 이들 데이터는 N 말단 서열 분석에서 확인된 주요 아종을 확인할 수 있음을 강력히 지지하며 주는 것이다.

[표 9-1]

IFN α n3a 및 RP-HPLC 피이크의 아미노산 조성

[표 9-2]

IFN α-3na 및 RP-HPLC 피이크의 아미노산 조성

B. N 말단 아미노산 서열

N 말단 아미노산 서열 분석에 사용된 방법은 앞서 나온바 있는 방법과 유사하다 [ Edman, Acta Chem. Scant., 4 : 283(1950); Edman et al.,Eur J. Biochem, 1: 80(1967)참조].

각각의 RP-HPLC 피이크에 대하여 약 500 pmole 의 단백질을 예비 사이클된 필터에 가하고 30∼35 사이클에 대해 서열 분석을 하였다. 서열 분석은 온라인 페닐히단토인(PTH)아미노산 분석기가 장치된 Applied Biosystems ABI-470A 시퀀서(sequencer)에서 분석하였다. 이 장치에서의 서열 분석방법은 Edman 분해법에 근거한 것이다.

Edman 분해법에 의한 N 말단 서열 분석은 비교적 짧은 펩티디 서열(즉, 20)에서 잔기를 확인하고 정량화하는데 극히 효과적이지만 길이가 긴 펩티드 서열(즉, 30)의 경우는 단백질 또는 폴리펩티드의 C 말단에 인접한 잔기의 확인은 불명료해진다. 따라서, 반복 수율로 인한 불명료성이 증가하여 일반적으로 95% 이하로 되기 때문에 각각의 추가 사이클에 대해 시그날의 누적 상실이 있게 된다.

이러한 이유로 해서 피이크 1a 와 1b 의 단백질은 CNBr 에 의해 메티오닌 잔기에서 가수분해됨으로써 분열되어 이들이 IFN-α2 아종인 것을 확인하였다.

이러한 분열은 70%포름산중에 알파 인터페론 단백질을 먼저 용해한 다음 CNBr 을 1M 농도가 되게 가하여 4℃ 에서 24 시간 배양하여 실시했다.

분열 반응은 고속 감압 장치에서 동결 건조하여 반응판으로 부터 CNBr을 비롯한 모든 용매를 제거함으로써 정지시켰다. 건조된 CNBr 단편을 10% TFA에 용해하여 C18 칼럼(0.2×25cm, Phenomenex)에 주입하였다. 0.1% TFA/H₂O(용매 A)와 0.1 % TFA/아세토니트릴(용매 B)의 다단계 기울기에서 0.2㎖/min 의 유속으로 단편들을 용리하였다. 사용된 다단계 직선 기울기는 다음과 같다. 즉,(1)0%∼40% 용매B 에서 60분,(2)40 %∼60 % 용매 B 에서 50분,(3)60%∼100% 용매 B 에서 13분(4)일정한 100% 용매에서 다시 15 분으로 하였다. 214 nm 에서의 흡광도를 모니터링함으로써 용리 단편들의 검출을 하였다. 용리된 단편들에 대해 위에 나온 바와 같이 서열 분석을 하였다.

이 분해법에 의해 단편을 얻어 이들을 RP-HPLC로 분석하였다. 75 ~ 80 분에서 용리하는 피이크를 서열 분석한 결과 두개의 서열이 있음을 확인하였다. 하나의 서열은 IFN-α2b 의 22 번 위치로 부터 59번 위치까지의 아미노산으로 구성된 CNBr 단편 #2의 서열과 연결되어 있었다.

(3)결 과

미분획 IFN α -n3a 와 분획 RP-HPLC 피이크의 N 말단 서열은 표 10 에 나와있다. 이 결과로 부터 미분획 알파 인터페론과 각각의 피이크는 다중 서열을 가지고 있음을 알 수 있다. 이러한 모든 서열은 인간 알파 인터페론으로 확인 되었다. 각 피이크의 주요 피이크는 표 11에 나와 있다.

[표 10-1a]

IFN α-n3a 및 RP-HPLC 피이크의 N 말단 서열

[표 10-1b]

IFN α-n3a 및 RP-HPLC 피이크의 N 말단 서열

* ND = 확인되지 않았음.

[표 10-2a]

IFN α-n3a 및 RP-HPLC 피이크의 N 말단 서열

[표 10-2b]

IFN α-n3a 및 RP-HPLC 피이크의 N 말단 서열

* ND = 확인되지 않았음.

[표 11]

N 말단 서열분석에 의한 주요 인터페론

N 말단 서열 분석에서 확인된 IFN α -n3a 에서는 모두 18 개의 아종이 존재한다. 이들 서열은 Celltech사에 의한 보고에 나온 바와 같이 NK2 모노 클로날 항체에 의해 식별된 인터페론 아종과 일치하고 있다. IFN-α2b와 α8(a/b/c)는 알파-n3a 인터페론에서 확인된 주요 서열이다. IFN-α2b는 피이크 1a 및 1b에서 주로 발견되며 피이크 2에서는 소량 발견된다. IFN-α2c는 피이크 1a 에서 흔적량 발견되고 IFN-α8(a/b/c)는 주로 피이크 4 와 6 에서 발견된다.

미량으로 존재하는 기타 인터페론 아종은 α4(a/b)및/또는 α16인데, 이들은 피이크 2 에서 나타나고 있다. 아종 10a 는 피이크 3 에서 나타나고 있다. 아종 α17(a/b/c)와 α21(a/b)는 주로 피이크 5이서 나타나고 있고 피이크 4에서는 흔적량이 나타나고 있다. 아종 α7(a/b/c)는 피이크 5 에서 주로 나타나고 있다. 서열 분석을 30∼35 사이클로 하였기 때문에 이들 30∼35 사이클내에서 서열 확인이 되는 몇가지 아종을 구별하기가 어렵다. 모든 인간 인터페론 알파 아종의 N 말단에서는 α21(a/b)과 α17(a/b/c/d)가 유사한 N 말단 서열을 가지며(아미노산 위치 33번 까지), α4(a/b)와 α16 은 아미노산 위치 33 번 까지 유사한 N 말단 서열을 가지고 α 2b 는 α2c와 서로 비교가 된다. 따라서, 이 서열 분석의 제약으로 인하여 몇가지 주요 아종을 배제할 수 없다.

각각의 인터페론 단백질의 아미노산 서열에 존재하는 주요한 차이는 알파 단백질의 차이에 기인하거나 유전 대립성에 기인할 수도 있다. 유전 대립성에서는 단일 부위에서 아미노산 변환이 일어나는 유사한 단백질의 모습으로 된다.

생성물을 다시 더 분석하며 인터페론 제품중에 존재하는 IFN-α2 아종을 확인 하였다. 그 결과 이미 보고된 바 있는 세가지 IFN-α2 아종, 즉 IFN-α2a, IFN-α2b 및 IFN-α2c가 존재하고 있었다. 이들 세가지 IFN-α2아종의 N 말단 서열의 차이는 표 12 에 있는 바와 같이 사이클 23 과 34 에 존재한다.

[표 12]

IFN-α2 아종의 서열 차이

원래의 단백질과 CNBr단편 #2의 35사이클 이하의 파이크 1a와 1b 에 대한 서열 분석 데이터 (표 9)로 부터 IFN-α2b가 RP-HPLC피이크 1a 및 1b에 존재하는 주성분임을 알 수 있다. 사이클 23 과 24 에서 방출된 PTH 아미노산은 각각 아르기닌(Arg)과 히스티딘(His)인데, 이것은 IFN-α2b에서 기대했던 서열과 일치하고 있다. 사이클 23 에서는 뚜렷한 리신(Lys)의 방출이 없는데, 이로 부터 IFN-α2a가 피이크(1a와 1b)또는 IFN α-n3a로 부터의 기타 RP-HPLC파이크에서 존재하지 않는다는 것을 알 수 있다.

이들 결과는 CNBr 분해후 방출된 펩티드의 맵핑(mapping)및 N 말단 서열 분석에 의해 입증되었다. 더욱이, IFN-α2c를 검출하기 위해 22번 위치의 Arg 로 부터 60 번 위치의 Met 까지에 이르는 CNBr 단편을 분리하여 트립신으로 분해하였다. 트립신 펩티드를 RP-HPLC 로 분석하고 서열 분석을 하였다. 이들 서열의 정량 측정에 의하여 IFN α-n3a중의 IFN-α2 90% 이상이 IFN-α2b인 것을 알 수 있다. IFN-α2c는 제제중에 함유되어도 좋으나 그 농도는 신뢰 검출 한계 이하여야 한다.

C. 탄수화물 함량

인터페론 단백질 샘플(150 ㎍)을 0.1 M 아세트산에 대해 2 로그(log)투석하여 그 체적을 약 300㎕ 로 줄였다. 농축된 샘플을 세부분으로 균등하게 나누어 증발 건조시켰다. 이들 샘플을(1)2 M 트리플루오로아세트산(TFA)중에서 100℃에서 4 시간 가수분해하여 중성당을 측정하거나, (2)6 N HCl 중에서 100℃ 에서 4 시간 가수분해하여 아미노당을 측정하거나, (3)0.1N HCl 중에서 80℃에서 1 시간 가수분해하여 시알산을 측정하였다. 가수 분해물을 증발 건고시키고, 잔류물을 HPLC 급의 물 170 ㎖ 중에서 환원시켜 80∼100℃ 에서 잠시 가열하여 용이하게 용해하도록 하였다.

단당류, 즉 글루코오스, 갈락토오스, 글루코사민, 갈락토사민, 푸코오스 및 만노오스를 2.5㎍/㎖ 함유하는 탄수화물 표준물을 HPLC 급 물속에 용해하고 CarboPac PAL 음이온 교환 칼럼이 장치된 Dionex HPLC 시스템을 사용하여 단당류를 분리하였다. 펄스 전류 적정 검출기를 1㎖/min 의 유속에서 19 mM NaOH 로 평형화 한 다음 후칼럼 안정제(0.5 M NaOH)로 0.5 ㎖/min 의 유속에서 2 시간동안 평형화하였다. 자동 주입기를 통해 90 ㎕의 표준물 또는 샘플을 주입하고 동등한 조건하에 19 mM NaOH 로 용리하였다.

시알산 표준물 2.5 ㎍/㎖ HPLC 급 물속에 용해하고 위와 동일한 Dionex HPLC 시스템에서 시알산을 용리하였다. 펄스 전류 적정 검출기를 250mM NaOH로 평형화 하고 90㎕의 표준물을 또는 전가수분해물을 주입하여 250 mM NaOH 로 동등한 조건하에 용리하였다. 탄수화물 함량을 알파 인터페론 단백질(몰)에 대한 당(몰)의 비로 계산하였다. 아미노산, 중성당 및 시알산에 대한 탄수화물 분석 데이터는 표 13에 나와 있다.

[표 13]

IFN α-n3a 및 RP-HPLC피이크의 탄수화물 및 시알산 함랑

NA = 분석불가.

* TFA에 의해 가수분해된 샘플로 확인한 것임.

미분획 IFN α-n3a와 모든 피이크에는 인터페론 1 몰당 1∼3 몰의 당을 함유하고 있다. 피이크 1a와 1b는 뒤에 용출하는 피이크에 비해 대부분의 탄수화물을 함유하고 있고, 파이크 6, 즉IFN-α8(a/b/c)는 최소랑의 탄수화물을 함유하고 있다. 파이크 3∼6 에서는 만노오스와 시알산이 검출되지 않았는데, 이 현상은 단백질의 소수성과 일치하고 있다. 단백질중에 탄수화물의 함량이 낮으면 소수성이 증가하게 되므로 단백질은 RP-HPLC에서 나중에 용리된다. 피이크 2 의 단백질은 이 피이크에서 그 양이 부족하였기 때문에 분석할 수 없었다.

글리코실화 부위를 파악하기 위한 또 다른 실험에서 피이크 1a와 1b로 부터 100㎍의 단백질을 변성시켜 환원한 다음 알킬화하였다. 이어서, 이 단백질을 글루탐산 엔도펩티다아제(V8)로 1:100(E:S)의 비로 소화시키고, 수득한 V8 단편을 HPLC 로 분석하여 각 획분을 수거하였다. 각 획분을 가수 분해하여 탄수화물을 유리시겨 탄수화물 분석을 하였다. 획분 52∼53 은 대부분의 탄수화물을 함유하고 있었다. 이어서, 이들 두가지 획분에 대해 N 말단 서열 분석을 하였다.

서열은 97 번 위치에서 부터 약 109번의 위치까지의 N 말단 영역에서의 서열이 AXVIQGVG VXETP [SEQ ID NO : 1](여기서, 첫번째 X 는 C 이고, 두번째 X는 T)인 IFN-α2펩티드의 것이었다. 이 펩티드는 IFN-α2b외 E96에서 V8 커트(cut)에 의해 생성된다. 108번 위치의 T 는 분명히 검출 되지만 106번 위치의 T에서의 시그날이 없는 것은 106번 위치의 T가 0결합 탄수화물에 의해 개질되어야 하는 것을 나타낸다. 따라서, 트레오닌 106 을 IFN α2(b/c)의 글리코실화 부위로 확인하였다.

D. 카르복실 말단 아미노산 서열 분석

카르복시펩티다아제 P 를 사용하는 단백질의 카르복실 말단 서열 분석 방법을 이용하여 피이크 1a와 1b를 분석하였다. 카르복시폡티다아제 P는 아미노산을 신속히 가수분해하며 특정 아미노산에 대해 선택성이 없다. 피이크 2∼ 6의 인터페론은 윈료 부족으로 분석이 되지 않았다.

단백질 시료(10∼30 ㎍)를 50 mM 아세트산 나트륨에 대해 pH 5.5 에서 투석하고 카르복시펩티다아제 P를 효소 : 단백질비 1 : 100(w/w)로 하여 첨가 하였다. 이 혼합물을 37℃ 에서 항온처리하고 0.5 분, 1 분, 2 분, 5 분, 10분 및 60 분에서 일부를 취하였다. 분해 및 분석을 각각 최소한 2 회 반복하였다.

각 시점에서 유리된 아미노산을 2% SDS/0.4 M리튬 보레이트중에서 O-프탈 알데히드(OPA)와 30 초 동안 반응시켰다. 유도된 아미노산을 아세트산 나트륨/테트라히드로푸란/물 완충액에 대하여 메탄올 기울기를 사용하여 C18 역상 Pico-Tag 칼럼에서 분리하였다. 방출된 아미노산의 확인과 정량은 OPA 와 반응한 표준 아미노산의 HPLC 프로파일과 비교함으로써 실시하였다.

IFN α-n3a, RP-HPLC 피이크 및 알파 인터페론 아종의 C 말단 서열 분석 결과는 표 14에 요약되어 있다.

[표 14]

알파 인터페론, IFN α-n3a 및 RP-HPLC 피이트의 C 말단 서열

서열을 각 아미노산 잔기의 출현 및 플래토우(plateau)순서에 따라 확인하였다. 예컨대, 글루탐산은 기타 잔기보다 일찍 출연하여 플래토우를 나타내므로 C 말단으로 부터 첫번째 잔기로 확인하였다. 기타 사이클로 부터의 서열을 마찬가지 윈칙에 따라 확인하였다. 미분획 알파 인터페론의 경우에 있어서 주요 C 말단 서열을 Leu-Arg-(Ser/Arg)-Lys-Glu [SEQ ID NO : 2(서열확인 No.2)] 로 확인 하였다.

이들 알파 인터페론 아종의 이론적인 서열 역시 표 14 에 비교를 위해 제시되어 있다. 결과에 의하면 피이크(1a,1b)와 미분획 인터페론의 주요 C 말단 서열은 IFN-α2b와 유사함을 알 수 있는데, 이로 부터 미분획 인터페론과 피이크(1a,1b)에는 윈래의 카르복실 말단을 가지고 있다는 것이 입증되고 있다. 여기에 사용된 C 말단 서열 분석은 N 말단 서열 분석의 경우보다 감도가 훨씬 떨어진다. 따라서, 조그만 차이라도 검출되지 않는다. 예컨대, α8 C 말단 잔기(Leu-Lys-Ser-Lys-Glu)[SEQ ID NO : 3] 는 주 α 2b C 말단 잔기(Leu-Arg-Ser-Lys-Glu)[SEQ ID NO:4] 의 존재하에서는 검출되지 않았는데, 이들은 두가지 서열만이 사이클 -4에서 상이하다. 절단된 C 말단을 가진 작은 양의 인터페론 성분이 존재한다는 것은 성분의 양이 20 % 이하인 경우에는 검출되지 않았다.

[실시예 7]

[1 차 독성 연구]

IFN α-n3a의 1차 연구는 CD4+ T세포 카운트가 ≥ 400/mm³인 무증후성의 HIV 감염 개체 20 개에 대하여 실시하였다. 적당한 투여용량 희석전의 조성물 중에는 3.3mg 페놀중의 5MU/㎖ IFN α-n3a, 1mg 알부민(인간), pH7.4, PBS, 8.0ng/㎖ NaCl, 1.74mg/㎖ 이염기성 인산 나트륨및 0.2mg/㎖ 염화 칼륨을 함유하고 있었다.

이 조성물을 다음의 투여량으로 하여 3∼6 개월 동안 월요일, 수요일 및 금요일 (1 주당 3 일)에 피하 투여하였다.

5 명 : 1 백만 IU,

10 명 : 첫번째 주 동안에는 2.5 백만 IU 투여 후 5 백만 IU,

5 명 : 최대 허용 투여량까지 증가시켰음.

병원에서 약물처리를 위한 첫번째 주 동안에 각 환자들을 관찰하였다.

이 연구 결과를 표 15 에 나타내었다. IFN α-n3a 는 ≤ 17.5 백만 IU 의 투여량에서 내용성이 있었고 열이나 독감 같은 증상, 위장 증상 또는 피부 발진등이 전혀 관찰되지 않았다. 총 백혈구, 과립구 및 혈소판 카운트에 대한 시험값은 모두가 WHO 요건에 의한 정상적인 한계 이내에 있었다. 알파 인터페론 활성에 대안 대용약(혈액 백혈구에 대안 증가된 1 급 HHC 발현 ; 알파인터페론 유도성 유전자 발현)은 대부분의 환자에게 투여되어 있었다.

재조합 알파 인터페론에 대하여 보고된 바 있는 역증상 빈도수와 시험실 시험 이상은 본 발명의 조성물의 균등한 투여량에서는 나타나지 않았다. 임상연구에 이전에 사용된 정제처리가 덜 된 제품(IFN α-n3)[Alferon A package insert, Interferon Sciences, Inc., New Jersey]의 항바이러스 활성에 대한 생체외 실험 결과와 더불어 만족스러운 안정성과 내용성 프로파일을 가지고 있다는 사실로 부터 본 발명의 조성물의 강력하고도 안정한 항바이러스 치료제로서의 유용성이 입증되는 것이다.

[표 15]

치료 관련 부작용 경험 (%)

Alferon N 주사

조기 HIV 감염

본 발명의 조성물이 공지의 알파 인터페론 조성물과 비교하며 저독성이라는 놀라울만한 장점을 가지고 있다는 것을 입증하기 위하여 독성 결과를 표 16 에서 이전에 보고된 여러가지 알파 인터페론(천연형, 세포 유래형 및 재조합형)과 비교하였다. 비교를 용이하게 하기 위하여 IFN α-n3a를 아래의 참고문헌에 기재되어 있는 몇가지 알파, 베타 및 감마 인터페론과 각각 비교하였다. 표 16 에서 참고문헌 No.는 아래의 참고문헌의 번호를 뜻한다.

[표 16-1]

[표 16-2]

[표 16-3]

[표 16-4]

[표 16-5]

[표 16-6]

[표 16-7]

[표 16-8]

[표 16-9]

[표 16-10]

[표 16-11]

[표 16-12]

[표 16-13]

[표 16-14]

[표 16-15]

[표 16-16]

[표 16-17]

[표 16-18]

[표 16-19]

[표 16-20]

[표 16-21]

[표 16-22]

[표 16-23]

[표 16-24]

[표 16-25]

[표 16-26]

[표 16-27]

[표 16-28]

[실시예 8]

인터페론 α-n3a의 항 HIV-1활성

인터페론은 생체내와 생체외에 있어서 항바이러스 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. IFN α-n3a의 인터페론에 있어서 생체외 분석에서 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV-1)에 대한 항바이러스 활성에 대하여 조사하였다. IFN α-n3a의 상대적인 활성을 알파 인터페론의 두가지 재조합형 (즉, IFN α-2a 및 IFN α-2b)과 비교하였다.

A. 세포 배양 및 역전사 효소 분석

이 연구에 사용된 세포들은 백혈구 영동 처리후 HIV 및 B형 간염 혈청 음성 공여자의 말초혈 단핵 세포(PBNC)로 부터 회수하여 혈구의 단핵 백혈구 고함유 획분을 역류 윈심 세척법으로 정제하여 얻은 정상적인 인간 단핵 세포 이었다. 세포 현탄액을 분석한 결과 단핵 세포는 98 % 이상이었는데, 이것을 DMEM[Gibco, Grand Island, NY ; 10% 가열 실활된 A+인간 혈청, 50 ㎍/㎖ 젠타마이신, 1000 U/㎖ 고순도 재조합 N-CSF(FAP-809, Cetus Corp., Emeryville, CA)함유] 중에서 밀착성 단일층(1.5×10⁵세포/㎖)으로 배양하였다. 모든 배양액을 시험한 결과 엔도톡신 오염에 대해서는 음성 이었다.

밀착성 단핵 세포를 인터페론 부재하에 7 일간 배양한 후 단핵 세포 주성(走性)의 HIV-1 균주(ADA)를 가하였다. 감염시킨 세포를 인터페론 존재 또는 부재하에 4 주일까지 배양하였다. 배지를 2∼3 일 마다 절반씩 교체하였다.

이 실험에 사용된 인터페론은 그 기원이 각기 상이하므로 먼저 다른 바이러스, 예컨대 소수포성 구내염 바이러스( VSV : Vesicular Stomatitis Virus)에 대해 MDBK세포를 사용하는 CPE분석을 하여 역가를 측정하였다. 이들 인터페론을 이 실험의 배양액 1 ㎖ 당의 항바이러스 활성의 동일한 수에 따라 이 CPE 분석에서 표준화하였다. IFN 을 바이러스와 동일한 시간에서 첨가하거나 바로 직전에 첨가하면 인터페론에 의한 HIV생성의 투여량에 따른 억제가 나타난다.

복제 세포 배양액중의 HIV-1 바이러스와 관련된 역전사 효소(RT : reverse transcriptase)의 활성을 이용하여 이들 실험에서의 바이러스 발현 정도를 정량 하였다. 각기 상이한 시간에서 회수한 조직 배양액을 pH 7.9 Tris-HCl 완충액중에 0.05% Nonidet P-40(Sigma Chemical사), 10㎍/㎖폴리(A), 0.25 U/㎖ 올리고(dT ; Pharmacia 사), 5 mM 디티오트레이톨(Pharmacia 사), 150 mM KC1, 15 mM MgCl₂및 3H-dTTP(2 Ci/mmo1, Amersham 사)를 가해서 된 반응 혼합물에다 가하고 37℃ 에서 24 시간 반응시켰다. 결합된 방사능을 차거운 TCA 로 침전시겨 세척한 다음 유리 필터 디스크에서 자동 세포 회수기(미합중국의 Skatron사제)로 회수하여 액체 신틸레이션 카운터로 방사능을 측정하였다.

B. 단핵 세포 배양액중에서 HIV-1_ADA감염에 미치는 인터페론의 비교 효과

IFN α-n3a의 투여량 의존 효과를 HIV-1 감염 단핵 세포에 대해 생체외에서 실험하여 두가지 기타 IFN공급원, 즉 재조합 IFN α-2a(Roferon A, 미합중국의 Hoffman-La Roche, Nutley, NJ)및 IFN α-2b(Intron A, 미합중국의 Schering Plough, Kenilworth, NJ)와 비교하였다. HIV-1_ADA(MOI = 0.01)로 감염시킨 단핵 세포에 IFN의 첨가량을 증가시키면서(즉,0∼500 IU/㎖), 12 일 동안 배양하였다. 그 결과는 표 17 에 나와 있는데 3 차 측정의 평균을 한 것이다. 이들 결과로 부터 IFN α-n3a는 시험에 사용된 두가지의 재조합 IFN 보다 HIV-1 단핵 세포 억제 분석에서 단위마다 훨씬 강력한 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다.

[표 17]

IFN농도의 함수로서의 RTase활성(CPM×10^-5)

이들 분석을 여러번 반복하여 이들 결과를 확인하였다. 표 18에는 요약된 결과가 나와 있다.

[표 18]

상이한 종류의 IFN 의 상대 억제 효과

** ID₅₀은 50% 억제 투여량

이들 결과로부터 IFN α-n3a는 IFNα-2b보다 10배나 강력하고 IFN α -2a보다 100배나 강력함을 알 수 있다. 이것은 위에 나온 CPE 분석에서 측정한 바와 같이 각 제제중에서의 인터페론의 상대적인 농도를 동일한 역가로 표준화한 후에 있어서도 마찬가지이다.

C. IFN α-n3a에서의 항 HIV-1활성의 분석

단핵 세포 배양액 분석에서의 IFN α-n3a의 높은 항 HIV-1의 활성의 기원에 대해 IFN α-n3a의 역상 HPLC 분획 피이크를 사용하여 조사하였다. 앞서 나온 바와 같이 RP-HPLC 에서 IFN α -n3a 를 분획하고 IFN 활성의 각각의 RP-HPLC피이크를 MDBK세포의 항바이러스(즉, VSV) CPE활성에 대해 표준화한 다음 이들 실험에 사용하였다. CPE 역가를 표준화한 후 6개의 피이크 영역을 이들 실험에서 조사하였다.(즉,파이크1 [a+b], 2, 3, 4, 5 및 6). 각각의 분석에 100 IU/㎖ 및 HIV-1 moi ≤ 0.02 을 사용하였다. 그 결과는 표 19 에 나와 있다.

[표 19]

IFN α -n3a 외 RP-HPLC 피이크의 상대적인 항 HIV-1 활성

이들 결과로 부터 항 HIV-1 활성의 대부분은 RP-HPLC 피이크 2 및 6 에서 발견되는 IFN 에서 나타나고 피이크 3, 4 및 5 는 활성이 강력하기는 하나 이 보다는 훨씬 떨어진다는 것을 알 수 있다. 흥미롭고 뜻하지 않은 것은 RP-HPLC 피이크 1 의 IFN 은 IFN α -n3a 에서 나타난 것의 가장 적은 항 반전 바이러스 활성을 가지고 있다는 점이다. 이것은 IFN α-2a와 IFN α-2b에서 나타난 낮은 항 HIV-1활성이 위와 같이 나타나는 것을 확인해 주는 것이다.

[서열 리스트]

(1)일반 정보 :

(i)출원인 : 다글라스 테스타,

메이쥰 리아오,

카탈린 페렌츠-비로,

아바스 라시드바이기,

마리오 디파올라,

마니샤 패드하이

(ii)발명의 명칭 : 개량된 알파 인터페론 조성물 및 인간 말초혈 백혈구로 부터의 제제 방법.

(iii)서열의 수 : 22

(iV)연락처

(가)수신인 : 호오손 앤드 호오손

(나)번지 : 스프링 하우스 코포레이트 센터, P.O. Box 457

(다)시 : 스프링 하우스

(라)주 : 펜실베니어

(마)국 : 미합중국

(바)우편번호 : 19477

(V)컴퓨터 판독형 :

(가)중간형 : 플로피 디스크

(나)컴퓨터 : IBM PC호환형

(다)작동 시스템 : PC-DOS/NS-DOS

(라)소프트웨어 : Patent In Release # 1.0, Version # 1.25

(Vi)현재 출원 데이터 :

(가)출원번호 :

(나)출원일 :

(다)분류 :

(Vii)선출원 데이타 :

(가)출원번호 : US 07/835,030

(나)출원일 : 1992년 2월 10일

(Viii)대리인 정보 :

(가)성명 :메리 E. 박

(나)등록번호 : 31,215

(다)참조/문서파일 번호 : NPD92USA

(ix)통신정보 :

(가)전화 : 215-540-9206

(나)텔리팍스 : 215-540-5818

(2)SEQ ID NO : 1(서열확인 No.1)의 정보

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 13 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 :불명

(ii)분자형 : 단백질

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 2

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Cys 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 10

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Thr 이어도 좋음 ''

(xi)서열 기재 : SEQ ID NO : 1 :

Ala Xaa Val Ile G1n Gly Val Gly Val Xaa Glu Thr Pro

1 5 10

(2)SEQ ID NO : 2 의 정보 :

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 3

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Arg 일 수도 있음

(xi)서열 기재 : SEQ ID NO : 2 :

Leu Arg Ser Lys Glu

1 5

(2)SEQ ID NO : 3 의 정보 :

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

(xi)서열 기재 : SEQ ID NO : 3 :

Leu Lys Ser Lys Glu

1 5

(2)SEQ ID NO : 4 의 정보 :

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

(xi)서열 기재 : SEQ ID NO : 4 :

Leu Arg Ser Lys Glu

1 5

(2)SEQ ID NO : 5의 정보

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 34 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 1

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Cys 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 11

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Ser 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 14

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Thr 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 16

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Met 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 19

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Gly 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 22

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Gly 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 27

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Pro 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 29

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Cys 이어도 좋음

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 1

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Cys 이어도 좋음

(xi)서열 기재 : SEQ ID NO : 5 :

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 34 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 34 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

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(2)SEQ ID NO : 8 의 정보 :

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 34 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 11

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(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 22

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 34 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 34 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 22

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 34 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

(ix)특징 :

(가)명칭/키이 : 영역

(나)위치 : 10

(라)기타정보 : /주 = 이 아미노산은 Arg 이어도 좋음

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 34 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

(xi)서열 기재 : SEQ ID NO : 12 :

(2)SEQ ID NO : 13 의 정보 :

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

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Leu Arg Arg Lys Asp

1 5

(2)SEQ ID NO : 14 의 정보 :

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

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(2)SEQ ID NO : 15 의 정보 :

(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

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(ii)분자형 : 단백질

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 : 불명

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

(라)토폴로지 : 불명

(ii)분자형 : 단백질

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

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(나)위치 : 3

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(i)서열 특징 :

(가)길이 : 5 개 아미노산

(나)서열형 : 아미노산

(다)스트랜드 특징 : 불명

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(ii)분자형 : 단백질

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Claims

알파 인터페론종 α2와 α8 및 그 대립형질과, α4, α7, α10, α16, α17 및 α21 로 된 군으로 부터 선택된 한가지 이상의 알파 인터페론종 및 그 대립형질의 혼합물과 약학적으로 허용되는 담체로 된, 인간 말초혈 백혈구 유래의 천연 알파 인터페론을 함유하는 항바이러스용 및 항암용의 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 인터페론 단백질 1 몰당 당이 1∼6 몰인 탄수화물 함량과, 최소한 95 % 인간 알파 인터페론 단백질의 순도와, 16,000∼27,000 돌튼의 겉보기 분자량과, 표 10 의 N 말단 서열중의 최소한 하나 및 표 14 의 C 말단 서열중의 최소한 하나를 가진 항바이리스용 및 항암용의 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 역상 HPLC(C4)칼럼으로 부터 아세토니트닐 용매 농도 40 ~ 60 % 사이의 직선 기울기로 0.1 % TFA 중에서 용리했을때 측정된 제 4도의 OD₂₈₀프로파일을 나타내고 HPLC 에서의 7 개의 피이크에 대한 평균 면적 백분율로 상대적인 비율을 나타내는 소수성을 가지며, 인터페론 단백질 1 몰당 당이 1∼6 몰인 탄수화물 함량과, 인간 세포와 소세포를 사용하여 생체의 항바이러스 분석으로 측정했을 경우 약 1∼10×10⁸IU/mg 의 비활성과, 표 10 의 N 말단 서열 및 표 14 의 C 말단 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항바이러스용 및 항암용의 약학 조성물.
(가)적혈구를 용해시킨후 연층을 회수함으로써 인간 말초혈 백혈구를 제조하고,

(나)L-글루타민, 비필수 아미노산, 탄산 수소 나트륨, 0.1∼1.5 mg/㎖ 의 인간 무감마 혈청, 임의의 비타민 B₃및/또는 C 및 미생물 생장 억제 능이 있는 임의의 적당한 억제제로 강화된 pH7.4 정도의 적당한 유도 배지에 상기 백혈구를 1∼10×10⁶세포/㎖ 의 세포 밀도로 현탁하고,

(다)유도 배지에 현탁된 백혈구에 미정제 또는 정제 알파 인터페론을 프라이머로 하여 첨가하고,

(라)상기 현탁액을 교반하면서 약 36℃ 에서 충분한 시간 동안 배양하고,

(마)이 현탁액에 센다이 바이러스를 1 ㎖ 당 50∼500 HA 단위 첨가하여,

(바)교반하면서 약 36℃ 에서 충분한 시간 동안 배양한 다음,

(사)원심분리하여 세포와 부스러기를 제거하며,

(아)알파 인터페론 혼합물중에 존재하는 기타 여리가지 종(species)으로 부터 알파 인터페론종 한가지를 분리하는 일이 없이 미정제 알파 인터페론을 생성물로 하여 회수하는 단계로 되어 있는 제 1 항에 의한 알파 인터페론 조성물의 제조방법.
제 4항에 있어서,(바)단계 후에 백혈구 현탁액을 유도 배지로 최종 농도 약 1∼5×10⁶세포/㎖ 되게 희석하는 단계를 포함하는 제조 방법.
(가)미정제 인터페론 혼합물을 10∼100 배로 여과 농축하고,

(나)농축 혼합물을 항체 면역친화성 크로마토그래피 처리하여 미정제 인터페론 중의 불순물을 제거하며,

(다)친화성의 정제 인터페론을 산 중에서 4℃ 에서 최소한 2 일 동안 배양한 다음,

(라)친화성의 정제 인터페론을 겔 여과 크로마토그래피로 더욱 정제하는 단계로 되어 있는 제 4항 또는 제 5항에 의해 제조된 미정제 알파 인터페론의 정제 방법.
인터페론종 α8, α4, α7, α10, α16, α17, 및 α21과 그 대립형질 및 이들의 조합으로 된 군으로 부터 선택된 1 종의 알파 인터페론 단백질과 약학적으로 허용되는 담체로 되어 있고, 필수적으로 인터페론종 α2 를 함유하지 아니한, 인간 말초혈 백혈구 유래의 천연 알파 인터페론을 함유하는 항바이러스용 및 항암용의 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 알파 인터페론 단백질은 인터페론종 α8 및 그 대립 형질로 부터 선택되는 항바이리스용 및 항암용의 약학 조성물.
제1항, 제2항, 제3항, 제7항 또는 제8항의 조성물 유효량을 상기 항바이러스제의 활성증가방법.
제9항에 있어서, 항바이러스제가 HIV 또는 간염치료에 사용되는 방법.