CS218120B1 - Živá vakcína kultury virů proti psince psů a kožešinových zvířat a způsob její výroby - Google Patents

Abstract

Podstata vakcíny podle vynálezu spočívá v tom, že obsahuje v 1 ml 102 až 104 TKID50 virů. psinky psů, kmene EPM 10—76, který je uložen ve vědeckém Všeobecném unijním ústavu pro zkoušení veterinárních preparátů ASSCJVP. Způsob její výroby spočívá v tom, že se kmen virů psinky EPM 10—76 deponovaný v ASSCJVP kultivuje na buněčné kultuře fibroplastů embryí japonských křepelek na Parkerově živné půdě hovězího séra, obsanujlcí 10 % zdroje uhlíku, aminokyselin a minerálních solí, při hodnotě pH 7,0 až 7,5 a při kultivační teplotě 34 až 36 °C, přičemž se první odběr kultivační kapaliny, která obsahuje vir, provádí při dosažení cytopathického efektu ve 20 až 40 % infikovaných buněk kultury embryí japonských křepelek a následující odběry se provádí tak dlouho, pokud nezůstane méně než 50 % živých buněk.

Description

Podstata vakcíny podle vynálezu spočívá v tom, že obsahuje v 1 ml 10² až 10⁴ TKID₅₀ virů. psinky psů, kmene EPM 10—76, který je uložen ve vědeckém Všeobecném unijním ústavu pro zkoušení veterinárních preparátů ASSCJVP.

Způsob její výroby spočívá v tom, že se kmen virů psinky EPM 10—76 deponovaný v ASSCJVP kultivuje na buněčné kultuře fibroplastů embryí japonských křepelek na Parkerově živné půdě hovězího séra, obsanujlcí 10 % zdroje uhlíku, aminokyselin a minerálních solí, při hodnotě pH 7,0 až 7,5 a při kultivační teplotě 34 až 36 °C, přičemž se první odběr kultivační kapaliny, která obsahuje vir, provádí při dosažení cytopathického efektu ve 20 až 40 % infikovaných buněk kultury embryí japonských křepelek a následující odběry se provádí tak dlouho, pokud nezůstane méně než 50 % živých buněk.

Předložený vynález se týká živé vakcíny kultury virů proti psince psů a kožešinových zvířat, používané ve veterinářství a způsobu její výroby.

Psinka je akutní kontaktní onemocnění kožešinových zvířat a psů. Obzvláště citlivá jsou na toto onemocnění infekční mláďata norků, stříbročerných lišek a modrých lišek. Vzhledem k vysoké úmrtnosti a nedostatku účinných léčiv způsobuje toto onemocnění značné ekonomické škody v chovu zvířat.

V přítomné době· se k profylaxi psinky kožešinových zvířat a psů používá řada živých vakcín kultury virů, které obsahují oslabené kmeny virů psinky, adaptované na kultury buněk ledvin psů nebo opic nebo embryí slepic.

Vakcína, která obsahuje oslabený kmen virů psinky kožešinových zvířat „Rochborn“, který byl získán z virulentního kmene viru, izolovaného z krve nemocného psa, se připravuje na kultuře ledvin psa. Pro výrobu takovéto vakcíny se uvedený kmen viru adaptuje ke kultuře buněk ledvin psa vícenásobným pasážováním (více než 50-tinásobnýmj a kultivuje se na uvedené kultuře buněk v Henksově roztoku, který obsahuje 0,5 0/ohydrolyzátu laktalbuminu a 10 % koňského krevního séra nebo 20 % krevního séra telete nebo v Erlově prostředí, které obsahuje 0,5 % hydrolyzátu laktalbuminu a 2 % koňského krevního séra nebo krevního séra telete. Adaptační teplota se udržuje konstantní v rozmezí 30 a 37 °C, s výhodou 35 až 37 °C. Získaná vakcína se stabilizuje a lyofilizuje (USA patentní spis č. 3 098 011).

Je známa také vakcína proti psince kožešinových zvířat a psů, která byla získána z viru, který byl podroben 10 pasážováním na kultuře buněk ledvin psa v Erlově prostředí, které obsahuje 5 °/o hydrolyzátu laktalbuminu a 5 % koňského séra, při teplotě 38,5 °C. (USA patentní spis č. 3 354 038).

Uvedené vakcíny mají vysokou imunogenní účinnost, avšak při tom mají řadu nedostatků. Jeden z těchto nedostatků spočívá v nízké reprodukovatelnosti viru v kultuře buněk ledvin psa.

Jiný nedostatek uvedených vakcín spočívá ve využívání kultur ledvin psa jako substrátu pro oslabení viru a výroby vakcíny. Ledviny psa mohou být kontaminovány i cizími viry. Aby se vyloučilo infikování psů, je nutné, vytvořiti speciální farmu pro chov zvířat, ve které se zvířata nacházejí pod přísně kontrolovatelnými podmínkami. To ovšem vyžaduje velké náklady.

Další nedostatek vakcín spočívá v obtížnosti stanovení jejich biologické účinnosti, neboť reprodukce virů je provázena nezřetelným cytopatogenním účinkem, který se projevuje až 20. den po infekci, kdy se mohou objeviti nespecifické degenerativní změny buněk, které ztěžují vyhodnocení výsledků.

Mimo to nedostatek uvedených vakcín, vyrobených na kultuře buněk ledvin psa, spočívá v pomalém růstu těchto buněk (monovrstva buněk se tvoří pouze 5. až 7. den), což prodlužuje technologický výrobní proces vakcíny.

Vakcíny viru pro potírání psinky kožešinových zvířat a psů, které se vyrábí kultivací kmene viru na kultuře buněk devět dní starých embryí slepic nebo na chorioallantoinových blanách embryí slepic, mohou být vzhledem k vysoké kontaminaci slepičích embryí cizími viry, zejména viry skupiny leukosy a sarkomů nebezpečné (USA patentní spisy č. 2 912 361 a 2 965 544).

Uvedený nedostatek má i vakcína, která byla připravena z kmene v buněčné kultuře slepicích embryí a je známa pod názvem KF—668 (SSSR).

Americká vakcína, která je známa jako vakcína ASL, je neškodná a nemá uvedený nedostatek, protože se připravuje v kultuře buněk bezleukózních slepičích embryí. Avšak pro chov bezleukózních slepic jsou nutné speciální farmy pro chov drůbeže, jejichž vytvoření a udržování je komplikované a značně nákladné. Kromě toho neposkytuje vakcína kmene viru žádný pravidelný cytopatický účinek v kultuře buněk slepicích embryí, což ztěžuje výrobní technologii vakcíny.

Je také známa vakcína viru proti psince kožešinových zvířat a psů, která se připravuje kultivací viru psinky kožešinových zvířat a psů na kultuře buněk ledvin mladých opic (USA patentní spis 4 004 974). Tato vakcína se vyznačuje dobrou imunogenitou, je areagenní a odpovídá nejvyšším standardům.

Avšak v přítomné době byl v mnoha zemích odchyt opic s ohledem na snížení stavu zvířat omezen. S přihlédnutím ke skutečnosti, že uvedená vakcína pamatuje na zhodnocení odpadků z výroby vakcíny proti poliomyelitidě, která je určena pro lidi, a s touto výrobou je bezprostředně spojena, lze snadno pochopit, že vytvoření speciální výroby vakcíny proti psince kožešinových zvířat a psů, založené na buněčné kultuře ledvin opic, je nákladná a nevhodná.

Tímto· způsobem se komplikuje výběr buněčného substrátu pro přípravu vakcíny virů. Obligatorní podmínkou je to, že se buněčný extrakt nestýká s cizími viry, jakož i možnost získat vakcínu viru v dostatečném množství.

Cíl předloženého vynálezu spočívá ve vytvoření vakcíny proti psince kožešinových zvířat a psů, která má vysokou immunogenitu, areaktogenitu, neškodnost, neobsahuje žádné cizí viry a lze ji získat při malých vlastních nákladech.

V souhlase s uvedeným cílem byla zadána úloha, která spočívala ve vyvinutí způsobu výroby vakcíny za využití nového kmene virů psinky kožešinových zvířat a psů, který lze kultivovat na neškodném a přístupném substrátu a dovolí získat vakcínu s vysokou imunogenitou, antigenitou a neškodností vzhledem k nepřítomnosti cizích virů.

Podstata živé vakcíny kultury virů proti psince psů a kožešinových zvířat, v lyofilizovaném stavu, podle vynálezu, spočívá v tom, že obsahuje v 1 ml 10² až 10⁴ TKID₅₍₎ virů psinky psů, kmene EKM 10—76, který je uložen ve vědeckém Všeobecném unijním ústavu pro zkoušení veterinárních preparátů ASSGJVP. Tento kmen byl získán z virulentního viru, izolovaného z krve norků, nemocných psinkou, vícenásobným postoupným pasážováním na následujících buněčných kulturách: 1) na buněčné kultuře ledvin psů; 2) na přeočkované kultuře ledvinových buněk lidského embrya Rh; 3) na smíšené buněčné kultuře, která sestává z huněk ledvin psa a buněk embryí japonských křepelek, adaptované k buněčné kultuře embryí japonských křepelek a na těchto kulturách byl kultivován.

Podstata způsobu výroby vakcíny podle vynálezu spočívá v tom, že se kmen virů psinky EKM 10—76, deponovaný v ASSCJVP, kultivuje na buněčné kultuře fíbroplastů embryí japonských křepelek na Parkerově živné půdě hovězího séra, obsahující 10 °/o zdroje uhlíku, aminokyselin a minerálních solí, při hodnotě pH 7,0 až 7,5 a při kultivační teplotě 34 až 36 °C, přičemž se první odběr kultivační kapaliny, obsahující vir, provádí při dosažení cytopatického efektu ve 20 až 40 % infikovaných buněk kultury embryí japonských křepelek a následující odběry se provádí tak dlouho pokud nezbyde méně než 50 % živých buněk.

Lyofilizace kapaliny, obsahující vir se provádí v přítomnosti 4,5 až 5,5 % hmot. sorbinu a 1,4 až 1,6 % hmot. želatiny.

Oslabený kmen viru, který se využívá pro výrobu vakcíny proti psince psů a kožešinových zvířat byl nazván kmenem EPM psinky psů a kožešinových zvířat. Pojem EPM znamená začáteční písmena slov: embryo křepelek, Moskva.

Uvedený kmen je nedávno získaný kmen vakcíny a je uložen ve sbírce kultur Všesvazového státního vědecko-kontrolního ústavu veterinárních preparátů ministerstva zemědělství SSSR, Moskva, D—22, Svenigorodskoje Sossé, 5 a to pod číslem EPM 10— —76.

Kmen EPM psinky psů a kožešinových zvířat, který byl uložen pod č. EPM 10—76, byl získán z virulentního viru, izolovaného z krve psinkou nemocných norků 20 až 50 pasážováním! na buněčné kultuře ledvin psa při teplotě 37 (+1) °C, poté 5 až 15 pasážováními na kultuře buněk lidského embrya Rh při teplotě 32 ( + l)°Ca 2 až 7 pasážováními na smíšené buněčné kultuře, která sestává z buněk psích ledvin a z buněk embryí japonských křepelek při teplotě 35 (+1) °C a následující adaptací během 4 až pasážování na buněčné kultuře embryí japonských křepelek (Coturnix japonica).

Pro výrobu vakcíny se uvedený kmen kultivuje na buněčné kultuře embryí japonských křepelek ve vhodném živném prostředí, například prostředí 199, které představuje směs, sestávající z aminokyselin, vitaminů, složek nukleinových kyselin aj. v Henkově solném roztoku nebo v Erlově prostředí za přídavku 10 % krevního séra hovězího dobytka.

První - dávka tekutiny, obsahující vir se nashromáždí podle důkazu cytopatického účinku ve 20 až 40 % buněk. Shromážděná tekutina, obsahující vir se suší lyofilně v přítomnosti 4,5 až 5,5 o sorbitu a 1,4 až 1,6 proč. želatiny.

Kmen vakcíny EPM virů psinky psů a kožešinových zvířat, který byl uložen pod číslem EPM 10—76, je vysoce oslabený, dobře se rozmnožuje v buněčné kultuře embryí japonských křepelek se zřetelně výrazným cytopathických účinkem, což značně zjednodušuje výrobní proces vakcíny. Uvedený kmen má při uchovávání dohrou stabilitu.

Nabízená vakcína má následující přednosti:

aj vakcína je neškodná, nemá žádný toxický účinek, vyrábí se v buněčné kultuře embryí japonských křepelek, která představuje levnou a přístupnou surovinu, která se dá spolehlivě kontrolovat, zda neobsahuje cizí viry;

Japonské křepelky nejsou od přírody citlivé na viry skupiny leukózy a sarkomu, a proto představuje buněčná kultura z jejich embryí optimální substrát pro výrobu vakcíny.

bj buněčná kultura embryí japonských křepelek má vysokou proliferační účinnost, což dovoluje infikovat suspenzi buněk, aniž by bylo nutné očekávat tvarování buněčné monovrstvy.

cj vakcína má vysokou antigenní účinnost, indukuje u zvířat, očkovaných vakcínou požadovanou a dlouhodobou imunitu, použitím vakcíny ve stádech epizootií psinky psů a kožešinových zvířat likviduje se rychto infekce stáda.

d) vakcína se může podávat nejen parenterálně, nýbrž i ve formě aerosolu, což značně zjednodušuje a zlevňuje profylaxi vakcínou.

e) vzhledem k tomu, že vakcína je vysoce účinná, je možné vyrobili obchodní produkt, který obsahuje široké dávkovači rozmezí od 1 až 500 dávek v jedné ampulce nebo láhvi, což je velmi pohodlné při individuálním a masovém použití.

Uvedené a jiné přednosti lze seznat z následujícího obšírného popisu vakcíny, způsobu její výroby a použití.

Způsob výroby vakcíny kultury živých virů je založen na systému očkování virem.

Systém očkovacího viru pamatuje na výrobu vakcíny viru ve velkém objemu, který odpovídá všem požadavkům oslabeného kmene, jeho uchovávání ve zmrazeném stavu a jeho využití podle potřeby pro výrobu vakcíny.

. Jak bylo shora uvedeno, využívá se pro· výrobu vakcíny proti psince psů a kožešinových zvířat oslabený kmen EPM, který byl uložen pod číslem EPM 10—76.

Uvedený kmen byl získán z „divokého“ virulentního viru psinky psů a kožešinových zvířat, který byl izolován z krve psinkou nemocných norků. Tento virulentní vir se oslabí vícenásobným pasážováním na různých buněčných kulturách v následujícím pořadí:. 1) na buněčné kultuře psích ledvin během 20 až 40 pasážování při teplotě 37 (+1) °C, 2) na přeočkované kultuře ledvinových buněk lidského embrya Rh během 5 až 15 pasážování při teplotě 32 ( +

1) °C a 3] na smíšené buněčné kultuře, která sestává z buněk psích ledvin a buněk embryí japonských křepelek, během 2 až 7 pasážování při teplotě 35 (+1) °C.

Po ukončení procesu oslabování se virus adaptuje během 4 až 10 pasážování k buněčné kultuře embryí japonských křepelek. Získaný kmen viru se zpracovává metodou maximálního zředění v buněčné kultuře embryí japonských křepelek. Jako výsledek těchto· pochodů získá kmen viru zřetelně cytopatickou účinnost, která dovolí kontrolovat proces výroby vakcíny, provést shromažďování dávek viru v optimálních lhútách, značně zjednodušit stanovení infekční účinnosti víru a kromě toho stanovit specifikací viru v buněčné kultuře a dokázati v krevním séru zvířat očkovaných vakcínou antitělíska. Získaný kmen viru se vyznačuje následujícími znaky:

1) specifičností při neutralizační reakci v buněčné kultuře ambry! japonských křepelek;

2) neškodností pro laboratorní zvířata: myši, morčata, králíky, slepičí embrya, jakož i norky a lišky;

3) infekční účinností v buněčné kultuře embryí japonských křepelek;

4) antigenní účinností;

5) imunogenní účinností při neutralizační reakci na zvířatech a v buněčných kulturách embryí japonských křepelek;

6) nepřítomností kontaminujících virů;

7) bakteriální sterilitou, nepřítomností mykoplasmat PPI O;

8) stabilitou při skladování;

9) není kontagiózní (nakažlivý).

Z uvedeného kmene viru, který má shora vypočítané znaky, se připraví očkovací vir na buněčné kultuře embryí japonských křepelek. Očkovací vir musí mít analogicky jako uvedený kmen všechny kvalitativní charakteristiky. Očkovací vir se uchovává ve zmrazeném stavu při teplotě maximálně —20 °C a používá se podle potřeby.

Pro výrobu vakcíny se používá kultura buněk tkáně embryí japonských křepelek, zpracovaná trypsinem. Za tímto účelem se tkáň 9 až 10 dní starých embryí japonských křepelek rozmělní a obvyklým způsobem zpracovává s trypsinem. Získaná buněčná suspenze se infikuje očkovacím virem a přidá se vhodné živné prostředí. Jako živné prostředí se mohou používat známá prostředí, která se používají pro kultivaci buněk a virů, například prostředí 199, které obsahuje 10 % hovězího krevního séra, při hodnotě pH 7,0 až 7,5. Infikovaná buněčná kultura se inkubuje za podmínek otáčení při teplotě 35 (+1) °C. Po vytvoření buněčné monovrstvy a důkazu cytopathické účinnosti u 20 až 40 %: buněk se provede první sběr tekutiny, obsahující vir.

Pro zvětšení sběrů viru a pro dokonalejší využití buněčné kultury se provádí vícenásobný sběr tekutiny, obsahující vir, u jednoho; a téhož vzorku kultury, tím, že se přidá čerstvé živné prostředí. Uvedené pochody se opakují až k úplné degeneraci buněčné kultury.

Pro odtažení vnitrobuněčného viru se buněčná kultura nechá zmrazit a roztát. Nashromážděné tekutiny, obsahující vir se po kontrole sterility a infekční aktivity spojí do jedné nádrže, přidá se stabilizátor, naplní se do lahví nebo ampulek a lyofilizuje. Usušený preparát má zbytkovou vlhkost až 3 %.

Doba, po kterou jsou lyofilizované preparáty vakcíny použitelné, činí minimálně jeden rok. Lyofilizovatelné vakcíny se uchovávají při teplotě maximálně 4 °C. Při uchovávání vakcín při nižší teplotě se doba, po kterou jsou vakcíny použitelné, prodlouží ještě o několik měsíců. Před použitím se pro zředěné vakcíny používá solný roztok, který se připraví na bázi Henksova roztoku.

Získaný preparát vakcíny se podrobí kontrole na stabilitu, neškodnost, specifičnost, nepřítomnost kontaminujících virů, infekční aktivitu, imunogenní a antigenní aktivitu a zbytkovou vlhkost.

Potom se může vakcína použít jak pro profylaktickou imunizaci srstnatých zvířat a psů, tak i pro terapeutické použití během prvních dnů po styku se zvířaty nemocnými psinkou. Průměrná dávka pro vakcínu zvířete musí obsahovati minimálně titr 10 TKID_5o (cytopathická tkáňová dávka). Zvýšení obsahu viru až na titr 1 000 000 TKID₅₀ nevyvolává žádné nežádoucí reakce u zvířat.

Imunizace zvířete se provádí intramuskulárním zavedením 1,0 ml vakcíny.

Pro zjištění spolehlivosti očkování vakcínou se může po 10 až 14 dnech provést serologické zjištění u imunizovaných zvířat a stanovití titr antitělísek neutralizační reakcí na buněčné kultuře embryí japonských křepelek, tím, že se jako antlgen použije uvedený kmen vakcíny, který vykazuje zřetelně výrazný cytopathlcký účinek.

Antitělíska byla prokázána u všech imunizovaných zvířat v titru 1 : 16 až 32. Maximální obohacení antitělísky (v titru 1 :

: 256) se objevuje již 30. den. Antitělíska se udrží v krvi po dobu 18 měsíců pozorování. U následujícího řešení nebyly u imunizovaných zvířat očkovaných virulentním kmenem Snyder Hill po 1, 3, 6, 12 a 18 měsících po iminizaci uvedenou vakcínou zjištěny žádné případy onemocnění. Tímto způsobem bylo zjištěno, že vakcína podle vynálezu má 100% imunogenní a antigenní účinnost.

Nabízená vakcína byla použita v chovu zvířat v okamžiku vypuknutí psinky mezi stříbrněčernými liškami. Měsíc po očkování vakcínou zanikl a v následujícím období nebylo onemocnění pozorováno. Vedle farmy pro chov lišek se nacházela farma pro chov norků. Vzhledem k vysoké kontagiózitě viru psinky psů a kožešinových zvířat byly registrovány jednotlivé případy onemocnění norků. Neprodlené zavedení vakcíny podle vynálezu zabránilo vypuknutí psinky mezi norky.

Tím svědčí získané výsledky o schopnosti vakcíny, která byla připravena z kmene EPM viru psinky psů a kožešinových zvířat, který je uložen pod číslem EPM 10—76, likvidovat v chovu zvířat počínající vypuknutí psinky během 3 až 6 týdnů.

Vakcína podle vynálezu se může použít i pro imunizaci zvířat metodou zavádění aerosolu.

K tomuto účelu se může použít vakcína připravená pro injekce, tj. obvyklé série prodejné vakcíny. Aerosolová metoda dovoluje imunizovat v krátké době velké množství zvířat.

Jako výsledek zkoušek nabízené vakcíny na zvířatech bylo během profylaxe zjištěno, že se prakticky ve 100 % případů tvoří antitělíska ve vysokém titru, která zvířata dokonale chrání před onemocněním psinkou. Kromě toho byla vakcína účinná i jako prostředek k likvidaci onemocnění stád.

Vakcína podle vynálezu je díky použití buněčné kultury embryí japonských křepelek jako substrátu laciná. Ve srovnání s jinými známými kulturami má uvedená kultura následující přednosti pro výrobu vakcíny. Hlavní předností substrátu je, že japonské křepelky jsou od přírody necitlivé vůči virům skupiny leukóz drůbeže a při infikování touto zůstávají rezistentní.

Jiná důležitá přednost buněčných kultur embryí japonských křepelek spočívá v tom, že má vysokou joroliferační účinnost, a že buněčná monovrstva se formuje první až druhý den po očkování buněk.

Další přednost uvedené buněčné kultury spočívá v tom, že suspenze buněk může být infiKOYÚná, To vede k dodatečnému zkrácení doby trvání technologického procesu výroby vakcína. Předností vynálezu je i vícenásobné sbírání tekutiny, obsahující vir až 5 sběrů u jednoho vzorku kultury.

S ohledem na skutečnost, že japonské křepelky jsou přístupné a nejsou drahé a držení farem chovu křepelek nepřináší žádné obtíže na nevyžaduje žádné velké náklady, je snadné pochopit komerční hodnotu nabízené vakcíny.

Pro ozřejmění vynálezu se uvádí příklady, z nichž příklad 1 se týká výroby kmene EPM viru spinky psů a kožešinových zvířat, uloženého pod číslem EPM 10—76, příklad 2 způsobu výroby vakcíny kultury živých virů a příklady 3 až 9 použití vakcíny na zvířatech.

Příklad 1

Výroba oslabeného, kmene EPM viru psinky psů a kožešinových zvířat, uloženého pod číslem EPM 10—76, z divokého virulentního kmene.

Do 10 zkumavek, které obsahují primární buněčnou kulturu psích ledvin se vnese po 0,2 ml defibrinované krve norků nemocných psinkou. Po tříhodinovém styku při teplotě místnosti se buněčná kultura promyje pečlivě živným prostředím 199, do každé zkumavky se zavede 1,5 ml živného prostředí 199 s 10 % hovězího krevního séra a buněčné kultury se inkubují při teplotě 37 °C.. Při tom se jedenkrát až dvakrát týdně mění živné prostředí. 62 dní po infikování se tekutina obsahující vir ze zkumavek shromáždí a k infikování se použije nová dávka buněčné kultury psích ledvin. K tomuto účelu se do každé z 10 zkumavek, které obsahují novou primární buněčnou kulturu psích ledvin vnese po 0,3 ml získané tekutiny, obsahující vir a po 1 ml živného prostředí 199 za přídavku 10 % hovězího krevního séra, a buněčné kultury se inkubují při teplotě 37 °C.

Pro prvních 10 pasážování slouží jako infekční látka tekutina, obsahující vir, nasbíraná 35 až 40 dní po infekci předchozí kultury. Pro dalších 23 pasážování se používá tekutina, obsahující vir, která byla nasbírána 15 až 20 dní po infekci, používá se také vir, který se získá z infikovaných buněk po jejich zmrazení a opětovném roztáni.

Potom se podle podobné metody infikování provede 12 pasážování viru v přeočkované kultuře buněk ledvin lidského embrya Rh při 32 °C. Látkou pro následující infikování je tekutina, obsahující vir, nasbíraná 15 až 20 dní po předchozím infikování.

Dále se oslabení viru provádí pasážováním na smíšené kultuře, která sestává ze 2 ml buněk psích ledvin a 2 ml buněk embryí japonských křepelek, při teplotě 35 °C. V takovéto smíšené kultuře byly provedeny tři pasážování viru, potom se vir pětkrát pasážuje buněčnou kulturou embryí japonských křepelek při 35 °C za podmínek otáčení 4 ot/min. Počínaje 5. pasážováním vyvolává vir pravidelně cytopathickou destrukci buněk, která byla prokázána po· 5 až 7 dnech po infikování. Takovýto vir byl zpracován jako vegetativně čistá linie metodou maximálního zředění v buněčné kultuře embryí japonských křepelek a využit jako kmen vakcíny. Získaný oslabený kmen virů psinky psů a kožešinových zvířat, který byl adaptován k buněčné kultuře japonských křepelek se kontroluje podle následujících znaků:

lj na specifičnost (identitu) při neutralizační reakci na buněčné kultuře embryí japonských křepelek;

2) na neškodnost (pro laboratorní zvířata: myši, embrya, morčata, králíky, jakož i norky a lišky);

3) na infekční aktivitu v buněčné kultuře embryí japonských křepelek;

4) na antigenní účinnost;

5) na imunogenní účinnost;

6) na nepřítomnost kontaminujících virů;

7) na bakteriální sterilitu, nepřítomnost mykoplasmy (PPIO);

8) na stabilitu preparátů při skladování;

9) na to, že není kontagiózní (nakažlivý).

Příklad 2

Příprava očkovacího viru vakcíny

a) Příprava očkovacího viru. Z kmene EPM, uloženého pod číslem EPM 10—76, získaného· podle příkladu 1, se vyrobí očkovací vir. Za tímto účelem se použití 9 až 11 dní stará embrya japonských křepelek, které byly přineseny z kontrolovatelné speciální farmy pro chov křepelek. 100 embryí se zpracuje obvyklým způsobem trypsinem a získá se 3 300 000 000 buněk, které se suspendují ve 4,120 litrech živného prostředí 199 za přídavku 10 % hovězího krevního séra a 100 mg/ml monomyzinu. 300 ml buněčné suspenze se rozplní po 150 ml do dvou lahví o obsahu 1 litr a ponechá ke kontrole.

Do druhé části buněčné suspenze se vnese 10 ml kultivační tekutiny, která obsahuje kmen vakcíny EPM, utočený pod číslem EPM 10—76 a rozplní se po 150 ml do lahví o obsahu 1 litr. Všechny láhve se inkubují při teplotě 35 °C za otáčení. 3 dny po očkování a infikování buněk se oddělí živné prostředí a do lahví se vnese čerstvé živné prostředí 199 a 100 mg/ml monomycinu. 6 dní po infikování buněk se při důkazu ložiska cytopathické aktivity viru sebere tekutina, obsahující vir z lahví, odeberou se vzorky pro odpovídající kontroly a do lahví se vnese čerstvé živné prostředí 199. Následující sběry tekutiny, obsahující vir se provádějí vícekráte tak dlouho, dokud se uchová 50 % buněk. V posledním stupni se vnese 70 ml čerstvého živného prostředí 199, buněčná kultura se nechá zmrazit v suchém ledu a pro odtažení intracelulárního viru odtát. Ve všech stupních přípravy očkovacího viru se odebírají kontrolní vzorky. Očkovací vir se musí kontrolovat podle následujících znaků: na specifičnost, neškodnost, infekční aktivitu, antigenitu, imunogenitu, na nepřítomnost kontaminujících virů, sterilitu, na to zda není kontagiózní (nakažlivý).

Očkovací vir, odpovídající uvedeným kontrolním požadavkům se uchovává ve zmrazeném stavu při teplotě maximálně —20 °C.

b) Výroba vakcíny. K této se používají 9 až 11 dní stará embrya japonských křepelek, která byla přinesena z kontrolovatelné speciální farmy pro chov křepelek. 200 embryí se zpracuje obvyklým způsobem s trypsinem a získá se 6 600 000 000 buněk, které se suspendují v 8,250 litrech živného prostředí 199 za přídavku 10 % hovězího krevního séra a 100 mg/ml monomycinu. 750 ml buněčné suspenze se rozplní po· 150 mililitrech do 5 lahví o obsahu 1 litr a ponechá ke kontrole. Do druhé části buněčné suspenze se vnese 10 ml kultivační tekutiny, která obsahuje očkovací vir kmene EPM 10—76, získaný způsobem, uvedeným sub aj a nyní se přeplní po 150 ml do lahví o obsahu 1 litr. Všechny lahve se inkubují při otáčení při teplotě 35 °C. 3 dny po očkování a infikování buněk se živné prostředí odstraní a do lahví se vnese čerstvé živné prostředí 199 a 100 mg/ml monomycinu. 6 dní po infikování buněčné suspenze se při důkazu ložiska cytopathické aktivity viru ve 30 % buněk tekutina, obsahující vir v láhvi, sebere, odeberou se vzorky pro odpovídající kontroly a do lahví se vnese čerstvé živné prostředí 199. Následující sběry tekutiny, obsahující vir se provádí vícekrát tak dlouho, dokud se uchová 50 % buněk; vnese se 70 ml živného prostředí 199. Buněčná kultura se nechá zmrazit v suchém ledu a pro odtažení intracelulárního viru odtát.

Všechny sterilní sběry, obsahující vir, se spojí v jedné nádrži, přidá se stabilizátor, který sestává z 5 % sorbitu a 1,5 % želatiny, vakcína se rozplní do ampulek nebo lahví a lyofilizuje.

Tato dávka představuje sérii vakcín. Získaná vakcína se může naplniti do lahví nebo ampulek různého obsahu od 1 ml až do 33 ml a v jedné láhvi nebo ampulce může být podle přání spotřebitele obsažena 1 až 500 dávek.

Ve všech stupních výroby vakcíny se odebírají kontrolní vzorky. Vakcína musí být kontrolována podle následujících znaků: na specifičnost, neškodnost, infekční aktivitu, antigenní a imunogenní aktivitu, na nepřítomnost kontaminujících virů, sterilitu a na to zda není kontagiózní (nakažlivá).

Série vakcíny odpovídající uvedeným kon218120 trolním požadavkům se může používat k imunizaci zvířat. V daném příkladě je obsaženo v jedné sérii 360 000 dávek vakcíny.

P ř í k 1 a d 3

Zkoušení vakcíny na neškodnost

Vakcína byla v dávce 1 ml, která obsahovala 100 TKIP₅₀ viru, použita po předchozím zředění Henksovým roztokem. Vakcína byla zavedena intramuskulárně. Vakcínou bylo očkováno 24 mláďat norka a 12 mláďat lišky. Pro kontrolu byl použito' ještě 16 mláďat norka a 8 mláďat lišky. Zvířata očkovaná vakcínou byla pozorována denně po dobu 28 dní. Všechna zvířata zůstala klinicky zdravá. Nebyly prokázány žádné patologické reakce — odmítání potravy, sklíčenost, poruchy trávení. Zvířata, která se nacházela ve styku se zvířaty, očkovanými vakcínou, neonemocněla psinkou.

Příklad 4

Zkoušení vakcíny na antigenitu

Zvířatům, která byla očkována dávkou preparátu podle příkladu 3, byly po 10 až 14 dnech odebrány vzorky krve a byl zjišťován titr antitělísek neutralizační reakcí na buněčné kultuře embryí japonských křepelek, tím, že se jako antigen použil kmen vakcíny EPM psinky psů a kožešinových zvířat, uložený pod číslem EPM 10—76. Antitělíska byla u všech zvířat zjištěna v titru v poměru 1 : 16 až 32.

Maximální obohacení titru (v titru 1: 256] byla zjištěna, již 30. den. Antitělíska se uchovala po dobu 18 měsíců pozorování. Příklad 5

Zkoušení vakcíny ná ímunogenitu a dobu trvání imunity aj 24 mláďat norka a 12 mláďat lišky bylo očkováno intramuskulárně vždy 1 ml zředěné vakcíny, která obsahovala 100 TKID₅₍) viru. Pro kontrolu bylo vzato 16 mláďat norka a 8 mláďat lišky. Po třiceti dnech bylo zjišťováno infikování zvířat očkovaných vakcínou a kontrolních zvířat infikovaných virulentním virem (Snyder Hill pro norky a Gaujasski pro lišky j.

Zvířata byla denně pozorována. Kontrolní zvířata (tj. zvířata neočkovaná vakcínou) zašla na psinku a u zvířat očkovaných vakcínou nebyly prokázány žádné reakce na zavedení virulentního' viru psinky. Během celé doby pozorování — (21 dní po infikování) zůstala pozorovaná zvířata klinicky zdravá.

bj 1 rok a 1,5 roku po očkování vakcínou byla zvířata opět infikována virulentním virem Snyder Hill a Gaujasski. Žádné zvíře očkované vakcínou neonemocnělo psinkou a všechna zůstala živá.

Příklad 6

Zkoušení vakcíny za polních podmínek.

Během letního očkování vakcínou za účelem.profylaxe, v 15 farmách pro chov zvířat bylo očkováno 1 400 000 lišek, 45 500 modrých lišek, 25 000 sobolů, 300 000 norků a 255 psů. Žádné zvíře neonemocnělo psinkou, nedbajíc na to, že v krajinách, kde se nacházely farmy pro chov zvířat byla pozorována vypuknutí onemocnění psinkou.

Příklad 7

Zkoušení vakcíny v ložisku psinky psů a kožešinových zvířat

V chovu zvířat, kde byly registrovány četné případy onemocnění psinkou psů a kožešinových zvířat mezi stříbrněčernými mláďaty lišek (potvrzeno laboratorními analýzami), dosáhla úmrtnost zvířat (mláďat) až 120 za den. Všechna zvířata byla očkována vakcínou. Po- dvou měsících se snížila úmrtnost mláďat lišky o dvojnásobek a po dalším měsíci ustala vůbec.

Na farmách pro chov norků v přímé blízkosti farmy pro chov lišek, byly registrovány jednotlivé případy onemocnění psinkou. Po zvláštním očkování všech norků vakcínou bylo vypuknutí psinky na farmě zažehnáno.

P ř í k 1 a d 8

Zkoušení nabízeného preparátu ve srovnání se známými vakcínami

V chovu zvířat na farmě pro chov norků s četnými případy psinky kožešinových zvířat mezí mláďaty, bylo Imunizováno, celé stádo zvířat známými vakcínami KF (SSSR). Po očkování vakcínou se nesnížila úmrtnost zvířat a dosáhla 180 mláďat za den. V souvislosti s tím byla neodkladně provedena imunizace 14 612 zvířat nabízenou vakcíno a 15 580 zvířat známou vakcínou ASL (USA). Po imunizaci uvedenými vakcinacemi se značně snížila úmrtnost mláďat a po dvou měsících bylo vypuknutí onemocnění psinkou likvidováno. Tímto způsobem bylo prokázáno, že vakcína podle vynálezu nezaostává nikterak v účinnosti za známou vakcínou ASL.

Příklad 9

Zkoušení vakcíny při aerosolové metodě zavádění

Pro zavádění aerosolu byla použita vakcína, která byla vyrobena podobně jako vak218120 cína, která je určena pro Intramuskulární zavádění. Aerosolovou metodou bylo imunizováno 300 mláďat norka ve stáří 45 až 60 dní. Expozice rozprášení vakcíny byla provedena tak, že jedna skupina norků dostala obvyklou dávku a druhá skupina tři obvyklé dávky; pod pojmem „obvyklá dávka“ se rozumí dávka, používaná pro intramuskulární zavádění. Antitělíska psinky psů a kožešinových zvířat v krevním séru imunizovaných zvířat byla určována neutralizační reakcí na buněčné kultuře embryí japonských křepelek tím, že se jako antigen použil kmen vakcíny EPM 10—76. Ve skupině norků, která dostala jednu dávku vakcíny, byla dokázána antitělíska ve zředění 1 : 8, v jiné skupině norků, kteří dostali tři dávky, byla zjištěna antitělíska ve zředění 1 : 32.

Nebyl prokázán žádný podstatný rozdíl ve velikosti titru antitělísek neutralizujících vir, u zvířat, která byla imunizována aerosolovou metodou a intramuskulárně (podle příkladu 4).

Pro zkoušení imunity zvířat ošetřených vakcínou pomocí aerosolové metody byla využita metoda infikování virulentním kmenem Snyder Hill. Po infikování uvedeným virulentním virem nebylo u zvířat, u nichž byla použita pro vakcinaci aerosolová metoda, pozorováno žádné onemocnění zvířete.

Jak lze seznati z příkladu 9, je nabízená vakcína, která byla vyrobena z kmene EPM viru psinky psů a kožešinových zvířat, uložena pod číslem 10—76, vyrobená pro injekce, účinná i při aerosolové imunizaci.

Další údaje o vakcíně podle vynálezu lze seznati z dále uvedené tabulky 1 a 2.

Stabilita několika genetických znaků

Stupeň pasážování vakcíny kmene virů psinky:

množství zavedeného viru (TKID_5o/l,O mlj:

počet zvířat očkovaných vakcínou: norků:

polárních lišek: reakce zvířat na vakcínu: tělesná teplota:

norků:

polárních lišek:

katarální onemocnění sliznic (očí, nosu, žaludečně-střevního traktu) aktivita antigenu:

norků:

polárních lišek:

Tabulka 1 kmene viru psinky psů

1	10
10 000	10 000
25	25
25	25
39,5—40,0	39,5—40,0
39,0—39,5	39,0—39,5
OTC*	OTC*
1 : 63	1 : 43
1 : 74	1: 71

Poznámka:

*OTC — nepřítomnost klinických znaků průběhu 30 dnů po očkování

Závěr:

Výsledky provedených pokusů svědčí o v tom, že reaktogenní a antigenní vlastnosti viru psinky se nemění v závislosti na stupni pasážování (1 až 10 pasáží).

Tabulka 2

Účinek množství kmene viru psinky zavedeného zvířatům na objevení se reaktogenních a antigenních vlastností vakcíny Množství viru v TKID_so/l,O ml

zavedené 1 zvířeti:	10	50	100
počet zvířat očkovaných vakcínou: norků:	15	15	15
polárních lišek:	15	15	15
reakce zvířat na očkování vakcínou: tělesná teplota: norků:	39,5—40,0	39,5—40,0	39,5—40,0
polárních lišek:	39,0—39,5	39,0—39,5	39,0—39,5
katarální onemocnění sliznic (očí, nosu, žaludečně-střevního traktu J	OTC*	OTC*	OTC*
aktivita antigenu: norků:	1 : 16	1 : 45	1: 54
polárních lišek:	1 : 27	1 : 60	1 : 77
počet onemocnělých zvířat po zavedení virulentního viru**: norků:	0	0	0
polárních lišek:	0	0	0

Poznámka:

OTC* = nepřítomnost klinických znaků v průběhu 30 dní po očkování zvířat vakcínou ** = virulentní vir psinky, který byl zaveden po 21 až 22 dnech po očkování vakcínou (pro polární lišky kmen Gaujaskij, pro norky kmen Spyder Hill).

Závěr:

Údaje uvedené v tabulce 2 ukazují, že reakce na vakcínu u očkovaných norků a polárních lišek se v průběhu 30 dnů po očkování vakcínou nedostaví a to nezávisle na množství zavedeného kmene viru. Všechna zvířata očkovaná vakcínou se po 21 až 22 dnech po očkování vakcínou nakazila virulentním kmenem viru psinky (norci kmenem Snyder Hill, polární lišky kmenem Gaujaskij). Zvířata, která byla očkována kmenem vakcíny v dávce 10 až 100 TKD₅₀ neonemocněla a zůstala naživu. Kontrolní zvířata onemocněla a uhynula za objevení se známek psinky.

Claims (3)

1. Živá vakcína kultury virů proti psince psů a kožešinových zvířat, v lyofilizovaném stavu, vyznačující se tím, že obsahuje v 1 ml 10² až 10⁴ TKID₅₀ virů psinky psů, kmene EKM 10—76, který je uložen ve vědeckém Všeobecném unijním ústavu pro zkoušení veterinárních preparátů ASSCJVP.

2. Způsob výroby vakcíny podle bodu 1, vyznačující se tím, že se kmen virů psinky EKM 10—76, deponovaný v ASSCJVP, kultivuje na buněčné kultuře fibroplastů embryí japonských křepelek na Parkerově živné půdě hovězího séra, obsahující 10 % zdroVYNÁLEZU jů uhlíku, aminokyselin a minerálních solí, při hodnotě pH 7,0 až 7,5 a při kultivační teplotě 34 až 36 °C, přičemž se první odběr kultivační kapaliny, obsahující vir provádí při dosažení cytopatického efektu ve 20 až 40 % infikovaných buněk kultury embryí japonských křepelek a následující odběry se provádí tak dlouho pokud nezbyde méně než 50 °/o živých buněk.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že lyofilizace kapaliny, obsahující vir se provádí v přítomnosti 4,5 až 5,5 %i hmot.

sorbitu a 1,4 až 1,6 % hmot. želatiny.