SE421748B - Valpsjukevaccin och forfarande for dess framstellning - Google Patents

Description

a 8008185-4 2 tid vara kontaminerade med främmande vírus. För att förhindra att hundarna blir infekterade måste man ha en speciell djuruppföd- ningsanstalt, där djuren uppfödes under strängt kontrollerade be- tingelser, vilket emellertid medför stora investeringskostnader. Ännu en nackdel med dessa kända vacciner är att deras biolo- giska aktivitet är svår att bestämma, eftersom man vid virusrep- roduktionen får en oklart markerad cytopatogen verkan, som visar sig på den 20-nde dagen efter infektionen, då icke-specifika de- generativa celländringar kan uppkomma, vilka gör uppskattningen av resultaten svårare.

En ytterligare nackdel med dessa kända, på cellkultur från hundnjurar beredda vacciner är en långsam tillväxt av nämnda cel- ler (ett s.k. monoskikt av celler bildas först på den femte-sjunde dagen, vilket ökar processtiden för framställning av vaccinet).

Virusvaccíner, vilka är avsedda för att bekämpa valpsjuka hos köttätande djur och beretts genom odling av en virusstam på en cellkultur från-hönsembryon med en ålder av 9 dagar eller på korionallantoishinnor från hönsembryon, kan vara farliga till följd av att dessa hönsembryon är mycket kontaminerade med främ- mande virus, speciellt till leukos- och sarkomatosgruppen hörande virus (jämför exempelvis de amerikanska patentskrifterna 2 912 361 Och 2 965 51414).

Nämnda nackdel är också typisk för ett vaccin, som beretts i en cellkultur från hönsembryon, av en under namnet KF-668 (USSR) känd stam.

I Det amerikanska, under namnet ASL kända vaccinet är icke skadligt och är fritt fårn nämnda nackdel, eftersom det beredes i en cellkultur från leukosfria hönsembryon. För att kunna upp- föda leukosfria höns måste man ha tillgång till speciella uppföd- ningsanläggningar, vilka är svåra och dyrbara att åstadkomma och underhålla. Vaccinstammen av viruset ger heller icke likformig cytopatisk verkan i cellkulturen från hönsembryon, vilket gör processtekniken för framställning av vaccinet komplicerad.

Känt är vidare ett virusvaccin mot valpsjukevirus, som be- retts genom att ett valpsjuka hos köttätande djur framkallande virus odlats på en cellkultur från gröna markattor (jämför exempel- vis den amerikanska patentskriften 4 OOÄ 97Ä). Detta vaccin är tämligen immunogent, icke-reaktogent, högt standardiserat och icke skadligt . 8008185-4 3 Tillståndsgivningen för infângande av apor (eller markattor) har i många länder blivit begränsad på grund av det stadigt mins- kande antalet apor och markattor. Dessutom är nyssnämnda kända vaccin baserat på utnyttjandet av avfallsprcdukter från produktio- nen av ett poliovaccin, som är avsett för människa, varför produk- tionen av det kända valpsjukevaccinet är direkt knuten till pro- duktionen av poliovaccinet. En därvid erforderlig separat avdel- ning för produktion av valpsjukevaccinet, som är baserat på cell- kulturen från ap- eller markattenjurar, är dyrbar och icke räntabel.

Valet av cellsubstrat för framställning av virusvaccinet är således komplicerat. Det nödvändiga villkoret är att cellsubstra- tet icke får vara kontaminerat med främmande virus och att man skall kunna framställa vaccinviruset i tillräckliga mängder.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett vaccin mot valpsjuka hos köttätande djur, som är höggradigt immu- nogent, antigent, icke är skadligt och är fritt från främmande vi- rus, samtidigt som det är billigt att framställa.

Ett annat syfte med uppfinningen är att åstadkomma ett för- farande för framställning av det föreslagna vaccinet under använd- ning av en ny stam av valpsjukevirus, vilken stam kan odlas på ett ofarligt och lättåtkomligt substrat, vilket förfarande gör det möjligt att framställa vaccinet, som är mycket immunogent, antigent, icke är skadligt och är fritt från främmande virus.

Detta uppnås enligt uppfinningen medelst ett levande virus- vaccin mot valpsjuka, vilket vaccin innehåller en försvagad stam EPM av det valpsjuka framkallande viruset. Denna stam (quail embryo Moscow) är deponerad dels hos nedan angivna sovjetiska in- stitut under nummer 10-76, dels hos Institut Pasteur, Frankrike (27 februari 1980), under registreringsnummer 1-129; och denna virusstam har framställts av ett vildtypsvirus, som isolerats från blodet hos en i valpsjuka insjuknad mink, genom flerdubbelt upp- repade passager successivt på följande cellkulturer: 1) på en cellkultur från hundnjurar, 2) på en omympad cellkultur Rh från njurar av människoembryon, 3) på en blandad cellkultur, som består av celler från hundnjurar och celler från embryon av japanska vaktlar, vilken stam är adapterad till cellkulturen från embryon av japanska vaktlar och odlad på denna kultur.

Nämnda syfte uppnås dessutom medelst ett förfarande för fram- ställning av det levande vírusvaccinet mot valpsjuka hos köttätan- 8008185-4 H de djur, vilket förfarande omfattar dels odling - på en cellkultur från embryon av.japanska vaktlar i ett lämpligt näringsmedium - av den försvagade stammen EPM av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset, vilken stam såsom ovan omnämnts är depone- rad under numret 10-76 i Sovjet och under numret 1-129 i Frankrike (Inst. Pasteur) och är framställd av ett víldtypsvirus, som isole- rats från blodet hos en i valpsjuka insjuknad mink, genom fler- dubbelt upprepade passager successivt på följande cellkulturer: 1) på en cellkultur från hundnjurar, 2) på en omympad cellkultur från njurar från människoembryon Rh, 3) på en blandad cellkultur bestående av celler från hundnjurar och celler av embryon från japanska vaktlar, med efterföljande adaptering till cellkulturen från embryon av japanska vaktlar, dels uppsamling av en virushaltig vätska och dels frystorkning av den virushaltiga vätskan i närvaro av ett lämpligt stabiliseringsmedel.

Nämnda försvagade virusstam, som användes för beredning av valpsjukevaccinem har benämnts EPM av virus som framkallar valp- sjuka hos köttätande djur. EPM är en förkortning för "embryot av vaktel, Moskva" på ryska. _ Denna stam är en nyframställd vaccinstam, lagras i "Vseso- juznom Gosudarstvennom nautchno-kontroljnom institute veterinarnykh preparator Ministerstva Seljskogo Khozjajstva SSR" och är såsom ovan nämnts deponerad under numret 10-76 i Sovjet och under numret 1-129 i Frankrike (Inst. Pasteur).

Den under numret 10-76 resp. 1-129 dcponoradu utammun EPM av virus som framkallar valpsjuka hos köttätande djur är framställd av ett vildtypsvirus, som isolerats från blodet hos en i valpsjuka insjuknad mink. Framställningen har skett genomêü-H0 passager på en cellkultur från hundnjurar vid en temperatur av 37 1 100, där- efter 5-15 passager på en cellkultur från njurar av människoembry- on Rh vid en temperatur av 32 É 1oC och 2-7 passager på en blandad cellkultur bestående av celler från hundnjurar och celler av em- bryon av japanska vaktlar vid en temperatur av 35 É 1°C, med ef- terföljande adaptering under H-10 passager på en cellkultur från embryon av japanska vaktlar (Coturnix coturnix japonica).

I och för beredning av vaccinet odlas nämnda stam på cell- kulturen av embryon av japanska vaktlar i ett lämpligt näríngsme- dium, exempelvis ett medium 199 eller ett Earle-medium, med en tillsats av 10% blodserum från storboskap. Den första skörden av den virushaltiga vätskan tas efter uppkomst av virusets cytopatiska 8008185-4 f; verkan i20~HO% av cellerna. Den hopsamlade virushaltiga vätskan frystorkas i närvaro av ett lämpligt stabiliseringsmedel, exempel- vislnë-5,5% sorbitol och 1,H-i,6% gelatos. Med "gelatoo" avses den produkt, som erhålles genom hydrolys av gelatin (product of gelation hydrolysis).

Den under nr10-76 i Sovjet och under numret 1-129 i Frankrike (Inst. Pasteur) deponerade vaccinstammen EPM av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset är höggradigt försvagad och förökar sig mycket väl i cellkulturen från embryon av japanska vaktlar, med klart utpräglad verkan, vilket gör framställningen av vaccinet avsevärt enklare. Nämnda stam är lagringsbeständig.

Det enligt uppfinningen föreslagna vaccinet uppvisar följande fördelar: a) vaccinet är icke skadligt, uppvisar icke någon toxisk verkan och framställes i cellkultur från embryon av japanska vakt- lar, som är ett billigt och lätt åtkomligt råmaterial, som pålit- ligt kan kontrolleras beträffande frånvaron av främmande virus; Japanska vaktlar är till sin natur icke mottagliga för virus tillhörande leukos- och sarkomatosgruppen, varför cellkulturen från embryon av japanska vaktlar utgör ett optimalt substrat för framställning av virusvaccinet; b) cellkulturen från embryon av japanska vuktlar uppvisar hög proliferativ aktivitet, varför man kan infektera cellsuspen- sionen utan att invänta bildningen av ett monoskikt av celler; c) vaccinet uppvisar hög antigen aktivitet och inducerar hon vaccinerade djur en stark och långvarig immunitet, varvid an- vändningen av vaccinet i valpnjuknepinnntínmrådnn för köttätnnde djur snabbt eliminerar infekticnshärden; d) vaccinet kan användas icke endast parenteralt utan även i form av aerosol, vilket gör vaccinprofylaxen avsevärt lättare och billigare; e) genom att vaccinet är högaktivt kan man marknadsföra preparat med mycket varierande antal doser (1-500) i ampuller el- ler flaskor, vilket är mycket bekvämt vid individuell användning eller massanvändning av vaccinet.

Dessa och andra fördelar framgår av följande närmare beskriv- ning av vaccinet, förfarandet för dess framställning och dess an- vändning.

Förfarandrt för bnvvdning av det levande virunvnccinet är baserat på ett n.k. ympvirusuyntnm, vid vilket man dels bereder 8008185-4 6 en stor mängd vaccínvirus, som uppfyller alla de krav, som ställes på den försvagade stammen, dels lagrar vaccinviruset i fruset till- stånd och dels använder detsamma, då det blir nödvändigt, för fram- ställning av vaccinet.

För att bereda vaccinet för att bekämpa valpsjuka hos kött- ätande djur använder man, såsom påpekats ovan, den försvagade, under nr 10-76 i Sovjet och under nr 1-129 i Frankrike (Inst. Pasteur) deponerade stammen EPM; den kallas i det följande "stam 1-129".

Stammen 1-129 har framställts av ett virulent vildtypsvirus, som framkallar valpsjuka hos köttätande djur och som isolerats från blodet hos en mink som varit sjuk i valpsjuka. Vildtypsviru- set försvagas genom flerdubbelt upprepade passager på olika cell- kulturer i följande ordningsföljd: I 1) på en cellkultur från hundnjurar; 20-H0 passager vid en temperatur av 37 É 1°C, 2) på en omympad cellkultur från njurar av människoembryon Rh; 5-15 passager vid en temperatur av 32 É 100 och 3) på en blandad cellkultur, som består av celler från hund- njurar och celler frân embryon av japanska vaktlar; 2-7 passager vid en temperatur av 35 É 1°C.

Sedan försvagningsprocessen avslutats, adapteras viruset under 4-10 passager till cellkulturen från embryon av japanska vaktlar. Den erhållna virusstammen klonas enligt en metod för s.k. gränsutspädning i cellkultur från embryon av japanska vakt- lar. Genom denna behandling får virusstammen en klart markerad cytopatisk aktivitet, som gör det möjligt att kontrollera vaccin- beredningen, samla virusskörden under optimala tidsperioder, i hög grad förenkla bestämningen av virusets infektionsaktivitet, be- stämma virusets specificitet i oellkulturen samt upptäcka anti- kroppar i blodserumet från vaccinerade djur. Den erhållna virus- stammen uppvisar följande egenskaper: 1) specificitet i neutraliseringsreaktion i ccllkultur från embryon av japanska vaktlar; 2) oskadlighet för laboratoriedjur, dvs. möss, marsvin, kaniner, hönsembryon samt minkar och blårävar; 3) infektionsaktivitet i cellkultur från embryon av japans- ka vaktlar;_ U) antigen aktivitet; 5) immunogen aktivitet (i neutralíseringsreaktion på djur och i cellkultur från embryon av japanska vaktlar); 6) frånvaro av kontaminerande virus (virusföroreningar); 8008185-4 7 7) bakteriell sterilitet, frånvaro av mykoplasma PPIO; 8) lagringsstabilitet; 9) är icke smittsam.

Av denna virusstam med samtliga dessa egenskaper beredes ett ympvirus på cellkultur frånemmryma av japanska vaktlar. Ymp- virusets alla kvalitetsegenskaper måste vara identiska med nämnda stams kvalitetsegenskaper. Ympviruset lagras i fruset tillstånd vid en temperatur av högst -EOOC och användes då det blir nödvän- digt .

För att framställa vaccinet användes en trypsinerad vävnade- cellkultur från embryon av japanska vaktlar, för vilket ändamål väv- naden från 9-10 dygn gamla embryon av japanska vaktlar finfördelas och trypsineras enligt den allmänt kända metoden. Den erhållna cellsuspensionen smittas med ympviruset och försattes med ett lämp- ligt näringsmedium. Detta kan utgöras av något av de kända medier- na som användes för odling av celler och virus, exempelvis ett medium 199 innehållande 10% serum från storboskap. pH är T- Den infekterade cellkulturen ïnkuberas i en (langsamt) roterande anordning vid 35 É 100. Rotationshastigheten kan t.ex. vara 2ü-25 varv/timme. Sedan ett monoskikt av celler bildats och vi- '- r 1 J» 3 rusets cytopatiska verkan uppkommit nosür-üO% av cellerna, uppsam- las (tjllvarntnu) den virunhaltign vätskan för första gângrn. I och för ökning av mängden nppunmlnt vivur och tüttrr utnyttjande av cellkulturrn tillvaratan den víruuhaltïga vätskan från ett mvh samma prov av kulturen många upprepade gånger samtidigt som färskt näringsmedium tillsättes. Dessa operationer upprepas tills kul- turcellerna helt degenererats.

För att man skall kunna extrahera det intracellulära viruset får cellkulturen frysas och upptinas. Den samlade virushaltiga vätskan ihälles - sedan kon kontrollerats med hänsyn till sterili- tet och infektionsaktivitet - i en enda behållare, försattes med ett stabiliseringsmedel, ihälles i flaskor eller ampuller och frys- torkas. Det torkade preparatet har en restfukthalt av högst 5 viktprocent.

Det frystorkade vaccinpreparatets livslängd är minst ett år.

Det frystorkade vaccinet lagras vid en temperatur av högst H00.

Ifall vacrinrt lagras vid en lägre temperatur, blir dess livslängd .filmn ufilqrn lllän-'uh-r lfinpfirv. I~l.'í|- man vill :|nv.'ín-J:| v:1f'f-Ir|--t, ul.- ngaäflui- :null «i:d, L-,adt:n1«: v:1r<-irl--I nu--1 --ri [15 lh-|»k;;- lF3n11i|1r3~:| t-:1u|:rv1d saltlösning. 8008185-4 8 Det framställda vaccinpreparatet kontrolleras med hänsyn till sterilitet, oskadlighet, specificitet, frånvaro av kontaminerande virus, infektionsaktivitet, immunogen och antigen aktivitet och restfukthalten, varefter vaccinet kan användas för profylaktisk immunisering av pälsdjur och hundar samt för terapeutiskt bruk under de första dagarna efter kontakt med ett köttätande djur, som är sjukt i valpsjuka. En enda medeldos för vaccinering av djuren måste innehålla minst 10 cytopatiska vävnadsdoser (CVDSO). En ök- ning av virushalten till 100 000 CVD50 orsakar icke några icke- önskvärda bireaktioner hos djuren.

Djuren immuniseras genom intramuskulär injicering av 1 ml vaccin.

För att pålitligt kunna vaccinera djuren kan man efter 10-lä dagar genomföra serologiska undersökningar av de immuniserade dju- ren och bestämma titern av antikroppar i neutraliseringsreaktionen på cellkultur från embryon av japanska vaktlar genom att man som antigen använder nämnda vaccinstam, som ger en utpräglad cytopa- tisk effekt. Antikropparna uppträder i alla de immuniserade dju- ren i en titer av 1:16 till 1:32. Största möjliga mängd antikrop- par (i en titer av 1:256) ansamlas redan på den 50-de dagen. Anti- kropparna finns kvar i blodet under en observationstid av 18 måna- der. Vid efterföljande behandling av de immuniserade djuren med en virulent stam Styder Hill efter 1, 3, 6, 12 och 18 månader ef- ter immuniseringen medelst nämnda vaccin upptäcktes icke_uppkomst av några sjukdomsfall. Det enligt uppfinningen föreslagna vaccinet uppvisar således 100-procentig immunogen och antigen aktivitet.

Vaccinet enligt uppfinningen har använts inom pälsdjursavel vid en tidpunkt, då valpsjuka utbrutit bland silverrävar. Efter en månad efter vaccineringen upphörde valpsjukan, och den upptäck- tes icke heller under den efterföljande tidsperioden. I närheten av rävfarmen fanns en minkfarm. På grund av att valpsjuka hos köttätande djur är mycket smittsam upptäcktes i enstaka fall sjuk- domen även hos minkarna. Omedelbar injicering av vaccinet enligt uppfinningen förebyggde ett regelrätt utbrott av valpsjuka bland minkarna.

De erhållna resultaten vittnar således om att vaccinet, som l'r-:urx:zi'..'.il'l 1.:: av :ztznu l-1;'_O :lv dx-l. valpujuku hm: kïittåitarvlc» djur' framkallande viruset, kan inom 5-N veckor eliminera valpujukan på en pälsdjursfarm, där denna sjukdom brutit ut. 8008185-4 O Vaccinet enligt uppfinningen kan dessutom användas för immu- nisering av djur genom ett s.k. aerosolinjiceringsförfarande.

I detta syfte använde man ett för injicering avsett vaccin, dvs. konventionella serier av vacciner. Aeroselmetoden gör det möjligt att inom kort tid immunisera ett stort antal djur.

Genom provning av vaccinet enligt uppfinningen på djur har man under profylaxtiden upptäckt, att i praktiskt taget 100% av fallen bildas antikroppar i en hög titer, vilka helt förhindrar att djuren blir smittade av valpsjuka. Vaccinet var dessutom effektivt som bekämpningsmedel för eliminering av smitthärden.

Vaccinet enligt uppfinningen är förhållandevis billigt att framställa genom att man som substrat använder eellkulturen från embryon av japanska vaktlar. Vad avser vaccinframställningen har denna cellkultur följande fördelar framför de andra kända kultu- rerna: En viktig fördel med substratet är att japanska vaktlar till sin natur icke är mottagliga för virus tillhörande fâgelleukos- gruppen och är resistenta, då de infekteras.

En annan viktig fördel med cellkulturen från japanska vakt- lar är att denna har hög proliferativ aktivitet och att monoskiktet av celler bildas under det första eller andra dygnet efter cell- ympningen.

En ytterligare fördel med nämnda cellkultur är att man kan infektera en cellsuspension, vilket resulterar i en extra minsk- ning avprocenstcgen för framställning av vaccinet. Ännu en fördel med uppfinningen är att man kan företa en flerdubbelt upprepad uppsamlíng av den virushaltiga vätskan, exem- pelvis upp till 5 uppsamlingar från ett_enda kulturprov.

Om hänsyn tages till att japanska vaktlar är lättåtkomliga och billiga, medan vaktelfarmernas underhåll icke är konmlicerat och icke erfordrar avsevärda investeringskostnader, blir det lätt förståeligt, att vaccinet enligt uppfinningen är kommersiellt vär- defullt.

Uppfinningen belyses nedan medelst följande utföringsexem~ pel, varvid exempel 1 åskådliggör framställningen av stammen 1-129 av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset, exempel ,' llf- lf/:zf~1' F¿31*I':|1~::r|<|--! I'iï|- I'z~'|n.. I FSI 1 rlï Int" :-v -I:-1. *l--'1:1r1-if- vf1-~'- ïrif-I. uvh wxvmprl 3-U Jifnr Jnvïndninpfn dv vn~~inrï på djur. n 8008185-4 10 Exempel 1. Framställning av den försvagade stammen 1-129 av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset, utgåen- de från virulent vlldtypsvirus.

I vart och ett av 10 provrör fyllda med en primürcwllkultur från hundnjurar införes 0,2 ml defibríniserad blod från en mínk, som är sjuk i valpsjuka. Efter en kontakttid av 3 timmar vid rums- temperatur tvättas cellkulturen omsorgsfullt med näringsmedium 199.

I varje provrör införes 1,5 ml färskt näringsmedium 199 med 10% blodserum från storboskap, varefter cellkulturerna inkuberas vid en temperatur av 5700. Näringsmediet bytes ut 1-3 gånger per ves- ka. Efter en tid av 62 dygn efter infekteringen uppsamlar man ur provrören en virushaltig vätska, som användes för infektering av en ny portion cellkultur från hundnjurar, för vilket ändamål man i vart och ett av tio provrör, fyllda med en ny primärcellkultur från hundnjurar, inför 0,3 ml av den erhållna vírushaltiga vätskan och 1 ml av näringsmediet 199 med en tillsats av 10% blodserum från storboskap, varefter cellkulturerna inkuberas vid 3700.

Under de första tio passagerna utgöres infekteringsmaterialet av en virushaltig vätska, som uppsamlats 35-H0 dagar efter infek- teringen av de föregående kulturerna. För efterföljande =; virus- passager användes en virushaltig vätska, som uppsamlats på den 15-20-nde dagen efter ínfekteríngen, varjämte man använder ett virus, som extraherats från cellerna efter frysning och upptining av de infekterade cellerna.

Man genomför sedan - enligt en liknande infekteringsmetod - 12 viruspassager i en omympad cellkultur från njurar av människo- umbryon Rh vid }PÜC. Materialet för varje efterföljande infekte- ring utgöres av den virushaltiga vätskan, som uppsamlats på den 15-20-nde dagen efter den föregående infekteringen.

Viruset försvagas sedan genom vid 5500 utförda passager på en blandad kultur, som består av 2 miljoner celler från hundnjurar och 2 miljoner celler från embryon av japanska vaktlar. I en så- dan blandad kultur genomföres 5 viruspassager, varefter viruset får passera 5 gånger i cellkultur från embryon av japanska vaktlar vid BSOC i en roterande anordning vid ett varvtal av U varv/min.

Med början från den femte passagen orsakade viruset regelbundet en cytopatisk cellförstöring, som observerades 5-7 dagar efter infekteringen. Ett sådant virus klonades genom en s.k. gränsut- spädningsmetod i cellkultur från embryon av japanska vaktlar och användes som vaccinstammen. Den erhållna försvagade stammen av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset, vilken 8008185-4 1 1 stam adapterats till cellkulturen från embryon av japanska vaktlar, kontrolleras med hänsyn till: 1) specifícitet (identifiering) i neufraliseringsreaktionen på cellkulturen från embryon av Japanska vuktlur; 2) oskadlighet (på laboratoriedjur exempelvis möss, embryon, marsvin, kaniner, samt minkar och blårävar); 3) infektionsaktiviteten i cellkulturen från embryon av japanska vaktlar; U) antigen aktivitet; 5) immunogen aktivitet; 5) frånvaro av virus-kontaminanter; 7) bakteriell sterilitot, frånvaro av mykoplasmn (PPiO); 8) preparatets lagringsntabílitet; 9) icke-smittsamhet. §§gm§¿l_§. Framntällning av ett ympvirus och vaccinet: a) Beredning av ympvíruset. Ympviruuet framställes av den enligt exempel 1 framställda stammen l-JD9, för vilket ändamål man använder embryon av japanska vaktlar med en ålder av 9-11 dygn, som levererats från en speciell kontrollerad vaktelfarm. 100 em- bryon trypsineras enligt den godkända metoden, varigenom man erhål- ler 3 300 000 000 celler, vilka suspenderae i 9,120 liter av nä- ríngsmediet 199 och försätts: med 10% serum från storboskap och 100 mg monomycín per ml. 300 ml av cellsuspensionen ihälles i två 1 lit. flaskor (150 ml i varje flaske); dessa prover sparas för kontrolläidamâl. I den andra portíonen av cellsuspensionen införes 10 ml av en odlingsvätska innehållande vaceinstammen 1-129, varefter 150 ml ihälles 1 varje 1 liter: flaska. Samtliga flaskor inkuburas vid vn temperatur av BSOC i en roterande anordning. Pâ det tredje dygnet efter ympningen och lnfekteringen av cellerna avlägsnas näringsmedíet, varefter färskt näringsmedium 199 och 100 mg monomycin per ml införes i flaskorna. På det sjätte dyg- net efter infekteringen av cellerna,då vírusets cytopatiska akti- vïtetshärdar uppkommer, uppsamlar man den-vlrushaltiga vätskan ur flaskorna, varefter man tar prov för genomförande av den nv- sedda kontrollen och inför färskt medium 199 i flaskorna. Den virushaltiga vätskan uppsamlas sedan upprepade gånger tills 50% celler bibehålles. Under slutsteget införes 70 ml färskt medium 199, varefter cellkulturen fryses i torris och upptinas för att man skall kunna exfrah~rn det intrauellulära viruset. 8008185-4 12 Under samtliga beredningssteg för ympviruset tas prov för kontrolländamål. Ympviruset måste kontrolleras med hänsyn till: specificitet, oskadlighet, infektionsaktivitet, antigenitet, immu- nogenitet, frånvaro av kontaminerande virus, sterilitet samt icke- smittsamhet. Det ympvirus, som uppfyller samtliga kontrollkrav, lagras i fruset tillstånd vid en temperatur av högst -2050. b) Framställning av vaccinet. I detta syfte användes embry- on av japanska vaktlar med en ålder av 9-11 dygn, som levererats från en kontrollerad speciell vaktelfarm. 200 embrgc: ' enligt den godkända metoden, varigenom man erhåller 6 600 celler, vilka suspenderas i 8,25 liter av näringsmediet 199 och för- sättes med 10% serum från storboskap och 100 mg monomycin per ml. 750 ml av cellsuspensionen ihälles i fem 1 lit. flaskor (150 ml i varje flaska); dessagnoversparas för kontrolländamål. I den and- ra portionen av cellsuspensionen införes 10 ml av en odlingsvätska, som innehåller det enligt a) framställda ympviruset av stammen 1- 129. I varje 1 lit. flaska ihälles 150 ml. Samtliga flaskor inku- beras vid 3500 i en roterande anordning. På det tredje dygnet efter ympningen och infekteringen av cellerna avlägsnas närings- mediet, varefter färskt medium 199 och 100 mg monomycin per ml in- föres i flaskorna. På det sjätte dygnet efter infekteringen av cellsuspensionen - då virusets cytopatiska aktívitetshärdar uppkom- mer i 50% av cellerna - uppsamlar man den virushaltiga vätskan ur flaskorna, varefter man tar prov för kontrolländamål och inför en färsk portion av mediet 199 i flaskorna. Den virushaltiga vätskan uppsamlas sedan upprepade gånger tills 50% celler finns kvar, var- efter 70 ml medium 199 införes. Cellkulturen fryses i torris och upptinas för att man skall kunna extrahera det intracellulära vi- ruset.

Samtliga uppsamlade portioner virushaltig vätska ihälles i en enda behållare och försättes med ett stabiliseringsmedel bestå- ende av 5% sorbitol och 1,5% gelatos, varefter vaccinet ihälles i ampuller eller flaskor och frystorkas. En sådan "pool" utgör en enda serie av vaccinet. Det framställda vaccinet kan ihällas i flaskor eller ampuller med en volym av 1-35 ml, varvid en enda flaska eller ampull kan innehålla 1-500 doser beroende på förbru- karens krav.

Under samtliga vaccinberedningssteg tas prov för kontroll.

Vaccinet måste kontrolleras med hänsyn till: specificitet, oskad- 8008185-4 13 lighet, infektionsaktivitet, antigen och immunogen aktivitet, från- varo av virus-kontaminantcr, sterilitet och avsaknad av smittsamhet.

Den vaccinscrie, som uppfyller samtliga kontrollkrav, kan användas för immunisering av djur. I denna utföringsform innehål- ler en enda serie 360 000 vaccindoser.

Exempel 3. Provning av vaccinet med hänsyn till oskadlighet.

Vaccinet användes i en dos av 1 ml innehållande 100 CVD50 av viruset efter det att det i förväg utspätts med Henks-lösning.

Vaccinet injicerades intramuskulärt. Man vaccinerade 2U minkvalpar och 12 blårävvalpar. För kontrolländamâl medtogs ytterligare 16 minkvalpar och 8 blårävvalpar i försöket. De vaccinerade djuren observerades dagligen under en tid av 28 dagar. Samtliga djur för- blev kliniskt friska. Man upptäckte icke några patologiska reak- tioner, dvs. vägran att äta fodret, depression, matsmältningsrubb- ning. De djur, som varit i kontakt med de vaccinerade, blev icke sjuka i valpsjuka.

Exempel H. Provning av vaccinet med hänsyn till antigenitet (antigenitetsprov).

Från de djur, som vaccinerats med en dos av preparatet såsom anges i exempel 3, tog man efter 10-ih dagar blodprov och bestämde antikropparnas titer i neutraliseringsreaktionen på cellkultur från embryon av japansk vaktel genom att man som antigen använde vaccin- stammen 1-129 av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset. Antikropparna bestämdes för alla djuren; titern var 1:16 till 1:32. Största möjliga mängd antikroppar (i en titer av 1:256) uppsamlades på den 30-nde dagen. Antikropparna bibehölls under en observationstid av 18 månader.

Exempel 5. Provning av vaccinet med hänsyn till immunogeni- tet och immunitetens varaktighet. a) Man injicerade intramuskulärt i BH minkvalpar och 12 blå- rävvalpar 1 ml av ett utspätt vaccin (1 ml hos varje valp) inne- hållande 100 CVDSO av viruset. Som kontrolldjur användes ytterli- gare 16 minkvalpar och 8 blårävvalpar. Efter 30 dagar infekterades de vaccinerade djuren och kontrolldjuren med ett virulent virus (Snyder Hill För minkar respektive Gaujasskïj för blårävar).

Djuren observerades dagligen. Kontrolldjuren (dvs. de icke vacci- nerade) insjuknade i (dog i) valpsjuka, under det att de vaccinera- de djuren icke uppvisade nâgra reædfioner på injiceringen av det virulenta valpsjukeviruset. Under hela obscrvationstiden (21 dagar efter infekteringen) förblev de vaccinerade djuren kliniskt friska. ;sons1ss-4 lä b) Efter ett år och efter ett år och sex månader efter vac- cineringen infekterades djuren på nytt med det virulenta viruset Snyder Hill resp. Gaujasskij. Inga vaccinerade djur insjuknade i valpsjuka och samtliga dessa djur förblev levande.

Exempel 6. Provning av vaccinet under fältförhållanden.

Under sommarvaccineringstiden vaccinerade man - i och för pro- fylaktisk behandling - på 15 pälsdjursfarmer 1 H00 000 rävar, H5 500 blårävar, 2500 soblar, 300 000 minkar och 255 hundar. Inga djur insjuknade i valpsjuka oavsett att valpsjukeutbrott ägt rum i de områden, där nämnda Farmer befann sig.

Exempel 7. Provning av vaccinet i en valpsjukehärd.

På en pälsdjursfarm, där man upptäckt många fall av valp- sjuka hos köttätande djur, speciellt unga silverrävar, dog upp till 120 valpar-dagligen. (Sjukdomsfallen undersöktes och bestyrk- ten genom lnborutoricförsök.) Man vaccinerade alla djuren. Efter två månader hade nntulut dödsfall blund rüvvalpuv minskat till hälften. Efter ännu en månad upphörde valpflukan helt hos rävarna.

Pâ en minkfarm, som befann sig i omedelbar närhet av rävfar- men, upptäcktes enstaka fall av valpsjukan. Efter snabb vaccine- ring av alla de minkarna förebyggdes ett regelrätt valpsjukeutbrott på farmen.

Exempel 8. Provning av preparatet enligt uppfinningen i jäm- förelse med de kända vaccinerna.

På en minkfarm, där talrika fall av valpsjuka hos köttätande unga djur konstaterats, immuniserades alla djuren med det kända vaccinet KF-668 (Sovjetunionen). Sedan vaccinet injicerats, mins- kade antalet dödsfall bland djuren, varvid detta antal uppgick till 180 minkvalpar per dag. Av detta skäl genomfördes snabbt en upp- repad immuniseríng av lä 612 djur med vaccinet enligt uppfinningen och 15 580 djur med det kända amerikanska ASL-vaccinet. Efter immuniseringen med dessa vacciner minskade antalet dödsfall plöts- ligt. Efter ytterligare tvâ månader var sjukdomen på denna farm eliminerad. Vad avser effektiviteten är vaccinet enligt uppfinning- en icke sämre än det kända ASL-vaccinet.

Exempel 9. Provning av vaccinet vid den s.k. aerosolinjice- ringsmetoden.

För den s.k. aerosolinjiceringen användes ett vaccin, som framställts på samma sätt som det för intramuskulär injicering av- sedda vaccinet. Medelst aerosolen immuniserades 300 minkvalpar med en ålder av 45-60 dagar. Vaccinet förstoftades så, att den

Claims (4)

8008185-4 15 ena gruppen av mlnkar fick en enda konventionell dos, medan den andra gruppen av minkar fick tre konventionella doser. Den kon- ventionella dosen är en dos, som är godkänd för intramuskulär in- jicering. Antikropparna mot valpsjukeviruset i blodserum från de immuniserade djuren bestämdes i neutraliseringsreaktionen på cell- kultur från embryon av japansk vaktel genom att man som antigen använde vaccinstammen 1-129. För den grupp av minkar, som vacci- nerats med en enda dos, bestämdes nntikropparna i ett utspädnings- förhållande av l:8. I den andra gruppen av mínkar, som behandlats med tre doser, bestämdes antikropparna i ett utspädningsförnållande av 1:32. Man upptäckte icke någon väsentlig skillnad i titern av vi- rusneutraliserande antikroppar hos de djur, som immuniserats me- delst aerosol, och de, som ímmuniserats intramuskulärt (enligt exempel 3). För att kontrollera den s.k. immunitetsstyrkan hos de med aerosol vaccinerade djuren användes en infekteringsmetod med det virulenta viruset Snyder Hill. Efter infekteringen med detta vi- rus upptäcktes icke någon valpsjuka hos de med aerosol vaccinerade djuren. K Såsom framgår av exempel 9 är det enligt uppfinningen före- slagna vaccinet, som framställts av valpsjukevirus-stammen 1-129, effektivt icke blott om det användes intramuskulärt utan även om det användes enligt aerosolimmuniseringsmetoden. P a t e n t k r a v

1. Levande virusvaccin mot valpsjuka hos köttätande djur, be- stående av en företrädesvis frystorkad blandning av virus och stabi- liseringsmedel, varvid viruset är en försvagad stam av ett valpsjuka hos köttätande djur framkallande virus, k ä n n e t e c k n a t a v att som nämnda försvagade virusstam ingår en stam av valpsjukeviruset, vilken har deponerats hos Institut Pasteur under nr I-129 och har framställts av ett vildtypsvirus, som isolerats från blodet hos en mink, som är sjuk i valpsjuka, genom flerdubbelt upprepade passager successivt på följande cnllkulturcrz 1) på en cellkultur från hund- njurar, 2) på en cellkultur fran njurar av männískoembryon Rh och 3) på en blandad cellkultur, som består av celler från hundnjurar och celler från embryon av japanska vaktlar, vilken stam adapterats till cellkultur från embryon av japanska vaktlar och odlats på denna kultur. 8008185-4 16

2. Förfarande för framställning av vaccin enligt krav 1, omfattan- de dels odling av en försvagad stam av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset på en cellkultur i ett näríngsmedium, dels uppsamling av en virushaltig vätska och dels frystorkning av den upp- samlade virushaltiga vätskan i närvaro av ett stabíliseringsmedel, k ä n n e t e c k n a t a v att man som nämnda försvagade stam använder den hos Institut Pasteur under nr I-129 deponerade stammen av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset, vilken stam framställts av ett vildtypsvirus, som isolerats från blcdeï hes en mink, som är sjuk i valpsjuka, genom a) 20-NO passager på en cell- kultur från hundnjurar vid en temperatur av 37 3 100, därefter b) 5-15 passager på en cellkultur från njurar av människoembryon Rh vid en temperatur av 32 1 1°C, därefter c) 2-7 passager på en blandad cellkultur bestående av celler från hundnjurar och celler från embry- on av japanska vaktlar vid en temperatur av 35 1 1°C, och därefter d) adaptering under 4-10 passager på cellkultur från embryon av japan- ska vaktlar.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t a v att den virushaltiga vätskan uppsamlas för första gången när viruset vid inkubation med celler från embryon av japanska vaktlar har cytopatisk verkan hos 20-40 % av cellerna.

4. Förfarande enligt krav 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t a v att den virushaltiga vätskan frystorkas i närvaro av 4,5-5,5 viktprocent sorbitol och 1,4-1,6 viktprocent gelatos. 8008185-4 S a m m a n d r a g Levande virusvaccin för att bekämpa valpsjuka hos köttätande djur och förfarande för framställning av detsamma. Nämnda vaccin består av en företrädesvis frystorkad blandning av virus och stabiliseringsmedel. Vaccinet innehåller som nämnda vi- rus en hos Institut Pasteur under nr I-129 registrerad, försvagad stam av ett valpsjuka hos köttëtande djur framkallande virus, vil- ken stam framställts av ett vildtypsvirus, som isolerats från en mink, som är sjuk i valpsjuka, genom flerdubbelt uppnwade passager i cellkulturer av varierande härkomst: på en cellkultur från hund- njurar, på en cellkultur från njurar av människoembryon Rh och på en blandad cellkultur, som består av celler från hundnjurar OCH celler från embryon av japanska vaktlar, vilken stam ädapterats till cellkultur från embryon av japanska vaktlar och odlats_på denna kultur. Förfarandet för framställning av vaccinet omfattar dels cd- ling av en försvagad stam av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset på en cellkultur i ett näringsmedium, dels uppsamling av en virushaltig vätska och dels frystorkning av den uppsamlade virushaltiga vätskan i närvaro av ett stabiliserings- medel, varvid det för förfarandet utmärkande består däri, att man som nämnda försvagade stam använder den hos Institut Pasteur under nr I-129 deponerade stammen av det valpsjuka hos köttätande djur framkallande viruset, vilken stam framställts av ett vildtypsvirus, som isolerats från blodet hos en mink, som är sjuk i valpsjuka, genom a) 20-H0 passager på en cellkultur från hundnjurar vid en temperatur av 37 I loC, därefter b) 5-15 passager på en cellkultur från njurar av människoembryon Rh vid em temperatur av 32 É lOC, därefter c) 2-7 passager på en blandad cellkultur bestående av cel- ler från hundnjurar och celler från embryon av japanska vaktlar vid en temperatur av 35 É l°C, och därefter d) adapteríng under H-10 passager på cellkultur från embryon av japanska vaktlar. Fördelen med vaccinet enligt uppfinningen är bl.a. att detta vaccin icke är skadligt och att det har hög ímmunogen och antigen aktivitet. Vaccinet är fritt från främmande virus och kan användas för profylaktisk behandling av valpsjuka nos de köttätande djuren och för eliminering av epizootier. Vaccinet kan även användas i form av aerosol.