JP2023529124A - コロナウイルスワクチンコンストラクトおよびこれを作製し使用する方法 - Google Patents

コロナウイルスワクチンコンストラクトおよびこれを作製し使用する方法 Download PDF

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Abstract

ウイルス感染を処置するための組成物および方法は、アデノウイルスベクターの使用を含み得る。本開示のアデノウイルスベクターは１つまたは複数の遺伝子座が機能的に除去された非ヒトアデノウイルスゲノムおよびトランスジーンを含み得る。ウイルス感染を処置する方法は、本開示のアデノウイルスベクターを含む組成物を対象に投与し、ウイルスの感染力または伝染を低減することを含み得る。鼻内投与は、筋肉内投与と比較して対象の上気道の保護の増強を提供する。

Description

政府による援助
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＡＩ１３１２５４の下で政府援助によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年３月１７日出願の米国仮特許出願第６３／１６２，４１７号の利益を主張し、２０２０年７月１３日出願の米国仮特許出願第６３／０５１，１０３号の利益を主張し、２０２０年６月１日出願の米国仮特許出願第６３／０３２，８１５号の利益を主張する。これらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は一般にバイオテクノロジーおよび医学の分野に関し、より具体的には呼吸器ウイルス感染に対する増強された治療のためのワクチンにおいて使用できる核酸コンストラクト、ポリペプチド、およびベクター、ならびにそれらの使用方法に関する。
配列表への参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出し、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。ＡＳＣＩＩコピーは２０２１年６月１日に創成され、６８８４２５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名されており、サイズは２１２，３６６バイトである。
ウイルス感染は毎年、数十万人の死亡に関与している。しかし多くのウイルスについては処置の選択肢は限られている。さらに、ウイルスキャリアは無症状であることがあり、感染しているが無症状の個体からの高い伝染率をもたらしている。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）はコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）症候群の病原体であり、これは急速に肺炎、呼吸不全、および全身性炎症疾患に進行することがある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年後半に中国武漢の重症呼吸器疾患の患者から最初に単離されたポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ベータコロナウイルスとして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は他の２つの高病原性呼吸器ウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶおよび中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）に関連している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、呼吸不全に進行し、心臓の病変、胃腸疾患、血液凝固障害、および高度の炎症症候群を提起することもある臨床症候群をもたらす。高齢者、免疫障害者、および共存する病的状態（例えば肥満、糖尿病、および高血圧）を有する者は、ＣＯＶＩＤ－１９による死亡の最大のリスクを有している。この流行病の開始以来、全世界で１億５２００万人を超える感染および３２０万人の死亡が記録されている。
ＣＯＶＩＤ－１９の甚大な罹患率、死亡率、および不安定な社会経済学的な結果は、感染の重症度を軽減し、伝染を抑制し、流行病を終息させ、その再発を防止するための効果的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの配備に対する緊急のニーズを強調している。
本開示の種々の態様は、本明細書で開示した有効量のナノ粒子組成物を含む組成物およびその使用方法を提供する。
本開示の一態様は、アデノウイルスのゲノムの少なくとも一部を有するアデノウイルスベクターを含む組成物であって、アデノウイルスのゲノムが、ベクターが天然のＥ１遺伝子座を欠き、Ｅ３またはＥ３Ｂの遺伝子座を欠いてもよく、および／またはベータコロナウイルストランスジーンを含むように改変されている、組成物を提供する。一態様では、トランスジーンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも一部（例えば武漢、南アフリカ、その他の変異体またはそれらの突然変異体等）、Ｓタンパク質の免疫原性断片、Ｓタンパク質の免疫原性突然変異体（例えば融合前安定化突然変異体、Ｄ６１４Ｇ突然変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体）、またはそれらの免疫原性部分、変異体、突然変異体、もしくは断片（例えば付加、挿入、欠失、置換）である。
本開示の別の態様は、サルアデノウイルスベクターを含む核酸分子、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスポリペプチドのスパイクタンパク質もしくはその免疫原性部分、変異体、突然変異体、もしくは断片をコードする核酸を含む組成物を提供する。例えば、スパイクタンパク質は武漢もしくは南アフリカ、またはそれらの変異体であってよい。
本開示の別の態様は、サルアデノウイルスベクターをコードする核酸分子、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも一部、Ｓタンパク質の免疫原性断片、Ｓタンパク質の免疫原性突然変異体（例えば融合前安定化突然変異体、Ｄ６１４Ｇ突然変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体）、またはそれらの免疫原性部分、変異体、突然変異体、もしくは断片（例えば付加、挿入、欠失、置換）を含む抗原をコードする核酸を含む組成物を提供する。
本開示の別の態様は、複数のアデノウイルス構造タンパク質またはコロナウイルスのスパイクタンパク質もしくはその免疫原性部分、変異体、突然変異体、もしくは断片からなる群から選択されるコロナウイルスポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを含む組成物を提供する。
本開示の別の態様は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質もしくは安定化突然変異体Ｓタンパク質の少なくとも一部またはそれらの免疫原性断片、突然変異体、もしくは変異体をコードする核酸配列をそのゲノム内に含む組換えアデノウイルス骨格を含む組成物を提供する。
本開示の別の態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクター、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載のコロナウイルスポリペプチドまたはその免疫原性部分もしくは変異体をコードする核酸、または賦形剤もしくはアジュバントを含むコロナウイルスワクチンを含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、コロナウイルスポリペプチドまたは免疫原性部分は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ポリペプチドまたはその免疫原性部分、変異体、もしくは突然変異体（ｍｕｔａｔｉｏｎ）、例えばＤ６１４Ｇ突然変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体である。
一部の実施形態では、核酸（またはヌクレオチド）配列は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも免疫原性部分またはその免疫原性断片もしくは変異体をコードし、アデノウイルスゲノム内の内因性アデノウイルスＥ１遺伝子を実質的に置き換える。
一部の実施形態では、核酸は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも一部もしくは免疫原性断片、または配列番号３のコロナウイルススパイクタンパク質部分と少なくとも８０％同一の配列を有する免疫原性断片もしくはその変異体をコードし、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇ突然変異を有する。
一部の実施形態では、核酸は配列番号５または配列番号６と少なくとも８０％同一であり、免疫原性スパイクタンパク質またはその免疫原性部分もしくは変異体をコードする。
一部の実施形態では、アデノウイルスベクターはサルＡｄ３６ベクター（ＣｈＡｄ）である。
一部の実施形態では、コロナウイルスタンパク質は配列番号３で説明される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇ突然変異を有する。
一部の実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号３で説明される配列と少なくとも８５％の配列同一性を有し、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇの突然変異を有する。
一部の実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号３で説明される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇの突然変異を有する。
一部の実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号３で説明される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇの突然変異を有する。
一部の実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号３で説明される配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇの突然変異を有する。
一部の実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号３で説明される配列を有し、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇの突然変異を有する。
一部の実施形態では、抗原は融合前トリマーにおいてスパイクを安定化する突然変異を含む。
一部の実施形態では、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）表面糖タンパク質の一部もしくは安定化された部分、これらと実質的に同一の配列、またはそれらの機能的断片もしくは機能的突然変異体もしくは変異体である。
一部の実施形態では、抗原は、少なくとも配列番号３の２つのアミノ酸の突然変異であるＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを有するＳタンパク質の機能性部分または突然変異体である。
一部の実施形態では、抗原は、少なくとも配列番号３による配列におけるＤ６１４Ｇ突然変異を有するＳタンパク質の機能性部分または突然変異体である。
一部の実施形態では、アデノウイルスは非ヒトアデノウイルスである。
一部の実施形態では、アデノウイルスはサルアデノウイルスである。
一部の実施形態では、アデノウイルスはＳＡｄ３６である。
一部の実施形態では、アデノウイルスはＥ１およびＥ３Ｂ遺伝子に欠失（それぞれ配列番号４；ヌクレオチド３００７２～３１８６９およびヌクレオチド４５５～３０２６）を有するサルアデノウイルスＳＡｄ３６である。
一部の実施形態では、アデノウイルスは機能性のＥ１遺伝子座およびＥ３遺伝子座を欠いている。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物を含み、１つまたは複数のさらなる活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含んでもよい、免疫原性組成物を提供する。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物またはアデノウイルスベクターをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物またはアデノウイルスベクターを形質導入した宿主細胞を提供する。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物またはウイルスベクターを産生するパッケージング細胞系を提供する。
一部の実施形態では、細胞は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載のウイルスベクターから機能的に欠失した任意のウイルス遺伝子（例えばＥ１）の相補体を含み、それにより、相補性によるウイルスの複製を可能にする。
本開示の一態様は、（ｉ）先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の宿主細胞、細胞系、組成物、もしくはアデノウイルスベクター、またはそれらの免疫原性組成物、または（ｉｉ）使用説明書を含むキットを提供する。
本開示の一態様は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも一部またはその免疫原性断片もしくは変異体（例えばＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ突然変異を有する配列番号３、Ｄ６１４Ｇ突然変異を有する配列番号３）をコードする核酸配列をそのゲノム内に含む組換えアデノウイルスベクターを提供する。
一部の実施形態では、核酸またはヌクレオチドの配列は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも免疫原性部分またはそれらの免疫原性断片もしくは変異体／突然変異体をコードし、アデノウイルスゲノム内の内因性アデノウイルスＥ１遺伝子を実質的に置き換える。
一部の実施形態では、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも一部もしくは免疫原性断片またはそれらの免疫原性断片もしくは変異体／突然変異体をコードする核酸は、配列番号３のコロナウイルススパイクタンパク質部分と少なくとも８０％同一の配列を有し、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇ突然変異を有する。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、組成物はアジュバントをさらに含む。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物または組換えアデノウイルスベクターを含むコロナウイルスワクチンを提供する。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルスベクターをコードする核酸を提供する。
一部の実施形態では、核酸は、配列番号３のコロナウイルススパイクタンパク質をコードする部分と少なくとも８０％同一である配列を有し、配列番号３はＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの突然変異を有するか、または配列番号３はＤ６１４Ｇの突然変異を有する。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の核酸または発現ベクターを含む細胞を提供する。
本開示の一態様は、先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物を以前に投与された対象の血清を含む組成物を提供する。
本開示の一態様は、先行する態様に記載の血清を含む免疫原的有効量の組成物を第２の対象に投与することを含む、コロナウイルス感染を有する第２の対象を処置する方法を提供する。
本開示の一態様は、免疫原的有効量の先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
本開示の一態様は、免疫原的有効量の先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、対象におけるコロナウイルス感染を処置または防止する方法を提供する。
本開示の一態様は、免疫原的有効量の先行する態様または実施形態のいずれか１つに記載の組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、コロナウイルスから対象を保護する方法を提供する。
一部の実施形態では、免疫原的有効量の組成物またはワクチンは、鼻道、上気道、肺組織、および播種されたその他の全ての部位において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して保護し、ならびに／または上気道の感染および鼻におけるウイルスの流出を防止する。
一部の実施形態では、免疫原的有効量の組成物またはワクチンは、鼻内に投与される。
一部の実施形態では、免疫原的有効量の組成物またはワクチンは、筋肉内に投与される。
一部の実施形態では、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、Ｄ６１４Ｇ突然変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異体である。
一部の実施形態では、対象はヒトである、
一部の実施形態では、対象はコロナウイルスに曝露されていた。
一部の実施形態では、対象はコロナウイルス感染を有しないが、コロナウイルス感染を発症するリスクがある。
一部の実施形態では、対象はコロナウイルスが蔓延している地域に旅行している。
一部の実施形態では、対象はコロナウイルスに曝露されている。
一部の実施形態では、ワクチンの送達は抗原特異的免疫応答をもたらす。
一部の実施形態では、対象はコロナウイルス感染を有しているか、コロナウイルス感染を有していると疑われるか、またはコロナウイルス感染を発症するリスクがある。
一部の実施形態では、本方法は対象の宿主細胞中にトランスジーンを送達することを含む。
本開示の一態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、突然変異体、またはそれらの安定化された突然変異体を含む組換えアデノウイルスベクターをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトすること、細胞が組換えアデノウイルスを産生するような条件下で細胞を培養すること、および組換えアデノウイルスを収集することを含む、組換えアデノウイルスを作製する方法を提供する。
一部の実施形態では、細胞はＨＥＫ細胞、Ｖｅｒｏ、またはＰＥＲ細胞である。
本開示の一態様は、アデノウイルスベクターをコードするポリヌクレオチド配列を宿主細胞中に組み込む工程を含む、組換えアデノウイルスベクターを産生する方法を提供し、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス安定化スパイクタンパク質、アデノウイルス野生型スパイクタンパク質、またはそれらの免疫原性断片もしくは変異体／突然変異体を産生することができる。
多数の実施形態を開示しているが、本開示のさらに他の実施形態は、本発明の説明的実施形態を示して記載する以下の詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
当業者は、下に記載される図面が例示目的のためのみであることを理解する。図面は、いかなる方法においても本教示の範囲を限定することを意図しない。
本出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許出願公報の写しは、請求および必要料金の支払いにより特許庁によって提供される。
図１Ａ～１Ｈは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの免疫原性を示す。図１Ａは、トランスジーンカセットの略図を示す：ＣｈＡｄ対照はトランスジーン挿入物を有さない；ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは２つの示されるプロリン突然変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードする。図１Ｂは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ形質導入２９３細胞の抗Ｓ ｍＡｂとの結合を示す。（左）概要：＋、＋＋、＋＋＋、－は、それぞれ＜２５％、２５～５０％、＞５０％の結合および結合無しを示す。（右）２回の実験の代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。図１Ｃは、４週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスが筋肉内経路を介してＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化され、４週間後にブーストされたことを示す。プライミングまたはブースティング後２１日目に、免疫化されたマウスの血清中の抗体応答が評価された。図１Ｄは、ＥＬＩＳＡ測定抗ＳおよびＲＢＤ ＩｇＧレベルを示す。図１Ｅは、ＦＲＮＴ判定中和活性を示す。データは、２回の実験からプールされる（ｎ＝１５から３０；マン・ホイットニー検定：＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）。図１Ｆは、細胞媒介応答がＳタンパク質ペプチドプールを用いた再刺激後のブースター免疫化後７日目に分析されたことを示す。脾細胞は、フローサイトメトリーによってＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγおよびグランザイムＢ発現について、およびＣＤ４＋Ｔ細胞においてはグランザイムＢのみについてアッセイされた。図１Ｇは、陽性細胞集団の頻度および数の概要を示す（ｎ＝５；マン・ホイットニー検定：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。バーは中央値を示し、点線はアッセイの検出限界（ＬＯＤ）である。図１Ｈは、脾臓がブースト後７日で採取され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク－特異的ＩｇＧ＋抗体分泌細胞（ＡＳＣ）頻度がＥＬＩＳＰＯＴによって測定されたことを示す（マン・ホイットニー検定：＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）。バーおよびカラムは中央値を示し、点線はアッセイの検出限界（ＬＯＤ）を示す。 図２Ａ～２Ｄは、ＦＲＮＴによる測定で、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンが中和抗体を誘起することを示す。４週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスは、筋肉内経路を介してＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いてプライムされた、またはプライムされかつブーストされた。図２Ａは、ＣｈＡｄ対照で免疫化されたマウス由来の、プライミングまたはブースティング後２１日目に収集された血清（図１に記載のとおり）が、ＥＬＩＳＡによってＳ特異的ＩｇＧ応答についてアッセイされたことを示す。図２Ｂは、ＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種マウス由来の血清試料がプライミング後２１日目に収集されたことを示す。図２Ｃは、ＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種マウス由来の血清試料がブースティング後２１日目に収集され、ＦＲＮＴによって中和活性についてアッセイされたことを示す。個々のマウスに対応する血清中和曲線は、示されたワクチンについて示されている（１群あたりｎ＝１５～３０）。各点は、標準偏差（ＳＤ）を示すエラーバーと共に２回の技術的反復の平均を表す。図２Ｄは、筋肉内経路によってワクチン接種されたＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳマウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ５日前および８日後に得られた対の血清におけるＥＬＩＳＡ測定抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ＩｇＧ応答を示す（ｎ＝５：＊＊ Ｐ＜０．０１；＊＊＊ Ｐ＜０．００１；対応ｔ検定）。点線は、未処置血清由来の平均ＩｇＧ力価を表す。 図３は、Ｔ細胞応答の分析についてのゲート戦略を示す。４週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化し、４週間後にブーストした。Ｔ細胞応答は、脾細胞においてブースト後７日目に分析された。細胞は、リンパ球（ＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－Ａ）、シングレット（ＳＳＣ－Ｗ／ＳＳＣ－Ｈ）、生細胞（Ａｑｕａ－）、ＣＤ４５＋、ＣＤ１９－に続いて、ＩＦＮγまたはグランザイムＢを発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞集団についてゲーティングされた。 図４Ａ～４Ｂは、Ｈｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２を用いたマウスの形質導入での予め存在するＣｈＡｄ免疫の影響を示す。４週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスは、プライムされた、またはプライムされかつブーストされた。血清試料は、Ｈｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２形質導入の１日前に収集された。図４Ａは、示されたワクチン群由来の血清中のＨｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２の中和活性がプライムのみの後にＦＲＮＴによって決定されたことを示す。図４Ｂは、示されたワクチン群由来の血清中のＨｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２の中和活性がプライムおよびブースト後にＦＲＮＴによって決定されたことを示す。各記号は動物１匹を表し；各点は２回の技術的反復を表し、バーは範囲を示す。陽性対照（抗Ｈ－Ａｄｖ５血清）は、基準枠として含まれる。 図５Ａ～５Ｇは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する筋肉内送達されたＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの保護有効性を示す。図５Ａは、ワクチン接種およびチャレンジの計画である。４週齢ＢＡＬＢ／ｃメスマウスは、ＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化された。一部のマウスは、同種ワクチンのブースター用量を受けた。免疫化後３５日目に、マウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて以下のとおりチャレンジされた：動物は、抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂを用いて処置され、１日後に鼻内経路を介してＨｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２を形質導入された。５日後、マウスは、鼻内経路を介して４×１０５フォーカス形成単位（ＦＦＵ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いてチャレンジされた。図５Ｂは、組織が分析のために４および８ｄｐｉに採取されたことを示す。肺における感染性ウイルスは、プラークアッセイによって測定された。図（ＦＩＣ．）５Ｃは、ウイルスＲＮＡレベルが肺、脾臓および心臓において４および８ｄｐｉにＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｃ）によって測定されたことを示す（ｎ＝３～７、マン・ホイットニー検定：＊＊＊ Ｐ＜０．００１）。図５Ｄは、４ｄｐｉに採取された肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブ（茶色）を使用するウイルスＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションを示す。画像は、高出力倍率挿入図を含んで低い（上；スケールバー、１００μｍ）および中程度の（中央；スケールバー、１００μｍ）出力の倍率で示す（１群あたりｎ＝３からの代表的な画像）。図５Ｅは、４ｄｐｉでの肺ホモジネートからの示されたサイトカインおよびケモカインの遺伝子発現における倍数変化がＲＴ－ｑＰＣＲによってＧａｐｄｈレベルへの正規化および未処置の未ワクチン接種、未チャレンジ対照との比較後に決定されたことを示す。（ｎ＝７；マン・ホイットニー検定：＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。図５Ｆは、プライム－ブースト免疫化を受けたマウスがブースター免疫化後３５日目にチャレンジされたことを示す。組織は、分析のために４ｄｐｉに収集された。肺における感染性ウイルスは、プラークアッセイによって決定された。図５Ｇは、プライム－ブースト免疫化を受けたマウスがブースター免疫化後３５日目にチャレンジされ、ウイルスＲＮＡが肺、脾臓および心臓においてＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｇ）を使用して測定されたことを示す（ｎ＝６～７；マン・ホイットニー検定：＊＊、Ｐ＜０．０１）。（Ｂ～ＣおよびＥ～Ｇ）カラムは、中央値を示し、点線はアッセイのＬＯＤを示す。 図６は、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた単回用量筋肉内ワクチン接種が、肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘起炎症からマウスを保護することを示す。４週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣｈＡｄ対照およびＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化され、図５に記載された計画に従ってチャレンジされた。肺は、８ｄｐｉに採取された。切片は、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色され、倍率４０×（左；スケールバー、２５０μｍ）、２００×（中央；スケール、５０μｍ）および４００×（右；スケールバー、２５μｍ）で画像化された。各画像は、マウス３匹の群の代表的なものである。 図７Ａ～７Ｊは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの鼻内免疫化後の免疫応答（ｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を示す。図７Ａは、実験計画を示す。５週齢ＢＡＬＢ／ｃメスマウスは、ＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて鼻内経路を介して免疫化された。図７Ｂは、プライミング後１か月での免疫化されたマウスの血清中の抗体応答が評価されたことを示す。ＥＬＩＳＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧを測定した。図７Ｃは、ＥＬＩＳＡ測定ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＡレベルを示す。図７Ｄは、ＦＲＮＴ決定した中和活性を示す。データは、１群あたりｎ＝１０～２５のマウスを用いた２回の実験からプールされる（マン・ホイットニー検定：＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）。図７Ｅは、ブースター用量を受けたマウスが、粘膜免疫応答および細胞媒介免疫応答を評価するために１週間後に屠殺されたことを示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧ。図７Ｆは、ＢＡＬ液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＡレベルがＥＬＩＳＡによって決定されたことを示す。図７Ｇは、ＢＡＬ液のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性がＦＲＮＴによって測定されたことを示す。図７Ｈは、肺中のＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｓタンパク質ペプチドプールを用いた再刺激後にフローサイトメトリーによってＩＦＮγおよびグランザイムＢ発現についてアッセイされたことを示す。図７Ｉは、肺中のＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ１０３およびＣＤ６９の発現について表現型決定されたことを示す。図７Ｊは、ブースト後１週間で採取された脾臓中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク－特異的ＩｇＧ＋およびＩｇＡ＋抗体分泌細胞（ＡＳＣ）頻度がＥＬＩＳＰＯＴによって測定されたことを示す。粘膜および細胞媒介応答についてのデータは、２回の実験からプールされる（Ｅ～Ｉ：１群あたりｎ＝７～９；マン・ホイットニー検定：＊＊＊、Ｐ＜０．００１）；Ｊ：１群あたりｎ＝５；マン・ホイットニー検定：＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。（Ｂ～Ｊ）バーおよびカラムは、中央値を示し、点線はアッセイのＬＯＤを示す。 図８Ａ～８Ｃは、ＦＲＮＴによって測定されて、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの鼻内接種が中和抗体を誘起することを示す。５週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスは、鼻内接種経路を介してＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化された。免疫化後１か月で収集された血清試料は、ＦＲＮＴによって中和活性についてアッセイされた。マウスは、プライミング後３０日目にブーストされ、免疫応答を評価するために１週間後に屠殺された。図８Ａは、ＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種マウス由来の血清試料がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株２０１９ ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０を用いて中和活性について検査されたことを示す（１群あたりｎ＝８～１０）。図８Ｂは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種マウス由来の血清試料が組換えルシフェラーゼ発現ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和について検査されたことを示す［野生型（左）およびＤ６１４Ｇ変異体（中央）］。（右）対となるＥＣ５０値が示される（ｎ＝５；ｎ．ｓ．有意でない、対応ｔ検定）。図８Ｃは、ＢＡＬ液がＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種マウスから収集され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株２０１９ ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０の中和がＦＲＮＴアッセイを使用して測定されたことを示す（１群あたりｎ＝８～１０）。各点はＳＤを示すエラーバーと共に２回の技術的反復の平均を表す。 図９Ａ～９Ｅは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた単回用量鼻内免疫化がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して保護することを示す。５週齢ＢＡＬＢ／ｃメスマウスは、鼻内経路を介してＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化された。免疫化後３５日目にマウスは以下のとおりチャレンジされた：動物は、抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂを用いて処置され、１日後に鼻内経路を介してＨｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２を形質導入された。５日後、マウスは、鼻内経路を介して４×１０５ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いてチャレンジされた。図９Ａは、組織および鼻洗浄液が４および８ｄｐｉに分析のために収集されたことを示す。肺における感染性ウイルスは、プラークアッセイによって測定された。図９Ｂは、肺、脾臓、心臓、鼻甲介および鼻洗浄液におけるウイルスＲＮＡレベルが４および８ｄｐｉにＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されたことを示す。図９Ｃは、４ｄｐｉでの肺ホモジネートにおける示されたサイトカインおよびケモカインの遺伝子発現における倍数変化がＲＴ－ｑＰＣＲによって決定され、Ｇａｐｄｈに正規化され、未処置対照と比較されたことを示す（実験２回、ｎ＝６～９；中央値が示される：＊、Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１；マン・ホイットニー検定）。カラムは、中央値を示し、点線はアッセイのＬＯＤを示す。図９Ｄは、肺が８ｄｐｉに採取されたことを示す。切片は、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色され、培率４０×（左；スケールバー、２５０μｍ）、２００×（中央；スケール、５０μｍ）および４００×（右；スケールバー、２５μｍ）で画像化された。各画像は、マウス３匹の群の代表的なものである。図９Ｅは、鼻内経路によってワクチン接種されたＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳマウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの５日前および８日後に得られた対になる血清におけるＥＬＩＳＡ測定抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ ＩｇＭ（左）およびＩｇＧ（右）抗体応答を示す（ｎ＝６：ｎｓ；有意でない；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１；対応ｔ検定）。点線は、未処置血清由来の平均ＩｇＭおよびＩｇＧ力価を表す（ｎ＝６）。 図１０Ａ～１０Ｎは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓが持続的な免疫を誘起することを示す。図１０Ａは、免疫化計画を示す。５週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＩＮまたはＩＭ経路を介して、ウイルス粒子１０１０個のＣｈＡｄ対照または、用量を減少させて（１０１０、１０９および１０８ｖｐ）ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いてワクチン接種された。図１０Ｂ～１０Ｍは、免疫化マウスの血清中の液性応答が評価されたことを示す（ｎ＝６～１４）。ワクチン接種後１００日（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）もしくは２００日（図１０Ｈ～１０Ｉ）でのＩＮ免疫化マウスからの、またはワクチン接種後１００日（図１０Ｅ～１０Ｆ）もしくは２００日（図１０Ｋ～１０Ｌ）でのＩＭ免疫化マウスからのＥＬＩＳＡ測定抗ＳおよびＲＢＤ ＩｇＧおよびＩｇＡレベル。ワクチン接種後１００日（図１０Ｄ、図１０Ｇ）または２００日（図１０Ｊ、図１０Ｍ）でのＩＮ免疫化（図１０Ｄ、図１０Ｊ）またはＩＭ免疫化（図１０Ｇ、図１０Ｍ）マウスからＦＲＮＴによって決定された血清の中和活性。図１０Ｎは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定された骨髄中のＳ特異的ＩｇＧまたはＩｇＡ産生ＬＬＰＣの頻度を示す（ｎ＝４）。（図１０Ｂ～１０Ｍ）について：ワクチンおよび対照群を比較するダネットのポストテストを伴う一元配置ＡＮＯＶＡ：ｎｓ、有意でない；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）（図１０Ｎ）について：マン・ホイットニー検定：＊、Ｐ＜０．０５。Ｂ～Ｎ、バーは中央値を示し、点線はアッセイの検出限界（ＬＯＤ）を示す。 図１１Ａ～１１Ｂは、ＦＲＮＴによって測定されて、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンが中和抗体を誘起することを示す。５週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＩＮまたはＩＭ経路を介して、単回の１０１０、１０９または１０８用量のＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化された。図１１Ａは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種マウス由来の血清試料が１００日目に収集されたことを示す。図１１Ｂは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種マウス由来の血清試料が免疫化後２００日目に収集され、ＦＲＮＴによって中和活性についてアッセイされたことを示す。個々のマウスに対応する血清中和曲線が、示されたワクチンについて示される（１群あたりｎ＝６～１４）。各点は２回の技術的反復の平均を表す。 図１２Ａ～１２Ｅは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの鼻内接種が、Ｆｃエフェクター機能能力を有する抗体応答を誘起することを示す。図１２Ａは、血清が抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＷＡ１／２０２０ Ｄ６１４Ｇ）スパイクおよびＲＢＤ ＩｇＧ１の量を定量化するためにＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームによって分析されたことを示す。バーは平均値を表す。図１２Ｂは、血清がさまざまなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質変異体に対する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＧ１の量を定量化するためにルミネックスによって分析されたことを示す。極座標プロット（Ｐｏｌａｒ ｐｌｏｔ）は、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質および変異体についてのＩｇＧ１パーセンタイルランク中央値を表す。図１２Ｃは、各ワクチンレジメンのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクまたはＲＢＤタンパク質に対するＩｇＧ力価およびＦｃγＲ結合力価を示すヒートマップを示す。各四角は、条件についての群内の平均ｚ－スコアを表す。図１２Ｄは、血清が初代マウス好中球（ｍＡＤＮＰ）またはＪ７７４Ａ．１細胞（ｍＡＤＣＰ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクコートビーズと共にインキュベートされ、ファゴサイトーシスが１時間後に測定されたことを示す。バーは平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。図１２Ｅは、血清が初代マウス好中球（ｍＡＤＮＰ）またはＪ７７４Ａ．１細胞（ｍＡＤＣＰ）およびＷＡ１／２０２０ Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７またはＢ１．３５１スパイクコートビーズと共にインキュベートされ、ファゴサイトーシスが１時間後に測定されたことを示す。極座標プロットは、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質および変異体についてのｍＡＤＮＰまたはｍＡＤＣＰパーセンタイルランク中央値を表す。（ＡおよびＤ）について：ワクチンを対照群と比較するダネットのポストテストを伴う一元配置ＡＮＯＶＡ：＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）（ＡおよびＤ）：バーは中央値を示す。 図１３Ａ～１３Ｌは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの保護有効性の持続性を示す。５週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＩＮまたはＩＭ経路を介して、１０１０ｖｐのＣｈＡｄ対照または１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化された。免疫化後１００または２００日目に、マウスは以下のとおりチャレンジされた：動物は、抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂを用いて処置され、１日後にＩＮ経路を介してＨｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２を形質導入された。５日後、マウスは、鼻内経路を介して５×１０４ ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＡ１／２０２０を用いて接種された。組織は４ｄｐｉに採取され、ウイルスＲＮＡレベルは、免疫化の１００（図１３Ａ～１３Ｆ）または２００（図１３Ｇ～１３Ｌ）日後にチャレンジされたマウスからＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された（ｎ＝６～１４、ダンのポストテストを伴うクラスカル・ワルス：ｎｓ、有意でない；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１ ＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）。バーは中央値を示し、点線はアッセイのＬＯＤを示す。 図１４Ａ～１４Ｈは、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスでの鼻内投与ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの免疫原性を示す。５週齢Ｋ１８－ｈＡＣＥ２メスマウスは、１０９ｖｐ ＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いてＩＮ経路を介して免疫化された。免疫化後６週間（図１４Ａ～１４Ｄ、ｎ＝２０）または９か月（図１４Ｅ～１４Ｈ、ｎ＝７）でのマウスの血清中における抗体応答が評価された。ＥＬＩＳＡ測定ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧ（図１４Ａ、図１４Ｅ）およびＩｇＡレベル（図１４Ｂ、図１４Ｆ）、ならびにＦＲＮＴ決定中和活性（図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｇ、図１４Ｈ）。図１４Ｃ～１４Ｄ、図１４Ｇ～１４Ｈ、免疫化マウスから６週間（図１４Ｃ、図１４Ｄ）または９か月（図１４Ｇ）で収集された、ＷＡ１／２０２０およびＷａｓｈ－Ｂ．１．３５１（図１４Ｃ、図１４Ｇ）またはＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８（図１４Ｄ、図１４Ｈ）に対する血清中和活性のペア分析。図１４Ａ～１４Ｂ、図１４Ｅ～１４Ｆ：マン・ホイットニー検定：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。図１４Ｃ～１４Ｄ、図１４Ｇ～１４Ｈ：両側ウィルコクソンマッチドペア符号付順位検定：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 図１５Ａ～１５Ｔは、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおいてＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓが変異体ウイルスに対する交差保護を付与することを示す。図１５Ａは、実験計画を示す。５週齢Ｋ１８－ｈＡＣＥ２メスマウスは、ＩＮ経路を介して１０１０ｖｐのＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化された。図１５Ｂ～１５Ｏは、免疫化後６週間で、マウスが、１０４ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＷａｓｈ－Ｂ．１．３５１（図１５Ｂ～１５Ｆ）、Ｗａｓｈ－Ｂ．１．１．２８（図１５Ｇ～１５Ｋ）またはＷＡ１／２０２０（図１５Ｌ～１５Ｏ）を用いてチャレンジされたことを示す。図１５Ｐ～１５Ｔは、免疫化後９か月で、マウスが１０４ＦＦＵのＷａｓｈ－Ｂ．１．３５１を用いてチャレンジされたことを示す。図１５Ｂ、図１５Ｇ、図１５Ｌ、図１５Ｐ。経時的体重変化。データは、ワクチン群を対照群と比較した平均±ＳＥＭである（各群についてｎ＝６～９；曲線下面積について非対応ｔ検定、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１）。図１５Ｃ～１５Ｆ、図１５Ｈ～１５Ｋ、図１５Ｍ～１５Ｏ、図１５Ｑ～１５Ｔ。肺、心臓、脳および鼻洗浄液におけるウイルスＲＮＡレベルは、６ｄｐｉにＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された（ｎ＝６～９；マン・ホイットニー検定：＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１）。バーは中央値を示し、点線はアッセイのＬＯＤを示す。 図１６Ａ～１６Ｂは、ＦＲＮＴによって測定されてＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンが、中和抗体を誘起することを示す。図４と関連する。５週齢Ｋ１８－ｈＡＣＥ２メスマウスは、１０９ｖｐ ＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いてＩＮ経路を介して免疫化された。図１６Ａは、血清試料が６週間で収集されたことを示す。図１６Ｂは、血清試料が免疫化後９か月で収集され、ＷＡ１／２０２０、Ｗａｓｈ－Ｂ．１．３５１またはＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８に対する中和活性についてＦＲＮＴによってアッセイされたことを示す。個々のマウスに対応する血清中和曲線は、示されたワクチン（１群あたりｎ＝７～２０）について示されている。各点は、２回の技術的反復の平均を表す。
本開示は少なくとも部分的に、コロナウイルス感染を処置または防止するための組換え非ヒトアデノウイルスベクター組成物およびその免疫原性組成物の開発に基づいている。さらに、本開示は、コロナウイルス感染に対する持続的な細胞性および液性の媒介免疫を提供する本明細書で開示する組成物を投与する方法を提供する。例えば、本開示は、鼻内ワクチン接種によって誘起される、筋肉内投与と比較して改善された粘膜免疫を示し、それによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝染を限定する鼻内投与のための組成物を提供する。
本明細書で示すように、本開示のアデノウイルス組成物の筋肉内投薬はＳタンパク質に対する強固な全身性の液性および細胞媒介の免疫応答を誘起し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のチャレンジ後の肺の感染、炎症、および病変に対して保護するが、ウイルス感染の残存が検出された。対照的に、本開示のアデノウイルス組成物の単回の鼻内投薬は、高レベルの全身性および粘膜のＩｇＡ免疫応答を誘起し、上気道および下気道の感染を完全に防止し、殺菌免疫を付与する。重要なことに、ワクチン接種した対象から得た血清もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体（例えばＳタンパク質のＤ６１４Ｇ突然変異を含む変異体。この適合突然変異を有するウイルスは現在世界的に広まっており、少なくとも細胞培養ではより大きな感染力に関連している）を効率的に中和する。したがって、本開示のアデノウイルス組成物の鼻内投与は（単回用量としてでさえも）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染および伝染を防止し、その汎発性流行を抑制するために有用である。
本出願人は、開示した組成物による単回用量の鼻内免疫化が筋肉内免疫化よりも優れた液性免疫を促進すること、１００分の１の低い接種用量が強固な中和抗体応答を誘起すること、筋肉内でなく鼻内の免疫化がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する血清ＩｇＡ応答およびＩｇＡ特異的長寿命形質細胞（ＬＬＰＣ）を誘起すること、ならびに本開示の組成物によって誘起された液性免疫は持続的で、ワクチン接種後６か月の期間にわたって上昇することを発見した。
２００２～２００４年のＳＡＲＳの流行に関与していた重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、２０１２年に初めて報告されたＭＥＲＳを惹起した中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、およびより最近のコロナウイルス疾患２０１９（Ｃｏｖｉｄ－１９）の大流行に関与しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は全て、細胞に感染するために細胞表面上のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合する。基本的にはＡＣＥ－２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、およびＭＥＲＳ－ＣＯＶ、ならびに最も起こり得る将来のＳＡＲＳ－ＣＯＶ変異体の機能性受容体である。ＡＣＥ－２はレニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）の重要な成分である。ＡＣＥ－２はアンジオテンシン２をアンジオテンシン１～７に変換する。高いアンジオテンシン２は血管収縮、炎症、および急性肺傷害に関連している。ＡＣＥ２は、肺、心臓、腎、肝、腸、およびその他の組織を含む種々の臓器で発現する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスはＡＣＥ－２に結合して細胞に進入する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡゲノムはほぼ３０，０００ヌクレオチドの長さである。５’側の３分の２はゲノムの複製およびウイルスＲＮＡの合成を可能にする非構造タンパク質をコードしている。残りの３分の１はスパイク（Ｓ）、エンベロープ、膜、および球状ビリオンを形成するヌクレオプロテイン（ＮＰ）等の構造タンパク質、ならびに細胞応答を規制するアクセサリータンパク質をコードしている。Ｓタンパク質はビリオン上でホモトリマー性スパイクを形成し、細胞表面受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と連動してヒト細胞中へのコロナウイルスの進入を促進する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質は進入プロセスの間に連続的に切断されてＳ１およびＳ２断片を生じ、続いてＳ２がさらにプロセシングされてより小さなＳ２’タンパク質が生じる（Hoffmann et al., 2020）。Ｓ１タンパク質は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、Ｓ２タンパク質は膜の融合を促進する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の可溶性で安定化された融合前形態の構造は低温電子顕微鏡によって解明され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質とのかなりの類似性が明らかになっている。Ｓタンパク質のこの形態は強い中和性のモノクローナル抗体によって認識され、有望なワクチン標的として役立つ可能性がある。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム配列の公開は、主としてウイルスＳタンパク質を標的とするワクチン候補の開発を直ちに開始するよう、学界、政府、および産業界のグループを鼓舞した。ＤＮＡプラスミド、脂質ナノ粒子カプセル化ｍＲＮＡ、不活化ビリオン、およびウイルスベクター化ワクチンを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を送達する多数のプラットフォームが開発されてきた。いくつかのワクチンは安全性を評価する臨床試験に入り、いくつかは免疫原性および有効性を評価する試験に進んだ。流行の緊急性のため、大部分のワクチンは動物における実質的な有効性データなしにヒトでの試験に進んだ。この状況は、部分的にはワクチンの設計および開発がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染および病因論の到達可能な前臨床疾患モデルの生成よりも速かったために起こった。
ベータコロナウイルスに対するアデノウイルス（Ａｄ）系ワクチンはすでに評価されてきた。ＭＥＲＳ－ＣｏＶの完全長のＳタンパク質をコードするチンパンジーＡｄベクター化ワクチンの単回投薬は、ヒトジペプチジルペプチダーゼ４（ｈＤＰＰ４）トランスジェニックマウスを感染から保護し、ウイルスの流出を低減し、ラクダにおける生存を増強し、ヒトの第１相臨床試験で安全かつ免疫原性であった。ＭＥＲＳ Ｓ１－ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質を発現するヒトＡｄ系ワクチンも、トランスジェニックｈＤＤＰ４マウスにおいて保護的であった。完全長のＳタンパク質を発現するＡｄ系ＳＡＲＳ－ＣｏＶワクチンは、フェレットにおいてチャレンジの後に肺炎を防止し、アカゲザルにおいて高度に免疫原性であった。野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするチンパンジーＡｄベクター（Ｙ２５、サルＡｄ－２３）（ＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９）は、現在ヒトで単回筋肉内注射として評価中である（ＮＣＴ０４３２４６０６）。予備的なプレプリント解析は、このワクチンが肺の感染および肺炎に対して保護するが、上気道感染および鼻におけるウイルスの流出に対しては保護しないことを示唆している（doi.org/10.1101/2020.05.13.093195）。
呼吸器ウイルス感染を有しているリスクがあるか、呼吸器ウイルス感染の軽度の症状を有しているか、または呼吸器ウイルス感染の重篤な症状を有している個体を処置するための組成物、方法、および処置計画が本明細書で開示される。本開示の組成物は、呼吸器ウイルス感染の感染力を処置、防止、または低減するために使用してよい。処置計画は、ウイルス感染を有しているリスクがあるかウイルス感染を有している個体に本開示の組成物を投与し、それによりウイルス感染を防止または処置することを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスの伝染は上気道におけるウイルス感染を低減することによって防止または低減され得る。本開示の組成物および方法は、強固な抗原特異的抗体、中和抗体、ならびにＢ細胞およびＴ細胞の応答を提供する。これにより、ウイルスの産生、炎症、および肺の病変の顕著な低減を伴う感染に対する保護が付与される。本開示の組成物および方法は、血清および肺における高レベルの中和性および抗ＲＢＤのＩｇＡおよびＩｇＧならびに肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的常在メモリーＴ細胞を含む強固な粘膜免疫を生成する。開示した組成物および方法は、鼻道、上気道、肺組織、および播種の可能性のある他の全ての部位においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して完全に保護する。抗ＮＰおよび抗ＯＲＦ８応答の測定に基づいて、本開示の組成物の単回鼻内投薬は殺菌免疫を付与する。これはいずれのＣｏｖｉｄ－１９ワクチンについても、まして単回用量投薬でも、これまで記載されていなかった。
本開示の組成物は局所的に、例えば鼻内に（例えば鼻スプレイまたは吸入として）、または全身的に（例えば静脈内または腹腔内）製剤化され、呼吸器ウイルス感染（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のコロナウイルス感染）を処置または防止するために投与してよい。本開示の組成物（例えば経鼻デリバリーまたは吸入のために製剤化された組成物）は、ウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染に罹患しているリスクがあり得る対象に投与してよい。例えば、本開示の組成物は、高リスクの環境にある個体（例えば医療従事者）、ウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に曝露されたか、もしくは曝露されたと疑われる個体、またはウイルス感染について陽性と検査された個体に投与してよい。本開示の組成物は、呼吸器感染（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）の症状を呈しているか、または投与の時点では無症状の個体に投与してよい。一部の実施形態では、本開示の組成物は、個体によって（例えば鼻スプレイまたは吸入として）自己投与してよく、医療施設の外（例えば家庭）で投与してもよい。
本明細書で開示する方法および組成物は、呼吸器ウイルス感染の感染力を処置、防止、または低減するために使用してよい。一部の実施形態では、ウイルス感染はコロナウイルス感染であってよい。潜伏期間の中央値が約５日であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等の長い潜伏期間を有する病原体は、感染した多くの個体が感染したことに気付かないので、伝染の高いリスクを有し得る。さらに、コロナウイルスのキャリアは無症状であるか軽度の症状を有することが多く、ウイルスの宿主とその他の集団構成員との間の気付かない接触がもたらされる。コロナウイルス感染のリスクがある対象がコロナウイルス感染の無症状キャリアと接触し、それにより気付かないうちにコロナウイルス感染に罹患することがある。リスクがある個体（例えばコロナウイルスのキャリアと接触した、またはコロナウイルスのキャリアと接触するかもしれない個体）におけるコロナウイルス感染を防止するための方法および組成物が必要である。一部の実施形態では、本明細書で開示する組成物、方法または処置レジメンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（例えばＣＯＶＩＤ－１９）を処置または防止し得る。
開示した組成物を調製するために使用すべき成分、ならびに本明細書で開示する方法の中でそれ自体を使用すべき組成物を以下に論じる。これらのおよびその他の材料は本明細書で開示されており、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されるが、種々の個体および集合的組合せのそれぞれならびにこれらの化合物の順列に関する特定の言及が明示的には開示されないこともある場合、それぞれが本明細書で具体的に意図され記述されていることが理解される。例えば、特定の化合物が開示され、論じられて、その化合物のいくつかの分子に対して行うことができるいくつかの改変が論じられれば、化合物のありとあらゆる組合せおよび順列、ならびに反対に具体的に示されない限り可能な改変が具体的に意図されている。即ち、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが開示され、分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスおよび組合せ分子Ａ－Ｄの例も開示されれば、それぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれはＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、およびＣ－Ｆの組合せが開示されているとみなされることを意味していることが個別にかつ集団的に意図されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも開示されている。即ち、例えばＡ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、およびＣ－Ｅのサブグループは開示されているとみなされる。この概念は、開示した組成物を作製し使用する方法における工程を含むがそれらに限らない本出願の全ての態様に適用される。即ち、実施することができる種々のさらなる工程があれば、これらのさらなる工程のそれぞれは、開示した方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組合せとともに実施できることが理解される。
本発明の種々の態様を以下の節でさらに詳細に記述する。
Ｉ．定義
本発明がさらに容易に理解できるように、ある種の用語を最初に定義する。他に定義しなければ、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明の実施形態が関係する技術における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様の、それを改変した、またはそれと等価な多くの方法および材料は、過度の実験なしに本発明の実施形態の実施において使用することができ、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。本発明の実施形態の記載および特許請求において、以下の用語は、以下に説明する定義に従って使用する。
アジュバントは、抗原性を増強するために使用される媒体を意味する。一部の実施形態では、アジュバントは、その上に抗原が吸着される鉱物（アラム、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、または抗原性をさらに増強する（抗原の分解を阻害し、および／またはマクロファージの流入を惹起する）ための死滅したミコバクテリウムを内包することもある（フロイント完全アジュバント）、例えばその中で抗原溶液が鉱油中で乳化される油中水エマルジョン（フロイント不完全アジュバント）を含み得る。一部の実施形態では、開示した免疫原性化合物において使用されるアジュバントは、レシチンとカルボマーホモポリマー（例えばＡｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＡｄｊｕｖａｎｔｓ，ＬＬＣから入手可能なＡＤＪＵＰＬＥＸ（商標）アジュバント、Wegmann, Clin Vaccine Immunol, 22(9): 1004-1012, 2015も参照されたい）の組合せである。開示した免疫原性組成物における使用のためのさらなるアジュバントには、ＱＳ２１精製植物抽出物、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ、ＡＳ０１、ＭＦ５９、およびＡＬＦＱアジュバントが含まれる。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むもの等）も、アジュバントとして使用できる。アジュバントには、共刺激分子等の生物学的分子（「生物学的アジュバント」）が含まれる。例示的なアジュバントには、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、およびトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えばＴＬＲ－９アゴニストが含まれる。アジュバントに関するさらなる説明は、例えばSingh (ed.) Vaccine Adjuvants and Delivery Systems. Wiley-Interscience, (2007)に見ることができる。アジュバントは、開示した組成物と組み合わせて使用することができる。
アミノ酸置換は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えである。
用語「抗体」は、コロナウイルスＳタンパク質、その抗原性断片、または抗原のダイマーもしくはマルチマー等の分析物質（抗原）を特異的に結合し認識する免疫グロブリン、抗原結合性断片、またはそれらの誘導体を意味する。用語「抗体」は本明細書では最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二特異性抗体）および抗体断片を含むがそれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体の非限定的な例には、例えば無傷の免疫グロブリンならびに抗原に対する結合親和性を保持しているその変異体および断片が含まれる。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれるがそれらに限定されない。抗体断片には、抗体全体の改変によって産生された抗原結合性断片または組換えＤＮＡ技術を使用してデノボで合成された抗体結合性断片が含まれる（例えばKontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2nd Ed., Springer Press, 2010を参照されたい）。
「保存的な」アミノ酸置換は、タンパク質の機能、例えば対象に投与した際に免疫応答を誘起するタンパク質の能力に実質的に影響せずまたはそれを低下させない置換である。用語「保存的変形形態」は、未置換の親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸を使用することも含む。さらに、コードされた配列における単一のアミノ酸または小さなパーセンテージのアミノ酸（例えば５％未満、一部の実施形態では１％未満）を変化、付加、または欠失させる欠失または付加は、その変化が化学的に同様のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合には、保存的変形形態である。
以下の６つのグループは、互いに保存的置換とみなされるアミノ酸の例である。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
非保存的置換は、組換えコロナウイルスＳ細胞外ドメイントリマーの活性または機能、例えば対象に投与した場合に免疫応答を誘起する能力を低減させる置換である。例えば、アミノ酸残基がタンパク質の機能に重要であれば、それ以外での保存的な置換であってもその活性を崩壊させることがある。即ち、保存的置換は目的のタンパク質の基本的機能を変化させない。
コロナウイルスは、重篤な呼吸器疾患を惹起することが知られているポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリーである。コロナウイルスファミリーの中でヒトに感染することが現在知られているウイルスは、アルファコロナウイルス属およびベータコロナウイルス属由来のものである。さらに、ガンマコロナウイルス属およびデルタコロナウイルス属が将来ヒトに感染する可能性があると考えられている。
ベータコロナウイルスの非限定的な例には、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＫＵｌ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＯＣ４３－ＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ－ＣｏＶ）、コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＷＩＶ１（ＷＩＶｌ－ＣｏＶ）、およびヒトコロナウイルスＨＫＵ９（ＨＫＵ９－ＣｏＶ）が含まれる。アルファコロナウイルスの非限定的な例には、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（２２９Ｅ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＬ６３－ＣｏＶ）、ブタ流行性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）、および伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）が含まれる。デルタコロナウイルスの非限定的な例としては、ブタデルタコロナウイルス（ＳＤＣＶ）がある。
ウイルスゲノムはキャップされ、ポリアデニル化され、ヌクレオカプシドタンパク質によってカバーされる。コロナウイルスビリオンは、スパイク（Ｓ）タンパク質と称されるＩ型融合糖タンパク質を含むウイルスエンベロープを含む。大部分のコロナウイルスは、ゲノムの５’部分に含まれるレプリカーゼ遺伝子およびゲノムの３’部分に含まれる構造遺伝子との共通のゲノム構成を有している。
コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質：先駆体タンパク質として初期に合成されるクラスＩ融合糖タンパク質。個別の先駆体Ｓポリペプチドはホモトリマーを形成し、ゴルジ装置の中でグリコシル化、ならびにプロセシングを受けてシグナルペプチドが除去され、細胞プロテアーゼによって切断されて個別のＳ１およびＳ２ポリペプチド鎖を生じる。これらはホモトリマーの中でＳ１／Ｓ２プロトマーとして会合したままであり、したがってヘテロダイマーのトリマーである。Ｓ１サブユニットはウイルス膜の遠位にあり、ウイルスのその宿主受容体への付着を媒介する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでいる。Ｓ２サブユニットは、融合ペプチド等の融合タンパク質機構、２つのヘプタッド繰り返し配列（ＨＲ１およびＨＲ２）および融合糖タンパク質の典型的な中央ヘリックス、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質性のテイルドメインを含んでいる。
コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の融合前コンフォメーションは、分泌系における成熟コロナウイルスＳタンパク質へのプロセシングに続き、コロナウイルスＳの融合後コンフォメーションへの遷移をもたらす融合イベントの誘発に先立つ、コロナウイルスＳタンパク質の細胞外ドメインによって採用される構造コンフォメーションである。融合前コンフォメーションにおける例示的なコロナウイルスＳタンパク質（ＨＫＵ１－ＣｏＶ）の三次元構造は本明細書で開示しており、Kirchdoerfer et al., "Pre-fusion structure of a human coronavirus spike protein," Nature, 531 : 118-121, 2016 （参照により本明細書に組み込まれる）で提供されている。
「融合前コンフォメーションで安定化された」コロナウイルスＳ細胞外トリマーは、天然のコロナウイルスＳ配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含み、これが対応する天然のコロナウイルスＳ配列から形成されたコロナウイルスＳ細胞外ドメイントリマーと比較して融合前コンフォメーションの保持の増大を提供している。１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入による融合前コンフォメーションの「安定化」は、例えばエネルギー的安定化（例えば融合後のオープンコンフォメーションに対する融合前コンフォメーションのエネルギーの低減）および／または速度論的安定化（例えば融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの遷移速度の低減）であり得る。さらに、融合前コンフォメーションにおけるコロナウイルスＳ細胞外ドメイントリマーの安定化は、対応する天然のコロナウイルスＳ配列と比較して変性への耐性の増大を含み得る。コロナウイルスＳ細胞外ドメイントリマーが融合前コンフォメーションにあるか否かを判定する方法は本明細書で提供しており、融合前コンフォメーションに特異的な抗体を使用する陰性染色電子顕微鏡および抗体結合アッセイを含む（しかしこれらに限定されない）。
縮重変異体：本開示の文脈では、「縮重変異体」は、遺伝子コードの結果として縮重した配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。２０種の天然のアミノ酸があり、それらの大部分は２つ以上のコドンで特定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が変化しない限り、ペプチドをコードする全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
一例では、所望の応答はＣｏＶ（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染を阻害、低減、または防止することである。本方法が効果的であるためには、ＣｏＶ感染は完全に除去または低減または防止される必要はない。例えば、有効量の免疫原の投与は、（例えば細胞の感染によって、またはＣｏＶに感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定して）所望の量、例えば好適な対照と比較して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも１００％（検出可能なＣｏＶ感染の除去または防止）ＣｏＶ感染を減少させる免疫応答を誘起することができる。エピトープ：抗原決定基。これらは抗原性である分子上の特定の化学基またはペプチド配列であり、したがって特定の免疫応答を誘発する。例えばエピトープはＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。抗体は特定の抗原性エピトープ、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ細胞外ドメイン等のコロナウイルスＳ細胞外ドメイン上のエピトープに結合することができる。エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次元フォールディングによって並置された連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。
発現は、核酸配列の転写または翻訳を意味する。例えば、遺伝子はそのＤＮＡがＲＮＡまたはＲＮＡ断片に転写される際に発現され、いくつかの例ではこれはプロセシングされてｍＲＮＡになる。遺伝子はそのｍＲＮＡがアミノ酸配列、例えばタンパク質またはタンパク質断片に翻訳される際にも発現されることがある。特定の例では、異種遺伝子はそれがＲＮＡに転写される際に発現される。別の例では、異種遺伝子はそのＲＮＡがアミノ酸配列に翻訳される際に発現される。用語「発現」は、本明細書で転写または翻訳を示すために使用される。発現の規制は、転写、翻訳、ＲＮＡの輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解における、または特定のタンパク質分子が産生された後の活性化、不活化、区画化、もしくは分解による、制御を含み得る。
発現制御配列は、それが作動可能に連結された異種核酸配列の発現を規制する核酸配列を意味する。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写および適切な場合には翻訳を制御し規制する場合に、核酸配列に作動可能に連結されている。即ち、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コーディング遺伝子の前の開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適正な翻訳を可能にする遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および停止コドンを含み得る。用語「制御配列」は、その存在が発現に影響し得る成分を最小限度含むことを意図しており、その存在が有利であるさらなる成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含み得る。発現制御配列はプロモーターを含み得る。
プロモーターは、転写を指令するために十分な最小の配列である。プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的、または外部のシグナルもしくは薬剤によって誘起できるように制御可能にするために十分なプロモーターエレメントも含まれる。そのようなエレメントは遺伝子の５’または３’の領域に位置してよい。構成性および誘導性の両方のプロモーターが含まれる（例えばBitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987を参照されたい）。例えば、細菌系でクローニングする場合には、バクテリオファージラムダのｐＬおよび、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ－ｌａｃハイブリッドプロモーター）等の誘導性プロモーターを使用することができる。一実施形態では、哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイウスから誘導されたプロモーター（例えばレトロウイルスの長いターミナルリピート；アデノウイルスの後期プロモーター；ワクチニアウイルスの７．５Ｋのプロモーター）を使用することができる。組換えＤＮＡまたは合成手法によって産生されたプロモーターも、核酸配列の転写を提供するために使用してよい。発現ベクター：発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクター。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含む。発現のためのその他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ（in vitro）発現系によって供給される。発現ベクターには、当技術で既知の発現ベクターの全て、例えばコスミド、プラスミド（例えば裸のまたはリポソームに含まれる）、および組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス（例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
用語「異種」は、異なる遺伝子源に起源することを意味する。細胞に対して異種の核酸分子は、それが発現される細胞以外の遺伝子源に起源している。特定の非限定的な１つの例では、組換えコロナウイルスＳタンパク質をコードする異種核酸分子は、哺乳動物細胞等の細胞内で発現される。細胞または生命体の中に異種核酸分子を導入する方法、例えば電気穿孔、リポフェクション、粒子銃加速、および相同的組換えを含む、核酸による形質転換は当技術で周知である。
宿主細胞は、その中でベクターが増殖することができ、そのＤＮＡが発現される細胞を意味する。細胞は原核細胞または真核細胞であってよい。この用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も含む。複製の間に起こる突然変異があり得るので、全ての子孫が親細胞と同一ではない可能性があることが理解される。しかし、用語「宿主細胞」が使用される場合には、そのような子孫は含まれる。
免疫応答は、刺激に対する免疫系の細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、または単球の応答である。一実施形態では、応答は特定の抗原に特異的（「抗原特異的応答」）である。一実施形態では、免疫応答はＴ細胞の応答、例えばＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、特定の抗体の産生をもたらす。
核酸分子はヌクレオチドのポリマー形態であり、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態および混合ポリマーを含み得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかの型のヌクレオチドの改変された形態を意味する。本明細書で使用される用語「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は通常、他に特定されない限り少なくとも１０塩基の長さである。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチドリンケージによって互いに連結された天然に存在するヌクレオチドと改変されたヌクレオチドの一方または両方を含み得る。「ｃＤＮＡ」は、一本鎖または二本鎖の形態の、ｍＲＮＡに対して相補的または同一であるＤＮＡを意味する。「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（即ちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列、およびそれに起因する生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型としての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を意味する。
用語「作動可能に連結された」は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、第１の核酸配列が第２の核酸配列と作動可能に連結されていることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するならば、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結された核酸配列は連続しており、２つのタンパク質コーディング領域を連結するために必要な場合には、同じリーディングフレーム内にある。
ポリペプチドは、長さまたは翻訳後改変（例えばグリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミノ酸の任意の鎖である。「ポリペプチド」は、天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーを含むアミノ酸のポリマーに適用され、またその中で１つまたは複数のアミノ酸残基は非天然アミノ酸、例えば天然に存在する対応するアミノ酸の人工の化学的模倣体でもある。「残基」は、アミド結合またはアミド結合の模倣体によってポリペプチドの中に組み込まれたアミノ酸またはアミノ酸の模倣体を意味する。ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ－末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有する。「ポリペプチド」はペプチドまたはタンパク質と相互交換可能に使用され、本明細書でアミノ酸残基のポリマーを意味するために使用される。
プライムブーストワクチン接種は、免疫応答を誘起するための、対象への第１の免疫原性組成物（プライマリーワクチン）の投与およびそれに続く第２の免疫原性組成物（ブースターワクチン）の投与を含む免疫療法である。プライミングワクチンおよび／またはブースターワクチンは、免疫応答が指向される抗原を発現するベクター（例えばウイルスベクター、ＲＮＡまたはＤＮＡベクター）を含む。ブースターワクチンはプライミングワクチンの後で対象に投与される。プライミングワクチンとブースターワクチンの投与の間の好適な時間間隔およびそのような時間枠の例を本明細書で開示する。一部の実施形態では、プライミングワクチン、ブースターワクチン、またはプライマーワクチンとブースターワクチンの両方は、アジュバントをさらに含む。１つの非限定的な例では、プライミングワクチンはＤＮＡ系ワクチン（または遺伝子デリバリーに基づくその他のワクチン）であり、ブースターワクチンはタンパク質サブユニットまたはタンパク質ナノ粒子に基づくワクチンである。
組換え核酸分子は天然に存在しない配列を有する分子であり、例えば１つまたは複数の核酸の置換、欠失、または挿入を含み、および／または別の方法で分離している２つの配列のセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有する。この人工的な組合せは、化学合成またはより一般的には核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば遺伝子操作技法によって、達成することができる。組換えウイルスは、組換え核酸分子を含むゲノムを含むウイルスである。組換えタンパク質は、天然に存在しない配列を有するか、または別の方法で分離している２つの配列のセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、細菌もしくは真核生物の細胞等の宿主細胞の中、または組換えウイルスのゲノムの中に導入された異種の（例えば組換え）核酸によってコードされる。
配列同一性はアミノ酸配列の間の類似性であり、配列の間の類似性の観点で表され、そうでなければ配列同一性と称される。配列同一性は同一性パーセンテージの観点で測定されることが多く、パーセンテージが高くなるほど２つの配列の類似性が高くなる。ポリペプチドのホモログ、オルソログ、または変異体は、標準的な方法を使用して整列した場合に比較的高度の配列同一性を有することになる。
比較のための配列の整列法は当技術で周知である。種々のプログラムおよび配列アルゴリズムが、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981、Needleman & Wunsch, /. Mol. Biol. 48:443, 1970、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988、Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988、Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989、Corpet et al, Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988、Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992、およびPearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403- 10, 1990は、配列整列法およびホモロジー計算の詳細な考察を提示している。
ポリペプチド（コロナウイルスＳ細胞外ドメイン等）のホモログおよび変異体は、典型的には目的のアミノ酸配列と完全長の整列にわたってカウントした少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の保有によって特徴付けられる。参照配列とさらに大きな類似性を有するタンパク質は、本方法によって評価した場合に増大する同一性パーセンテージ、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示すことになる。全体未満の配列を配列同一性について比較する場合には、ホモログおよび変異体は、典型的には１０～２０個のアミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を保有することになり、参照配列とのそれらの類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を保有し得る。そのような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定する方法はインターネットのＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％の同一性」または同様の言語への言及は、特定した参照配列との「少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらに１００％同一性」を意味する。
ワクチンは、対象において予防的免疫応答または治療的免疫応答を誘起する医薬組成物である。一部の場合では、免疫応答は保護的免疫応答である。典型的には、ワクチンは、病原体、例えばウイルス病原体の抗原への、または病的状態に関連する細胞成分への抗原特異的免疫応答を誘起する。ワクチンは、ポリヌクレオチド（例えば開示した抗原をコードする核酸）、ペプチドもしくはポリペプチド（例えば開示した抗原）、ウイルス、細胞、または１つもしくは複数の細胞成分を含み得る。非限定的な例では、ワクチンは、コロナウイルス感染（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染）に関連する症状の重症度を低減し、および／または対照と比較してウイルス負荷を減少させる免疫応答を誘起する。別の非限定的な例では、ワクチンは、対照と比較してコロナウイルス感染（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染）を低減および／または防止する免疫応答を誘起する。
ベクターは、目的の抗原のコード配列に作動性に連結され、コード配列を発現することができるプロモーターを有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む実体である。非限定的な例には、裸のもしくはパッケージされた（脂質および／またはタンパク質）ＤＮＡ、裸のもしくはパッケージされたＲＮＡ、複製能力がなくてもよいウイルスもしくは細菌もしくはその他の微生物の副成分、または複製能力があってもよいウイルスもしくは細菌もしくはその他の微生物が含まれる。ベクターはコンストラクトと称されることもある。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列、例えば複製の起点を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当技術で既知のその他の遺伝エレメントも含み得る。ウイルスベクターは、１つまたは複数のウイルスから誘導された少なくともいくつかの核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、いくつかのウイルスのいずれかから誘導された複製しないウイルスのシェルである。ＶＬＰは一般に１つまたは複数のウイルスタンパク質、例えばそれらに限定されないが、カプシド、コート、シェル、表面および／もしくはエンベロープのタンパク質と称されるタンパク質、またはこれらのタンパク質から誘導された粒子形成性ポリペプチドからなっている。ＶＬＰは、適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現に際して自然に形成することがある。特定のＶＬＰを産生する方法は当技術で既知である。ウイルスタンパク質の組換え発現に続くＶＬＰの存在は、当技術で既知の従来の手法を使用して、例えば電子顕微鏡、生物物理学的特徴解析等によって検出することができる。さらに、ＶＬＰは既知の手法、例えば密度勾配遠心分離によって単離し、特徴的な密度バンディングによって同定することができる。例えばBaker et al. (1991) Biophys. J. 60: 1445-1456、およびHagensee et al. (1994) /. Virol. 68:4503-4505、Vincente, J Invertebr Pathol., 2011、Schneider-Ohrum and Ross, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 354: 53073, 2012を参照されたい。
ＩＩ．組成物
本開示の組成物は１つまたは複数の活性薬剤を含んでよい。一部の実施形態では、活性薬剤はウイルス感染の感染力を防止、処置、または低減する薬剤であってよい。一部の実施形態では、ウイルス感染の処置は、ウイルスの感染力および／または伝染を低減することを含み得る。一部の実施形態では、ウイルス感染の防止は、ウイルスの感染力および／または伝染を低減することを含み得る。本開示の組成物は、ウイルス感染を防止する活性薬剤、ウイルス感染を処置する活性薬剤、ウイルス感染の感染力を低減する活性薬剤、またはそれらの組合せを含んでよい。本開示の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含んでよい。さらに、本開示の組成物は、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着香剤、塩（本発明の物質はそれ自体、薬学的に許容される塩の形態で提供されてよい）、緩衝剤、コーティング剤、または抗酸化剤を含んでよい。
本開示は、呼吸器ウイルス感染を処置または防止するための、非ヒトアデノウイルスベクター組成物ならびにアデノウイルスベクターを含み、１つまたは複数のさらなる活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含んでもよい免疫原性組成物を使用する方法に関する。本出願人は、サルアデノウイルスベクターを使用することによって、ヒトアデノウイルスベクタープラットフォーム（ＰＭＩＤ：３２４５０１０６）において見られていた異種ベクター交差免疫の問題が克服されることを発見した。本出願人は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２「Ｓ」タンパク質の安定化形態等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を発現するチンパンジーアデノウイルスベクターの中に構成し、それが疾患の動物モデルにおいてＣＯＶＩＤ－１９に対して保護できることを示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原またはその免疫原性部分は、アデノウイルスベクターの中で発現された場合、ヒトの感染に際して免疫応答を刺激し、それによりＣＯＶＩＤ－１９疾患に対する免疫を付与することができる。
本発明のその他の態様を、以下により詳細に述べる。
ａ）アデノウイルスベクター
本開示はアデノウイルスベクターを提供する。アデノウイルスは非エンベロープウイルスであり、直径は約９０～１００ｎｍで、ヌクレオカプシドおよび直鎖状の二本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ウイルスのヌクレオカプシドは、ペントンおよびヘキソンのカプソマーを含む。特有の線維がそれぞれのペントンベースに付随しており、宿主細胞の表面上のコクサッキーアデノウイルス受容体を介して宿主細胞へのウイルスの付着を補助している。５０種を超えるアデノウイルスの血清型株が同定されており、その大部分はヒトにおいて呼吸器感染、結膜炎、および胃腸炎の原因となる。宿主のゲノムに一体化されるよりは、アデノウイルスは通常は宿主細胞の核におけるエピソーマルエレメントとして複製する。アデノウイルスのゲノムは４つの早期転写ユニット（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４）を含み、これらは主として規制機能を有し、宿主細胞をウイルス複製のために準備させる。ゲノムは５つの後期転写ユニット（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５）も含み、これらはペントン（Ｌ２）、ヘキソン（Ｌ３）、スカフォールドタンパク質（Ｌ４）、および線維タンパク質（Ｌ５）を含む構造タンパク質をコードし、これらは単一のプロモーターの制御下にある。ゲノムのそれぞれの先端は、ウイルス複製に必要なインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む。
組換えアデノウイルスは当初、遺伝子療法のために開発されたが、これらの遺伝子デリバリー剤によって誘発される強力で持続的なトランスジーン特異的免疫応答により、ワクチン担体としてのそれらの使用が促進された。高度の免疫原性に加えて、アデノウイルスは臨床的ワクチン開発のための他の多くの利点を提示している。アデノウイルスのゲノムは比較的小さく（２６～４５ｋｂｐ）、十分に特徴付けられており、操作が容易である。単一の転写ユニットＥ１の欠失により、ウイルスは複製不能になり、これは臨床応用においてその予測可能性を増大し、副反応を低減する。組換えアデノウイルスは、ある場合には８ｋｂまでになる比較的大きなトランスジーンを収容することができ、サブユニットの設計における融通性を可能にし、多種の細胞および組織へのトランスジーンのデリバリーを容易にする比較的広い向性を有している。臨床応用には重要なことに、組換えアデノウイルスの高い力価へのスケールアップされた産生および精製の方法はよく確立されている。これまでのところ、サブグループＣ血清型ＡｄＨｕ２およびＡｄＨｕ５は、主としてベクターとして使用されてきた。しかし、原型的なヒトアデノウイルスＡｄＨｕ５に基づく第１世代のワクチンベクターは、有望な前臨床データにも関わらず、臨床試験では貧弱な有効性を示した。引き続いて、成人の大きな割合が自然感染の結果としてＡｄＨｕ２およびＡｄＨｕ５等の一般的なヒト血清型に対する中和抗体の顕著な力価を有していることが発見された。中和抗体は、宿主細胞へのウイルスの進入をブロックし、それにより標的トランスジーンのデリバリーをブロックすることによって、ウイルスベクターワクチンの能力を低減させる可能性がある。
本明細書に記載した組成物は、治療用またはワクチンの目的のために異種分子を細胞に送達するベクターを含む。本明細書で使用される場合、ベクターには、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミド、またはウイルスを限定なしに含む任意の遺伝エレメントが含まれ得る。一部の実施形態では、そのようなベクターは、サルアデノウイルスＤＮＡ（例えばＳＡｄＶ－３６）、およびトランスジーンを含む。「トランスジーン」は、選択された異種遺伝子と、宿主細胞における遺伝子産物の翻訳、転写、および／または発現を推進するために必要な他の規制エレメントとの組合せを意味する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、コロナウイルスＳタンパク質をコードするトランスジーンを発現するアデノウイルスベクターを含み得る。種々の起源、サブタイプ、またはサブタイプの混合物に由来するアデノウイルスを、アデノウイルスベクターのためのウイルスゲノムの源として使用することができる。非ヒトアデノウイルス（例えばサル、チンパンジー、ゴリラ、鳥類、イヌ科、ヒツジ科、またはウシ科のアデノウイルス）は、アデノウイルスベクターを生成するために使用することができる。例えば、サルアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのウイルスゲノムの源として使用することができる。サルアデノウイルスは、血清型１、３、７、１１、１６、１８、１９、２０、２７、３３、３６、３８、３９、４８、４９、５０，または他の任意のサルアデノウイルス血清型のものであってよい。サルアデノウイルスは、例えばＳＶ、ＳＡｄＶ、ＳＡＶ、またはｓＡＶ等の当技術で既知の任意の好適な略語を使用することによって言及することができる。一部の例では、サルアデノウイルスベクターは、血清型３６のサルアデノウイルスベクターである。
典型的には、ＳＡｄＶ由来のアデノウイルスベクターは、選択されたアデノウイルス遺伝子に由来する領域における他のアデノウイルス配列を含む核酸分子の中にトランスジーンが位置するように設計される。所望であれば、存在する遺伝子領域の中にトランスジーンを挿入して、その領域の機能を崩壊させるようにしてもよい。その代わりに、部分的にまたは完全に欠失したアデノウイルス遺伝子の部位にトランスジーンを挿入してもよい。例えば、トランスジーンは選択され得る他の部位の中でも機能性Ｅ１欠失または機能性Ｅ３欠失（即ちＥ３Ｂ）の部位等の部位に位置してもよい。用語「機能的に欠失した」または「機能性欠失」は、十分な量の遺伝子領域が例えば突然変異または改変によって除去またはそうでなければ損傷され、それによりその遺伝子領域が遺伝子発現の機能性産物をもはや産生できなくなったことを意味する。所望であれば、遺伝子領域全体が除去されてもよい。一実施形態では、本開示による有用なアデノウイルスベクターは、Ｅ１およびＥ３Ｂ遺伝子に欠失を有するサルアデノウイルスＳＡｄ３６である。一態様では、アデノウイルスベクターは配列番号４の核酸配列を有する。別の態様では、アデノウイルスベクターは、配列番号４と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。
例えば、組換えウイルスの生成のために有用な産生ベクターについては、ベクターは、トランスジーンおよびアデノウイルスゲノムの５’末端もしくはアデノウイルスゲノムの３’末端、またはアデノウイルスゲノムの５’と３’の両末端を含んでよい。アデノウイルスゲノムの５’末端は、パッケージングおよび複製のために必要な５’シスエレメント、即ち５’インバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列（これは複製の起点として機能する）ならびに天然の５’パッケージングエンハンサードメイン（これはＥ１プロモーターのための直鎖状Ａｄゲノムおよびエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む）を含む。アデノウイルスゲノムの３’末端は、パッケージングおよびカプシド化に必要な３’シスエレメント（ＩＴＲを含む）を含む。好適には、組換えアデノウイルスは５’と３’の両方のアデノウイルスシスエレメントを含み、トランスジーンは５’と３’のアデノウイルス配列の間に位置する。サル系アデノウイルスベクター（例えばＳＡｄＶ－３６）も、さらなるアデノウイルス配列を含んでよい。
好適には、これらのサル系アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムから誘導された１つまたは複数のアデノウイルスエレメントを含む。一実施形態では、ベクターは、ＩＴＲを提供する血清型とは異なるアデノウイルス血清型から誘導されたアデノウイルス配列を含む。本明細書で定義するように、シュードタイプアデノウイルスは、アデノウイルスのカプシドタンパク質がＩＴＲを提供するアデノウイルスとは異なるアデノウイルスに由来するアデノウイルスを意味する。キメラまたはハイブリッドアデノウイルスは、本明細書に記載したアデノウイルスを使用し、当業者には既知の手法を使用して構築してよい。例えば米国特許第７，２９１，４９８号を参照されたい。
トランスジーンは、これに隣接するベクター配列には異種の核酸配列であり、目的のポリペプチド、タンパク質、またはその他の産物をコードする。核酸のコード配列は、宿主細胞におけるトランスジーンの転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で制御成分と作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、トランスジーンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２「Ｓ」タンパク質の安定化形態等のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原をコードする。一部の実施形態では、トランスジーンは、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の少なくとも一部もしくは免疫原性断片、または配列番号３のコロナウイルススパイクタンパク質の部分（または免疫原性部分もしくはその変異体）と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、もしくは９９．９％の配列同一性；またはＫ９８６ＰもしくはＶ９８７Ｐの突然変異を有する配列番号３；もしくはＤ６１４Ｇの突然変異を有する配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、もしくは９９．９％の配列同一性の配列を有する免疫原性断片もしくはその変異体をコードする。一部の実施形態では、トランスジーンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体のスパイクタンパク質をコードし、非限定的な例ではスパイクタンパク質は配列番号３に対してＤ８０Ｇ、１４４ｄｅｌ、Ｆ１５７Ｓ、Ｌ５Ｆ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｓ４７７Ｎ、１４４ｄｅｌ、Ｑ６７７Ｈ、Ａ７０１Ｖ、Ｆ８８８Ｌ、Ｔ７９１Ｉ、Ｔ８５９Ｎ、Ｄ９５０Ｈ、Ｅ４８４Ｑ、Ｄ６１４Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Δ６９－７０、Ｌ４５２Ｒ、またはＫ４１７ＮもしくはＲＢＤ Ｅ４８４Ｋ突然変異を有する。一部の実施形態では、トランスジーンはＷＡ１／２０２０、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．１．２８、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．５２６．１、Ｂ．１．５２５、Ｐ．２、Ｂ．１．６１７、Ｂ．１．６１７．１、Ｂ．１．６１７．２、Ｂ．１．６１７．３、Ｂ．１．４２９、またはＢ．１．４２９変異体由来のスパイクタンパク質をコードする。上記の実施形態のそれぞれでは、スパイクタンパク質は融合前安定化形態になる（例えば、残基１０５０～１０６９の間、または残基９８１～９９９の間に、二重のプロリン置換を有する）よう、さらに改変される。
トランスジーン（ｔｒａｎｇｅｎｅ）について上で特定した主要なエレメントに加えて、ベクターは、プラスミドベクターをトランスフェクトした細胞または本発明によって産生されたウイルスを感染させた細胞におけるその転写、翻訳、および／もしくは発現を可能にする様式でトランスジーンに作動可能に連結された、必要な従来の制御エレメントも含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは少し離れて作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始、停止、プロモーターおよびエンハンサーの配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（即ちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；および所望の場合に、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。
天然の、構造性の、誘導性の、および／または組織特異的なプロモーターを含む多数の発現制御配列が当技術で既知であり、利用してよい。構造性プロモーターの例には、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（ＲＳＶエンハンサーを含んでもよい）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶエンハンサーを含んでもよい）［例えばBoshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦＩａプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が限定なく含まれる。
誘導性プロモーターは遺伝子発現の規制を可能にし、外部から供給された化合物、温度等の環境因子、または特定の生理学的状態の存在、例えば急性相、細胞の特定の分化状態、もしくは複製している細胞のみにおいて、によって規制され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性システムは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄを限定なく含む種々の市販の供給源から入手可能である。他の多くのシステムが記載されており、当業者によって容易に選択できる。例えば、誘導性プロモーターには、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーターおよびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターが含まれる。その他の誘導性システムには、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（ＷＯ ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター［No et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 93:3346-3351 (1996)］、テトラサイクリン抑制性システム［Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)］、テトラサイクリン誘導性システム［Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995)、Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)も参照されたい］が含まれる。その他のシステムには、ＦＫ５０６ダイマー、カストラジオールを使用するＶＰ １６またはｐ６５、ジフェノールムリスレロン、ＲＵ４８６誘導性システム［Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) およびWang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)］、およびラパマイシン誘導性システム［Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)］が含まれる。いくつかの誘導性プロモーターの有効性は経時的に増大する。そのような場合には、多数のリプレッサーをタンデムに挿入すること、例えばＩＲＥＳによってＴｅｔＲに連結されたＴｅｔＲによって、そのようなシステムの有効性を増強することができる。その代わりに、所望の機能についてスクリーニングする前に少なくとも３日待ってもよい。このシステムの有効性を増強する既知の手段によって、所望のタンパク質の発現を増強することができる。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後規制エレメント（ＷＰＲＥ）を使用すること。
別の実施形態では、トランスジーンのための天然のプロモーターが使用される。トランスジーンの発現が天然の発現を模倣すべきことが望まれる場合には、天然のプロモーターが好まれる。天然のプロモーターは、トランスジーンの発現が時間的にもしくは発生的に規制されなければならない場合、または組織特異的な様式で、または特定の転写刺激に応答して、使用され得る。さらなる実施形態では、その他の天然の発現制御エレメント、例えばエンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはＫｏｚａｋコンセンサス配列も、天然の発現を模倣するために使用してよい。トランスジーンの別の実施形態は、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたトランスジーンが含まれる。例えば、骨格筋における発現が望ましい場合には、筋肉内において活性なプロモーターを使用すべきである。この中には、骨格β－アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性を有する合成筋肉プロモーターが含まれる［Li et al, Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)を参照されたい］。組織特異的なプロモーターの例としてはとりわけ、肝臓について［アルブミン、Miyatake et al, J. Virol., 71:5124-32 (1997)；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Arbuthnot et al, Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)］、骨オステオカルシン［Stein et al, MoI. Biol Rep., 24:185-96 (1997)］；骨シアロプロテイン［Chen et al, J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)］、リンパ球［ＣＤ２、Hansal et al, J. Immunol, 161: 1063-8 (1998)；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖］、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター等の神経系［Andersen et al, Cell. MoI Neurobiol, 13:503-15 (1993)］、神経フィラメント軽鎖遺伝子［Piccioli et al, Proc. Natl Acad. ScL USA, 88:561 1-5 (1991)］、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子［Piccioli et al, Neuron, 15:373-84 (1995)］が知られている。治療に有用なまたは免疫原性の産物をコードするトランスジーンを運搬するベクターは選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子を含んでよく、これらはとりわけジェネチシン、ハイグロマイシン、またはプリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を含んでもよい。そのような選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子（好ましくはウイルス粒子の中にパッケージングされるウイルスゲノムの外側に位置する）は、細菌細胞中にアンピシリン耐性等のプラスミドの存在を示すために使用することができる。ベクターの他の成分には、複製の起点が含まれる。これらのおよびその他のプロモーターおよびベクターエレメントの選択は従来のものであり、そのような多くの配列が入手可能である（例えばSambrook et alおよびその引用文献を参照されたい）。これらのベクターは、当業者には既知の手法と併せて本明細書で提供する手法および配列を使用して生成される。そのような手法には、教科書（Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY）に記載されたもの等のｃＤＮＡの従来のクローニング手法、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供する任意の好適な方法が含まれる。
一部の実施形態では、本開示によるトランスジーンを含むアデノウイルスベクターは、配列番号２の核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターは、配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、開示した組換えアデノウイルスベクターを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。ＶＬＰはウイルスの複製に必要なウイルス成分を欠いており、したがって高度に減弱し、複製不能なウイルスの形態を表している。ウイルス様粒子およびその産生の方法は当業者にはよく知られており、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ［Kang et al., Biol. Chem. 380: 353-64 (1999)］、セムリキ－フォレストウイルス［Notka et al., Biol. Chem. 380: 341-52 (1999)］、ヒトポリオーマウイルス［Goldmann et al., J. Virol. 73: 4465-9 (1999)］、ロタウイルス［Jiang et al, Vaccine 17: 1005-13 (1999)］、パルボウイルス［Casal, Biotechnology and Applied Biochemistry, Vol 29, Part 2, pp 141-150 (1999)］、イヌパルボウイルス［Hurtado et al., J. Virol. 70: 5422-9 (1996)］、Ｅ型肝炎ウイルス［Li et al, J. Virol. 71 : 7207-13 (1997)］、およびニューカッスル病ウイルスを含むいくつかのウイルスに由来するウイルスタンパク質はＶＬＰを形成することが知られている。そのようなＶＬＰの形成は、任意の好適な手法によって検出することができる。培地中のＶＬＰの検出のための本技術で既知の好適な手法の例には、例えば電子顕微鏡手法、動的光散乱（ＤＬＳ）、選択的クロマトグラフィー分離（例えばＶＬＰのイオン交換、疎水性相互作用、および／またはサイズ排除クロマトグラフィー分離）、および密度勾配遠心分離が含まれる。
ｂ）組成物の成分
本開示は医薬組成物も提供する。医薬組成物は、活性成分としての本開示のアデノウイルス組成物、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む。
薬学的に許容される賦形剤は、希釈剤、バインダー、フィラー、緩衝剤、ｐＨ改変剤、崩壊剤、分散媒、保存剤、滑剤、風味遮蔽剤、香味剤、または着色剤であってよい。医薬組成物を形成するために利用される賦形剤の量および型は、薬科学の既知の原理に従って選択してよい。
本明細書に記載した実施形態のそれぞれにおいて、本発明の組成物は、本開示のアデノウイルス組成物に加えて、１つまたは複数のさらなる薬物または治療活性薬剤を含んでもよい。即ち、本明細書に記載した療法に加えて、ウイルス感染の処置に有効であることが既知の他の療法を対象に提供してもよい。一部の実施形態では、二次的薬剤は、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、静脈内免疫グロブリン、キナーゼ阻害薬、融合もしくは組換えのタンパク質、モノクローナル抗体、またはそれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、併用療法に好適な薬剤には、それらに限定されないが、吸入気管支拡張剤および吸入ステロイドが含まれる。
（ｉ）希釈剤
一実施形態では、賦形剤は希釈剤であってよい。希釈剤は圧縮可能（即ち可塑的に変形可能）または研磨に脆弱であってよい。好適な圧縮可能希釈剤の非限定的な例には、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（即ちアセテートブチレート混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コーンスターチ、リン酸化コーンスターチ、アルファ化コーンスターチ、コメデンプン、ポテトデンプン、タピオカデンプン、デンプン－ラクトース、デンプン－炭酸カルシウム、デンプングリコレートナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトースモノハイドレート、スクロース、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マリトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン、およびトレハロースが含まれる。好適な研磨に脆弱な希釈剤の非限定的な例には、二塩基性リン酸カルシウム（無水または二水塩）、三塩基性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、および炭酸マグネシウムが含まれる。
（ｉｉ）バインダー
別の実施形態では、賦形剤はバインダーであってよい。好適なバインダーには、それだけに限らないが、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２－Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびそれらの組合せが含まれる。
（ｉｉｉ）フィラー
別の実施形態では、賦形剤はフィラーであってよい。好適なフィラーには、それらに限定されないが、炭水化物、無機化合物、およびポリビニルピロリドンが含まれる。非限定的な例として、フィラーは二塩基性および三塩基性の硫酸カルシウム、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、改変デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールであってよい。
（ｉｖ）緩衝剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は緩衝剤であってよい。好適な緩衝剤の代表的な例には、それらに限定されないが、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、トリス緩衝剤、および緩衝食塩水塩（例えばトリス緩衝食塩水またはリン酸塩緩衝食塩水）が含まれる。
（ｖ）ｐＨ改変剤
種々の実施形態では、賦形剤はｐＨ改変剤であってよい。非限定的な例として、ｐＨ改変剤は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、またはリン酸であってよい。
（ｖｉ）崩壊剤
さらなる実施形態では、賦形剤は崩壊剤であってよい。崩壊剤は非発泡性または発泡性であってよい。非発泡性崩壊剤の好適な例には、それらに限定されないが、コーンスターチ、ポテトスターチ、それらのアルファ化および改変スターチ等のスターチ、甘味剤、ベントナイト等のクレイ、微結晶セルロース、アルギネート、デンプングリコレートナトリウム、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペシチン（ｐｅｃｉｔｉｎ）、およびトラガカント等のガムが含まれる。好適な発泡性崩壊剤の非限定的な例には、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウム、および酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムが含まれる。
（ｖｉｉ）分散媒
さらに別の実施形態では、賦形剤は分散媒または分散増強剤であってよい。好適な分散媒には、それらに限定されないが、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコレートナトリウム、イソアモルファスシリケート、および微結晶セルロースが含まれる。
（ｖｉｉｉ）賦形剤
別の代替の実施形態では、賦形剤は保存剤であってよい。好適な保存剤の非限定的な例には、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、またはレチニルパルミテート等の抗酸化剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム；ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ等のキレート化剤；およびパラベン、クロロブタノール、またはフェノール等の抗微生物剤が含まれる。
（ｉｘ）滑剤
さらなる実施形態では、賦形剤は滑剤であってよい。好適な滑剤の非限定的な例には、タルクまたはシリカ等の鉱物；および植物ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸等の脂肪が含まれる。
（ｘ）風味遮蔽剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は風味遮断剤であってよい。風味遮断材料には、セルロースエーテル；ポリエチレングリコール；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコールとポリエチレングリコールのコポリマー；モノグリセリドもしくはトリグリセリド：アクリル系ポリマー；アクリル系ポリマーとセルロースエーテルとの混合物；セルロースアセテートフタレート；およびそれらの組合せが含まれる。
（ｘｉ）香味剤
代替の実施形態では、賦形剤は香味剤であってよい。香味剤は、合成香味油および香味芳香族および／または天然の油、植物抽出物、葉、花、果実、もしくはそれらの組合せから選択してよい。
（ｘｉｉ）着色剤
まださらなる実施形態では、賦形剤は着色剤であってよい。好適な着色添加剤には、それらに限定されないが、食物、薬物、および化粧品用の着色剤（ＦＤ＆Ｃ）、薬物および化粧品用の着色剤（Ｄ＆Ｃ）、または外用薬および化粧品用の着色剤（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が含まれる。
組成物中の賦形剤または賦形剤の組合せの重量分率は、組成物の全重量の約９９％以下、約９７％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であってよい。
本明細書に記載した薬剤および組成物は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)に記載されている１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤を使用し、任意の従来の様式によって製剤化することができる。そのような製剤は、本明細書に記載した治療有効量の生物活性薬剤を含むことになり、これは、対象への適正な投与のための形態を提供するために適した量の担体とともに精製された形態であってよい。
用語「製剤化」は、ヒト等の対象への投与に適した形態で薬剤を調製することを意味する。即ち、「製剤」は、希釈剤または担体を含む薬学的に許容される賦形剤を含み得る。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、許容できない薬理学的活性の損失または許容できない副反応を惹起しない物質または成分を表現することができる。薬学的に許容される成分の例は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２００５の米国薬局方（ＵＳＰ２９）および国民医薬品集（ＮＦ２４）（「ＵＳＰ／ＮＦ」）またはより最近の版に論文を有するもの、および継続的にアップデートされているＦＤＡのIｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈオンラインデータベースに列挙されている成分であってよい。ＵＳＰ／ＮＦ等に記載されていない他の有用な成分も使用してよい。
用語「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用される場合、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、または吸収遅延剤を含み得る。薬学的活性成分のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術で周知である［一般にRemington’s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)を参照］。いずれの従来の媒体または薬剤も活性成分と不適合な場合を除く限り、治療用組成物におけるその使用が意図されている。補完的な活性成分も、組成物に組み込むことができる。
「安定な」製剤または組成物は、都合の良い温度、例えば約０℃～約６０℃で、商業的に妥当な期間、例えば少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約１か月、少なくとも約３か月、少なくとも約６か月、少なくとも約１年、または少なくとも約２年の保存を可能にするために十分な安定性を有する組成物を意味し得る。
製剤は投与モードに適合する必要がある。本開示による使用のための薬剤は、それらに限定されないが、非経口、経肺、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、眼内、頬側、および経直腸を含むいくつかの経路を使用して対象に投与するための既知の方法によって製剤化することができる。個別の薬剤は、１つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて、または生物学的に活性なもしくは生物学的に不活性な薬剤とともに、投与してもよい。そのような生物学的に活性なもしくは不活性な薬剤は、薬剤と流体でもしくは機械的に連結されてもよく、イオン性、共有結合性、ファンデルワールス性、疎水性、親水性、またはその他の物理的な力によって薬剤に結合していてもよい。
鼻内デリバリーのための組成物を含む製剤は、生理学的に酸性の鼻のｐＨに相当するｐＨを有してよい。生理学的に酸性の鼻のｐＨは、無傷の鼻粘膜の機能に依存し得る。組成物は、約６．５±０．５（５．９～７．３）のｐＨまたは約６．７±０．６（５．３～７．６）のｐＨを含み得る。組成物は、約３．８～７．７（平均±ＳＤ ５．７±０．９）のｐＨを含み得る。経鼻デリバリーのための組成物は、やや酸性の範囲にあってよい。平均ｐＨは、ｐＨ５．７の酸性度を有してよい。
鼻内投与を介する治療剤の有効なデリバリーには、粘膜層の糖タンパク質への結合による薬物の損失に加えて、鼻粘膜の保護的粘液内層を横切る輸送速度の減少を考慮しなければならない。正常な粘液は、水、電解質、ムチン、高分子、および脱落した上皮細胞からなる粘弾性のあるゲル様物質である。これは主として下層の粘膜組織のための細胞保護性および潤滑性のある被覆としての役割を果たしている。粘液は、鼻の上皮およびその他の粘膜上皮に位置するランダムに分布した分泌細胞によって分泌される。粘液の構造単位はムチンである。この糖タンパク質は主として粘液の粘弾性的性質に関与しているが、他の高分子もこの特性に寄与し得る。気道の粘液では、そのような高分子には、局所で産生される分泌性ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、リゾチーム、および気管支トランスフェリンが含まれ、これらも宿主の防御機構において重要な役割を果たしている。
本開示の協調的投与法には、有効な粘液溶解剤または粘液除去剤を組み込んでもよい。これらは、鼻内粘膜表面からの粘液を分解、菲薄化、または除去するように働き、鼻内に投与された生体治療剤の吸収および／または吸着を容易にする。これらの方法の中で、粘液溶解剤または粘液除去剤は補助的化合物として協調的に投与され、生物学的活性薬剤の鼻内デリバリーを増強する。その代わりに、有効量の粘液溶解剤または粘液除去剤は、本発明の多重処理法の中の処理剤として、または本発明の組合せ製剤の中の添加剤として組み込まれ、鼻内粘液のバリア効果を低減することによって、生体治療化合物の鼻内デリバリーを増強する改善された製剤を提供する。
種々の粘液溶解剤または粘液除去剤が、本発明の方法および組成物の中に組み込むために利用可能である。それらの作用機序に基づいて、粘液溶解剤および粘液除去剤は、以下の群、即ちムチン糖タンパク質のタンパク質コアを切断するプロテアーゼ（例えばプロナーゼ、パパイン）；ムコタンパク質ジスルフィドを分割するスルフヒドリル化合物；および粘液中の非共有結合を破壊する界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ ２０）に分類できることが多い。これに関連するさらなる化合物には、それらに限定されないが、胆汁塩および界面活性剤、例えばデオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、およびリソホスファチジルコリンが含まれる。
粘液の構造破壊の惹起における胆汁塩の有効性は、デオキシコール酸塩＞タウロコール酸塩＞グリココール酸塩の順序である。粘液の粘度または付着を低減して本発明の方法による鼻内デリバリーを増強するその他の効果的な薬剤には、例えば短鎖脂肪酸、およびキレート化によって作用する粘液溶解剤、例えばＮ－アシルコラーゲンペプチド、胆汁酸、およびサポニンが含まれる（キレート化によって作用する粘液溶解剤は部分的に、粘液層の構造の維持において重要な役割を果たすＣａ２＋および／またはＭｇ２＋をキレート化することによって機能する）。
本発明の方法および組成物における使用のためのさらなる粘液溶解剤にはＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＡＣＳ）が含まれ、これは気管支肺粘液の粘度および付着を低減し、麻酔したラットにおいてヒト成長ホルモンの経鼻生物利用性をある程度増大させる（７．５％から１２．２％に）ことが報告されている強力な粘液溶解剤である。これらのおよびその他の粘液溶解剤および粘液除去剤は、生物学的活性薬剤の投与と協調して、典型的には約０．２～２０ｍＭの濃度範囲で鼻粘膜と接触させられ、鼻内粘膜の極性粘度および／または弾性を低減する。
さらに他の粘液溶解剤または粘液除去剤はグリコシダーゼ酵素の範囲から選択してよく、これらは粘液糖タンパク質の中のグリコシド結合を切断することができる。α－アミラーゼおよびβ－アミラーゼはこのクラスの酵素の代表であるが、それらの粘液溶解効果は限定的であり得る。対照的に、細菌のグリコシダーゼは、これらの微生物がその宿主の粘液層を透過することを可能にする。
本開示の中のアデノウイルス組成物との組合せ使用のため、非無機界面活性剤も一般に粘液溶解剤または粘液除去剤として有用である。これらの薬剤は典型的にはアデノウイルス組成物の活性を改変または実質的に損傷しない。
ｃ）投与
（ｉ）投薬形態
組成物は種々の投薬形態に製剤化し、治療有効量の活性成分を送達するいくつかの異なる手段によって投与することができる。そのような組成物は、所望に応じて従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および媒体を含む投薬単位製剤で、経口（例えば吸入）または非経口で投与することができる。局所投与は、経皮パッチまたはイオントフォレーシスデバイス等の経皮投与の使用も含んでもよい。本明細書で使用される用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、もしくは胸骨内の注射、または注入手法を含む。薬物の製剤化は、例えばGennaro, A. R., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (18th ed, 1995)およびLiberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y. (1980)で論じられている。特定の実施形態では、組成物は食品サプリメントでもよく、組成物は化粧品でもよい。
非経口投与（皮下、眼内、皮内、静脈内、筋肉内、動脈内、および腹腔内を含む）のため、調製物は水溶液または油系溶液であってよい。水溶液は、無菌の希釈剤、例えば水、食塩溶液、薬学的に許容されるポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒；ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサール、その他の抗菌剤および／または抗真菌剤；アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、もしくはリン酸塩等の緩衝剤；および／または塩化ナトリウム、デキストロース、またはマンニトールもしくはソルビトール等の浸透圧調節用の薬剤を含んでよい。水溶液のｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基によって調整してよい。油系の溶液または懸濁液は、ゴマ油、落花生油、オリーブ油、または鉱油をさらに含んでよい。組成物は単位用量または多用量の容器、例えばシールされたアンプルおよびバイアルで提示してよく、使用直前に無菌の液体担体（ｃａｒｒｉｅｄ）、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））された状態で保存してよい。その場で調製できる注射用の溶液および懸濁液を、無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。
一般に、安全かつ有効な量、例えば望ましくない副反応を最小化する一方で、対象において所望の治療効果を惹起する量のアデノウイルス組成物が投与される。種々の実施形態では、本明細書に記載した有効量のアデノウイルス組成物は、ウイルス感染に罹患している対象におけるウイルスの感染力を実質的に低減することができる。一部の実施形態では、有効量は呼吸器ウイルス感染を処置することができる量である。一部の実施形態では、有効量は呼吸器ウイルス感染に関連する１つまたは複数の症状を処置することができる量である。
薬学的に許容される担体と組み合わせて単一投薬形態を産生することができる本明細書に記載した組成物の量は、処置される宿主および特定の投与モードに応じて変動することになる。必要な治療有効量はいくつかの個別の用量の投与によって到達できるので、それぞれの投薬形態の個別の用量の中に含まれる薬剤の単位含量はそれ自体で治療有効量を構成する必要はないことは、当業者には認識されよう。
アデノウイルスベクターの投薬量は、一次的には処置すべき状態、患者の年齢、体重、および健康状態等の因子に依存し、したがって患者の間で変動し得る。例えば、ウイルスベクターの成人または動物への治療有効投薬量は一般に約１×１０６～約１×１０１５個の粒子、約１×１０７～１×１０１３個の粒子、または約１×１０９～１×１０１２個の粒子のウイルスの濃度を含む約１００μＬ～約１００ｍＬの担体の範囲である。投薬量は動物の大きさおよび投与経路に応じて変動することになる。例えば、筋肉内注射のための好適なヒトまたは動物の投薬量は（約８０ｋｇの動物について）、単一の部位について１ｍＬあたり約１×１０９～約５×１０１２粒子の範囲である。多数の投与部位に送達してもよい。別の例では、経口製剤について好適なヒトまたは動物の投薬量は、約１×１０１１～約１×１０１５粒子の範囲であってよい。当業者であれば、投与経路および組換えベクターが採用される治療用またはワクチン用の用途に応じてこれらの用量を調整することができる。トランスジーンの発現のレベル、または免疫原については循環する抗体のレベルをモニターして、投薬量投与の頻度を決定することができる。投与の頻度のタイミングを決定するためのさらに他の方法は、当業者には容易に明らかになる。
必要に応じた方法ステップは、ウイルスベクターの投与と同時、またはその前もしくは後の、好適な量の短期作用型免疫調節剤の患者への共投与を含む。選択される免疫調節剤は、本発明の組換えベクターを指向する中和抗体の形成を阻害することができる薬剤または細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によるベクターの除去を阻害することができる薬剤として本明細書で定義される。免疫調節剤は、Ｔヘルパーサブセット（ＴＨｉまたはＴ＾）とＢ細胞との相互作用を妨害して中和抗体の形成を阻害し得る。その代わりに、免疫調節剤はＴＨｉ細胞とＣＴＬとの相互作用を阻害してＣＴＬによるベクターの除去の発生を低減し得る。有用な種々の免疫調節剤およびその使用の投薬量は、例えば全て参照により本明細書に組み込まれるYang et al., J. Virol., 70(9) (Sept, 1996)；１９９６年５月２日公開の国際特許出願公開第ＷＯ ９６／１２４０６号；および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３０３５号に開示されている。
任意の特定の対象に対する特定の治療有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度；採用する特定の化合物の活性；採用する特定の組成物；対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事；投与の時期；投与経路；採用する組成物の排泄速度；処置の継続期間；採用する特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用する薬物；および医療技術において周知の同様の因子を含む種々の因子に依存することになる［例えばKoda-Kimble et al. (2004) Applied Therapeutics: The Clinical Use of Drugs, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781748453; Winter (2003) Basic Clinical Pharmacokinetics, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781741475; Sharqel (2004) Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton & Lange, ISBN 0071375503を参照されたい］。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルの組成物の用量から開始して、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加することは、十分に当技術の技能の範囲内である。所望であれば、投与の目的のために１日の有効用量を複数回の用量に分割してよい。結果として、単回投与組成物は、そのような量またはその分割量を含んで１日用量を作製してよい。しかし、本開示の化合物および組成物の１日全投薬量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解されよう。
ウイルス組成物の投与は、単一の事象として、または処置の時間経過にわたって起こり得る。例えば、ナノ粒子組成物の１つまたは複数は、毎日、毎週、隔週、または毎月、投与することができる。急性状態の処置のためには、処置の時間経過は通常、少なくとも数日になる。ある種の状態は処置を数日から数週に延長することがある。例えば、処置は１週、２週、または３週にわたって延長することがある。より慢性的な状態のためには、処置は数週から数か月または１年もしくはそれ以上にも延長することがある。
本明細書に記載した方法による処置は、呼吸器ウイルスに対する従来の処置手段の前に、それと同時に、またはその後に、実施することができる。
本開示は上で開示した化合物を含む医薬組成物を包含し、それにより、活性薬剤の投与を容易にし、その安定性を助長する。例えば、本開示の化合物を少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤と混合し、それにより、生きた対象、例えば好適な対象（即ち「処置を必要とする対象」または「それを必要とする対象」）に上手にかつ効果的に投与される（与えられる）医薬組成物をもたらすことができる。本発明の態様および実施形態の目的のため、対象はヒトまたはその他の任意の動物であってよい。
ＩＩ．方法
本開示は、それを必要とする対象におけるウイルスの感染力または伝染を処置、防止、または低減する方法を包含する。一部の実施形態では、本方法は、対象の細胞内へのウイルスの内部化を防止することによって、または対象の細胞内へのウイルスゲノムの内部化を防止することによって、ウイルス感染の感染力を防止または低減する。一部の実施形態では、本明細書で提供する組成物、例えば節ＩＩに記載した組成物の投与は、ウイルス表面タンパク質（例えばスパイクタンパク質またはエンベロープタンパク質）と宿主の受容体タンパク質［例えば上皮アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）］との相互作用を破壊または防止する、対象内における免疫応答を創成し得る。ウイルス感染のリスクにある対象に本開示の組成物を投与することにより、対象におけるコロナウイルス感染のリスクを低減することができる。
開示した組成物は、対象における対応するコロナウイルススパイクタンパク質に対する免疫応答を誘起するために、対象に投与することができる。特定の例では、対象はヒトである。免疫応答は保護的免疫応答、例えば対応するコロナウイルスによるその後の感染を阻害する応答であってよい。免疫応答の誘発は、対応するコロナウイルスに関連する感染および病気を処置または阻害するために使用することもできる。
例えばコロナウイルスへの曝露または曝露の可能性によって免疫原中のＳタンパク質に対応するコロナウイルスへの感染を発症するリスクを有するかそのリスクにある対象を処置のために選択することができる。開示した免疫原の投与に続いて、対象はコロナウイルスに関連する感染もしくは症状、またはその両方についてモニターすることができる。
本開示の治療薬および方法による処置のために意図される典型的な対象には、ヒトならびに非ヒト霊長類およびその他の動物が含まれる。本開示の方法による予防または処置のための対象を特定するため、許容されたスクリーニング法を採用して、標的としたもしくは疑われる疾患もしくは状態に関連する危険因子を判定し、または対象における存在する疾患もしくは状態の状況を判定する。これらのスクリーニング法には、例えば標的としたもしくは疑われる疾患もしくは状態に関連し得る環境的、家族的、職業的、およびその他のそのような危険因子を決定する従来の検査、ならびにコロナウイルス感染を検出および／または特徴付ける種々のＥＬＩＳＡおよびその他のイムノアッセイ法等の診断法が含まれる。これらのおよびその他の日常的な方法によって、臨床医は本開示の方法および医薬組成物を使用する療法が必要な患者を選択することができる。これらの方法および原理によれば、本明細書の教示またはその他の従来の方法に従い、独立の予防または処置のプログラムとして、または他の処置のフォローアップ、補助、もしくは協調処置レジメンとして、組成物を投与することができる。
開示した組成物の投与は、予防または治療の目的のためであってよい。予防的に提供される場合には、開示した治療剤は、いずれの症状に先立っても、例えば感染に先立っても提供される。開示した治療剤の予防的投与は、いずれの引き続く感染をも防止または改善するように働く。治療的に提供される場合には、開示した治療剤は、疾患もしくは感染の症状の開始のときまたはその後に、例えば組成物中のＳタンパク質に対応するコロナウイルスによる感染の症状が発現した後に、またはコロナウイルス感染の診断の後に、提供される。即ち治療剤は、感染および／もしくは関連する疾患の症状の予測される重症度、継続期間、または程度を減衰させるためにコロナウイルスへの予測される曝露に先立って、ウイルスに曝露されもしくは曝露が疑われた後で、または感染が実際に開始した後で、提供することができる。
本明細書に記載した組成物は、対象、好ましくはヒトにおけるコロナウイルスＳタンパク質に対する免疫応答を誘起または増強するために有効な量で、対象に提供される。開示した組成物の実際の投薬量は、疾患の兆候および対象の特定の状況（例えば対象の年齢、体格、適合性、症状の程度、感受性因子、その他）、投与の時期および経路、同時に投与される他の薬物もしくは処置、ならびに対象において所望の活性もしくは生物学的応答を誘発するための組成物の特定の薬理等の因子に従って変動することになる。投薬量レジメンは、最適の予防または治療の応答が提供されるように調整することができる。
本開示による組成物は、協調（またはプライムブースト）ワクチン接種プロトコールまたは組合せ製剤で使用することができる。ある特定の実施形態では、組成物および協調免疫化プロトコールは、それぞれが抗ウイルス免疫応答、例えばコロナウイルスＳタンパク質に対する免疫応答を誘発するように指向された個別のトランスジーンまたは製剤を採用している。抗ウイルス免疫応答を誘発する個別の免疫原性組成物は、単一の免疫化ステップで対象に投与される多価の免疫原性組成物の中に組み合わせることができ、またはこれらは協調（またはプライムブースト）免疫化プロトコールの中で個別に（一価の免疫原性組成物の中で）投与することができる。
いくつかのブーストがあってもよく、それぞれのブーストは異なる開示されたトランスジーンであってよい。一部の例では、ブーストは別のブーストまたはプライムと同じトランスジーンであってよい。プライムおよびブーストは単一用量として投与することができ、または複数用量、例えば２回用量、３回用量、４回用量、５回用量、６回用量、またはそれ以上の用量として数日、数週、または数か月にわたって対象に投与することができる。多数回のブースト、例えば１～５回（例えば１、２、３、４、または５回のブースト）またはそれ以上を与えることもできる。一連の逐次免疫化では異なる投薬量を使用することができる。例えば一次免疫化では比較的大きな用量、次いで比較的小さな用量によるブースト。
一部の実施形態では、ブーストはプライムの約２週、約３～８週、もしくは約４週後に、またはプライムの数か月後に投与することができる。一部の実施形態では、ブーストはプライムの約５か月、約６か月、約７か月、約８か月、約１０か月、約１２か月、約１８か月、約２４か月後、またはプライムの後、ほぼその前後に投与することができる。対象の「免疫記憶」を増強するために、適切な時点で定期的な追加のブーストを使用することもできる。選択したワクチン接種パラメーター、例えば処方、用量、レジメン等の妥当性は、対象から血清アリコートを採取し、免疫化プログラムの経過中の抗体力価をアッセイすることによって判定することができる。さらに、所望の効果、例えば感染の防止または疾患状態の改善（例えばウイルス負荷の低減）について対象の臨床状態をモニターすることができる。そのようなモニタリングによってワクチン接種が最適以下であることが示されれば、追加の用量の免疫原性組成物によって対象をブーストすることができ、免疫応答を強化するために期待される様式でワクチン接種パラメーターを改変することができる。
一部の実施形態では、本開示の組成物は単回用量で投与される。
本開示の開示された組成物の投与に際して、対象の免疫系は、典型的には組成物中に含まれるコロナウイルスＳタンパク質に特異的な抗体を産生することによって組成物に応答する。そのような応答は、免疫に有効な用量が対象に送達されたことを表している。
一部の実施形態では、対象の抗体応答は、有効な投薬量／免疫化プロトコールを評価することに関して判定されることになる。大部分の場合には、対象から得た血清または血漿中の抗体力価を評価することで十分になる。ブースター接種を投与すべきか否かおよび／または個体に投与する治療剤の量を変更すべきか否かに関する決定は、少なくとも部分的に抗体力価レベルに基づき得る。抗体力価レベルは、例えば、例えば免疫原中に含まれる組換えコロナウイルスＳタンパク質を含む抗原に結合する血清中の抗体の濃度を測定する免疫結合アッセイに基づき得る。
本方法が有効であるためには、コロナウイルス感染を完全に除去または低減または防止する必要はない。例えば、開示した組成物の１つまたは複数によるコロナウイルスへの免疫応答の誘発は、組成物の非存在下におけるコロナウイルスへの感染と比較して所望の量、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％のコロナウイルスによる感染を低減または阻害すること（検出可能な感染細胞の除去または防止）ができる。さらなる例では、開示した方法によってコロナウイルスの複製を低減または阻害することができる。本方法が有効であるためには、コロナウイルスの複製を完全に除去する必要はない。例えば、開示した組成物の１つまたは複数を使用して誘発された免疫応答は、免疫応答の非存在下におけるコロナウイルスの複製と比較して所望の量、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少さらになくとも１００％の対応するコロナウイルスの複製を低減すること（検出可能なコロナウイルスの複製の除去または防止）ができる。
一部の実施形態では、開示した組成物は、アジュバントの投与と同時に対象に投与される。他の実施形態では、開示した組成物は、アジュバントの投与の後で、免疫応答を誘起するために十分な時間内に、対象に投与される。
一部の実施形態では、治療有効量の開示した組成物の１つまたは複数の対象への投与は、対象において中和免疫応答を誘起する。対象の免疫化に続いて中和活性を評価するため、適切な時点で対象から血清を採取し、凍結し、中和検査のために保存することができる。中和活性をアッセイする方法は当業者には既知であり、本明細書でさらに記載する。これらの方法には、それだけに限らないが、プラーク低減中和（ＰＲＮＴ）アッセイ、ミクロ中和アッセイ、フローサイトメトリーに基づくアッセイ、単一サイクル感染アッセイが含まれる。一部の実施形態では、コロナウイルスシュードウイルスのパネルを使用して血清中和活性をアッセイすることができる。例えば、生物安全レベル３の設備の必要性なしに多数のＭＥＲＳ－ＣｏＶ株に対するワクチン候補の免疫原性を試験するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶについて以前に開発された方法（Martin et al, Vaccine 26, 6338, 2008; Yang et al, Nature 428, 561, 2004; Naldini et al, PNAS 93, 11382, 1996; Yang et al, PNAS 102, 797, 2005）と同様のシュードタイプ化したレポーターウイルス中和アッセイがすでに開発された（Wand et al., Nat Commun, 6:7712, 2015）。
他の実施形態では、本開示は、呼吸器ウイルス感染の感染力を処置、防止、または低減する方法を提供する。一部の実施形態では、ウイルス感染はコロナウイルス感染であってよい。コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、ＯＣ４３、または２２９Ｅであってよい。コロナウイルスはベータ－コロナウイルスであってよい。コロナウイルス感染のリスクにある対象は、コロナウイルス感染の無症状キャリアと接触し、それにより、知らずにコロナウイルス感染に罹患している可能性がある。
一般に、本明細書に記載した方法は、治療有効量の本開示のナノ粒子組成物の対象への投与を含む。本明細書に記載した方法は一般に、それを必要とする対象に対して実施される。対象はげっ歯類、ヒト、家畜、コンパニオン動物、または動物園の動物であってよい。一実施形態では、対象はげっ歯類、例えばマウス、ラット、モルモット等であってよい。別の実施形態では、対象は家畜であってよい。好適な家畜の非限定的な例には、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、リャマ、およびアルパカが含まれ得る。さらに別の実施形態では、対象はコンパニオン動物であってよい。コンパニオン動物の非限定的な例には、イヌ、ネコ、ウサギ、および鳥等のペットが含まれ得る。さらに別の実施形態では、対象は動物園の動物であってよい。本明細書で使用される場合、「動物園の動物」は、動物園で見られる動物を意味する。そのような動物には、非ヒト霊長類、大型のネコ、オオカミ、およびクマが含まれ得る。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
ＩＩＩ．キット
キットも提供される。そのようなキットは、本明細書に記載した薬剤または組成物、およびある特定の実施形態では投与のための使用説明書を含むことができる。そのようなキットは、本明細書に記載した方法の実施を容易にすることができる。キットとして供給する場合、組成物の異なる成分を個別の容器に包装し、使用直前に混合することができる。成分には、それらに限定されないが、本明細書に記載した組成物およびナノ粒子組成物を含む医薬製剤が含まれる。成分のそのような包装は、所望であれば組成物を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで個別に提示することができる。パックは、例えば金属またはプラスチックのフォイル、例えばブリスターパックを含んでよい。ある特定の場合には、成分のそのような包装は個別に成分の活性を失わずに長期保存を可能にすることもできる。
キットは、例えば個別に包装された凍結乾燥された活性成分に添加する無菌水または食塩水等の薬剤も個別の容器に含んでもよい。例えば、シールされたガラスアンプルに凍結乾燥された成分を含ませ、別のアンプルにそれぞれが窒素等の中性で非反応性の気体のもとに包装された無菌水、無菌食塩水を含ませてもよい。アンプルは任意の好適な材料、例えばガラス、有機ポリマー、例えばポリカーボネート、ポリスチレン、セラミック、金属、または薬剤を保持するために典型的に採用される任意の他の材料からなっていてよい。好適な容器の他の例には、アンプルと同様の物質から製造され得るボトル、およびアルミニウムもしくは合金等のフォイルで裏打ちされた内部からなるエンベロープが含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、その他が含まれる。容器は、皮下注射針によって穿刺することができる栓を有するボトルのように、無菌のアクセスポートを有してよい。他の容器は、除去された際に成分を混合することができる容易に除去可能な膜によって分離された２つの区画を有してよい。除去可能な膜はガラス、プラスチック、ゴム、その他であってよい。
ある特定の実施形態では、キットは説明用資料とともに供給することができる。使用説明書は紙またはその他の基材に印刷してよく、および／または電子的に読み取り可能な媒体、例えばフロッピーディスク、ミニＣＤ－ＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ジップディスク、ビデオテープ、オーディオテープ等として供給してよい。詳細な使用説明書はキットに物理的に付随していなくてもよく、その代わりに、キットの製造業者または販売業者によって特定されるインターネットウェブサイトにユーザーを導いてもよい。
分子生物学プロトコールを利用する本明細書に記載した組成物および方法は、当技術で既知の種々の標準的な手法に従うことができる［例えばSambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717、Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929、Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773、Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754、Studier (2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234、Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363、Baneyx (2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253を参照されたい］。
本明細書で開示した特定の実施形態は、「含む（comprising）」よりむしろ「～からなる（consisting of）」または「本質的に～からなる（consisting essentially of）」という言語を使用する特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲で使用される場合、出願したものであっても補正によって追加したものであっても、遷移用語「～からなる」は、特許請求の範囲で特定していないいずれのエレメント、ステップ、または成分をも除外する。遷移用語「本質的に～からなる」は、特許請求の範囲を、特定した材料またはステップおよび基礎的で新規な特徴に実質的に影響しない材料またはステップに限定する。このように主張される本発明の実施形態は、本明細書で本質的または明示的に記載され、可能にされている。
上記の材料および方法において本発明の範囲を逸脱せずに種々の変更を行うことが可能であるので、上の記載および以下の実施例に含まれる全ての事柄は説明の意味であって限定する意味はないと解釈すべきであることが意図されている。
以下の実施例は、本開示の種々の実施例を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、それにより本発明のその実施のための好ましい様式を構成するとみなされ得ることは、当業者によって理解されるべきである。しかし、本開示に照らして当業者は、多数の変更が開示される具体的な実施形態に行われてよく、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果をさらに得られることを理解すべきである。
［実施例１］
単回用量チンパンジーアデノウイルスベクター化ワクチンは、ヒトＡＣＥ２受容体を発現するマウスにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および肺炎を保護する
本実施例は、Ｓ２サブユニットに２個のプロリン置換を導入した後の融合前安定化されたスパイク（Ｓ）タンパク質をコードするチンパンジーＡｄ（サルＡｄＶ－３６）ベースのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ）を提供する。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの筋肉内投与は、Ｓタンパク質に対する強固な全身性の液性および細胞媒介免疫応答を誘起した。１または２ワクチン用量は、ヒトＡＣＥ２（ｈＡＣＥ２）受容体を一過的に発現するマウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後に肺感染、炎症および病態に対して保護した。血清中の高レベルの中和抗体の誘起にもかかわらず、相当なレベルのウイルスＲＮＡがいまだ肺において検出されたことから、いずれの投薬レジメンもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して完全には保護しなかった。比較して、鼻内経路によって単回用量のＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを投与した場合、高レベルの中和抗体および抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＡならびに上気道および下気道の両方で感染に対する完全な保護が検出された。さらに対照ＣｈＡｄワクチンとは対照的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジの８日後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰタンパク質に対する血清抗体応答は、鼻内デリバリーを介してＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した動物では無かった。したがって、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、ウイルス誘起疾患および伝染の両方を防止する殺菌免疫（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を接種の部位に付与する可能性を有する。
結果
チンパンジーＡｄ－ベクター化ワクチンは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強固な抗体応答を誘起する：サルＡｄ－３６ウイルスに基づく２つの複製不能ＣｈＡｄベクターを構築した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓベクターは、外部ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含んでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の完全長配列をトランスジーンとしてコードし（ＧｅｎＢａｎｋ：ＱＪＱ８４７６０．１）、残基Ｋ９８６およびＶ９８７での２個のプロリン置換によって融合前形態に安定化される。ＣｈＡｄ対照は、トランスジーンを有さない。Ｓタンパク質トランスジーンは、サイトメガロウイルスプロモーターによって転写的に制御される。ベクターを複製不能にし、パッケージング能力を増強するために、それぞれ、Ｅ１Ａ／Ｂ遺伝子を置き換え、Ｅ３Ｂ遺伝子に欠失を導入した（図１Ａ）。Ｓタンパク質が発現され、抗原性が未変化であることを確認するために、２９３Ｔ細胞に形質導入し、２２個の中和モノクローナル抗体のパネルのＳタンパク質に対する結合をフローサイトメトリーによって確認した（図１Ｂ）。
ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの免疫原性を評価するために、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの群をＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳまたはＣｈＡｄ対照のウイルス粒子を１０１０個用いて筋肉内接種によって免疫化した。一部のマウスは、４週間後にブースター用量を受けた。血清試料は、初回のまたはブースターの免疫化の２１日後に収集し（図１Ｃ）、精製ＳおよびＲＢＤタンパク質に対するＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡによって評価した。一方、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、高レベルのＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧを誘起し、ＣｈＡｄ対照免疫化マウスでは、あるとしても低いレベルが検出された（図１Ｄおよび図２Ａ）。血清試料は、フォーカス減少中和検査（ｆｏｃｕｓ―ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）（ＦＲＮＴ）を使用して感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和についてインビトロ（in vitro）でアッセイした。予測されたとおりＣｈＡｄ対照免疫化マウス由来の血清は、初回免疫化またはブースティング後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻止しなかった。対照的にＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種動物由来の血清は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を強く中和し、ブースティングは、この阻害活性を増強した（図１Ｅおよび図２Ｂ～２Ｃ）。
ワクチン－誘起メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞および抗原特異的Ｂ細胞応答：最適なワクチン免疫性は、しばしば液性および細胞性の応答の両方からなることから、ワクチン接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを測定した。４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳまたはＣｈＡｄ対照を用いて免疫化し、３週間後にブーストした。ワクチン誘起ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価するために、ブースティングの１週間後に脾細胞を採取し、２５３個の重複する１５アミノ酸長Ｓペプチドのプールを用いてエクスビボ（ex vivo）で刺激した。続いて、細胞内ＩＦＮγおよびグランザイムＢ発現の定量化をフローサイトメトリーによって決定した。エクスビボでのペプチド再刺激後に、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化したマウスにおいて、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞はＩＦＮγを発現し、脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方はグランザイムＢを発現したが、ＣｈＡｄ対照ベクターではしなかった（図１Ｆ～１Ｇおよび図３）。抗原特異的Ｂ細胞応答を評価するために、脾細胞を採取し、Ｓタンパク質を用いるＥＬＩＳＰＯＴ分析に供した。脾臓においてＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンは、Ｓタンパク質特異的ＩｇＧ抗体分泌細胞を誘起したが、対照ワクチンはしなかった（図１Ｈ）。
ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンを用いた筋肉内免疫化は、肺においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して保護する：ＢＡＬＢ／ｃマウスがベクター化ヒトＡｄ（Ｈｕ－Ａｄ５－ｈＡＣＥ２）の鼻内デリバリー後に肺においてｈＡＣＥ２を発現する、近年開発されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染モデルにおいてＣｈＡｄワクチンの保護活性を検査した。内在性マウスＡＣＥ２は、ウイルス侵入を支持せず、この系は、マウス肺における増殖性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を可能にする。４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを最初に筋肉内経路を介してＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンを用いて免疫化した。およそ３０日後にマウスに、１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨｕ－Ａｄ５－ｈＡＣＥ２および抗Ｉｆｎａｒ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を鼻内および腹腔内経路を介してそれぞれ投与した。単回用量の抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂもこのモデルでの肺病態形成を増強するために投与した。ＣｈＡｄとＨｕ－Ａｄ５ベクターとの間の交差免疫の非存在を確認した。ＣｈＡｄ免疫化マウス由来の血清は、Ｈｕ－Ａｄ５感染を中和しなかった（図４Ａ～４Ｂ）。
Ｈｕ－Ａｄ５－ｈＡＣＥ２形質導入の５日後、マウスを鼻内経路を介して４×１０５フォーカス形成単位（ＦＦＵ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いてチャレンジした（図２Ａ）。感染４日後（ｄｐｉ）、このモデルでのウイルス負荷のピーク、マウスを安楽死させ、肺、脾臓および心臓をウイルス負荷およびサイトカイン分析のために採取した。注目すべきことに、プラークアッセイによる判定で、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化したマウスの肺に検出可能な感染性ウイルスは無かった一方で、高レベルがＣｈＡｄ対照を用いてワクチン接種したマウスに存在した（図５Ｂ）。この結果と一致して、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種動物の肺、心臓および脾臓におけるウイルスＲＮＡレベルの低減がＣｈＡｄ対照ベクターを受けたマウスと比較して観察された（図５Ｃ）。４ｄｐｉに採取した肺におけるウイルスＲＮＡについてのインサイツハイブリダイゼーション染色は、ＣｈＡｄ対照と比較して、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した動物の肺細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの実質的な減少を明らかにした（図５Ｄ）。免疫化した動物のサブセットを８ｄｐｉに安楽死させ、評価のために組織を採取した。この時点で、再度ウイルスＲＮＡレベルは、対照ＣｈＡｄベクターと比較して、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ免疫化マウスの肺および脾臓において低いか非存在であった（図５Ｃ）。合わせてこれらのデータは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた単回筋肉内免疫化が、チャレンジしたマウスの肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の顕著な低減を生じたが抑制はしなかったことを示している。
次に、肺の炎症および疾患へのワクチンの効果を評価した。ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１β、ＩＬ－６、ＣＣＬ５、ＩＦＮβおよびＩＦＮγを含む、いくつかの炎症誘発性サイトカインおよびケモカインｍＲＮＡレベルは、ＣｈＡｄ対照と比較してＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した動物の組肺織において低かった（図５Ｅ）。さらに、ＣｈＡｄ対照ワクチンを用いて免疫化し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いてチャレンジしたマウスは、血管周囲および肺胞部位における免疫細胞の蓄積、血管のうっ血および間質浮腫によって特徴付けられるウイルス性肺炎の証拠を示した。対照的に、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した動物は、ＣｈＡｄ対照免疫化マウスにおいて発症した肺における炎症反応の顕著な減弱を示した（図６）。したがって、Ｃｈ－Ａｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いた免疫化は、ウイルス性感染およびその結果としての肺の炎症ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に関連する傷害の両方を減少させる。
プライム－ブーストワクチンレジメンを使用した保護の改善を次に評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを筋肉内経路を介してＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化し、同種のブースター用量を４週間後に受けさせた。ブースト後２９日目に、マウスを単回用量の抗Ｉｆｎａｒ１抗体に続いてＨｕ－Ａｄ５－ｈＡＣＥ２を用いて処置し、５日後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いてチャレンジした。予測されたとおり、プライム－ブーストレジメンは、肺において感染性ウイルスが検出されずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対して保護した（図５Ｆ）。肺、脾臓および心臓におけるウイルスＲＮＡの顕著な低減が４ｄｐｉに検出されたが、ウイルスＲＮＡの残存レベルは、まだ存在し、ブースティング後であってさえも保護が完全ではないことを示唆している（図５Ｇ）。
ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた単回鼻内免疫化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する殺菌免疫を誘起する：鼻咽頭経路を通じた粘膜免疫化は、分泌性ＩｇＡ抗体を含む、呼吸器病原体の接種部位またはその付近に保護を付与する局所免疫応答を誘発できる。粘膜ワクチン接種の免疫原性および保護有効性を評価するために、５週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓのウイルス粒子１０１０個を用いて鼻内経路を介して接種した（図７Ａ）。免疫化後４週間で血清試料を液性免疫応答を評価するために収集した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの鼻内免疫化は、血清中で、高レベルのＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ（図７Ｂ～７Ｃ）ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を誘起したが（幾何平均力価１／１、５７４）、ＣｈＡｄ対照はしなかった（図７Ｄおよび図８Ａ）。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化したマウス由来の血清抗体は、Ｓタンパク質中のＤ６１４Ｇ突然変異をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組換え、ルシフェラーゼ発現変異体を同等に中和した（図８Ｂ）；この発見は、多数の循環しているウイルスがこの置換を有し、細胞培養物中のより大きな感染力と関連することから重要である（doi．Org／10.1101／2020.06．12.148726）。免疫化したマウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体応答も評価した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種マウス由来のＢＡＬ液は、中和活性を有するものを含む高レベルのＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧならびにＩｇＡ抗体（図７Ｅ～７Ｆ）を示したが、ＣｈＡｄ対照ワクチン接種マウスは示さなかった（図７Ｇおよび図８Ｃ）。
粘膜免疫化を介して活性化されたＴ細胞応答を評価するために、マウスを鼻内経路を介してＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳまたはＣｈＡｄ対照のいずれかを用いてワクチン接種し、４週間後に同様にブーストした。ブースティングの１週間後に肺を採取し、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。Ｓペプチドのプールを用いたエクスビボでの再刺激は、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンを受けたマウスの肺においてＩＦＮγおよびグランザイムＢ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の顕著な増加も生じた（図７Ｈ）。具体的には、肺において、ワクチン誘起常在性メモリーＴ細胞と表現型的に一致するＩＦＮγ分泌、抗原特異的ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を同定した（図７Ｉ）。脾臓では、Ｓタンパク質に対するＩｇＡまたはＩｇＧを産生する抗体分泌形質細胞が、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた鼻内免疫化後に検出された（図７Ｊ）。注目すべきことに、抗Ｓ ＩｇＡを分泌するＢ細胞がＩｇＧよりも約５倍高い頻度で観察された。
単回用量鼻内免疫化後のＣｈＡｄワクチンの保護有効性を評価した。ワクチン接種後３０日目に、マウスに１０８ＰＦＵのＨｕ－Ａｄ５－ｈＡＣＥ２および抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂを上に記載のとおり投与した。５日後、マウスを４×１０５ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いてチャレンジした。４および８ｄｐｉに、肺、脾臓、心臓、鼻甲介および鼻洗浄液を採取し、ウイルス負荷について評価した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンの鼻内デリバリーは、肺における感染性ウイルスの非存在（図９Ａ）、および肺、脾臓、心臓、鼻甲介または鼻洗浄液において測定可能なウイルスＲＮＡがほとんど無かった（図９Ｂ）ことから判断して、顕著な保護有効性を実証した。４ｄｐｉでの肺および鼻甲介における非常に低いウイルスＲＮＡレベルは、同様のレベルがｈＡＣＥ２受容体発現を欠いているＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてこの時点で測定されたことから、投入した複製しないウイルスを反映していると考えられる。肺ホモジネートにおけるサイトカインおよびケモカインｍＲＮＡレベルも、ヒトＡｄベクターｈＡＣＥ２デリバリー系による残存発現の可能性を有して、ＣｈＡｄ対照ワクチンよりもＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化したマウスにおいて実質的に低かった（図９Ｃ）。最終的に、鼻内経路によってＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いてワクチン接種し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いてチャレンジした動物由来の肺組織の病理組織学的分析は、８ｄｐｉにＣｈＡｄ対照ワクチン接種動物において観察された広範な炎症と比較して、あるとしてもわずかな血管周囲および肺胞の浸潤を示した（図９Ｄ）。
殺菌免疫がＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの鼻内デリバリーを用いて達成されるかどうかを判定するために、抗ＮＰ抗体を８ｄｐｉに測定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の５日前の応答と比較した。ＮＰ遺伝子がワクチンベクターには存在しないことからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露後のＮＰに対する液性免疫応答の誘起は、ウイルス性タンパク質翻訳および活動性の感染を示唆する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後、抗ＮＰ抗体応答を鼻内経路によってワクチン接種したＣｈＡｄ対照マウスまたは筋肉内経路によってワクチン接種したＣｈＡｄ対照およびＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓマウスにおいて検出した（図９Ｅおよび図２Ｄ）。際だったことに、鼻内経路を介してＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化したマウスで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後に抗ＮＰ抗体応答の顕著な増加を示したものは無かった。本発明者らのウイルス学的分析と併せてこれらのデータは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの単回の鼻内免疫化が強固で、おそらく滅菌性の粘膜免疫を誘起し、それが、ｈＡＣＥ２受容体を発現するマウスの上気道および下気道においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を防止することを示唆している。
考察
本実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのワクチンプラットフォームとしての複製不能ＣｈＡｄベクターの筋肉内および鼻内投与を評価した。筋肉内経路を介した安定化されたＳタンパク質ベースワクチンの単回用量免疫化は、ＳおよびＲＢＤ特異的結合ならびに中和抗体を誘起した。１または２用量を用いたワクチン接種は、肺における感染性ウイルスの非存在ならびに肺および他の臓器におけるウイルスＲＮＡレベルの実質的な低減から明らかになるとおり、ヒトＡＣＥ２を発現しているマウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対して保護した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化したマウスは、対照ＣｈＡｄワクチンと比較して、肺の病態、肺の炎症および肺炎の証拠の非存在ではないが顕著な低減も示した。しかし、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの筋肉内ワクチン接種は、肺を含むいくつかの組織での検出可能なウイルスＲＮＡレベルおよび抗ＮＰ抗体応答の誘起によって明らかになるとおり、殺菌免疫を付与しなかった。鼻内経路を介して単回用量のＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化したマウスもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対して保護された。しかし鼻内ワクチン接種は、上気道および下気道の両方のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して保護し、野生型およびＤ６１４Ｇ変異体ウイルスの両方の感染を阻止する強固なＩｇＡおよび中和抗体応答を生じた。チャレンジの文脈において、上気道組織での非常に低いウイルスＲＮＡおよびＮＰへの血清学的な応答の非存在は、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの単回の鼻内用量を受けた大部分の動物が殺菌免疫を達成することを強く示唆している。
いくつかのワクチン候補（例えば、脂質封入ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、不活化およびウイルス性ベクター化）は、流行病を制御するための迅速な努力においてヒト臨床試験に速やかに進んだが、前臨床モデルにおいて有効性を実証した研究はほとんど無かった。完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドワクチンの２または３用量を用いて免疫化したアカゲザルは、血清中で中和抗体を誘起し、ＢＡＬおよび鼻腔粘膜液におけるウイルス負荷を低減した。さらに、精製した不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いた２週間にわたる３回の免疫化は、中和抗体を誘起し、投与された用量に応じてアカゲザルに感染およびウイルス性肺炎に対する部分的なまたは完全な保護を提供した。これらのチャレンジモデルの限界の１つは、アカゲザルが一部のヒトおよび他の非ヒト霊長類種と比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後に穏和な間質性肺炎を発症することである。ｈＡＣＥ２発現マウスでの本実施例は、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンの単回の筋肉内または鼻内用量が、ウイルス複製、炎症および肺疾患に対する実質的でおそらく完全な保護を付与することを示した。
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む新興ＲＮＡウイルスに対する非ヒトＡｄ－ベクター化ワクチンの使用を支持する。以前の研究は、Ｚｉｋａウイルス（ＺＩＫＶ）のｐｒＭ－Ｅ遺伝子をコードするゴリラＡｄの単回用量または二用量レジメンの有効性を妊娠の文脈を含むいくつかのマウスチャレンジモデルにおいて示した。他は、ＣｈＡｄまたはアカゲザルＡｄワクチン候補をＺＩＫＶに対して評価し、マウスおよび非ヒト霊長類における有効性を示した。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（ＣｈＡｄＯｘ１）をコードするさまざまなＣｈＡｄは、現在、ヒト（ＮＣＴ０４３２４６０６）における臨床試験中である。ヒトの治験からのデータはまだ報告されてないが、アカゲザルでの研究は、単回の筋肉内用量は肺において感染に対して保護するが上気道ではしないことを示唆している（biorxiv．org／content／10.1101／2020.05．13.093195v1）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して評価したワクチンは、いかなる前臨床および臨床研究においても免疫増強の証拠を示しておらず、他のヒトおよび動物コロナウイルスを用いた研究に基づく理論上のリスクである。実際に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶワクチンまたは抗体を用いたデータとは対照的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＣｈＡｄを用いて免疫化した、または受動的に移行したモノクローナル抗体を投与した動物において感染、免疫病理または疾患の増強は観察されなかった。
エクスビボでのＳタンパク質ペプチド再刺激後にＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、高いパーセンテージおよび数のＩＦＮγおよびグランザイム発現細胞を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘起した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンによる強固なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘起は、他のサルＡｄベクターを用いた報告と一致する。ＣｈＡｄワクチンベクターは、ヒトアデノウイルスに対する予め存在する免疫性の問題を克服するだけでなく、疲弊したＴ細胞応答を誘起しないことから免疫学的有利点も有する。
ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの単回鼻内用量は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対して、同じワクチンおよび用量の１回または２回の筋肉内免疫化よりも優れた免疫を付与した。血清中和抗体応答が同等であったと仮定すると、鼻内デリバリー後に観察されたより大きな保護は、粘膜免疫応答が生じたためであると仮定される。実際に、高レベルの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＡが血清および肺において検出され、ＩｇＡを分泌するＢ細胞が脾臓で検出された。さらに、鼻内ワクチン接種も肺において、残存メモリー表現型の可能性がある、ＣＤ１０３＋ＣＤ６９＋細胞を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘起した。本発明者らの知るかぎりでは、現在の臨床試験において鼻内デリバリーアプローチを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンプラットフォームは無い。局所的な液性および細胞性の免疫応答を誘発するそれらの能力により、インフルエンザＡウイルスワクチンのための鼻内デリバリーを使用することに大きな関心がある。実際に、インフルエンザＡウイルス再感染に対する殺菌免疫は、鼻内によって最適に誘起されるが筋肉内接種によってはされない、肺における局所的な適応免疫応答を必要とする。鼻内経路を介して弱毒生ウイルスワクチンを投与することに懸念はあるが、サブユニットベースのまたは複製不能ベクター化ワクチンは、より安全な様式で粘膜免疫を生じさせるために有望であり、特に製剤に進歩をもたらす。
要約すると本実施例は、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた免疫化が中和抗体および抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を誘起することを確立した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの単回の筋肉内免疫化が肺におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および炎症に対して保護を付与する一方で、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの鼻内デリバリーは、粘膜免疫を誘起し、優れた保護をもたらし、少なくとも、ｈＡＣＥ２受容体を一過的に発現するマウスにおいて殺菌免疫を促進すると考えられる。このように本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、疾患および伝染を管理するためのプラットフォームとしてＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの鼻内デリバリーを支持する。
方法
ウイルスおよび細胞：Ｖｅｒｏ Ｅ６（ＣＲＬ－１５８６、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ８１ （ＡＴＣＣ）およびＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１Ｘ非必須アミノ酸および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で培養した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株２０１９ ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０は、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎから得た（Ｎａｔａｌｉｅ Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇからの寄贈）。ウイルスは、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ８１細胞で１度継代し、フォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）によってＶｅｒｏ Ｅ６細胞でタイトレーションした。組換えルシフェラーゼ発現完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２レポーターウイルス（２０１９ ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０株）は、以前報告され（Zost et al., 2020）、Ｄ６１４Ｇ変異体は他所に記載されている。感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いた全ての研究は、適切な陽圧空気マスクおよび保護具を使用してＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認ＢＳＬ３およびＡ－ＢＳＬ３施設において実施した。
マウス実験：動物研究は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）における勧告に従って実施した。プロトコールは、ｔｈｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された（保証番号Ａ３３８１－０１）。ウイルス接種は、ケタミン塩酸塩およびキシラジンを用いて導入され、維持された麻酔下で実施し、全ての試みは動物の苦痛を最小化するように行った。
メスＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（カタログ０００６５１）から購入した。４から５週齢の動物を、後肢の筋肉内注射を介してまたは鼻内接種を介して、５０μｌ ＰＢＳ中１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）のＣｈＡｄＶ－空またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した。免疫化した動物のサブセットを初回免疫化の４週間後に初回免疫化についてと同じ経路を使用してブーストした。ワクチン接種マウス（１０から１１週齢）に１０８ＰＦＵのＨｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２の鼻内投与の１日前に、２ｍｇの抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂ（ＭＡＲ１－５Ａ３、Ｌｅｉｎｃｏ）の単回腹腔内注射を与えた。Ｈｕ－ＡｄＶ５形質導入５日後に、マウスに４×１０５ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻内経路によって接種した。動物を４または８ｄｐｉに安楽死させ、組織をウイルス学的、免疫学的および病理学的分析のために採取した。
チンパンジーアデノウイルスベクターのコンストラクション：サルＡｄ３６ベクター（ＣｈＡｄ）は、ｔｈｅ Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから得た。ＣｈＡｄゲノムは、Ｅ１およびＥ３Ｂ領域の欠失を含んで操作した（ＧｅｎＢａｎｋ：ＦＪ０２５９１７．１；それぞれヌクレオチド４５５～３０２６および３００７２～３１８６９）。改変ヒトサイトメガロウイルス主要最初期プロモーター配列を相補ＤＮＡ鎖に反時計回り方向でＥ１遺伝子の場所に組み込んだ。ＣＭＶ改変は、ＴＡＴＡボックスとｍＲＮＡ開始との間にタンデムで挿入された２コピーのｔｅｔオペレーター２（ＴｅｔＯ２）配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９２０３９３、ヌクレオチド１７４２１１～１７４２１２）の追加を含んだ（５´－ＴＣＴ ＣＴＡ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＴＡ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＴＡ ＧＧ ＧＡ－３´）（配列番号７）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（Ｓの融合前形態を安定化する、残基Ｋ９８６およびＶ９８７に２個のプロリン置換を含む融合前安定化された突然変異体をコードする）を、ｐＳＡｄ３６－Ｓを生成するために、ｐＳＡｄ３６ゲノムプラスミドにＣＭＶ－ｔｅｔＯ２プロモーター制御下で固有のＰｍｅＩ部位にクローニングした。並行して、トランスジーンを含まない空ＣＭＶ－ｔｅｔＯ２カセットを保有するｐＳＡｄ３６対照も生成した。ｐＳＡｄ３６－ＳおよびｐＳＡｄ対照プラスミドをＴ－Ｒｅｘ２９３－ＨＥＫ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのトランスフェクションのためにウイルスゲノムを遊離させるためにＰａｃＩ制限酵素を使用して直線化した。レスキューされた複製不能ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳおよびＣｈＡｄ対照ベクターを２９３細胞においてスケールアップし、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心分離によって精製した。各ベクター調製物中のウイルス粒子濃度を２６０ｎｍでの分光光度法によって決定した。
ヒトＡＣＥ２を発現するヒトアデノウイルスベクターコンストラクション：コドン最適化ｈＡＣＥ２配列をｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｈＡＣＥ２を生成するようにシャトルベクター（ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶ、Ａｄｄｇｅｎｅ ２４０００７）にクローニングした。ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｈＡＣＥ２をＰｍｅＩを用いて直線化し、続いて、同種組換えによってｐＡｄＶ５－ＡＣＥ２を生成するように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３にＨｕＡｄｖ５骨格プラスミド（ｐＡｄＥａｓｙ－１ベクター；Ａｄｄｇｅｎｅ ２４０００５）と同時形質転換した。ＨｕＡｄＶ５ゲノムを含有するｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミドは、Ｅ１およびＥ３遺伝子に欠失を有する。ｈＡＣＥ２はサイトメガロウイルスプロモーターの転写制御下にあり、その３’末端でＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに隣接している。ｐＡｄ－ｈＡＣＥ２は、ＨｕＡｄｖ５－ｈＡＣＥ２を生成するためのＴ－Ｒｅｘ２９３ＨＥＫ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのトランスフェクションの前にＰａｃＩ制限酵素を用いて直線化した。組換えＨｕＡｄｖ５－ｈＡＣＥ２を２９３－ＨＥＫ細胞において産生し、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心分離によって精製した。ウイルス力価を２９３－ＨＥＫ細胞においてプラークアッセイによって決定した。
インサイツＲＮＡハイブリダイゼーションおよび組織学：ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションをＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＨＤ（Ｂｒｏｗｎ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を製造者の使用説明書に従って使用して実施した。左肺組織を死体解剖で収集し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いて膨張させ、その後処理の前に７日間、１０％ＮＢＦ中で浸漬固定した。パラフィン包埋肺切片を６０℃で１時間インキュベートすることによって脱パラフィンし、内在性ペルオキシダーゼをＨ２Ｏ２を用いて１０分間、室温でクエンチした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＮＡプローブ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ８４８５６１）ハイブリダイゼーションおよびシグナル増幅の前に、スライドを１５分間、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ中で煮沸し、３０分間、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｐｌｕｓ試薬中でインキュベートした。切片をギルのヘマトキシリンを用いて対比染色し、明視野顕微鏡によって可視化した。一部の肺切片をヘマトキシリンおよびエオシン染色後に組織学的検査のために処理した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイ：加熱不活化した血清試料を系列希釈し、１０２ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と共に１時間、３７℃でインキュベートした。ウイルス血清混合物を９６ウエルプレート中のＶｅｒｏ細胞単層に加え、１時間、３７℃でインキュベートした。続いて細胞に２％ＦＢＳを補充したＭＥＭ中の１％（ｗ／ｖ）メチルセルロースをオーバーレイした。ＰＢＳ中の４％ＰＦＡを用いた１時間の固定の前にプレートを３０時間、室温でインキュベートした。次に細胞を洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）サポニン（Ｓｉｇｍａ）および０．１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＲ３０２２抗体（Yuan et al., 2020）（１μｇ／ｍＬ）およびＨＲＰ－コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて連続的にインキュベートした。ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）をＢｉｏＳｐｏｔ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）でフォーカスをカウントする前にプレートを発色させるために使用した。ルシフェラーゼ発現ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いた中和実験のために、血清試料を１：５０から開始して３倍希釈し、８５ＰＦＵの各組換えウイルス（野生型およびＤ６１４Ｇ）と混合した。透明底黒色壁９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に蒔いたＶｅｒｏ Ｅ６細胞に血清ウイルス混合物を接種し、細胞を３７℃、４８時間培養した。続いて細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をｔｈｅ Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の仕様書に従って使用して測定した。
Ｈｕ－ＡｄＶ５中和アッセイ：Ｈｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２形質導入の１日前に、血清試料をＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて筋肉内免疫化したマウスから収集した。１０２ＦＦＵ のＨｕＡｄＶ５を用いた１時間、３７℃でのインキュベーションの前に血清を加熱不活化し、系列希釈した。ウイルス－血清混合物を９６ウエルプレート中のＨＥＫ２９３細胞単層に加え、１時間、３７℃でインキュベートした。次に細胞に５％ＦＢＳを補充したＭＥＭ中の１％（ｗ／ｖ）メチルセルロースをオーバーレイした。プレートを、ＰＢＳ中２％ＰＦＡ、１時間、室温での固定の前に３７℃、４８時間インキュベートした。続いてプレートをＰＢＳを用いて洗浄し、透過処理緩衝剤（０．１％（ｗ／ｖ）サポニンおよび０．１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ）中に希釈したビオチン化抗ＨｕＡｄＶ５－ヘキソン抗体（２μｇ／ｍＬ；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＢ６００４１３）と共に一晩、４℃でインキュベートした。プレートを再度洗浄し、透過処理緩衝剤中のストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：３０００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＳＡ－５００４）と共に３０分間、室温でインキュベートした。最後の洗浄シリーズ後にプレートをＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）を使用して発色させ、フォーカスをＢｉｏＳｐｏｔ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）上でカウントした。
タンパク質発現および精製：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来の精製ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、組換え遺伝子クローニングのための鋳型として使用した。完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＰ（ＮＰ－ＦＬ）をヘキサヒスチジンタグを含むｐＥＴ２１ａにクローニングし、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ｂｉｏＷＯＲＬＤ）中でＢＬ２１（ＤＥ３）－ＲＩＬ大腸菌を使用して組換えで発現させた。イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（Ｇｏｌｄｂｉｏ）を用いた２５℃、一晩の誘起に続いて、細胞を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ β－メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｅｔｈａｎｏｌ）および５ｍＭイミダゾール中で、ニッケル親和性精製のために溶解させた。５００ｍＭイミダゾールを補充した事前の緩衝剤中への溶出後、タンパク質をサイズ排除および、場合によりカチオン交換クロマトグラフィーを使用して均一に精製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤおよびＳ外部ドメイン［Ｓ１／Ｓ２フューリン切断部位を破壊し、二重プロリン突然変異をＳ２サブユニットに導入し、フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）三量体形成モチーフを組み込んだ］をＣ末端ヘキサヒスチジンまたはオクタヒスチジンタグと共にｐＦＭ１．２にクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に一過的にトランスフェクトし、コバルト荷電レジン（ｃｏｂａｌｔ－ｃｈａｒｇｅｄ ｒｅｓｉｎ）クロマトグラフィー（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、以前記載されたとおり（Alsoussi et al., 2020）精製した。
ＥＬＩＳＡ：精製抗原（Ｓ、ＲＢＤまたはＮＰ）を９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ透明プレートに５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３ｐＨ９．６（７０μＬ）中２μｇ／ｍＬ、一晩、４℃でコートした。コーティング緩衝剤を吸引し、ウエルを２００μＬの１Ｘ ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０＋１％ＢＳＡ＋０．０２％ＮａＮ３（ブロッキング緩衝剤、ＰＢＳＴＢＡ）を用いて１時間、３７℃または一晩、４℃のいずれかでブロックした。加熱不活化した血清試料をＰＢＳＴＢＡ中に、別々の９６ウエルポリプロピレンプレートに希釈した。次にプレートを１Ｘ ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を用いて３回洗浄し、続いて５０μＬの各血清希釈物を添加した。ブロックしたＥＬＩＳＡプレート中で血清を少なくとも１時間、室温でインキュベートした。再度ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ中５０μＬの１：２０００抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ カタログ番号１０３０－０５）またはＰＢＳＴＢＡ中１：１００００のビオチン化抗マウスＩｇＧ、抗マウスＩｇＭもしくは抗マウスＩｇＡ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）の添加が続いた。プレートを室温、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ中で３回洗浄し、次にストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の１：５０００希釈物をウエルに加えた。１時間、室温でのインキュベーションに続いて、プレートをＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、５０μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡを加えた（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号３４０２８）。１２から１５分間のインキュベーションに続いて、反応を５０μＬの２Ｍ硫酸を用いて停止させた。各ウエルの４５０ｎｍでの吸光度を、硫酸の添加の２分以内に読み取った（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１）。光学密度（４５０ｎｍ）測定値をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して決定した。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＨＡフィルター９６ウエルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）プレートを３μｇ／ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を用いて一晩、４℃でプレコーティングした。ＰＢＳＴを用いたリンスの後、プレートを４時間、３７℃で培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５０ｍＭ β－メルカプトエタノール）を用いてブロックした。培養培地中の脾細胞の単一細胞懸濁物をＳタンパク質コートプレートに加え、３７℃、５％加湿ＣＯ２で４時間インキュベートした。ＰＢＳおよびＰＢＳＴを用いた洗浄後、プレートをビオチン化抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートし、ストレプトアビジンコンジュゲート西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とのインキュベーション、各１時間、室温が続いた。ＰＢＳを用いた追加の洗浄後、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ）基質溶液をスポット発色のために加えた。水でリンスすることによって反応を停止させた。スポットをＢｉｏｓｐｏｔプレートリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してカウントした。
ウイルス負荷の測定：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染マウスをケタミンおよびキシラジンカクテルを使用して安楽死させ、臓器を収集した。組織を秤量し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する１ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にＭＡｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してビーズを用いてホモジナイズした。ＲＮＡを澄ませた組織ホモジネートからＭａｇＭａｘ ｍｉｒＶａｎａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒデュオプライム抽出機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡレベルをワンステップ定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）ＴａｑＭａｎアッセイによって以前記載のとおり測定した（Hassan et al., 2020）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）特異的プライマーおよびプローブセットを使用した：［Ｌプライマー：ＡＴＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡ（配列番号８）；Ｒプライマー：ＧＡＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣ（配列番号９）。ウイルスＲＮＡは、ｌｏｇ１０スケールで１ミリグラムあたりの（Ｎ）遺伝子コピー数として表した。一部の試料について、ウイルス力価をＶｅｒｏ Ｅ６細胞でのプラークアッセイによって決定した。サイトカインおよびケモカインｍＲＮＡ測定。ＲＮＡは肺ホモジネートから抽出し、肺ホモジネートは、ＤＮＡｓｅ処置し、製造者のプロトコールに従ってＲＮａｓｅ阻害剤を添加してＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡを合成するために使用した。サイトカインおよび）ケモカイン発現を、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＩＦＮ－γ（ＩＤＴ：Ｍｍ．ＰＴ．５８．４１７６９２４０）、ＩＬ－６（Ｍｍ．ＰＴ．５８．１０００５５６６）、ＩＬ－１β（Ｍｍ．ＰＴ．５８．４１６１６４５０）、ＴＮＦ－α（Ｍｍ．ＰＴ．５８．１２５７５８６１）、ＣＸＣＬ１０（Ｍｍ．ＰＴ．５８．４３５７５８２７）、ＣＣＬ２（Ｍｍ．ＰＴ．５８．４２１５１６９２）、ＣＣＬ５（Ｍｍ．ＰＴ．５８．４３５４８５６５）、ＣＸＣＬ１１（Ｍｍ．ＰＴ．５８．１０７７３１４８．ｇ）、ＩＦＮ－β（Ｍｍ．ＰＴ．５８．３０１３２４５３．ｇ）およびＩＦＮγ－２／３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｍ０４２０４１５６＿ｇＨ）に特異的な市販のプライマー／プローブセットを用いて決定し、結果をＧＡＰＤＨ（Ｍｍ．ＰＴ．３９ａ．１）レベルに正規化した。倍数変化を処置マウスを未処置対照と比較する２－ΔΔＣｔ法を使用して決定した。
ペプチド再刺激および細胞内サイトカイン染色：筋肉内ワクチン接種マウス由来の脾細胞を、ブレフェルジンＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４２０６０１）を用いた処置の４時間前に、２５３個の重複する１５アミノ酸長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓペプチドのプールを含む培養物中で１２時間、３７℃でインキュベートした。ＦｃγＲ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン９３）を用いたブロッキングに続いて細胞を、ＣＤ４５ ＢＵＶ３９５（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ クローン３０－Ｆ１１）；ＣＤ４４ ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ４ ＰＥ－Ｃｙ５、ＣＤ８ｂ ＰｒｅＣＰ－Ｃｙ５．５およびＣＤ１９ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ クローン、それぞれＩＭ７、ＧＫ１．５、ＹＴＳ１５６．７．７および６Ｄ５）ならびにＦｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ３４９６６）を用いて氷上で染色した。染色した細胞を固定し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、００－５５２３）を用いて透過処理した。続いて細胞内染色を、抗ＩＦＮ－γ Ａｌｅｘａ ６４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＸＭＧ１．２）、抗ＴＮＦαＢＶ６０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＭＰ６－ＸＴ２２）および抗ＧｒＢ ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧＲＢ０４）を用いて実施した。鼻内免疫化マウス由来の肺を採取し、（１６７μｇ／ｍｌ）のＬｉｂｅｒａｓｅ ＤＨ（Ｓｉｇｍａ）および（１００μｇ／ｍｌ）のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ培地からなる消化緩衝剤中で１時間、３７℃で消化した。肺細胞を上に記載した２５３個の重複する１５アミノ酸長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓペプチドのプールと共に３７℃で、ブレフェルジンＡの存在下で５時間、３７℃でインキュベートした。次に肺細胞を、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ５をＣＤ４－ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ クローンＧＫ１．５）で置き換え、ＣＤ１９染色を含まず、ＣＤ１０３－ＦＩＴＣおよびＣＤ６９－ＢＶ７１１（それぞれＢｉｏＬｅｇｅｎｄ クローン２Ｅ７およびＨ１．２Ｆ３）を加えたことを除いて上に記載したとおりに染色した。分析をＦｌｏｗＪｏ Ｘ １０．０ソフトウェアを使用してＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０血球計算器上で実施した。
フローサイトメトリー－に基づく抗原特徴付け：ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞をＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの形質導入の２４時間前に細胞１０６個／ウエルで６ウエルプレートに播種した（ＭＯＩ、５）。２０時間後、細胞を採取し、固定し、Ｆｏｘｐ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して透過処理し、以下の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和マウスｍＡｂを用いたインキュベーション後にウイルス抗原について染色した：ＳＡＲＳ２－０１、ＳＡＲＳ２－０２、ＳＡＲＳ２－０７、ＳＡＲＳ２－１１、ＳＡＲＳ２－１２、ＳＡＲＳ２－１６、ＳＡＲＳ２－１８、ＳＡＲＳ２－２０、ＳＡＲＳ２－２１、ＳＡＲＳ２－２２、ＳＡＲＳ２－２３、ＳＡＲＳ２－２９、ＳＡＲＳ２－３１、ＳＡＲＳ２－３２、ＳＡＲＳ２－３４、ＳＡＲＳ２－３８、ＳＡＲＳ２－３９、ＳＡＲＳ２－５０、ＳＡＲＳ２－５５、ＳＡＲＳ２－５８、ＳＡＲＳ２－６６およびＳＡＲＳ２－７１（L.VanBlargan and M. Diamond、未発表結果）。Ｈ７７．３９、アイソタイプ適合抗ＨＣＶ Ｅ２ ｍＡｂを陰性対照として使用した。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートし、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。所与のｍＡｂに対して陽性の細胞のパーセンテージを抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＡｂのオリゴクローナル混合物の飽和量を用いて染色した細胞と比較した。
［実施例２］
マウスにおいて鼻内ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体に対して持続的に保護する
抗体中和を減弱するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体は、ワクチン有効性およびＣＯＶＩＤ－１９流行病の終息を危険にさらす可能性がある。実施例１は、単回用量で鼻内投与したスパイクタンパク質に基づくチンパンジーアデノウイルス－ベクター化ワクチン（ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ）の保護活性を動物において示し、ヒト治験に進んだ。本実施例は、マウスにおける持続的で、用量応答性の交差保護活性を提供する。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの単回鼻内用量は、持続的で高い中和およびＦｃエフェクター抗体応答を血清において、ならびにＳ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ分泌長寿命形質細胞を骨髄において誘起した。歴史的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する保護は、１００倍ワクチン用量範囲にわたって２００日間にわたり観察された。ワクチン接種後６週間または９か月で、血清抗体は、Ｂ．１．３５１およびＢ．１．１．２８スパイクタンパク質を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を中和し、チャレンジ後に上気道および下気道にほとんど完全な保護を付与した。これによりマウスでは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた鼻内免疫化は、歴史的および新興ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する持続的な保護を提供する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンのスパイク（Ｓ）タンパク質は、抗体に基づくおよびワクチンの対策のための主要な標的である。Ｓタンパク質は、ヒト細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入を促進するための最初のウイルス付着および侵入因子として作用し、細胞表面受容体アンジオテンシン－変換酵素２（ＡＣＥ２）に会合する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、Ｓ１タンパク質が受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有し、Ｓ２タンパク質が膜融合および細胞質へのウイルス侵入を促進する、Ｓ１およびＳ２断片を生じるように切断される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の融合前形態は、モノクローナル抗体を強力に中和すること、またはタンパク質阻害剤によって認識される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を標的化する多数のワクチン候補が、ＤＮＡプラスミド、脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡ、不活化ビリオン、タンパク質サブユニットまたはウイルスベクター化ワクチンプラットフォームを使用して開発された。筋肉内（ＩＭ）注射によって投与されるいくつかのワクチン（例えば、Ｐｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＢＮＴ１６２ｂ２およびＭｏｄｅｒｎａ １２７３ ｍＲＮＡおよびＪｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａｄ２６．ＣＯＶ２およびＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９アデノウイルスプラットフォーム）は、多くの国で緊急時使用承認を認められ、世界中で数億用量が与えられた（covid19.who.int）。
ＩＭ注射によって投与されたワクチンが、重篤な疾患および死亡率に対して保護する強固な全身性免疫を誘起する一方で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２伝染を縮小するそれらの能力、特に上気道感染が低減されるかどうかに疑問が残る。実際に、多数のＩＭ投与ワクチンは、前臨床研究において上気道感染および伝染に対する変化しやすい保護を示し、実質的な粘膜（ＩｇＡ）免疫を誘起できなかった。この課題は、スパイクタンパク質中に置換を有するＢ．１．１．７、Ｂ．１．３５１およびＢ．１．１．２８が挙げられるさらに伝染性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体の出現から重要である。シュードウイルスおよび標準ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を用いた実験もワクチン誘起血清による中和が、Ｌ４５２、Ｅ４８４位および他所でスパイク遺伝子中に突然変異を発現する変異体に対して減少していることを示唆している。保護への潜在的な悪影響を超えて、呼吸粘膜におけるある特定の変異体に対する免疫の減少および天然で低い抗Ｓ ＩｇＧレベルの組合せは、上気道での抵抗性および一般集団への伝染についてのさらなる選択のための条件を創成できる。
本明細書に記載のとおり、単回用量、鼻内（ＩＮ）送達チンパンジーアデノウイルス（サルＡｄ－３６）に基づく、融合前安定化されたＳタンパク質をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン（ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ）は、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス、ハムスターおよび非ヒト霊長類において、強固な液性、細胞媒介および粘膜免疫応答を誘起し、上気道および下気道感染を限定した。ヒト臨床試験（ＢＢＶ１５４、臨床試験ＮＣＴ０４７５１６８２）に進んだこのワクチンは、ＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９、チンパンジーＡｄ－２３に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンとは異なり、現在いくつかの国において緊急時使用が承認された。本明細書において、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの潜在的有用性を評価するためのさらなる工程として、マウスにおける上気道および下気道感染への効果を含むその用量応答、持続性および交差保護活性を評価した。ＩＮ免疫化後およそ９か月で、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチン接種動物の血清における中和抗体および抗Ｓタンパク質ＩｇＡレベルは、高いままであり、Ｂ．１．３５１およびＢ．１．１．２８スパイクタンパク質を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株での感染を阻止した。この時点で、易罹患性Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスは、Ｂ．１．３５１スパイクタンパク質を提示するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いたチャレンジ後に上気道および下気道感染に対して完全に保護された。
結果
単回ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ免疫化は、さまざまな用量で持続性の抗スパイクおよび中和応答を誘起する：用量を漸増させたＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（１０８、１０９および１０１０ウイルス粒子［ｖｐ］）または１０１０ｖｐのＣｈＡｄ対照ワクチンを用いたＩＭまたはＩＮ免疫化後１００または２００日でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける液性免疫応答の持続性を評価した（図１０Ａ）。最初に、抗Ｓおよび抗ＲＢＤ ＩｇＧおよびＩｇＡレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ワクチン接種後１か月時点３０日、１００または２００日で、以前の結果と一致してＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮ免疫化は、ＩＭ免疫化またはＣｈＡｄ対照を用いたワクチン接種よりも優れた抗体応答を誘起した（図１０Ｂ～１０Ｍおよび図１１）。血清中の抗Ｓおよび抗ＲＢＤ特異的結合ＩｇＧレベルは、１００または２００日目でＩＭ免疫化よりもＩＮ後に大きかった。１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮ免疫化１００日後に、それぞれＳ特異的ＩｇＧ応答の幾何平均力価（ＧＭＴ）は１．１×１０６、４．８×１０５および２．６×１０５であり、ＲＢＤ特異的ＩｇＧは３．２×１０５、１．８×１０５および８．７×１０４であった（図１０Ｂ）。比較して、１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＭ免疫化１００日後でのＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧ応答は、Ｓ特異的ＩｇＧ力価が２．１×１０５、１．１×１０５および４．５×１０４ならびにＲＢＤ特異的ＩｇＧ力価が５．１×１０４、２．９×１０４、および２．３×１０４で、それぞれ４から６分の１に低かった（Ｐ＜０．０００１）（図１０Ｅ）。同様の用量応答がＩＮまたはＩＭ免疫化２００日後でＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧ力価で観察された（図１０Ｈおよび図１０Ｋ）。１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮ免疫化２００日後で、それぞれＳ特異的ＩｇＧのＧＭＴは２．８×１０６、２．４×１０６および１．２×１０６であり、ＲＢＤ特異的ＩｇＧは１．１×１０６、６．１×１０５および３．２×１０５であった（図１０Ｈ）。１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＭ免疫化２００日後で、それぞれＳ特異的ＩｇＧ ＧＭＴは８．１×１０５、６．９×１０５および２．６×１０５、ＲＢＤ特異的ＩｇＧ ＧＭＴは１．４×１０５、１．３×１０５および８．０×１０４であった（図１０Ｋ）。それにより抗Ｓおよび抗ＲＢＤ ＩｇＧレベルは、ＩＭ免疫化よりもＩＮ免疫化後に高く、単回用量のワクチン接種数か月後でさえ血清において上がり続けた。
次に本発明者らは、血清ＩｇＡ応答の誘起および持続性を評価した。ＩＭ免疫化は、ＳまたはＲＢＤ特異的ＩｇＡを誘起できなかったが（図１ＦおよびＬ）、相当なレベルの抗ＳおよびＲＢＤ ＩｇＡをＩＮ免疫化後、免疫化１００または２００日後に検出した（図１ＣおよびＩ）。１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮ免疫化１００日後に、それぞれＳ特異的ＩｇＡのＧＭＴは４．８×１０３、１．２×１０３および８．４×１０２であり、ＲＢＤ特異的ＩｇＡは２．２×１０３、４．６×１０２および２．９×１０２であった（図１Ｃ）。ＩｇＧを用いて見られたのと同様に、ＩｇＡレベルは、１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮ免疫化２００日後にそれぞれＳ特異的ＩｇＡのＧＭＴが１．１×１０４、７．４×１０３および５．４×１０３であり、ＲＢＤ特異的ＩｇＡが５．２×１０３、３．８×１０３および９．８×１０２であるように経時的に増加し続けた（図１Ｉ）。
次に、血清学的応答の機能的相関をフォーカス減少中和検査（ＦＲＮＴ）を使用して中和活性をアッセイすることによって評価した（図１０Ｄ、図１０Ｇ、図１０Ｊ、図１０Ｍおよび図１１）。予測されたとおり、中和活性は、ＣｈＡｄ対照処置マウス由来の血清中で検出されなかった。１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮ免疫化１００日後に、平均有効最大半量阻害力価［ＥＣ５０］は、それぞれ３９，４４９、９，９８９および７，２７０であった（図１０Ｄ）。比較して、１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＭ免疫化後のこの時点で、ＥＣ５０値は、それぞれ４，９８８、２，０１７および３９１で８から２０分の１であった（Ｐ＜０．０００１）（図１０Ｇ）。１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮ免疫化２００日後に、高い抗ＳおよびＲＢＤ力価が見られたのと一致して、ＥＣ５０値はそれぞれ４５，５９１、２２，７６９および２３，４３３であった（図１０Ｊ）。比較して、１０１０、１０９および１０８ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＭ免疫化２００日後に、ＥＣ５０値はそれぞれ２，５２４、９４０および７１６でさらに低かった（図１０Ｍ）。
長寿命形質細胞（ＬＬＰＣ）は、骨髄に存在し、血清レベルと相関する高レベルの抗体を構成的に分泌する。１０１０ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＭまたはＩＮ免疫化２００日後の抗原特異的ＬＬＰＣのレベルを評価するために、ＣＤ１３８＋細胞を骨髄から単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＳ特異的ＩｇＧまたはＩｇＡ産生についてアッセイした。ＩＭ免疫化後においてよりもＩＮ免疫化後にＳ特異的ＩｇＧを分泌する約４倍高い頻度のＬＬＰＣを観察した（図１０Ｎ）。追加的にＩＮ免疫化後に、ＩＭ免疫化後には無かったＳ特異的ＩｇＡを産生するより多くのＬＬＰＣが検出された（図１０Ｎ）。さらに、これらのデータは、次のことを確立する：（ａ）単回用量ＩＮ免疫化がＩＭ免疫化よりも優れた液性免疫を促進する；（ｂ）１００分の１の接種用量のＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓがマウスにおいて強固な中和抗体応答を誘起する；（ｃ）ＩＮ免疫化は、血清ＩｇＡ応答およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対するＩｇＡ特異的ＬＬＰＣを誘起するがＩＭ免疫化はしない；ならびに（ｄ）ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓによって誘起される液性免疫は持続性であり、ワクチン接種後６か月間にわたって生じる。
ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＩＮ接種は、Ｆｃエフェクター機能能力を含む広範な抗体応答を誘起する：液性応答をさらに特徴付けるために、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来血清を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体タンパク質への抗体結合およびＦｃエフェクター機能をＩＮまたはＩＭワクチン接種９０日後に分析した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の本発明者らのパネルは、ＷＡ１／２０２０、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．１．２８株に対応するスパイク（Ｄ６１４Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Δ６９－７０、Ｋ４１７Ｎ）およびＲＢＤ（Ｅ４８４Ｋ）抗原を含んだ。最初に、いくつかのアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭおよびＩｇＡ）について抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体応答ならびにＦｃγ受容体（マウスＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＶ）に結合するそれらの能力をルミネックスプラットフォームを使用して測定した。ＥＬＩＳＡによって得られたデータと一致して（図１０Ｂおよび図１０Ｅ）、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＩＮワクチン接種は、ＩＭ免疫化よりも高いレベルのＩｇＧ１をＤ６１４ＧスパイクおよびＷＡ１／２０２０ ＲＢＤタンパク質に対して誘起し、予測されたとおり、ワクチンの用量の減少はより低い抗体価を生じた（図１２Ａ）。ＩＮ免疫化後の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＧ１力価も全てのスパイクおよびＲＢＤ変異体に対して、ＩＭ免疫化後よりも高く、力価はワクチン用量と共に減少した（図１２Ｂ）。ヒートマップに示すとおり、この傾向は、全ての抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体アイソタイプについて観察され、ＦｃγＲ結合パターンと相関した（図１２Ｃ）。これらのデータは、ＩＮワクチン接種が、ＩＭワクチン接種よりもより多く広範な抗体サブクラス応答をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して誘起することを示唆している。
抗体エフェクター機能、例えばオプソニン作用は、Ｆｃγ受容体会合によって部分的に媒介される。抗体価およびＦｃγＲ結合力価における観察された差異がエフェクター機能における差異を生じるかどうかを決定するために、抗体依存性好中球（ＡＤＮＰ）および細胞性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）アッセイを実施した（図１２Ｄ～１２Ｅ）。ＩＮワクチン接種マウス由来の血清は、ＩＭワクチン接種マウスから得られたものよりも実質的に多いＡＤＮＰを刺激した。しかし、ＡＤＣＰにおけるわずかな差異がＩＮおよびＩＭワクチン接種後に誘導された抗体から明らかになった（図１２Ｄ～１２Ｅ）。これらのデータは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮワクチン接種がＩＭワクチン接種後よりもより多くさらに機能性の抗体応答を誘起することを実証している。
鼻内投与ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する持続性の保護を誘起する：ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓワクチンの有効性を評価するために、図１０Ａに記載した投薬レジメンを与えられた免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いてチャレンジした。ウイルスチャレンジには、歴史的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によるＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｈＡＣＥ２の異所性発現およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖性の感染を可能にするＨｕ－Ａｄ５－ｈＡＣＥ２の鼻内（ｉｎｔｒａｎｓａｌ）導入が先行した。動物をＩＮまたはＩＭ経路を介して１０１０ｖｐのＣｈＡｄ対照または１０８、１０９もしくは１０１０ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて１回免疫化した。ワクチン接種後９５または１９５日目に、マウスに１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨｕ－Ａｄ５－ｈＡＣＥ２および抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡｂを与えた；後者は、自然免疫を減弱し、このモデルで病態形成を増強する。５日後、ＢＡＬＢ／ｃマウスを５×１０４フォーカス形成単位（ＦＦＵ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＷＡ１／２０２０株）を用いてＩＮ経路を介してチャレンジした。感染後４日（ｄｐｉ）、免疫化後１００日でチャレンジしたマウスから肺、脾臓および心臓を採取し、免疫化後２００日でチャレンジした第２のコホートから肺、鼻甲介および鼻洗浄液を収集した。組織をサブゲノムＲＮＡ（Ｎ遺伝子）に対するプライマーを使用する定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によってウイルス負荷について評価した。３種全ての用量を用いたＩＮ免疫化は、ＣｈＡｄ対照ワクチンを受けた動物と比較して、肺、脾臓および心臓におけるウイルスＲＮＡの実質的な非存在によって明らかになるとおりワクチン接種１００日後に顕著な保護を誘起した（図１３Ａ～１３Ｃ）。免疫化２００日後に、ＩＮ送達したＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓによって付与された保護は、ＣｈＡｄ対照免疫化マウスと比べて上気道および下気道において強固に残っていた。それにもかかわらず、最も低い１０８ｖｐ用量のＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した動物では、肺および鼻甲介での限定的な感染ブレイクスルーが観察された（図１３Ｇおよび図１３Ｉ）。比較して、ＩＭ免疫化１００日後での保護は、同じチャレンジ時点でＩＮ免疫化後よりも少なかった。ウイルスＲＮＡは心臓および脾臓において検出されなかったが（図１３Ｅ～１３Ｆ）、ＩＭ経路をＩＮ経路と比較することによって、少なくとも１，０００から３０，０００倍（Ｐ＜０．０００１）高いレベルがＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化したマウスの肺において測定された（図１３Ａおよび図１３Ｄ）。１０８ｖｐ用量での肺におけるウイルスＲＮＡ負荷における低減が、すでにＣｈＡｄ対照ワクチン接種マウスにおいてと異なったことから、ＩＭ経路による投薬のより大きな影響も観察された（図１３Ｄ）。ＩＭ免疫化２００日後に、肺、鼻洗浄液および鼻甲介におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するＩＮ免疫化後よりも低い保護が観察された（図１３Ｇ～１３Ｌ）。
ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおいて持続性の免疫を誘起する：次に、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染にさらに脆弱であるＫ１８－ｈＡＣＥ２ Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、鼻内に（ｉｎｔｒａｎｓａｌｌｙ）送達したＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの免疫原性を評価した。５週齢Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにＩＮ経路を介して１０９ｖｐのＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを接種した。血清試料を６週間後に収集し、液性免疫応答を評価した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＩＮ免疫化は、高レベルのＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡを誘起したが、ＣｈＡｄ対照はしなかった（図１４Ａ～１４Ｂ）。ＷＡ１／２０２０ならびに、Ｂ．１．３５１およびＢ．１．１．２８変異体由来のスパイクタンパク質を有する２つの他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する中和抗体価をＦＲＮＴアッセイによって測定した（図１４Ｃ～１４Ｄおよび図１６）。ＷＡ１／２０２０に対する高レベルの中和抗体がＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの単回ＩＮ用量後に誘起された（９，５９１のＥＣ５０）。ワクチン誘起ヒト血清を用いて見られたとおり、ＷＡ１／２０２０と比較して中和力価の減少が、Ｗａｓｈ－Ｂ．１．３５１（約５分の１、Ｐ＜０．０００１；図１４Ｃ）およびＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８（約３分の１、Ｐ＜０．０００１；図４Ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して観察された。液性応答の持続性を評価するために、別々のコホートのＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスをＩＮ経路を介して免疫化し、血清試料を９か月で収集した。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、ＷＡ１／２０２０（１２，５５０のＥＣ５０）に対する高レベルのＳおよびＲＢＤ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡならびに中和抗体をこの時点で誘起した（図１４Ｅ～１４Ｈおよび図１６）。Ｗａｓｈ－Ｂ．１．３５１およびＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８ウイルスに対して検査した場合、中和力価における減少も、それらはいまだ高いままだが（それぞれ１，６２７および１，９１８のＥＣ５０）ＷＡ１／２０２０と比較して観察された（約６から８分の１、Ｐ＜０．０５；図１４Ｇ～１４Ｈ）。
ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓは、ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにＷａｓｈ Ｂ．１．３５１およびＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８チャレンジに対する交差保護を付与する：課題の変異体に対応するスパイク遺伝子を有するＷＡ１／２０２０ならびに２つのキメラウイルス（Ｗａｓｈ－Ｂ．１．３５１およびＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８）に対するＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの保護有効性を検査した（図１５Ａ）。５週齢Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスをＩＮ経路を介して単回１０９ｖｐ用量のＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した。６週間後、マウスをＩＮ経路によって、１０４ＦＦＵのＷａｓｈ－Ｂ．１．３５１、Ｗａｓｈ Ｂ．１．１．２８またはＷＡ１／２０２０を用いてチャレンジした。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて免疫化した全てのマウスが、体重減少を示さなかった一方で、大部分のＣｈＡｄ対照ワクチン接種マウスは、３から６ｄｐｉに実質的な体重減少を経験した（図１５Ｂ、図１５Ｇおよび図１５Ｌ）。際だったことに、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたワクチン接種は、検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを上気道および下気道、心臓および脳において６ｄｐｉにほとんど生じなかった（図１５Ｃ～１５Ｆ、図１５Ｈ～１５Ｋおよび図１５Ｍ～１５Ｏ）。交差保護応答の持続性のさらなる検査として、５週齢Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスをＩＮ経路を介して単回１０１０ｖｐ用量のＣｈＡｄ対照またはＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した。９か月後、マウスをＩＮ経路を介して１０４ＦＦＵのＷａｓｈ－Ｂ．１．３５１を用いてチャレンジした。ＣｈＡｄ対照処置マウスとは対照的にＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ワクチン接種マウスは、体重を維持した（図１５Ｐ）。さらに、一部のマウスではごく少量のＷａｓｈ－Ｂ．１．３５１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡだけが上気道および下気道、心臓および脳で検出されたことから、実質的なウイルス学的保護が観察された（図１５Ｑ～１５Ｔ）。
考察
ワクチン誘起免疫応答の持続性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する持続的な保護を提供し、現在の流行病を抑制するために重要である。本明細書において、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた単回ＩＮ免疫化が数か月間上昇し続けるＳおよびＲＢＤ特異的結合ならびに中和抗体を誘起し、胚中心反応の維持を思わせることが示された。骨髄中のＬＬＰＣは、ＩＮワクチン接種の６か月後に検出され、循環において持続性の高い抗ウイルス抗体レベルに寄与していると考えられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＩｇＧおよびＩｇＡを分泌していた３４。比較して、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＭ免疫化は、より低いレベルの血清中和抗体、より少ないスパイク－特異的ＩｇＧ分泌ＬＬＰＣを誘起し、血清または細胞性ＩｇＡ応答を実質的に誘起しなかった。少なくともマウスでは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた単回ＩＮ用量免疫化は、１００倍の用量範囲にわたって観察された持続性の液性免疫をもたらした。これらの前臨床免疫原性結果を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｍＲＮＡワクチンを用いたヒトでの、少なくとも数か月間続く液性免疫応答を示す研究と順調に匹敵する。比較して、自然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の抗体応答の持続性は、相当変動する可能性がある。
ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの単回免疫化は、６か月間を通じた複数の時点で、ｈＡＣＥ２－形質導入ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＷＡ１／２０２０株）チャレンジに対して持続性の保護を付与した。特にＩＮ免疫化は、限定的な感染ブレイクスルーが１００分の１のワクチン用量で見られただけで、実質的に完全なウイルス学的保護を上気道および下気道感染に対して与えた。上気道での感染の抑止は、ＩＮワクチン接種が伝染を防止できることを示唆している。比較して、ＩＭ免疫化は、肺におけるウイルスＲＮＡレベルを低減したが、上気道由来の試料中の相同（ｈｏｍｏｌｇｏｕｓ）ＷＡ１／２０２０株に対しては実質的に少ない保護を示した。さまざまなプラットフォーム由来の多数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補が動物モデルにおいて免疫原性および保護有効性を実証したが、本発明者らの知るかぎりでは、変異体ウイルスに対する持続性または保護を確立したものはない。１００分の１の接種用量であってさえＩＮ免疫化によって付与される長期間の保護は、有望である。マウスにおける結果が再現される場合、用量を節約する戦略は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染および伝染を縮小できる大量のワクチン用量の生産を可能にする。
受容体結合モチーフ中にアミノ酸の突然変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ変異体（例えば、Ｂ．１．３５１およびＢ．１．１．２８）の出現は、多くの中和抗体の阻害活性へのそれらの抵抗性のために懸念される。実際に、ＢＮＴ１６２ｂ２ ｍＲＮＡ またはＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９（ＡＺＤ１２２２）ワクチンを用いてワクチン接種した対象由来のヒト血清は、Ｂ．１．３５１に対する中和の低減を示す。懸念されることに、ＩＭ投与されたＣｈＡｄＯｘ１ ｎＣｏＶ－１９（ＡＺＤ１２２２）は、ヒトにおいて穏和から中程度のＢ．１．３５１感染に対する保護有効性の低減を示した。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスにおいて、本発明者らがＷＡ１／２０２０およびＢ．１．１．２８またはＢ．１．３５１スパイクタンパク質を発現するキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対するＩＮ送達ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの免疫原性を比較した場合、変異体ウイルスの中和の低減（３から８分の１）が、力価は＞１，０００で残っていても観察された。ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＩＮ免疫化後６週間で、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスは、ＷＡ１／２０２０、Ｗａｓｈ－Ｂ．１．３５１およびＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８によって、体重減少および上気道および下気道および脳の感染に対して完全に保護されたマウスであった。顕著なことに、単回ＩＮ免疫化の９か月後にチャレンジしたＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスの別のコホートでは、動物は、Ｗａｓｈ－Ｂ．１．３５１チャレンジに対して完全に保護された。保護の相互関係はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンについて完全には確立されていないが、変異体ウイルスに対する高レベルの交差中和抗体は、強固なウイルス特異的全身性および粘膜性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答と組み合わされて保護に寄与すると考えられる。これを越えて、抗体エフェクター機能もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染および疾患を防止するために寄与できる。実際に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体タンパク質に対するＦｃエフェクター機能の増強が、ＡＤＮＰおよびＡＤＣＰ応答の強固な誘起を含むＩＮ送達ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ由来の血清において観察された。
要約すると、本実施例は、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いたＩＮ免疫化が強固で、持続的に結合するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体、中和抗体、Ｆｃエフェクター機能およびＬＬＰＣ応答をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して誘起することを示す。マウスでは、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いた単回ＩＮ免疫化は、Ｂ．１．３５１およびＢ．１．１．２８変異体に対応するスパイクタンパク質を提示するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する交差保護を、ワクチン接種の９か月後でさえ付与する。複数の動物モデルでの前臨床評価の有効性３０、３１、３２、および課題の変異体に対する持続性の保護免疫を考えると、ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＩＮデリバリーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を防止し、伝染を抑制するための有望なプラットフォームである。
方法
ウイルスおよび細胞：Ｖｅｒｏ Ｅ６（ＣＲＬ－１５８６、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｖｅｒｏ－ＴＭＰＲＳＳ２ ５７、Ｖｅｒｏ（ＣＣＬ－８１、ＡＴＣＣ）およびＨＥＫ２９３（ＣＲＬ－１５７３、ＡＴＣＣ）細胞は、３７℃、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１Ｘ非必須アミノおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。Ｖｅｒｏ－ＴＭＰＲＳＳ２細胞は５μｇ／ｍＬのブラストサイジンも補充した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株２０１９ ｎ－ＣｏＶ／ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０（ＷＡ１／２０２０）は、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎから得た。ウイルスは、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ８１細胞で１度継代し、フォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）によってＶｅｒｏ Ｅ６細胞でタイトレーションした。変異体スパイク遺伝子を有するＷａｓｈ－Ｂ．１．３５１およびＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８キメラウイルスは、に以前記載された２８、５８。全てのウイルスをＶｅｒｏ－ＴＭＰＲＳＳ２細胞で継代し、置換の導入および安定性を確認するために次世代配列決定に供した。全てのウイルス実験は、承認された生物安全レベル３（ＢＳＬ－３）施設で実施した。
マウス実験：動物研究は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針における勧告に従って実施した。プロトコールは、ｔｈｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された（保証番号Ａ３３８１－０１）。ウイルス接種は、ケタミン塩酸塩およびキシラジンを用いて導入され維持された麻酔下で実施し、全ての試みは動物の苦痛を最小化するように行った。
メスＢＡＬＢ／ｃ（カタログ０００６５１）およびＫ１８－ｈＡＣＥ２ Ｃ５７ＢＬ／６（カタログ０３４８６０）マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。４から５週齢の動物を、ＩＭ（後肢）またはＩＮ注射を介して、５０μｌ ＰＢＳ中１０１０ｖｐのＣｈＡｄＶ対照または１０８、１０９もしくは１０１０ｖｐのＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを用いて免疫化した。ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウス（１０から１１週齢）に２ｍｇの抗Ｉｆｎａｒ１ ｍＡ（ＭＡＲ１－５Ａ３ ５９（Ｌｅｉｎｃｏ）の単回腹腔内注射を、１０８ＰＦＵのＨｕ－Ａｄ５－ｈＡＣＥ２ ３７のＩＮ投与の１日前に与えた。Ｈｕ－Ａｄ５－－ｈＡＣＥ２形質導入の５日後に、マウスに４×１０５ＦＦＵの ＷＡ１／２０２０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をＩＮ経路によって接種した。Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスは、免疫化後の示された日に１０４ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＷＡ１／２０２０、Ｗａｓｈ－Ｂ．１．３５１またはＷａｓｈ－Ｂ．１．１．２８）を用いてＩＮ経路を介してチャレンジした。動物は、６ｄｐｉに安楽死させ、組織をウイルス学的分析のために採取した。
チンパンジーおよびヒトアデノウイルスベクター：ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＣｈＡｄ対照ワクチンベクターは、サルＡｄ３６骨格から誘導され６０、コンストラクションおよび検証は本明細書に記載されている。レスキューされた複製不能ＣｈＡｄ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳおよびＣｈＡｄ対照ベクターをＨＥＫ２９３細胞でスケールアップし、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心分離によって精製した。各ベクター調製物中のウイルス粒子濃度を２６０ｎｍでの分光光度法によって決定した。Ｈｕ－ＡｄＶ５－ｈＡＣＥ２ベクターも上に記載し、ＨＥＫ２９３細胞において産生した。ウイルス力価をＨＥＫ２９３細胞でのプラークアッセイによって決定した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイ：加熱不活化した血清試料を系列希釈し、１０２ＦＦＵのさまざまなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株と共に１時間、３７℃でインキュベートした。ウイルス血清混合物を９６ウエルプレート中のＶｅｒｏ細胞単層に加え、１時間、３７℃でインキュベートした。続いて細胞に２％ＦＢＳを補充したＭＥＭ中の１％（ｗ／ｖ）メチルセルロースをオーバーレイした。ＰＢＳ中の４％ＰＦＡを用いた１時間、室温での固定の前にプレートを３０時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）サポニンおよび０．１％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳ中のＳＡＲＳ２－２、ＳＡＲＳ２－１１、ＳＡＲＳ２－１６、ＳＡＲＳ２－３１、ＳＡＲＳ２－３８、ＳＡＲＳ２－５７およびＳＡＲＳ２－７１ ６２抗Ｓ抗体のオリゴクローナルプール、ならびにＨＲＰ－コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１２－３４９）と共に連続的にインキュベートした。ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）をＢｉｏＳｐｏｔ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）でフォーカスをカウントする前にプレートを発色させるために使用した。
タンパク質発現および精製：ＷＡ１／２０２０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対応する精製したＳおよびＲＢＤタンパク質のクローニングおよび産生は、以前記載された。簡潔には、融合前安定化されたＳ ６４およびＲＢＤをヘキサヒスチジンタグを含むｐＣＡＧＧＳ哺乳動物発現ベクターにクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に一過的にトランスフェクトした。タンパク質をコバルト荷電レジンクロマトグラフィー（Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって精製した。
ＥＬＩＳＡ：精製した抗原（ＳまたはＲＢＤ）を９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ透明プレートに５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３ ｐＨ９．６（７０μＬ）中２μｇ／ｍＬで一晩、４℃でコーティングした。コーティング緩衝剤を吸引し、ウエルを２００μＬの１Ｘ ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０＋１％ＢＳＡ＋０．０２％ＮａＮ３（ブロッキング緩衝剤、ＰＢＳＴＢＡ）を用いて、一晩、４℃でブロッキングした。加熱不活化した血清試料をＰＢＳＴＢＡ中に別々の９６ウエルポリプロピレンプレートで希釈した。次にプレートを１Ｘ ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を用いて３回洗浄し、５０μＬの各血清希釈物の添加が続いた。ブロックしたＥＬＩＳＡプレートで血清を少なくとも１時間、室温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを再度ＰＢＳＴ中で３回洗浄し、ＰＢＳＴ中５０μＬの１：１，０００抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１０３０－０５）または、ＰＢＳＴＢＡ中１：１０００の抗マウスＩｇＡ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）の添加が続いた。プレートを室温、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ中で３回洗浄し、次に１００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡを加えた（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号３４０２８）。１０から１２分間のインキュベーションに続いて、反応を５０μＬの２Ｍ硫酸を用いて停止させた。光学密度（４５０ｎｍ）測定値をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して決定した。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：骨髄中のＳ特異的形質細胞を定量化するために、大腿骨および脛骨をＲＰＭＩ１６４０で乳鉢および乳棒を使用して粉砕し、１００μｍ濾過器を通して濾過し、ＡＣＫ溶解に供した。ＣＤ１３８＋細胞を製造者の使用説明書に従ったポジティブ選択および磁気ビーズによって濃縮した（ＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ１３８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ）。濃縮したＣＤ１３８＋細胞を一晩、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を用いてプレコートしたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＨＡ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中でインキュベートした。抗マウスＩｇＧ－ビオチンまたは抗マウスＩｇＡ－ビオチンおよびストレプトアビジン－ＨＲＰとの連続インキュベートに続いて、フォーカスをＴｒｕＢｌｕｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ）を使用して発色させた。プレートをＢｉｏＳｐｏｔ装置を使用して画像化し、フォーカスを手作業で数えた。
ウイルス負荷の測定：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染マウスをケタミンおよびキシラジンカクテルを使用して安楽死させ、臓器を収集した。組織を秤量し、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する１ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にＭＡｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してビーズを用いてホモジナイズした。ＲＮＡを澄ませた組織ホモジネートからＭａｇＭａｘ ｍｉｒＶａｎａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ抽出システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡレベルをワンステップ定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）ＴａｑＭａｎアッセイによって以前記載３７のとおり測定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）特異的プライマーおよびプローブセットを上に記載のとおり使用した。ウイルスＲＮＡは、ｌｏｇ１０スケールで１ミリグラムあたりの（Ｎ）遺伝子コピー数個として表した。
Ｌｕｍｉｎｅｘ分析：Ｌｕｍｉｎｅｘ分析（ａｎａｌｈｙｓｉｓ）を以前記載されたとおり実施した。簡潔には、タンパク質（スパイク：Ｄ６１４Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Δ６９－７０、Ｋ４１７Ｎ、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１；受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（ＩｍｍｕｎｅＴｅｃｈ）：ＷＴ、Ｅ４８４Ｋ、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．１２８）をＳｕｌｆｏ－ＮＨＳおよびＥＤＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるＮＨＳ－エステル連結を使用してｍａｇｎｅｔｉｃ Ｌｕｍｉｎｅｘ ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ ｂｅａｄｓ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にカルボキシカップリングさせ（ｃａｒｂｏｘｙ―ｃｏｕｐｌｅｄ）、次に血清（ＩｇＧ１、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ １：３０００；ＩｇＧ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ３、Ａ、ＦｃγＲＩＶ１：１０００、ＩｇＭ １：５００）と２時間、３７℃でインキュベートした。アイソタイプ分析を、免疫複合体を、各アイソタイプに対する二次ヤギ抗マウス－ＰＥ抗体（ＩｇＧ１ １０７０－０９、ＩｇＧ２ａ １０８０－０９Ｓ、ＩｇＧ２ｂ １０９０－０９Ｓ、ＩｇＧ３ １１００－０９、ＩｇＭ １０２０－０９、ＩｇＡ １０４０－０９ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とインキュベートすることによって実施した。ＦｃγＲ結合を、免疫複合体をストレプトアビジン－ＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）にコンジュゲートしたビオチン化ＦｃγＲｓ（ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶ、Ｄｕｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙのご厚意による）とインキュベートすることによって定量化した。フローサイトメトリーは、ＩＱｕｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を用いて実施し、分析はＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ＦｏｒｅＣｙｔ（ｖ８．１）で実施した。
抗体依存性好中球または細胞性ファゴサイトーシス：抗体依存性好中球ファゴサイトーシス（ＡＤＮＰ）および細胞性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）アッセイを以前記載されたとおり実施した。簡潔には、スパイクタンパク質を青、黄緑または赤のＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ（商標）カルボン酸修飾ミクロスフェア、０．２μｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にＳｕｌｆｏ－ＮＨＳおよびＥＤＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いるＮＨＳエステル連結を使用してカルボキシルカップリングさせた。スパイクコートビーズを希釈した血清（１：１５０ ＡＤＮＰ、１：１００ ＡＤＣＰ）と２時間、３７℃でインキュベートした。ＡＤＮＰアッセイのために、骨髄細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスから収集し、赤血球をＡＣＫ溶解に供した。残存細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、９６ウエルプレートにアリコートした（１ウエルあたり細胞５×１０４個）。ビーズ抗体複合体を細胞に加え、１時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、細胞を以下の抗体を用いて染色した：ＣＤ１１ｂ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １０１２１２）、ＣＤ１１ｃ Ａ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １１７３２０）、Ｌｙ６Ｇ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（１２７６２８）、Ｌｙ６Ｃ ＢＶ６０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １２８０３６）、Ｆｃｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５３１４２）およびＣＤ３ ＰＥ／Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ １００３２０）。細胞を４％ＰＦＡを用いて固定し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した。好中球は、ＣＤ３－、ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ＋と定義した。好中球ファゴサイトーシススコアを（％ＦＩＴＣ＋）×［ＦＩＴＣの蛍光強度の幾何平均（ｇｅｏｍｅｔｉｃ ｍｅａｎ）］／１００００として算出した。ＡＤＣＰアッセイのために、Ｊ７７４Ａ．１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－６７）マウス単球細胞をスパイクコードビーズ抗体複合体と１時間、３７℃でインキュベートした。細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡ ＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡを用いて固定し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。細胞性ファゴサイトーシススコアを（％ＦＩＴＣ＋）×（ＦＩＴＣの蛍光強度の幾何平均）／１００００として算出した。
等価物
本明細書においていくつかの発明的実施形態が記載され、例示されたが、当業者は、本明細書に記載される機能を実施するため、ならびに／または結果および／もしくは１つもしくは複数の有利点を得るための種々の他の手段および／または構造を容易に予測し、そのような変更および／または改変それぞれは、本明細書に記載される発明的実施形態の範囲内であるとみなされる。さらに一般的に当業者は、本明細書に記載される全てのパラメーター、大きさ、材料および配置が、例示であり、実際のパラメーター、大きさ、材料および／または配置が本発明の教示が使用される具体的な１つまたは複数の適用によって決まることを容易に理解する。当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載される具体的な発明的実施形態の多数の等価物を認識する、または確認することができる。したがって、前述の実施形態が例の方法によってのみ示され、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内であり、発明的実施形態が具体的に記載され、特許請求される以外に実施される可能性があることは理解される。本開示の発明的実施形態は、本明細書に記載される個々の特性、システム、物品、材料、キットおよび／または方法それぞれに方向付けられている。加えて、そのような特性、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の２つ以上の任意の組合せは、そのような特性、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に相反しない限り、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書において開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それについてそれぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、一部の場合では文書全体を包含し得る。
句「および／または」は、明細書においておよび特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、そのように結合されたエレメント、即ち一部の場合に結合的に存在し、他の場合に非結合的に存在するエレメントの「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」を用いて列挙された複数のエレメントは、同様の様式で、即ちそのように結合された「１つまたは複数の」エレメント、と解釈されるべきである。他のエレメントは「および／または」節によって具体的に同定されたエレメント以外に、具体的に同定されたこれらのエレメントに関連するかどうかに関わらず、存在してもよい。それにより、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」を参照することは、制約の無い語、例えば「含む」と併せて使用される場合、一実施形態ではＡのみを参照してよく（Ｂ以外のエレメントを含んでもよい）；別の実施形態ではＢのみを参照してよく（Ａ以外のエレメントを含んでもよい）；さらに別の実施形態ではＡおよびＢの両方を参照してよい（他のエレメントを含んでもよい）；など。
明細書においておよび特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「または」は上に定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的である、即ち、多数のまたはリストのエレメントの少なくとも１つだけでなく、１つより多くの、および適宜列挙されていない追加的な項目の含有としても解釈されるべきである。用語がそうでないと明らかに示す場合のみ、例えば「～の１つだけ」もしくは「～の正確に１つ」または、特許請求の範囲において使用される場合の「からなる」は、多数のまたはリストのエレメントの正確に１つのエレメントの含有を指す。一般に、本明細書で使用される場合、用語「または」は、排他的な用語、例えば「いずれか」、「～の１つ」、「～の１つだけ」または「～の正確に１つ」によって先行される場合にだけ、排他的な選択肢（即ち、「一方または他方だが両方ではない」）を示すとして解釈されるべきである。特許請求の範囲において使用される場合、「本質的にそれからなる」は、特許法の分野において使用される場合の通常の意味を有するべきである。
明細書においておよび特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、１つまたは複数のエレメントのリストを参照する句「少なくとも１つ」は、エレメントのリスト中の任意の１つまたは複数のエレメントから選択される少なくとも１つのエレメントを意味すると理解されるべきであるが、エレメントのリスト内に具体的に列挙されたそれぞれおよび全てのエレメントの少なくとも１つを必ずしも含まず、エレメントのリスト中のエレメントの任意の組合せを排除しない。この定義は、エレメントが、句「少なくとも１つ」が参照するエレメントのリスト内で具体的に同定されたエレメント以外に存在してもよいことを、具体的に同定されたエレメントに関連するかどうかに関わらず可能にする。それにより、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または等価に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または等価に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つの、適宜１つより多くのを含んで、ＡをＢが存在せずに（および、適宜Ｂ以外のエレメントを含んで）；別の実施形態では、少なくとも１つの、適宜１つより多くを含んで、ＢをＡが存在せずに（および、適宜Ａ以外のエレメントを含んで）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、適宜１つより多くを含んで、Ａを、および少なくとも１つの、適宜１つより多くを含んで、Ｂを（および適宜他のエレメントを含んで）指し得る；など。
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語は、本発明が属す分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明らかに示さない限り複数の参照物を含む。本明細書における「または」の参照は、他に述べない限り「および／または」を包含することを意図する。

Claims (37)

  1. 非ヒトアデノウイルスのゲノムを含むアデノウイルスベクターであって、前記アデノウイルスのゲノムが、前記ベクターが天然のＥ１遺伝子座を欠き、Ｅ３またはＥ３Ｂの遺伝子座を欠いてもよく、宿主細胞における転写、翻訳、および／または発現を指令する発現制御配列に作動可能に連結されたトランスジーンを含むように改変されており、前記トランスジーンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質またはその免疫原性部分、変異体、突然変異体、もしくは断片をコードする、アデノウイルスベクター。
  2. 前記非ヒトアデノウイルスがサルアデノウイルス（ＳＡｄＶ）である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  3. 前記ＳＡｄＶがサルアデノウイルス３６である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
  4. 前記アデノウイルスゲノムが配列番号４と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  5. 前記アデノウイルスゲノムが配列番号４の核酸配列を有する、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  6. 前記トランスジーンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の安定化された融合前形態をコードする、請求項１から５のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
  7. 前記トランスジーンが配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質をコードする、請求項１から５のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
  8. 前記トランスジーンが、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐの突然変異を有する配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質をコードする、請求項１から５のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
  9. 前記トランスジーンが、ＷＡ１／２０２０、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．１．２８、Ｐ．１、Ｂ．１．４２７、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．５２６．１、Ｂ．１．５２５、Ｐ．２、Ｂ．１．６１７、Ｂ．１．６１７．１、Ｂ．１．６１７．２、Ｂ．１．６１７．３、Ｂ．１．４２９、またはＢ．１．４２９変異体由来のコロナウイルスＳタンパク質である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  10. 配列番号２、配列番号５、または配列番号６と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の配列同一性を有する核酸配列を有する、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  11. 配列番号２、配列番号５、または配列番号６の核酸配列を有する、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含む、医薬組成物。
  13. 鼻内投与のために製剤化された、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記請求項のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含み、１つまたは複数のさらなる活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、もしくはアジュバントを含んでもよい、免疫原性組成物。
  15. 前記請求項のいずれか一項に記載の組成物またはアデノウイルスベクターを形質導入した、宿主細胞。
  16. 前記請求項のいずれか一項に記載の組成物またはウイルスベクターを産生する、パッケージング細胞系。
  17. 前記細胞が、前記請求項のいずれか一項に記載のウイルスベクターにおいて機能的に欠失した任意のアデノウイルス遺伝子の相補体を含む、請求項１６に記載のパッケージング細胞系。
  18. （ｉ）請求項１から１７のいずれか一項に記載の宿主細胞、細胞系、組成物、もしくはアデノウイルスベクター、またはそれらの免疫原性組成物、および（ｉｉ）使用説明書を含む、キット。
  19. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物またはアデノウイルスベクターを含む、コロナウイルスワクチン。
  20. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物を以前に投与された対象の血清を含む、組成物。
  21. 請求項２０に記載の血清を含む免疫原的有効量の組成物を第２の対象に投与することを含む、コロナウイルス感染を有する前記第２の対象を処置する方法。
  22. 免疫原的有効量の請求項１から１４または１９から２０のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘導する方法。
  23. 免疫原的有効量の請求項１から１４または１９から２０のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるコロナウイルス感染を処置または防止する方法。
  24. 免疫原的有効量の請求項１から１４または１９から２０のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、コロナウイルス感染から前記対象を保護する方法。
  25. 前記組成物が鼻内に投与される、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記免疫原的有効量の組成物が、鼻道、上気道、肺組織、および播種されたその他の全ての部位において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して保護し、ならびに／または上気道の感染および鼻におけるウイルスの流出を防止する、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記免疫原的有効量の組成物が筋肉内に投与される、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、Ｄ６１４Ｇ突然変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異体である、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記対象がヒトである、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記対象がコロナウイルスに曝露されていた、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記対象がコロナウイルス感染を有しないが、コロナウイルス感染を発症するリスクがある、請求項２１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記対象が、コロナウイルスが蔓延している地域に旅行している、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記組成物の投与が抗原特異的免疫応答をもたらす、請求項２１から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記対象が、コロナウイルス感染を有しているか、コロナウイルス感染を有していると疑われるか、またはコロナウイルス感染を発症するリスクがある、請求項２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記対象の宿主細胞中にトランスジーンを送達することを含む、請求項２１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のウイルスベクターを細胞にトランスフェクトすること、前記細胞が組換えアデノウイルスを産生するような条件下で前記細胞を培養すること、および前記組換えアデノウイルスを収集することを含む、組換えアデノウイルスを作製する方法。
  37. 前記細胞がＨＥＫ細胞、Ｖｅｒｏ、またはＰＥＲ細胞である、請求項３６に記載の方法。
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