TW202144383A - 冠狀病毒免疫原性組合物及其等之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供免疫原性組合物、其等之藥用製劑、以及其等之用途，用於一哺乳動物體內誘導針對2019新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）及變異體之保護性免疫反應。

Description

冠狀病毒免疫原性組合物及其等之用途
本發明整體上係涉及用於向哺乳動物受試者給藥之一腺病毒載體冠狀病毒抗原藥用製劑，其係於受試者體內誘導一免疫反應並選擇性提供針對新型2019冠狀病毒（SARS-CoV-2）之保護。
冠狀病毒係為多種大型外套膜單股正鏈RNA（positive-stranded RNA（ss RNA））病毒，其等係可引起人類及其他動物之呼吸道及腸道疾病。例如，人類冠狀病毒229E（HCoV-229E）、OC43（HCoV-OC43）、NL63、及HKU1於人類群體中係為地方性病毒，且係可導致多達30%之尋常感冒。動物之冠狀病毒（例如豬傳染性腸胃炎病毒（TGEV）、鼠肝炎病毒（MHV）及禽傳染性支氣管炎病毒（IBV））係可於其各自之宿主中引起呼吸道、腸胃道、神經或肝疾病。
冠狀病毒具有陽性、未分段之單鏈RNA基因體，其編碼至少18種病毒蛋白（例如非結構蛋白（NSP）1-13、結構蛋白E、M、N、S、以及一種RNA依賴性RNA聚合酶）。冠狀病毒具有三種主要表面醣蛋白（經命名為S、E及M），且些許冠狀病毒具有另一種稱為血球凝集素（HE）之表面醣蛋白，此外，N（核殼）蛋白係為一種鹼性磷酸蛋白，其通常係與該基因體相關，並經回報具有抗原性（Holmes and Lai，Fields Virology，Chapter 34，1996）。S（棘狀）蛋白係為冠狀病毒之主要抗原，其具有兩個域：S1，經認為與受體結合有關，以及S2，經認為係介導病毒及目標細胞間之膜融合（Holmes and Lai，1996，同上）。
S（棘狀）蛋白係可形成非共價連接之同源三聚體（寡聚物），其可介導受體鍵結與病毒感染性。S蛋白之同源三聚體對於呈現受體結合域之正確天然構形與引發中和抗體反應可能係為必需。此外，S蛋白之細胞內加工係與顯著之轉譯後寡醣修飾有關。N-聚醣模體分析所預期之轉譯後寡醣修飾（醣基化）指出，S蛋白具有多達23個此種修飾位點。此外，C端半胱胺酸(cysteine)殘基亦可能參與蛋白折疊並保留天然之（功能性）S蛋白構形。些許冠狀病毒之S蛋白係可透過高基氏體（Golgi apparatus）中之胰蛋白酶樣蛋白酶(trypsin-like protease)或細胞外定位酶，在S蛋白中心附近進行蛋白分解加工以形成一經連結多肽，其包含一N端S1及一C端S2多肽。目前，冠狀病毒經分為α屬、β屬（例如，MERS，SARS，SARS-CoV-2）、及γ屬。參見圖14。
冠狀病毒的感染係透過病毒外套膜之脂雙層與宿主細胞膜之融合來實現。膜融合係由病毒外套膜上之病毒棘狀（S）醣蛋白所介導。S醣蛋白經合成為約180kDa之前驅物，其係於內質網中寡聚並摻入前高基氏區室（pre-Golgi compartment）之出芽病毒體中。S1包含該受體結合位點，因此有助於定義病毒之宿主範圍。S2係為跨膜次單元，有助於介導病毒及細胞膜間之融合。S2包含兩個4,3-疏水重複域（4,3-hydrophobic repeat domains）（HR），其等係可預期形成捲曲螺旋結構。此等區域係經表示HR-1及HR-2，並經稱為螺旋間結構域的胺基酸殘基之插入片段所隔開。此等捲曲螺旋區域可能在定義於天然狀態下之棘狀蛋白的寡聚結構及其融合能力中扮演重要作用。
新型冠狀病毒SARS-CoV-2（最初經報導為2019-nCoV，並由冠狀病毒研究組（Coronavirus Study Group，國際病毒分類學委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses）之一工作組）基於親緣關係、分類學及慣例（BioRxiv；doi.org/10.1101/2020.02.07.937862）正式命名為SARS-CoV-2）係為一種新病毒株，其先前尚未於人體內受到鑑定，且首次係於中國湖北省武漢市受到報導。SARS-CoV-2為導致2019至2020年度武漢冠狀病毒暴發以及全球衛生緊急情況之原因。基因組定序已證明其係為一種陽性、單股RNA冠狀病毒（GenBank登錄號MN908947.3、RefSeq NC_045512、「武漢海鮮市場肺炎病毒分離株Wuhan-Hu-1」）。冠狀病毒主要透過密切接觸傳播，特別係透過咳嗽及打噴嚏引起之呼吸道飛沫傳播，範圍約為6英尺（1.8 m）。常見感染跡象包括呼吸道症狀、發燒、咳嗽、呼吸急促及呼吸困難。於更嚴重情況下，感染係可導致肺炎、嚴重急性呼吸道症候群、腎衰竭、甚至死亡。目前係迫切需要可用於誘導抵抗SARS-CoV-2之免疫反應之載體，以及包含該載體之免疫原性組合物。本發明內容係可解決此等問題。
本發明主張2020年2月14日遞交之第62/977,078號、2020年3月20日遞交之第62/992,553號、2020年4月6日遞交之第63/005,923號、2020年4月28日遞交之第63/016,902號、2020年7月12日提交之第63/050,844號、2020年8月5日遞交之第63/069,792號、2020年10月7日遞交之第63/088,736號、2021年1月21日遞交之第63/140,128號、2021年1月27日遞交之第63/142,077號以及2021年2月11日遞交之第63/148,374號美國臨時專利申請案，其等係經完整結合於本發明。
於些許實施例中，本發明係提供用於誘導及/或改善（例如，增強）抵抗冠狀病毒之免疫反應的藥劑、組合物、及方法，尤其係針對2019新型冠狀病毒SARS-CoV-2。例如，於些許實施例中，本發明提供複製缺陷型腺病毒載體，其係編碼至少一種SARS-CoV-2抗原（例如，E1A/E3剔除5型人類腺病毒（hAd5）（hAd5-SARS-CoV-2）），以及/或一不同類型之傳染源（例如，不同類型之病毒，例如流感病毒（例如，Ad-HA））之另一或多種外源抗原，或缺乏轉基因（「hAdE」，例如，未編碼至少一種抗原或外源性傳染源之抗原，為「空，empty」），其等係統稱為「SARS-CoV-2免疫載體」。如本文所述，此類載體（以及/或包含相同物之免疫原性組合物）係可用於誘導抵抗SARS-CoV-2（例如針對保護性SARS-CoV-2抗原決定位，如棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD））之黏膜、細胞介導以及/或體液免疫反應。於些許實施例中，本發明描述向動物及/或人類施用此種載體（例如，hAd5-SARS-CoV-2及/或hAd5），以誘導及/或增強對SARS-CoV-2 T抗原決定位（例如優勢抗原決定位）具有特異性之免疫反應（例如，產生抗體以及/或CD8+ T細胞（及/或其他T細胞）。於些許實施例中，由鼻內給藥的載體誘導之免疫反應可誘導及/或增強呼吸道中具有固有記憶表型之T細胞反應。於些許實施例中，此種免疫反應對SARS-CoV-2具有保護作用，並且/或於緩解SARS-CoV-2之症狀及/或感染方面係為有效，且於些許實施例中係可對SARS-CoV-2之攻擊具有保護效果。因此，於些許實施例中，本發明係描述一種或多種免疫原性組合物之用途，該組合物包含hAd5-SARS-CoV-2，以提供所屬技術領域所公認關於SARS-CoV-2之傳播及感染問題之解決方案。
本發明提供之些許實施例中，為用於治療及/或預防由SARS-Cov-2病毒感染引起COVID-19相關疾病之免疫原性組合物、其製劑、及其使用方法，其中，該免疫原性組合物包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其包含一核酸序列，編碼SEQ ID NO：446或與SEQ ID NO：446有至少90%或至少95%同一性之變異體。於實施例中，該免疫原性組合物包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其包含一核酸序列，編碼SEQ ID NO：15或與SEQ ID NO：15具有至少90%或至少95%同一性之變異體。SEQ ID NO：15包含RBD序列（SEQ ID NO：446），其具有棘狀蛋白（SEQ ID NO：3）之S1結構域之長側翼序列及一前導序列。於些許實施例中，該核酸序列係編碼SEQ ID NO：13（S1結構域）。於實施例中，該核酸序列編碼包含SEQ ID NO：3之一個或多個點突變之一序列。
如本文所用之「變異體」係指RBD序列中之一個或多個突變。於些許實施例中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476及SEQ ID NO：460中之一個或多個（與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：446、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15之RBD序列相比，其RBD序列包含一個或多個突變。）。於實施例中，該核酸序列編碼包含一個或多個突變之序列，所述突變係位於胺基酸位置333至388、390至395、397至399、401至411、413至415、417至419、424、426至435、437、439至442、444至446、449、450、452、453、455至463、465、467至473、475至479、481至486、490、491、493至495、499至510、或513至526，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411或SEQ ID NO：3（全長棘狀蛋白）。於實施例中，該核酸序列編碼包含一個或多個突變之序列，所述突變係位於胺基酸位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504、及/或505，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411或SEQ ID NO： 3（全長棘狀蛋白）。
於實施例中，該一個或多個突變係選自：以N取代胺基酸417（K）；以V、S或A取代胺基酸446（G）；以N取代胺基酸449（Y）；以F取代胺基酸453（Y）；以F取代胺基酸455（L）；以L取代胺基酸456（F）；以V取代胺基酸473（Y）；以V取代胺基酸475（A）；以S或A取代胺基酸476（G）；以N、R、T、G、A或I取代胺基酸477（S）；以Q、K、D、A或R取代胺基酸484（E）；以L或S取代胺基酸486（F）；以F取代胺基酸453（Y）；以L或R取代胺基酸493（Q）；以N或F取代胺基酸495（Y）；以I取代胺基酸500（T）；以Y、T或S取代胺基酸501（N）；以R、D或C取代胺基酸502（G）；以L、I或F取代胺基酸503（V）；或者，以H、E、W或C取代胺基酸505（Y）；其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411或SEQ ID NO：3（全長棘狀蛋白）。於實施例中，核酸序列編碼包含一個或多個突變之一序列，所述突變係選自K417T、K417N、E484K、L452R及/或N501Y，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411或SEQ ID NO：3（全長棘狀蛋白）。於實施例中，編碼SEQ ID NO：446之該核酸序列進一步包含一前導序列，其係由編碼選自SEQ ID NO：418至437之一序列之一核酸序列所編碼。
於本文提供之實施例為一種免疫原性組合物，其中，該轉基因之編碼序列係針對一哺乳動物進行密碼子優化。於實施例中，該複製缺陷型腺病毒載體為一牛(bovine)腺病毒、犬(canine)腺病毒、非人靈長類(non-human primate)腺病毒、雞(chicken)腺病毒、豬(porcine)或養豬類(swine)腺病毒、或人類腺病毒。於實施例中，非人靈長類腺病毒為一黑猩猩或大猩猩腺病毒。於實施例中，該複製缺陷型腺病毒載體為一人類腺病毒。於實施例中，該人類腺病毒為Ad5或Ad26。
於本文提供之實施例為一種藥用製劑，其包含一有效量之免疫原性組合物（例如，包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其包含一核酸序列，編碼SEQ ID NO：446或與SEQ ID NO：446具有至少90%或至少95%同一性之變異體），該組合物包含至少一種藥學上可接受之稀釋劑或載體，其中，該稀釋劑係選擇性為磷酸鹽緩衝液。於實施例中，該製劑係經配置用於非侵入性或鼻內給藥，其中，該藥學上可接受之載體係選擇性為一噴霧或氣溶膠形式。
於本文提供之實施例為一種誘導抵抗SARS-CoV-2之免疫反應之方法，該方法包含對一人類施用一有效量之本發明免疫原性組合物（例如，包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其包含一核酸序列，編碼SEQ ID NO：446或與SEQ ID NO：446具有至少90%或至少95%同一性之變異體）。於一實施例中，該有效量為至少108 個病毒顆粒（vp）、至少109 個病毒顆粒（vp）、或至少1010 個病毒顆粒（vp）。於實施例中，該免疫原性組合物係經鼻內給藥。
於些許實施例中，本發明揭露之組合物係可用於治療或預防SARS-CoV-2，且本發明揭露之組合物係可用於製備藥物，以提供SARS-CoV-2之治療或預防。因此，儘管本發明包含治療及預防SARS-CoV-2的方法，但本發明亦包含本發明組合物之用途，且此等用途係可與任何本發明之方法相似並涉及本發明之任何或所有組合物。
本發明揭露內容涉及一種免疫原性組合物（例如疫苗），其包含編碼至少一種2019新型冠狀病毒SARS-CoV-2抗原（「 SARS-Cov-2轉基因」）之腺病毒載體，包含相同組成之組合物，及其用於誘導抵抗SARS-CoV-2之保護性免疫反應中之用途。腺病毒系為一種天然存在之呼吸道病毒，其常被做為將遺傳物質引入細胞之載體，其中該腺病毒載體可將SARS-CoV-2抗原基因轉導至鼻黏膜細胞中（通過鼻內給藥），進而導致經編碼之SARS-CoV-2抗原蛋白或其胜肽在此類細胞中之短暫表現。後續於正常人類上皮細胞中產生SARS-CoV-2抗原，可實現抵抗SARS-CoV-2抗原之免疫反應，因其係存在於自然循環之冠狀病毒（例如SARS-CoV-2）中。SARS-CoV-2，起初經報導為2019-nCoV，係為一種新型高致病性病毒，甫於2019年12月出現。經世界衛生組織（WHO）所正式定義，在人類中，SARS-CoV-2係為導致一種稱為2019冠狀病毒疾病（COVID-19）之根源。本發明揭露之組合物係為最早針對SARS-CoV-2且提供針對COVID-19及相關疾病保護之組合物其中之一。因此，本發明揭露之免疫原性組合物提供針對此種新型及致病性SARS-CoV-2病毒之預防與治療，因為先前並無針對其所提供之療法存在，且仍然存在大流行之可能。於些許實施例中，該免疫原性組合物可預防及/或降低COVID-19於2020年6月經FDA工業指南「預防COVID-19之疫苗開發及許可」以及於2020年10月及FDA工業指南「為預防COVID-19之緊急使用疫苗授權」所定義之COVID-19的嚴重性，該文獻內容均透過引用併入本發明。於些許較佳實施例中，所述免疫原性組合物可降低感染發生率或經病毒學證實為無症狀或有症狀案例之COVID-19的發生率。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物可降低嚴重及/或非嚴重（輕度或中度）COVID-19發生率或與COVID-19相關之醫院入院發生率。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物可降低輕度或中度COVID-19之發生率。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物可降低嚴重COVID-19之發生率。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物可降低與COVID-19相關之急診就診、COVID-19住院及/或COVID-19致死之發生率。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物可降低與COVID-19相關疾病之嚴重性。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物可減少SARS-CoV-2之傳播。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物可減少SARS-CoV-2之傳播。
於實施例中，本發明揭露內容提供複製缺陷型腺病毒載體，其係編碼至少一種SARS-CoV-2抗原（例如，E1A/E3缺失5型人類腺病毒（hAd5）（hAd5-SARS-CoV-2））以及/或另一種或多種不同類型之傳染因子（例如，不同類型之病毒，例如流感病毒（例如，Ad-HA）），或係缺乏轉基因（「hAdE」；例如，未編碼至少一種外源性傳染源「空」之抗原或免疫原），以及基因表現匣（expression cassette），例如用於包含或插入編碼序列至載體中，其中包含一種SARS-CoV-2抗原編碼序列，其編碼至少一種SARS-CoV-2抗原（以及/或另一種或一種或多種不同類型傳染源之外源性抗原）。此等載體於本發明中統稱為「SARS-CoV-2免疫載體」。如本發明所述，此等SARS-CoV-2免疫載體（以及/或包含相同物之免疫原性組合物）較佳者係用於誘導抵抗SARS-CoV-2之黏膜、細胞介導及/或體液免疫反應（例如針對保護性SARS-CoV-2抗原決定位，例如棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD））。於些許實施例中，此類SARS-CoV-2免疫載體（以及/或包含相同物之免疫原性組合物）可刺激先天免疫反應，若於預防性使用時，可支持該載體的適應性免疫，若於暴露前期（感染前幾天）或暴露後期間使用時，則可直接干擾SARS-CoV-2之感染。於些許實施例中，本發明揭露內容描述對動物及/或人類施用此類載體（例如，hAd5-SARS-CoV-2及/或hAd5）以誘導和/或增強免疫反應（例如，抗體與/或CD8+ T細胞（以及/或其他T細胞）之產生）對於SARS-CoV-2 T細胞抗原決定位（例如優勢抗原決定位）具有特異性。於些許實施例中，此種免疫反應對SARS-CoV-2具有保護作用且/或於減輕SARS-CoV-2之症狀及/或感染與/或減少SARS-CoV-2之傳播方面係有其效益，並且於些許實施例中係可防範SARS-CoV-2之攻擊。因此，於些許實施例中，本發明揭露內容描述一種包含hAd5-SARS-CoV-2之免疫原性組合物於針對本領域所認知關於SARS-CoV-2之傳播及感染問題提供解決方案之用途。
於實施例中，SARS-CoV-2抗原係可為如本發明揭露之棘狀（S）抗原或其他SARS-CoV-2抗原，或者係可為以其他方式對所屬技術領域中具有通常知識者可使用者。於些許實施例中，該SARS-CoV-2抗原係可為全長棘狀（S）蛋白、其表現片段或衍生自來自多個SARS-CoV-菌株之棘狀抗原序列的共有棘狀（S）抗原，該等菌株係於2019/2020爆發期間受到判別及初步定序，並經提供於GenBank MN908497；NCBI參考序列：NC_045512.2「武漢海鮮市場肺炎病毒分離株Wuhan-Hu-1」（以引用方式併入本發明）；另參見Tegally et al.所著，「Sixteen novel lineages of SARS-CoV-2 in South Africa」，Nat Med（2021），可透過網際網路取得於doi.org/10.1038/s41591-021-01255-3（以引用方式併入本發明，連同Tegally中引用之所有數據及編碼（包括延伸數據），以及Tegally et al.中引用之所有參考文獻，亦透過引用併入本發明）；Conti et al.，「The British variant of the new coronavirus-19 (Sars-Cov-2) should not create a vaccine problem」，J Biol Regul Homeost Agents，Dec 30；35(1) (2020)，可透過網際網路取得於doi：10.23812 / 21-3-E（以引用方式併入本發明）； Fiorentini et al.，「First detection of SARS-Cov-2 spike protien N501 mutation in Italy in August，2020」，Lancet Infect Dis (2021)，可於線上取得於doi.org/10.1016/ S1473-3099（21）00007- 4（透過引用併入本發明，連同Fiorentini引用之參考文獻亦透過引用併入本發明）。於些許實施例中，包含編碼至少一種冠狀病毒抗原之編碼序列的基因表現匣係包含棘狀蛋白之至少S1及/或S2結構域，或其表現片段（例如，棘狀蛋白S1結構域之RBD序列）。如圖13、14及15所示。於些許實施例中，可使用融合前穩定之棘狀蛋白（例如，透過引入脯胺酸（proline）殘基於S2（HR1結構域）中，如圖所示於MERS及SARS中之表現改善（參見美國專利公開號No. 2020/0061185 A1（Graham et al.；參見如圖4），於在S1/S2切割位點處將野生型胺基酸序列NSPRRARSVAS（SEQ ID NO：450）取代為NSPQQAQSVAS（SEQ ID NO：451）（QQAQ突變）；於S2'切割位點（融合胜肽截斷，819-828缺失）將KRSFIEDLLFNKVTLADA（SEQ ID NO：452）取代為KRSFIADA（SEQ ID NO：453），以及/或將SRLDKVEAEV（SEQ ID NO：454）取代為SRLDPPEAEV（SEQ ID NO：455）（2P突變，K986P / V987P））。所屬技術領域中具有通常知識者係可理解，本發明中亦將使用其他類型之S蛋白/抗原納入考慮。參照下方「穩定棘狀蛋白抗原設計」段落。
於些許實施例中，包含編碼至少一種冠狀病毒抗原之編碼序列的基因表現匣係包含S1之受體結合域（RBD）及/或N端結構域（NTD）。參見例如圖13、16至21所示。於些許實施例中，該基因表現匣包含一編碼序列，其編碼SEQ ID NO：3（圖3A）或SEQ ID NO：3至少一結構域序列（例如，B細胞抗原決定位或T細胞抗原決定位）或至少編碼SEQ ID NO：446（圖3B）之該RBD結構域編碼序列。於實施例中，編碼一SARS-CoV-2抗原之腺病毒載體係可為單價或多價（即一個或多個抗原抗原決定位）。於實施例中，該基因表現匣包含用於更佳表現與分泌編碼序列之一前導序列（例如tPA），其中該編碼序列細選擇性地針對哺乳動物受試者（例如人）進行密碼子優化。於實施例中，該基因表現匣包含之RBD序列（例如SEQ ID NO：446）選擇性地進一步包含SARS-CoV-2病毒所天然存在之長或短側翼序列（例如SEQ ID NO：14及15），其係可增強RBD以其天然球狀構象排列之表現。於實施例中，該基因表現匣包含一種或多種重組腺病毒，其分別編碼一種或多種SARS-CoV-2抗原。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供用於在包括人類之哺乳動物受試者體內誘導抵抗冠狀病毒之免疫反應的組合物及方法。在些許實施例中，本發明提供了一種免疫原性組合物，包含一複製缺陷型腺病毒載體，其包含一基因表現匣，該基因表現匣包含編碼至少一種冠狀病毒抗原或其至少一表現片段之編碼序列。本發明使用之免疫原性組合物係指可引發、促使、激發、誘出、刺激、加強、增強、放大或加強一適應性（特異性）免疫反應之任一種或多種Ad-載體化合物或藥劑或經表達之免疫原及/或抗原，該免疫反應係可為細胞性（T細胞）、體液性（B細胞）與/或黏膜性或其等之一組合。該細胞性反應係可為鼻黏膜或呼吸道中之外周T細胞反應或駐留T細胞反應。且，細胞性反應較佳者係可由具有抗病毒表型（例如產生干擾素-γ）之CD8+ T細胞及/或CD4+ T細胞所驅動。較佳地，該適應性免疫反應係為保護性，其係可包括病毒之中和（降低或消除病毒感染性）以及/或症狀或病毒脫落（即傳播）之緩和。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供免疫學組合物，其包含空（即，於Ad5基因組中編碼不具外源性非Ad病原體抗原）腺病毒載體（AdE）做為透過激發包括黏膜先天免疫反應在內之先天免疫反應的冠狀病毒治療劑。參見範例2。於些許實施例中，當暴露於SARS-Cov-2前約2天至約20天施用AdE時，鼻內單次施用即可提供保護。於些許實施例中，免疫原性組合物之施用係可於疫苗接種後與受攻擊後誘導MCP-1及IFN-γ之水平升高，致使單核球、嗜中性球與/或淋巴細胞之募集，此進而刺激IFN-γ之產生。於些許實施例中，施用此類免疫原性組合物可誘導IL-1α、IL-6及/或IL-12p70之細胞激素顯著降低（例如，與安慰劑控制組相比），該等細胞激素可介導COVID-19中的肺部間質性發炎。參見範例7。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供用於在無外源非Ad病原體情況下於鼻內（i.n.）施用於Ad5基因組中編碼不具外源性非Ad病原體抗原之AdE載體（即，複製缺陷型ΔE1E3腺病毒5型（Ad5））病毒顆粒以賦予哺乳動物（較佳者為人類）抵抗SARS-CoV-2之預防性治療的藥劑（例如，免疫原性組合物）及方法。於較佳實施例中，此種AdE免疫原性組合物可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其係為一免疫原性組合物）並表現出可接受之安全性。於較佳實施例中，所獲得之免疫反應於統計上係顯著甚至更理想地具有保護性（即，其係為SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，此種AdE免疫原性組合物可用於治療感染SARS-CoV-2之人（例如住院患者）。參見範例3。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供一種E1/E3剔除之複製缺陷型hAd5，包含一基因表現匣，其包含一前導序列（例如，組織血纖維蛋白溶酶原活化因子（tPA））以及編碼至少一個SARS- CoV-2蛋白（例如，SEQ ID NO：2至11中任一個或多個以及/或其一個或多個片段及/或其衍生物）之經密碼子優化的核苷酸序列，其可操作地連接至一啟動子（例如，巨細胞病毒（CMV）），亦提供免疫原性組合物及使用相同物誘導抵抗SARS-CoV-2之免疫反應的方法。參見範例4。於些許實施例中，將SARS-CoV-2編碼序列插入至hAd5之E1區域（「hAd5-SARS-CoV-2」）中。於些許實施例中，該hAd5-SARS-CoV-2係可基於複製缺陷、E1-及E3-缺失之腺病毒5型載體平台（Tang et al 2009），以針對SARS-CoV-2棘狀蛋白（登錄號為QHD43416.1（SEQ ID NO：3））之S1結構域（殘基16至685（參見例如範例14、16））或RBD結構域（S1結構域（參見例如範例15、17）之殘基331至527表現人類密碼子優化基因。於較佳實施例中，此種以Ad5-為載體之S1及RBD轉基因包括人類組織血纖維蛋白溶酶原活化因子前導序列，並可於巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子之控制下表現（參見，例如SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：15）。於些許實施例中，可利用數量足夠之hAd5-SARS-CoV-2病毒顆粒（vp）或感染單元（ifu）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 或至少1×1011 個vp或ifu）使一人類產生鼻內（i.n.）免疫作用，進而誘發中和抗體。於些許實施例中，hAd5-SARS-CoV-2疫苗係可誘導保護性反應，進而降低疾病嚴重程度。於些許實施例中，hAdv5-SARS-CoV-2組合物可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（即，其係為一免疫原性組合物），並表現出可接受之安全性。較佳者，免疫反應於統計學上係顯著甚至更理想地為一保護性免疫反應（即，其係為SARS-CoV-2疫苗）。於些許實施例中，此種免疫原性組合物可改善感染SARS-CoV-2患者（例如住院患者）之臨床進展與/或恢復時間。參見範例5。於些許實施例中，鼻內單次（或作為初打-加強方案之一部分，相同或不同的免疫原性組合物）施用表現棘狀蛋白（參見例如較佳實施例SEQ ID NO：15）RBD結構域之複製缺陷型Ad5載體可刺激血清中IgG抗體之產生，此係代表於哺乳動物（較佳為人類）體內誘導全身性反應以及IgG及IgA抗體之產生。於較佳實施例中，接受單次施用高劑量疫苗之動物，如透過灶點減少中和試驗（FRNT）所測量，表現出針對SARS-CoV-2之中和抗體（較佳者係對SARS-CoV-2具有持久性（參見例如範例18））的存在，或誘導不同免疫區室中先天及適應性免疫細胞之募集與/或增殖（參見範例13B）。於較佳實施例中，施用此種免疫原性組合物可於哺乳動物（較佳者為人類）體內誘導全身性及黏膜性T細胞免疫力（例如，於較佳實施中為一Th-1-偏倚(Th-1 biased)），其係可利用流式細胞儀測定（參見例如範例17）。於較佳實施例中，包含hAd5-SARS-CoV-2之免疫原性組合物，當以單次鼻內劑量施用於哺乳動物時，可誘導抵抗棘狀蛋白之抗體反應，該反應可持續至少4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月或至少約12個月（一年）。參見範例18。於些許實施例中，施用該免疫原性組合物（例如，hAd5-SARS-CoV-2如該RBD載體）可誘導哺乳動物（較佳者為人類）體內之骨髓及肺臟駐留記憶抗體分泌細胞（例如，於較佳實施例中為可分泌抗棘狀IgG及IgA之骨髓及肺臟駐留記憶抗體分泌細胞）。參見範例19。於較佳實施例中，鼻內給藥表現SARS-CoV-2棘狀RBD序列之複製缺陷型Ad5載體（參見例如較佳實施例SEQ ID NO：15）可於全身及黏膜部位產生體液及細胞免疫反應，特別係於肺臟內部，其係代表感染及臨床疾病之主要部位（參見例如範例20）。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供於鼻內（i.n.）施用rdAd抗SARS-CoV-2載體組合物（例如，「經結合SARS-CoV-2組合物」）以提供針對SARS-CoV-2之預防性治療的方法。參見範例10。經組合SARS-CoV-2組合物之成分（例如AdE、AdD及/或hAd5-SARS-CoV-2；指代用於治療及/或預防冠狀病毒感染之複製缺陷型腺病毒載體的「AdD」係可為一種未表現一種或多種冠狀病毒抗原，但表達一種或多種不同類型傳染源（例如流感病毒）之抗原者；指代用於預防及/或治療冠狀病毒感染之rdAd載體的「AdE」係可為未表現外源性抗原（對於衍生出腺病毒載體之腺病毒係為外源）者；且指代複製缺陷型腺病毒之「rdAD」或「rdAd」係可經包含於單一組合物中或可經包含於可同時或於不同時間（例如，作為初打-加強方案（prime-boost protocol）之一部分）並於受試者（例如，哺乳動物（較佳者為人類））相同或不同部位所施用之不同組合物中。較佳之初打-加強方案包括將第一組合物施用於哺乳動物，較佳者為人類，並於適當時間後（於些許較佳實施例中為7至21天後，較佳者為7天後）施用第二種組合物（即，分別施用第一及第二組合物），其中第一及第二組合物包含相同或不同之rdAd抗SARS-CoV-2載體。於較佳實施例中，經組合之SARS-CoV-2組合物係經配置以於施用所述免疫原性組合物之哺乳動物受試者（較佳者為人類）中誘導抵抗SARS-CoV-2之中和抗體、IgA及/或細胞免疫反應，以及/或本發明揭露之其他反應（例如，避免Covid-19患者住院或縮短住院時間）。於較佳實施例中，經組合之SARS-CoV-2組合物可用於在人類體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其為一免疫原性組合物），且具有可接受之安全性。較佳者，該免疫反應在統計學上係顯著甚至更理想地為一保護性免疫反應（即，其為SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，資料顯示經組合之SARS-CoV-2組合物可用於治療受SARS-CoV-2感染之受試者（例如住院患者）。
於些許實施例中，經組合之SARS-CoV-2組合物可包含：a）缺乏編碼一外源性、非腺病毒、抗原之編碼序列的rdAd載體； b）包含一基因表現匣之rdAd載體，該基因表現匣包含編碼至少一種SARS-CoV-2抗原（即，hAd5-SARS-CoV-2）之SARS-CoV-2抗原編碼序列，其中該抗原選擇性包含一包括SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）；c）一種包含一基因表現匣之rdAd載體，該基因表現匣包含編碼除SARS-CoV-2外至少一種感染原之外源性抗原的至少一種的編碼序列；d）一種a）與b）組合之載體；e）一種b）與c）組合之載體； f）一種a）、b）或c）任一者組合之任意rdAd載體；以及/或g）一種b）（即hAd5-SARS-CoV-2）之rdAd載體中的兩種不同類型之組合，其中，各類型包含一種基因表現匣，其係編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，其係不同於該組合（多價COVID-19疫苗）中由至少一種其他類型hAd5-SARS-CoV-2載體所編碼者。於些許實施例中，經組合之SARS-CoV-2組合物的成分可包含AdE及/或AdD中之一者或兩者以及/或一種或多種hAd5-SARS-CoV。於些許實施例中，經組合之SARS-CoV-2組合物可包含一第一組合物，其包含經施用於一人類之AdE及/或AdD，隨後並施用一第二組合物，其包含至少一種hAd5-SARS-CoV-2。於些許實施例中，經組合之SARS-CoV-2組合物可包含至少兩種類型之hAd5-SARS-CoV-2，其中各類型之hAd5-SARS-CoV-2包含一種基因表現匣，該基因表現匣係編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，其係不同於由該組合物中其他類型之hAd5-SARS-CoV-2載體所編碼者。因此，於些許實施例中，經組合之SARS-CoV-2組合物可包含表現一第一SARS-CoV-2抗原之第一類型hAd5-SARS-CoV-2與編碼一第二SARS-CoV-2抗原之一第二類型hAd5-SARS-CoV-2，該第二SARS-CoV-2抗原不同於該第一SARS-CoV-2抗原。於些許實施例中，經組合之SARS-CoV-2組合物可包含一第一組合物，其包括經施用於一人類之AdE、AdD以及/或一第一類型hAd5-SARS-CoV-2，隨後並施用一第二組合物，其包括至少一種第二類型hAd5-SARS-CoV-2，與該第一類型hAd5-SARS-CoV-2（或其中該第一組合物為AdE或AdD之第一者）不同，施用需間隔一段適當時間（於些許較佳實施例中為7至21天後，較佳者為7天後）（即，分別施用第一及第二組合物）。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供免疫原性組合物，包括鼻內（i.n.）施用AdD載體（即複製缺陷型ΔE1E3腺病毒5型（Ad5）病毒顆粒，其編碼一種衍生自非SARS-CoV-2之傳染源的病原體抗原，例如流感病毒，如NasoVAX，係為表現流感血凝素（HA）抗原之AdVector（Ad5），其係如2020年4月6日遞交之美國專利申請號16/840,723中所述，該案主張2019年4月6日遞交申請號為62/830,444且公開號為2020/0316188之美國專利申請案優先權，其等伴隨該等申請案及公開案中所引用之所有文獻，皆透過引用併入本發明，並揭露NasoVAX之製備方式；亦參見美國專利號6,706,693、6,716,823、6,348,450；以及美國專利公開號2003/0045492、2004/0009936、2005/0271689、2007/0178115以及2012/0276138，其等可能涉及經製備以施用於一包含並表現一流感抗原之哺乳動物的腺病毒載體，其中各者伴隨其等之引用文獻係透過引用方式併入本發明中），以給予針對SARS-CoV-2之預防性治療（其中提及NasoVAX係為一種於本發明揭露內容中使用用語「NasoVAX」時所指代之特定產品，所屬技術領域中具有通常知識者可理解該特定產品，亦可廣泛理解表現一種流感血凝素（HA）之抗原AdVector（Ad5），其有利者係為E1及/或E3 Ad5載體）之方法。於此種實施例中，該AdD載體可誘導同時抵抗SARS-CoV-2以及與該AdD載體表達之外源抗原相關病原體的先天免疫反應，較佳者係為一保護性免疫反應。例如，NasoVAX（或更廣泛地係為包含表現流感抗原之AdD載體的免疫原性組合物）可用於誘導同時抵抗流感及包括SARS-CoV-2之冠狀病毒的免疫反應。以此方式，AdD係為一種雙效疫苗，可誘導抵抗兩種呼吸道感染原先天免疫反應，以及針對表現抗原之保護性適應性免疫反應。於些許實施例中，可將此種免疫原性組合物施用於已感染SARS-CoV-2之患者，並可改善臨床改善與/或恢復時間。此外，於些許實施例中，該AdD組合物係可在可接受之安全性下於人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其係為一免疫原性組合物）。較佳者，該免疫反應於統計學上係顯著或更理想地為一保護性免疫反應（即，其係為一SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，資料顯示AdD組合物可用於治療感染SARS-CoV-2之受試者（例如住院患者）。於些許實施例中，NasoVAX可做為COVID-19感染早期階段之療法或做為合併療法，於些許實施例中與直接抗病毒劑（例如氯奎寧(chloroquine)、亞茲索黴素(azithromycin））結合。參見範例7。於些許情況下，該藥物物質可轉變成一種產品，其中係單獨施用該載體（例如，非如於AdE中具有轉基因）。於些許實施例中，NasoVAX可有效降低患有早發型COVID-19患者之ICU入院率及機械換氣需求率，以及/或降低需住院治療之早發型COVID-19患者的COVID-19嚴重性。於些許實施例中，於施用NasoVAX予受試者後，可能產生炎性細胞激素如IL-1α、IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）以及/或RANTES（CCL5）之表現降低（參見例如範例2），並可能於些許實施例中用於診斷COVID-19與/或預測該疾病之康復，以及用於相應地調整治療方案（例如，非NasoVAX治療）。於些許實施例中，於施用NasoVAX不久後，MCP1與/或RANTES之增加係可用於預測（例如，做為標記物）COVID-19之康復與症狀之改善。較佳者，該免疫反應於統計學上係顯著甚至更理想地為一保護性免疫反應（即，其係為一SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，數據顯示NasoVAX可用於治療感染SARS-CoV-2之受試者（例如住院患者）。於較佳實施例中，此種免疫原性組合物係可重複施用（例如，做為約每11至14個月施用一次之季節性疫苗），且不會引起針對腺病毒載體本身之明顯免疫反應。參見範例9。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供於環境溫度如室溫（例如15至30 °C，較佳為20至25 °C）下穩定約3個月的腺病毒載體疫苗組合物（例如，AdD、NasoVAX）。於些許實施例中，此類腺病毒載體疫苗組合物係可儲存或運輸，且不需要冷藏或特定儲存條件。於些許實施例中，此類腺病毒載體疫苗組合物係可經配置以誘導抵抗SARS-CoV-2病毒（大流行性冠狀病毒株）感染之免疫反應，以及/或減輕COVID-19疾病症狀，並可以直接運送予用戶以對患者施用（較佳為鼻內給藥）。參見範例8。
於些許實施例中，如本發明範例2中所示，對小鼠施用AdE可降低些許細胞激素之表現，其等係已知與例如如流感等病毒引起之傳染病進程與症狀有關。例如，未受（流感）感染之小鼠於施用AdE 25天後，單核球趨化蛋白（MCP-1（CCL2））、γ干擾素（IFN-γ）及RANTES（CCL5）表現增加。施用AdE之28天後，該未受感染之小鼠出現MCP-1及IFN-γ之表現增加，但IL-12之表現亦有所下降。受流感感染之小鼠於施用AdE之3天後，發現小鼠出現IL-1α、IL-6、IL-12、MCP-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）及RANTES之表現下降。施用AdE之六（6）天後，受感染小鼠出現IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1及GM-CSF之表現下降，而巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1αCCL3α）及RANTES（CCL5）之表現增加。此等結果與SARS-CoV-2感染期間「細胞激素風暴」之發展相吻合。此後，於些許實施例中，為透過例如抑制細胞激素風暴之發展或抑制細胞激素風暴預防及/或治療SARS-CoV-2感染，將一種SARS-CoV-2免疫原性組合物伴隨一種或多種抗細胞激素試劑（例如，一種或多種抗IL-1α試劑、一種或多種抗IL5試劑、一種或多種抗IL-6試劑、一種或多種抗IL-12試劑、一種或多種抗IL-17試劑、一種或多種抗MCP-1試劑、一種或多種抗TNF-α試劑、一種或多種抗GM-CSF試劑以及/或一種或多種抗RANTES試劑）共同施用於一人類。參見範例11。於些許實施例中，該一種或多種抗細胞激素試劑不包括一種或多種抗MIPα試劑以及/或一種或多種抗RANTES試劑。如本發明所述可使用之範例抗細胞激素試劑可包括，例如，本發明表10中所示者。於些許實施例中，此類抗細胞激素試劑可SARS-CoV-2免疫原性組合物共同施用（例如同時）或透過各藥劑之適當途徑（例如鼻內給藥SARS-CoV-2免疫原性組合物並皮下注射有效量之抗細胞激素試劑（s））以其有效量實質上同時施用。於些許實施例中，可將該一種或多種抗細胞激素試劑與SARS-CoV-2免疫原性組合物共同施用，且於些許實施例中，該一種或多種抗細胞激素試劑係於後續做為一活性劑施用。於較佳實施例中，SARS-CoV-2組合物與一種或多種抗細胞激素試劑之結合可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其係為一免疫原性組合物），其具有可接受之安全性，並減輕與些許患者所經歷細胞激素之有害作用相關的症狀（例如，前述之細胞激素風暴）。於較佳實施例中，該免疫反應於統計上係顯著甚至更理想地為一保護性和/或治療性免疫反應（即，其係為一SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，SARS-CoV-2組合物與一種或多種抗細胞激素試劑之組合可用於治療受SARS-CoV-2感染之受試者（例如住院患者）。
如本發明所述，本發明所述的S蛋白（棘狀蛋白）免疫原、片段及其變異體包含一種或多種可引發或誘導免疫反應之抗原決定位，該免疫反應較佳者係為保護性免疫反應，其係可為體液反應、黏膜IgA反應與/或細胞介導免疫反應。保護性免疫反應可透過以下至少一種表現：預防冠狀病毒感染一宿主；改變或限制感染；幫助、改善、增強或刺激宿主自感染中恢復；以及產生可預防或限制冠狀病毒後續感染之免疫性記憶。體液反應可包括產生抗體，該等抗體可中和感染性、溶解病毒及/或受感染細胞、促進宿主細胞去除病毒（例如，促進吞噬細胞作用）以及/或結合以促進病毒抗原物質之去除。抗體反應亦可包括黏膜反應，其包含引發或誘導特異性黏膜IgA反應。於些許實施例中係提供一種在人類受試者體內誘導抵抗SARS-CoV-2感染的黏膜、體液及/或細胞介導之聯合保護性免疫反應。
本發明提供藥學上可接受之組合物（亦可稱為製劑），其係適合與/或經配置為鼻內給藥予哺乳動物受試者，並經配置以誘導抵抗一抗原（例如，免疫原）之免疫反應，並可選擇性誘導保護性免疫反應（即，做為疫苗）。於些許實施例中，該藥用製劑為一免疫原性組合物，其於施用後誘導哺乳動物受試者體內針對一抗原之免疫反應。於些許實施例中，該藥用製劑係為疫苗或治療性組合物，其經配置為於哺乳動物受試者體內誘導保護性免疫反應，其對外來感染原具有保護作用，並且於較佳實施例中可誘導或刺激針對SARS-CoV-2感染之保護性反應。
定義
如本發明中所用，用語「一個」或「一種」，係如於專利文件中常見者，包括一個或超過一個，不同於「至少一個」或「一個或多個」之任何其他情況或用法。
如本發明中所用，用語「或」係用以表示非排他性或可使「A或B」包括「 A但非B」、「B但非A」以及「A及B」，另有說明者除外。
如本發明中所用，用語「約」係用以表示一數量係幾乎、近似或介於或相同於或等於一所述量，例如，所述量加/減約5%、約4%、約3%、約2%或約1%。
本發明之組合物、製劑及方法可包含本發明之成分及素材以及本發明所述其他成分，或是本質上由其等所組成或構成。如本發明中所用，「本質上由...組成」及「本質上由...構成」係指該等組合物、製劑及方法可包括額外步驟、成分或素材，但前提為該等額外步驟、成分或素材不會實質性地改變經主張組合物、製劑及方法之基本與新穎特徵。例如「包含」、「被包含」、「經包含」等用語係為同意詞，諸如「包括」、「包含」或「其特徵在於」等用語，且係包含性或開放性用語，不排除其他、未提及之元素，成分或材料或步驟。於此方面，本發明之目的非為將任何先前已知之產品、該產品之製造方法或產品之使用方法包括於本發明內，使申請人保留權利並於此揭露針對先前已知產品、過程或方法之一免責聲明。亦應注意，本發明無意將任何產品、過程及產品製造過程或使用方法皆包含於本發明範圍內，此係非符合美國法律/USPTO對於書面描述、可據以實現性以及/或明確性要求（例如35 USC§112(a)、(b)）或EPC/EPO之充分性要求（例如EPC第83條），以利申請人保留權利並據此揭露對任何不滿足書面描述、據以實現性以及/或明確性與/或確定性與/或充分性之要求以及/或先前描述或已知產品、該產品製造過程或使用方法該等內容中任何主題之免責聲明。於實施本發明時符合EPC 53（c）和EPC法規28（b）和（c）等條文之要求係可能有利。於此明確保留否認任何實施例落入本發明之譜系或任何其他譜系中或任何第三方任何於先前提交之申請案中任何已核准專利主體之所有權利。於此明確保留否認所有申請在先但未經先前公開之專利申請或專利中之內容的權利（相對於本發明揭露內容申請日「先申請但未經公開」者）。本發明任何內容均不得解釋為承諾。本發明中對任何文件之任何引用或認定皆非承認該文件係為前案。
亦應注意，如本說明書及所附請求項中所使用，用語「配置」描述一系統、裝置或其他結構係經構造或配置為執行特定任務或採用特定配置。用語「配置」可與其他類似語詞互換，例如佈置及配置、構造及佈置、適配及配置、適配，建構、製造和佈置等。
如本發明中所用，「佐劑」係指增強身體對抗原之免疫反應的物質。於實施例中，本發明知單價流感藥用製劑係為非佐劑疫苗組合物。
「施用」係指將本發明之免疫原性或疫苗組合物引入受試者體內；其亦可指稱向受試者提供本公開之組合物的行為（例如，透過開立處方或用藥）。
如本發明中所用，用語「環境溫度」係為用於儲存本發明單價流感藥用製劑之氣溫。於實施例中，環境溫度係為室溫，例如選自約15至30 °C，較佳者約20至25 °C範圍內之任何溫度。
如本發明中所用，術語「治療有效量」係指將可誘導黏膜、體液及細胞介導免疫反應等綜合反應之化合物的施用量。該用語亦指本發明組合物之量，其將於某種程度上減輕或預防待治療病症之一種或多種症狀。關於可使用本發明揭露內容之組合物直接治療的病症/疾病，一治療有效量係指可具有以下效果之量：預防病症/疾病在可能罹患該疾病但尚未經歷或表現出疾病/疾病症狀（預防性治療）之哺乳動物體內發生、緩解疾病/病症之症狀、減輕疾病/疾病程度、穩定（例如，不惡化）疾病/病症、預防疾病/病症傳播、延遲或減慢疾病/病症進程、改善或緩解疾病/病症狀態以及其等之結合。用語「有效量」係化合物經給予之量將產生一反應（例如，保護性免疫反應以及/或由疫苗提供之反應），其係不同於該化合物不存在之環境下會發生之情況。
如本發明中所用，於兩序列（例如蛋白序列）之技術背景中，用語「同源性百分比（%）」或「同一性百分比（%）」及其語法變化係指兩個或更多個序列或子序列（ 例如，其片段）當經過比較及校準以獲得最大對應性時，如使用其中一種習知序列比較演算法或透過目測進行測量時，具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88 %、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及/或100%核苷酸或胺基酸殘基同一性（同源性）。用於比較兩序列之數學演算法的非限制性範例係為Karlin＆Altschul演算法，Proc的算法。Natl。學院科學美國1990；87：2264-2268，修改為Karlin & Altschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990；87：2264-2268，經修正為 Karlin & Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993；90：5873-5877）。用於比較序列之數學演算法的另一範例係為Myers & Miller演算法（CABIOS 1988；4：11-17）。此算法已經整合至ALIGN程式（2.0版）中，其係為GCG序列校準軟體包之一部分。當使用ALIGN程式比較胺基酸序列時，係可使用PAM120權重殘基表，間隙長度懲罰值12，以及間隙長度懲罰值4。另一種可用於識別局部序列相似性及校準之眼算法係如Pearson＆Lipman（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988；85：2444-2448）中所述之FASTA演算法。使用WU-BLAST（華盛頓大學BLAST）2.0版軟體係可為有利。可自ftp://blast.wustl.edu/blast/executables下載可用於多個UNIX平台之WU-BLAST 2.0版可執行程式。該程式係基於WU-BLAST 1.4版，而此版本係基於公有領域NCBI-BLAST 1.4版（Altschul & Gish，1996，Local alignment statistics，Doolittle ed.，Methods in Enzymology 266：460-480；Altschul et al.，Journal of Molecular Biology 1990；215：403-410；Gish & States，1993；Nature Genetics 3：266-272；Karlin & Altschul，1993；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5877。其等內容皆透過引用併入本發明）。此外，根據此定義，當本發明揭露內容談及同源性百分比（%）時，讀者亦可理解同一性百分比（%）。此外，應理解，本發明中之蛋白係可不同於本發明揭露內容中所描繪及描述之確切序列。因此，本發明預期所顯示序列之缺失、增添及取代，只要該序列可根據本發明之方法發揮作用即可。於此方面，由其較佳之取代通常於本質上係為保守性，即發生於胺基酸家族內之取代。例如，胺基酸通常係分為四個家族：（1）酸性－天門冬胺酸（aspartate）及麩胺酸（glutamate）；（2）鹼性－離胺酸（lysine）、精胺酸（arginine）、組胺酸（histidine）；（3）非極性－丙胺酸（alanine）、纈胺酸（valine）、白胺酸（leucine）、異白胺酸（isoleucine）、脯胺酸（proline）、苯丙胺酸（phenylalanine）、甲硫胺酸（methionine）、色胺酸（tryptophan）；（4）不帶電荷極性－甘胺酸（glycine）、天冬醯胺（asparagine）、麩醯胺（glutamine）、半胱胺酸（cysteine）、絲胺酸蘇胺酸（serine threonine）、酪胺酸（tyrosine）。苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸有時係分類為芳族胺基酸。可合理地預測，以異白胺酸或纈胺酸單獨取代白胺酸，反之亦然；以麩胺酸取代天冬胺酸，反之亦然；以絲胺酸取代蘇胺酸，反之亦然；或將一胺基酸類似取代為結構上相關之胺基酸，將不會對生物學活性產生重大影響。因此，具有與所示及所描述序列實質上相同之胺基酸序列，但具有實質上不影響蛋白免疫原性之細微胺基酸取代的蛋白，皆落於本發明範圍內。關於此類蛋白，本發明內之核酸序列將類似地自本發明明確揭露之內容變化而來。因此，本發明包括編碼本發明所揭露之抗原或蛋白之功能性與/或抗原性等效之變異體及衍生物，及其功能等效之片段的核苷酸序列。此等功能上等效之變異體、衍生物及片段顯示保留抗原活性之能力。例如，DNA序列中不改變經編碼胺基酸序列之改變，以及可導致胺基酸殘基保守性取代、一個或數個胺基酸缺失或增加，以及胺基酸殘基經胺基酸類似物取代之改變，係為不會顯著影響經編碼多胜肽之性質者。保守性胺基酸取代係為甘胺酸/丙胺酸；纈胺酸/異白胺酸/白胺酸；天冬醯胺/麩醯胺；天冬胺酸/麩胺酸；絲胺酸/蘇胺酸/甲硫胺酸；離胺酸/精胺酸；以及苯丙胺酸/酪胺酸/色胺酸。
如本發明中所用，用語「人類腺病毒」旨在涵蓋腺病毒科之所有人類腺病毒，其包括馬斯特腺病毒屬（Mastadenovirus  genera）之成員。迄今已鑑定出超過五十一種人類血清型腺病毒（參見例如 Fields et al.，Virology 2，Ch. 67（第3版，Lippincott-Raven Publishers））。腺病毒係可為A、B、C、D、E或F血清型。人類腺病毒可以是血清型1（Ad 1）、血清型2（Ad2）、血清型3（Ad3）、血清型4（Ad4）、血清型5（Ad5）、血清型6（Ad6）、血清型7（Ad7）、血清型8（Ad8）、血清型9（Ad9）、血清型10（Ad10）、血清型11（Ad11）、血清型12（Ad12）、血清型13（Ad13）、血清型14（Ad14）、血清型15（Ad15）、血清型16（Ad16）、血清型17（Ad17）、血清型18（Ad18）、血清型19（Ad19）、血清型19a（Ad19a）、血清型19p（Ad19p） ）、血清型20（Ad20）、血清型21（Ad21）、血清型22（Ad22）、血清型23（Ad23）、血清型24（Ad24）、血清型25（Ad25）、血清型26（Ad26）、血清型27（Ad27）、血清型28（Ad28）、血清型29（Ad29）、血清型30（Ad30）、血清型31（Ad31）、血清型32（Ad32）、血清型33（Ad33）、血清型34（Ad34）、血清型35（Ad35）、血清型36（Ad36）、血清型37（Ad37）、血清型38（Ad38）、血清型39（Ad39）、血清型40（Ad40）、血清型41（Ad41）、血清型42（Ad42）、血清型43（Ad43）、血清型44（Ad44） ）、血清型45（Ad45）、血清型46（Ad46）、血清型47（Ad47）、血清型48（Ad48）、血清型49（Ad49）、血清型50（Ad50）、血清型51（Ad51）或其等之組合，但不限於此這些例子。於些許實施例中，腺病毒係為血清型5（Ad5）。
如本發明中所用，「免疫原性組合物」係指一種組合物，其通常包含如本發明所揭露至少一種複製缺陷型腺病毒載體以及至少一種藥學上可接受載體，當施用於宿主時，該組合物可誘導與/或增強一免疫反應，該免疫反應係針對其所指向之抗原與/或傳染源（例如，由複製缺陷型腺病毒載體編碼之抗原以及/或可由「空」hAd5載體誘導/增強之抗原）。一「疫苗」係指此一免疫原性組合物，其於施用時可誘導抵抗一感染因子之保護性免疫反應（例如，保護宿主免受感染源之攻擊）。於些許實施例中，免疫原性組合物（例如，疫苗）係可包含一種或多種包括及/或表現一抗原之病毒載體，以及適合施用於哺乳動物宿主之免疫原性組合物（例如，疫苗）之其他成分，包括一種或多種佐劑、緩釋化合物、溶劑、緩衝劑等。於些許實施例中，免疫原性組合物及/或疫苗可包含蛋白與/或碳水化合物與/或脂質與/或其他抗原，包括但不限於一種或多種死亡抗原（例如，死亡或完全失活之病毒）或活減毒抗原（例如，減毒病毒）。於些許實施例中，該免疫原性組合物及/或疫苗可改善對任何抗原之免疫反應，無論抗原來源或其功能為何皆然。
如本發明中所用，一「藥學上可接受載體」係指不會對人類受試者造成明顯刺激且不會消除經施用之免疫原性或疫苗組合物之生物活性與特性之載體或稀釋劑。
如本發明中所用，用語「血清轉化」係經定義為疫苗接種（例如施用本發明之免疫原性或疫苗組合物）後，血清中和抗體效價（例如抗S1/S2抗體或S1抗體之抗RBD）增加4倍以上。
如本發明中所用，用語「血清陽性」係指於疫苗接種（例如，施用本發明之免疫原性組合物）後，於血清中和抗體中係為可測得（例如於體外測定中可測得）。
如本發明中所用，用語「保護」表示已引起保護性免疫反應，且保護性免疫反應可透過以下至少一種方式表現：防止宿主受冠狀病毒感染；改變或限制感染；幫助、改善、增強或刺激宿主自感染中恢復；並產生免疫記憶，以預防或限制受冠狀病毒後續感染。體液反應可包括產生可中和感染性、溶解病毒與/或受感染細胞、促進宿主細胞去除病毒（例如，促進吞噬作用）以及/或結合以促進去除病毒抗原物質之抗體。抗體反應亦可包括黏膜反應，其包含引起或誘導特異性黏膜IgA反應。如本發明中所用，用語「具血清保護」係指接種後之受試者透過產生血清中和抗體而免於感染。於人群中，此係指血清保護個體之百分比（%）（例如50%）。於實施例中，本發明之免疫原性組合物及使用方法可對哺乳動物受試者（如人類受試者）提供針對SARS-CoV-2感染之血清保護。保護之持續時間係可為至少約一個月至至少約14個月。血清保護可持續至少約1個月、2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、12個月或至少約13個月。
用語「治療」、「醫治」與「療法」係為用於獲得有益或期望臨床結果之方法。具體而言，有益或期望之臨床結果包括但不限於症狀之減輕、疾病程度之降低、疾病之穩定（例如不惡化）、疾病進展之延遲或減緩、實質上防止疾病之傳播、疾病狀態之改善或緩和，以及緩解（部分或全部），無論是否可檢測皆然。此外，「治療」、「醫治」與「療法」亦可表示與不接受治療之預期生存率相比，可使存活率有所延長，以及/或可部分或完全對於疾病與/或可歸咎於該疾病之不良反應具有療效。如本發明中所用，用語「預防性治療」或「預防性療法」係指可完全、實質上或部分預防宿主體內之疾病/病症或其一種或多種症狀。相似地，「延緩疾病發作」亦可包括於「預防性療法」內，且係指增加易罹患該疾病之患者體內疾病實際發作前之時間。
於本發明揭露內容中，「疫苗」係有利地指包含複製缺陷型腺病毒載體之組合物，其包含並表現冠狀病毒抗原或其他感染原，以及/或缺乏外源抗原之編碼序列（例如，空腺病毒載體(Empty Advector)），並伴隨疫苗製劑之其他成分，包括佐劑、緩釋化合物或溶劑等，用於誘導一保護性免疫反應。本發明揭露內容中包含具有並表現冠狀病毒抗原或其他感染原之組合物，以及/或缺乏用於外源抗原（例如空腺病毒載體）之編碼序列，以及疫苗製劑之其他成分，包括例如佐劑、緩釋化合物、溶劑等，亦可用於誘導免疫反應，且係囊括於本發明所討論「免疫原性組合物」之內。於本發明實施例中，疫苗或免疫原性組合物可改善對任何抗原之免疫反應，無關抗原來源或其功能為何皆然。
如本發明中所指，「載體」載有一抗原之遺傳密碼或其一部分，然而其係非為抗原本身。於一範例態樣，載體可包括一病毒載體，例如一腺病毒載體。如本發明中所用，一「抗原」係指一種物質，可對包括人與/或動物受試者體內誘導和/或增強針對該抗原與/或表現此一抗原之傳染源的特異性免疫反應。該抗原可包括死亡、減毒或存活之完整有機體；一有機體之次單元或部分；一重組載體，其包含具有免疫原性特質之插入物；呈現予宿主動物時可誘導免疫反應之DNA部件或片段；一多胜肽、抗原決定位、半抗原或其等之任何組合。於不同態樣中，該抗原係為一病毒、細菌、有機體之次單元、自體抗原或癌症抗原。
範圍係可於本發明中表示為自大約一特定值以及/或至大約另一特定值間。當表現此等範圍時，另一態樣包括自一特定值與/或至另一特定值之間。相似地，當透過使用大約或近似先行詞將數值表現為近似值時，將可理解該特定值可形成另一態樣。亦將理解，各範圍之端點係為顯著，此無論係相對於另一端點或獨立於另一端點而言皆然。範圍（例如90至100%）旨在包括範圍本身以及該範圍內之各獨立值，即如各值皆經單獨列舉一般。
免疫原性組合物與疫苗
本發明提供複製缺陷型腺病毒（「rdAd」）載體以及包含相同物之免疫原性組合物（於些許實施例中為疫苗製劑），其適合並/或經配置以用於向哺乳動物受試者施用以預防與/或治療冠狀病毒感染（「冠狀病毒藥用製劑」），較佳者，其中冠狀病毒係為SARS-CoV-2。於些許實施例中，本發明所屬技術領域中具有通常知識者習知並準備向哺乳動物施用之任何腺病毒載體（Ad載體）係可包含並表現一冠狀病毒抗原，其較佳者係為SARS-CoV-2抗原，但亦可不表達一外源性（即非Ad）抗原，或亦可為空腺病毒載體（例如無外源性抗原轉基因），其係可用於組合物與本發明案之方法中。此種Ad載體包括本發明所屬技術領域中具有通常知識者習知之任何載體，包括但不限於美國專利號6,706,693、6,716,823、6,348,450以及/或美國專利公開號2003/0045492、2004/0009936、2005/0271689、2007/0178115以及/或2012/0276138所述者，其等皆透過引用整體併入本發明。於些許實施例中，非複製型腺病毒病毒載體（rdAd）係為人腺病毒。於替代實施例中，腺病毒係為牛腺病毒、犬腺病毒、非人類靈長類腺病毒（例如黑猩猩）、雞腺病毒或豬類或豬腺病毒。於示例性實施例中，非複製型病毒載體係為人類腺病毒。於些許實施例中，非複製型腺病毒載體對於將基因轉移至真核細胞及免疫原性組合物（例如疫苗）中之發展以及於動物模型中特別有用。
於些許實施例中，重組腺病毒載體係可為非複製型或複製缺陷型（RD），其需要補充之E1活性以進行複製。於實施例中，重組腺病毒載體可包括其中缺失病毒基因之E1缺陷型、E3缺陷型與/或E4缺陷型腺病毒載體，或「無腸」（gutless）腺病毒載體。E1突變提高了載體之安全性邊際，因為E1缺陷型腺病毒突變異體於非容許細胞中無法複製。E3突變透過破壞腺病毒用於降低MHC1類分子之機制增強抗原之免疫原性。E4突變透過抑制晚期基因表現降低腺病毒載體之免疫原性，因此可允許利用相同載體反覆進行重複接種。於示例性實施例中，重組腺病毒載體係為E1及E3缺陷型載體。「無腸」腺病毒載體之複製需要一輔助病毒與同時表現E1a及Cre之特殊人類293細胞系，此一條件並不存在於自然環境中；該載體經剝奪病毒基因，因此做為一免疫原性組合物（例如疫苗）之該載體係為非免疫原性，且係可經多次注射以重複接種。「無腸」腺病毒載體亦包含36 kb之空間用於容納轉基因，因此允許將大量抗原基因共同傳遞至細胞中。可將特定序列模體如RGD模體插入腺病毒載體之H-1環中以增強其感染性。可透過將特定轉基因或轉基因片段克隆至任何如下所述之腺病毒載體中，以構建一腺病毒重組體。腺病毒重組體載體係用於以非侵入性方式轉導脊椎動物之表皮細胞，以做為一免疫用劑。腺病毒載體亦可用於侵入性施用方法，例如靜脈內、肌內或皮下注射。
於些許實施例中，用於預防與/或治療冠狀病毒感染之此種rdAd載體係可為不表現一外源抗原者（對於來自腺病毒載體之腺病毒係為外源），此等載體係指本發明中所稱之「AdE」載體。於些許實施例中，用於治療與/或預防冠狀病毒感染之複製缺陷型腺病毒載體係可為不表現一種或多種冠狀病毒抗原，但表達一種或多種不同類型感染原（例如流感病毒）抗原者（於此稱為「AdD」）。於些許實施例中係提供一種免疫原性組合物，包含一rdAd載體，其包含一基因表現匣，該基因表現匣包含編碼至少一種SARS-CoV-2抗原之編碼序列，於本發明中稱為hAd5-SARS-CoV-2載體。於些許實施例中，本發明揭露之免疫原性組合物可單獨或與hAd5-SARS-CoV-2載體組合包含一不同類型之此類載體（例如，AdE或AdD）。於些許實施例中，此等類型之載體係可統稱或做為至少兩個此等載體之子集合而稱為「rdAd抗SARS-CoV-2載體」。一SARS-CoV-2免疫原性組合物（例如疫苗）係為包含一種或多種此類rdAd抗SARS-CoV-2載體之藥用製劑。
一AdE載體係為不編碼一外源性抗原之rdAd載體（即，一種對於來自腺病毒載體之腺病毒為外源性之抗原，例如，不同類型傳染源如流感病毒之抗原）。此種hAd5載體亦可稱為「空」的，其缺乏外源性轉基因並且/或為「無轉基因」。於些許實施例中，一AdE載體係可為一ΔE1E3 Ad5載體（例如，缺少病毒基因組之E1區域（核苷酸343至3511）與E3區域中之核苷酸28132至30813）。本發明揭露內容提供些許實施例，其包括包含AdE載體（包括AdE病毒顆粒）之免疫原性組合物以及此種免疫原性組合物於預防與/或治療冠狀病毒（較佳者其中冠狀病毒係為SARS-CoV-2）感染中之用途，以及此等用途之方法 。於些許實施例中，此類AdE載體係可與一種或多種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體共同施用。於些許實施例中，此種共同施用係可指施用包含AdE載體與一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體之單一免疫原性組合物，以及/或基本上同時與/或順序施用包含AdE載體及另一種包含一種或多種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體之多種免疫原性組合物。此類AdE載體亦可做為初打-加強方案之一部分施用，其中包含AdE之一免疫原性組合物係於施用包含一種或多種其他種rdAd抗SARS-CoV-2載體之免疫原性組合物之前或之後（例如，之前及/或之後7至28天）施用。其他類型的。於些許實施例中，本發明揭露內容提供透過施用（例如鼻內）一有效量之此類組合物（例如，至少約107 個傳染單位（ifu）或病毒顆粒（vp）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu之AdE，以及（若存在者）至少一種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體）以誘導（與/或增強）有其需求之哺乳動物受試者體內針對SARS-CoV-2之免疫反應的方法。於些許實施例中，透過施用此種免疫原性組合物所誘導或增強針對SARS-CoV-2之此種免疫反應，較佳者係於施用約24小時內開始，且較佳者可持續至少約21天。於較佳實施例中，此等方法包括鼻內給藥有一效量（例如，至少約107 ifu之AdE，以及，若存在時，至少一種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體）之此種免疫原性組合物。於較佳實施例中，該第二rdAd抗SARS-CoV-2載體編碼SARS-CoV-2之至少一種異源性抗原與/或至少一種其他感染原（例如，AdD），進而提供藥物-疫苗雙重方案。於些許實施例中，多重劑量之AdE載體（與/或其他rdAd抗SARS-CoV-2載體）之施用係可相隔約7、10、14、21、28、35、42、49或56天中任何一者。較佳者，此種免疫原性組合物係可為鼻內給藥。於些許實施例中，宿主係為一動物，例如成人或兒童，其中該宿主係可選擇性為免疫功能不足者。於較佳實施例中，針對冠狀病毒之免疫反應持續至少約40至50天，且可透過在具有或不具有一種或多種SARS-CoV-2載體之情況下重新施用AdE以重新啟動。如所屬技術領域中具有通常知識者皆可理解，本發明亦已將此類AdE載體、免疫原性組合物與/或方法之其他實施例納入考量。
AdD載體係為一rdAd載體，其編碼除冠狀病毒與/或SARS-CoV-2以外之傳染源的外源抗原（例如，不同類型傳染源之抗原，例如流感（例如豬流感、季節性流感、禽流感、H1N1流感或H5N1流感）之抗原）。於些許實施例中，AdD載體係可為一ΔE1E3Ad5載體，其編碼至少一種異源（例如，非Ad）抗原，較佳者係針對宿主（例如哺乳動物）中之表達受到優化。利用本發明所述方法可用於產生針對SARS-CoV-2免疫反應之抗原的代表性範例可包括流感血凝素、流感核蛋白、流感M2、破傷風毒素C片段、炭疽保護性抗原、炭疽致死因子、狂犬病醣蛋白、HBV表面抗原、HIV gp 120、HIV gp 160、人類癌胚抗原、瘧疾CSP、瘧疾SSP、瘧疾MSP、瘧疾pfg以及結核分枝桿菌HSP等。於一實施例中，AdD載體係可為編碼A/New Caledonia / 20/99 H1N1 IFV（NC20）HA1域之AdNC.H1.1載體（參見例如，參見Tang et al. Expert Rev Vaccines 8: 469-481 (2009)。於一實施例中，AdD載體係可包含編碼來自A/California/04/2009(H1N1)樣流感病毒（AdcoCA09.HA“ NasoVAX”）之血凝素（HA）表面蛋白抗原的遺傳插入物，較佳者係由在容許複製之PER.C6細胞中繁殖，並自感染細胞收穫物中純化病毒，並製備包含以下賦形劑之最終產品：Tris HCl（pH 7.4）、組胺酸、蔗糖、氯化鈉、氯化鎂、聚山梨醇酯（polysorbate）80、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic）及乙醇。本發明揭露內容提供些許實施例，其包含具有AdD載體之免疫原性組合物（包括AdD病毒顆粒）以及此種免疫原性組合物於預防與/或治療冠狀病毒（較佳者其中冠狀病毒係為SARS-CoV-2）感染中之用途，以及該用途之方法。於些許實施例中，此種AdD載體可與一種或多種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體共同施用。於些許實施例中，此種共同施用係可指施用包含AdD載體與一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體的單一免疫原性組合物，以及/或基本上同時與/或順序施用包含AdE載體及另一種包含一種或多種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體之多種免疫原性組合物。此類AdD載體亦可做為初打-加強方案之一部分施用，其中包含AdD之一免疫原性組合物係於施用包含一種或多種其他種rdAd抗SARS-CoV-2載體之免疫原性組合物之前或之後（例如，之前及/或之後7至21天）施用。於些許實施例中，本發明揭露內容提供透過施用（例如鼻內）一有效量之此類組合物（例如，至少約107 個傳染單位（ifu）或病毒顆粒（vp）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu之各AdD載體，以及（若存在者）至少一種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體），以誘導（與/或增強）有其需求之哺乳動物受試者體內針對SARS-CoV-2之免疫反應的方法。於些許實施例中，透過施用此種免疫原性組合物所誘導或增強針對SARS-CoV-2之此種免疫反應，較佳者係於施用約24小時內開始，且較佳者可持續至少約21天。於較佳實施例中，此等方法包括鼻內給藥一有效量（例如，至少約107 個病毒顆粒（vp）或傳染單位（ifu）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu）之各AdD載體，以及，若存在者，至少一種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體）之此種免疫原性組合物。於較佳實施例中，該第二rdAd抗SARS-CoV-2載體為AdE及/或編碼至少一種SARS-CoV-2之異源性抗原及/或至少一種其他感染原，進而提供藥物-疫苗雙重方案。於些許實施例中，多重劑量之AdD載體（與/或其他rdAd抗SARS-CoV-2載體）之施用係可相隔約7、10、14、21、28、35、42、49或56天中任何一者。較佳者，此種免疫原性組合物係可為鼻內給藥。於些許實施例中，宿主係為一動物，例如成人或兒童，其中該宿主係可選擇性為免疫功能不足者。於較佳實施例中，針對冠狀病毒之免疫反應持續至少約40至50天，且可透過在具有或不具有一種或多種SARS-CoV-2載體之情況下重新施用AdD以重新啟動。如所屬技術領域中具有通常知識者皆可理解，本發明亦已將此類AdD載體、含有相同成分之免疫原性組合物與/或利用相同物之方法的其他實施例納入考量。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供包含一種或多種SARS-CoV-2載體之免疫原性組合物，該SARS-CoV-2載體包含一rdAd載體，其包含一基因表現匣，該基因表現匣包含編碼至少一種SARS-CoV-棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）或其至少一免疫原性片段之編碼序列，其中該組合物係經配置以於哺乳動物受試者體內誘導針對該棘狀蛋白RBD之中和抗體。推定研究指出，棘狀蛋白透過其S1之受體結合域結合血管緊張素轉換酶2（ACE2）受體（Y. Wan et al.；J. Virol. doi:10.1128/JVI.00127-20；線上發布於 29 January 2020）。產生針對棘狀蛋白之至少該RBD的免疫反應係為用於誘導中和抗體之吸引力靶標，其中棘狀蛋白透過首先結合於一宿主受體（例如，ACE2）並融合病毒與宿主膜以介導冠狀病毒進入宿主細胞。用於SARS-CoV-2之棘狀蛋白於本發明中係經提供為SEQ ID NO：3（GenBank：QHD43416.1）。參見圖3。
於些許實施例中，免疫原性組合物（例如疫苗）包含一種或多種冠狀病毒抗原。於些許實施例中，冠狀病毒係為SARS-CoV-2，其中Wuhan 　2019分離株之編碼序列（SARS-CoV-2）於本發明中係提供為SEQ ID NO：1。於實施例中，複製缺陷型腺病毒載體包含一個或多個 SEQ ID NO：1之編碼序列。該等序列包含一個或多個免疫原性結構域，例如B細胞與/或T細胞抗原決定位。於些許實施例中，複製缺陷型腺病毒載體包含並/或表現（例如，包含一基因表現匣編碼）經編碼SEQ ID NO：2至20中任一個或多個免疫原性結構域。於較佳實施例中，複製缺陷型腺病毒載體包含並/或表現（例如包含一基因表現匣編碼）SEQ ID NO：15或其之一變異體（即，於RBD序列（SEQ ID NO：15的胺基酸57至253（包含SEQ ID NO： 446））中以及/或訊號與/或前導與/或側翼序列）。於實施例中，複製缺陷型腺病毒載體之編碼序列編碼至少一個或多個B細胞抗原決定位、一個或多個CD8+ T細胞抗原決定位與/或一個或多個CD4+ T細胞抗原決定位。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可了解如何使用生物訊息學方法鑑定較大序列中之該等抗原決定位，例如可自免疫抗原決定位數據庫（IEDB）取得之公開工具，根據來自感染陽性受試者之外周血單核細胞(PBMC)與掃描抗原序列之短線性胜肽組合的體外測定法，或根據使用掃描抗原序列之短線性或構象胜肽之血清的體外測定法。
於實施例中，複製缺陷型腺病毒載體包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，該編碼序列編碼SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、RBD胺基酸序列（SEQ ID NO：15（SEQ ID NO：446）之胺基酸57至253）之一抗原或其之一免疫原性片段。於實施例中，複製缺陷型腺病毒載體包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，該編碼序列編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白、S1結構域、S2結構域或其之一免疫原性片段。於實施例中，免疫原性組合物之基因表現匣包含一編碼序列，其係用於棘狀（S）蛋白（例如較佳實施例之SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：12中）、棘狀蛋白之S1結構域（例如較佳實施例之SEQ ID NO：13中）、或其之一免疫原性片段（例如較佳實施例之SEQ ID NO：14至17（圖17B至21）中）。於一較佳實施例中，該編碼序列編碼包含SEQ ID NO：15（SEQ ID NO：446）之胺基酸57至253的RBD序列。於些許實施例中，該等經編碼序列包含一天然或重組之前導訊號序列，其包含一pTA訊號序列（例如較佳實施例MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGS（SEQ ID NO：427））。
於些許實施例中，免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：3所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：3具有至少80%同源性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為與SEQ ID NO：3具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：12所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：12具有至少80%同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為與SEQ ID NO：12具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、98%、99%之同源性與/或同一性。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物的序列係為SEQ ID NO：13所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：13具有至少80%同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物的序列係為與SEQ ID NO：13具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：14所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：14具有至少80%之同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：14具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：15所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：15具有至少80%之同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：15具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：16所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：16具有至少80%之同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：16具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：17所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：17具有至少80%之同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：17具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：446所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：446具有至少80%之同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：446具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：460及SEQ ID NO：475至476中任一者所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：460及SEQ ID NO：475至476具有至少80%之同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：412至420中任一者具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。
於些許其他實施例中，該免疫原性組合物之基因表現匣包含一編碼序列，其係用於該棘狀蛋白之S1結構域（例如SEQ ID NO：13），或其之一免疫原性片段。於些許實施例中，該編碼序列編碼至少SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之331至527位胺基酸，其中胺基酸位置編號係基於該全長棘狀蛋白序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13之331至527位胺基酸具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性；其中，胺基酸位置編號係基於該全長棘狀蛋白序列（圖3）。
於些許實施例中，該免疫原性組合物之基因表現匣包含該棘狀蛋白S1結構域之編碼序列（例如，SEQ ID NO：13；圖17A）或其片段（較佳者為免疫原性片段）（例如，SEQ ID NO：14或15），其中，該序列包含一個或多個以下殘基：L455、F486、Q493、S494及/或N501（基於全長棘狀蛋白之胺基酸位置編號）。參見如圖3、15及17B至21。於實施例中，編碼序列包含Q493及N501。於些許實施例中，編碼序列包含Q493。一般相信，SARS-CoV-2於位置455、486、493、494及/或501處之該等特定胺基酸殘基可直接與其受體相互作用。該等胺基酸殘基係可根據該棘狀蛋白之455、486、493、494與501位之SARS-CoV-2胺基酸的物理化學性質透過保守取代進行個別修飾。以此方式，可產生可能捕獲逃逸物（例如避開經獲取之中和抗體但仍結合於宿主受體之病毒突變）之替代性序列，其中該免疫原性組合物可根據該等替代性序列誘導中和抗體。於實施例中，該免疫原性組合物之基因表現匣包含用於該棘狀蛋白S1結構域、S1結構域之RBD或其免疫原性片段之編碼序列，其中該序列包含SEQ ID NO：16，其中，455（L）係選自Y、F、L或S；486（F）係選自L、F、S或P；493（Q）係選自L、N、Q、R或K；494（S）係選自D、G、P、L或S；且501（N）係選自T、S、N或Y。於實施例中，該免疫原性組合物之基因表現匣包含用於棘狀蛋白S1結構域、S1之RBD或其免疫原性片段之編碼序列，其中該序列包含SEQ ID NO：17，其中，455（L）係選自Y、F、L或S；486（F）係選自L、F、S或P；493（Q）係選自L、N、Q、R或K；494（S）係選自D、G、P、L或S；且501（N）係選自T、S、N或Y。
於些許實施例中，該免疫原性組合物之基因表現匣包含用於修飾SEQ ID NO.13之棘狀蛋白序列子段的編碼序列，該子段之胺基酸序列係顯示於圖17B（「序列」）中如下： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNF (SEQ ID NO: 411 ) 於些許實施例中，該編碼序列可編碼SEQ ID NO：411任何胺基酸之至少一個取代。於些許實施例中，該編碼序列可編碼SEQ ID NO：411之至少一個取代（「突變」）。較佳者，對SEQ ID NO：411之一個或多個取代係如圖17B中所示者其中之一。於些許實施例中，該一個或多個取代係可為胺基酸333至388、390至395、397至399、401至411、413至415、417至419、424、426至435、437、439至442、444至446、449、450、452、453、455至463、465、467至473、475至479、481至486、490、491、493至495、499至510、或513至526之其中一個或多個，該編號對應於圖17B中所示者。於較佳實施例中，該取代係可為做為與人類ACE2受體主要接觸殘基之一種或多種胺基酸，較佳者係為胺基酸417、446、447、449、453、455、456、473、475至477、484、486、487、493、495至498、500至503、及/或505（編號對應於圖17B中所示者）。於些許實施例中，對SEQ ID NO：411之取代係為以下至少一者：胺基酸417（K）經取代為N；胺基酸446（G）經取代為V、S或A；胺基酸449（Y）經取代為N；胺基酸453（Y）經取代為F；胺基酸455（L）經取代為F；胺基酸456（F）經取代為L；胺基酸473（Y）經取代為V；胺基酸475（A）經取代為V；胺基酸476（G）經取代為S或A；胺基酸477（S）經取代為N、R、T、G、A或I；胺基酸484（E）經取代為Q、K、D、A或R；胺基酸486（F）經取代為L或S；胺基酸453（Y）經取代為F；胺基酸493（Q）經取代為L或R；胺基酸495（Y）經取代為N或F；胺基酸500（T）經取代為I；胺基酸501（N）經取代為Y、T或S；胺基酸502（G）經取代為R、D或C；胺基酸503（V）經取代為L、I或F；以及/或胺基酸505（Y）經取代為H、E、W或C；該編號對應於圖17B所示者。
於實施例中，編碼之棘狀蛋白RBD序列包含選自Y455、F455或S455之殘基。於其他實施例中，編碼之棘狀蛋白RBD序列包含選自L486或P486之殘基。於些許實施例中，編碼之棘狀蛋白RBD序列包含選自N493、R493或K493之殘基。於實施例中，編碼之棘狀蛋白RBD序列包含選自D494或G494之殘基。於實施例中，編碼之棘狀蛋白RBD序列包含選自T501或S501之殘基。
穩定化棘狀蛋白抗原設計
針對Covid-19之病毒載體免疫原性組合物或疫苗（例如SARS-CoV-2）之開發面臨與下述相關之些許重大挑戰：（1）病毒載體表現具有四級結構蛋白質之能力，該四級結構代表冠狀病毒所表現之天然融合前蛋白，並且係與針對SARS-CoV-2病毒之中和抗體的誘導作用協調；（2）在細胞表達系統中，病毒載體於其製造期間在干擾有限情況下之傳播能力，該干擾受限可能與轉基因棘狀蛋白之共伴表現有關。
於實施例中，設計在感染細胞表面表現之融合前三聚體構象中之穩定化棘狀抗原的病毒載體，對於開發Covid-19免疫原性組合物或疫苗以解決疫苗之抗原性及生產問題可能係為理想。於其他實施例中，其免疫原性片段（棘狀蛋白），例如S1或受體結合域（RBD），對於開發Covid-19免疫原性組合物或疫苗可能係為理想，其同樣解決免疫原性組合物或疫苗之抗原性及生產相關問題。該等難題部分歸因於SARS-Cov-2棘狀蛋白之「融合」特性，其於本發明中係用以指稱棘狀蛋白獲得進入宿主細胞之融合特性（例如，做病毒顆粒表面上之殼蛋白），其利用ACE2做為進入受體，或表現於宿主細胞上以與鄰近細胞融合形成較大之合胞體（多核宿主細胞），以透過此種與進入受體無關之細胞對細胞獨立融合的極快速增殖手段。宿主細胞蛋白酶啟動冠狀病毒S蛋白對於病毒進入表現ACE2之細胞極為重要，並且涵蓋S1/S2及S2'位點之S蛋白切割。SARS-CoV-2 S之S1/S2切割位點具有數個精胺酸殘基（多鹼基），表示其具有高切割性（Hoffmann et al.，SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor；Cell；2020 Apr 16；181(2)：271–280.e8）。S蛋白構象變化之成功，可導致膜融合，不僅需要受體結合，亦需要適當之蛋白酶活化。SARS-CoV-2 S蛋白之S1及S2（胺基酸682至685，RRAR）次單元之間具有一Furin蛋白酶位點，與高致病性流感病毒中所發現者相似。該Furin蛋白酶位點（RRAR）不存在於其他冠狀病毒S蛋白中（例如，參見Walls et al. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein; Cell; 2020 Mar 9文中之圖1C，該文係透過引用併入本發明），並可能導致不穩定性，並可能阻礙病毒載體疫苗之開發。因此，於些許實施例中，可去除並/或修飾SARS-Cov-2棘狀蛋白中之該等胺基酸殘基，以改善或去除SARS-Cov-2棘狀蛋白中存在之S1及S2結構域間的Furin蛋白酶切割位點。
因此，一種穩定棘狀蛋白之方法係為（1）於以細胞為基礎之生產中，例如於（腺病毒）病毒載體之生產中在E1互補細胞系中之蛋白表現過程中，以及/或（2）於施用病毒載體後在哺乳動物體內之蛋白表現過程中，使蛋白對蛋白分解之降解具有更強抵抗力。蛋白分解切割位點係可透過胺基酸取代、插入或缺失來修飾，以防止或減少酶促降解。對於此類方法之相關蛋白分解切割位點較佳者，係於蛋白之溶劑可及區域中發現，該區域其係形成蛋白三聚體複合物之立體結構的面溶劑表面。此等溶劑可及位點包括S1/S2接點QTQTNSPRRARSVASQ（SEQ ID NO：25）以及S2'接點PDPSKPSKRSF（SEQ ID NO：26）。可透過計算相對溶劑可及分數區域（SASA）之習知方法識別其他溶劑可及區域。涉及棘狀蛋白之蛋白分解切割的潛在酶包括Furin、Trypsin、Elastase、Plasmin、TMPRSS2、Chymotrypsin、Cathepsin-L、Cathepsin-B、TMPRSS11D、Dipeptidyl Peptidase IV、MMP-13、MMP-12、MMP-2、MMP-9、MMP-3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9。可使用如Proper、Properous、PeptideCutter、Pripper、CasCleave、CasCleave 2.0、CASVM及iProt-Sub等習知演算法預測蛋白酶切割位點。
自SARS-CoV-2以及/或其他冠狀病毒相應序列切割S1/S2接點QTQTNSPRRARSVASQ（SEQ ID NO：25），經證實主要係仰賴精胺酸殘基，例如來自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：12之685、682與/或683位置之精胺酸。為干擾蛋白分解切割，可考慮使用親水性、非正電荷胺基酸或小胺基酸如N、Q、D、E、T、S、G或A取代精胺酸殘基。此外，可透過胺基酸之缺失或插入使S1/S2接點得以抵抗蛋白分解切割，前提為該些序列修飾不會改變棘狀抗原之三維構象，藉以保持其抗原性及刺激中和抗體產生之能力。對於序列SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：12中位置814處之離胺酸殘基及位置815處之精胺酸殘基，亦可將類似方法應用於S2'接點PDPSKPSKRSF（SEQ ID NO：26）。於實施例中，該免疫原性組合物之基因表現匣包含SEQ ID NO：18（較佳實施例）、SEQ ID NO：19（較佳實施例）或SEQ ID NO：20之一編碼序列。參見圖22至24。因此，於些許較佳實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列係為SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19中所呈現之序列或其免疫原性片段，或與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少80%同源性與/或同一性之序列。於些許實施例中，該免疫原性組合物之編碼序列與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之同源性與/或同一性。
於其他實施例中，用於穩定該棘狀蛋白之另一方法包括將介穩定之棘狀蛋白保持於其融合前構象。Pallesen等人於2017年（Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoV spike antigen，Proc Natl Acad Sci U S A.， 2017 Aug 29；114（35）:E7348-E7357）以及和Wrapp等人於2020年（Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation，Science，2020 Mar 13；367（6483）：1260-1263）已公開用以穩定處於融合前構象之冠狀病毒棘狀蛋白之序列修飾，顯示於第一個七胜肽重複區（HR1）及中央螺旋（CH）間之環中的脯胺酸取代可限制融合蛋白之過早觸發，且經常增加融合前胞外結構域之表現量。參見圖22至24以及SEQ ID NO：18、19及20。
於實施例中，其他方法包括促進感染細胞表面之蛋白表現。該棘狀蛋白係可保留於內質網與/或前高爾基（pre-golgi）/高爾基體中，此現象與跨膜及/或細胞內結構域之性質有關。可透過取代富含半胱胺酸之結構域中取代半胱胺酸以修飾細胞內結構域（IC），或透過修飾C端內質網滯留模體（VKLHYT（SEQ ID NO：409）），以來防止細胞內滯留。參見圖24及SEQ ID NO：20。
於些許實施例中，可透過修飾該棘狀抗原序列中所包含之融合胜肽，實現於病毒載體製造過程中限制轉基因棘狀蛋白之毒性。透過胺基酸之缺失、插入與/或胺基酸之取代所進行的修飾係可經導入至棘狀序列中，以中斷該融合胜肽之α螺旋構象。可透過以脯胺酸殘基取代特定胺基酸實現融合胜肽之α螺旋構象的中斷。
因此，於實施例中，針對表現穩定全長三聚體棘狀抗原之Covid-19的病毒載體免疫原性組合物或疫苗，其設計係可包含上述一種或多種修飾。該等修飾之範例係如表1（S1/S2、S2’及融合結構域）及表2（HR1/CH及IC結構域）（圖22-24，SEQ ID NO：18-20）中所示。 [表1] 用於增加全長棘狀蛋白之穩定性或表面表現之示例性修飾
區域 S1/S2 S2' 融合
取自SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 12之序列 QTQTNSPRRARSVASQ (SEQ ID NO: 25) PSKPSKRSF (SEQ ID NO: 26) SFIEDLLFNKVTLADAGFI (SEQ ID NO: 447)
修飾  .......XX.X.....  ......X..  .....P.............
 .......QQ.Q.....  ......Q..  ...............P...
 .......SG.G.....  ......N..  .....P.........P...
 .......-----....  .....NA..  ....---------......
 .....--..
「.」=保守性胺基酸； X = N、Q、D、E、T、S、G或A；且「-」 = 缺失。 [表2] 用於增加全長棘狀蛋白之穩定性或表面表現之示例性修飾
區域 HR1/CH IC
取自SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 12之序列 SRLDKVEAEV (SEQ ID NO: 448) CCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT (SEQ ID NO: 449)
修飾 ....PP....  ................................------
 .....................-----------------
 ...........---------------------------
 .................................Z.#..
   ...........Z..........................
   ............Z.........................
   ..............Z.......................
   .................Z....................
 ..................Z...................
「.」=保守性胺基酸； Z = N、Q、D、E、T、S、G或A；且「-」 =缺失。
於實施例中，本發明之免疫原性組合物係為一多價組合物。於些許實施例中，該複製缺陷型腺病毒載體之基因表現匣進一步包含一編碼序列，其編碼SARS-CoV-2結構蛋白外套膜（E）、膜（M）或核殼（N）中之一個或多個。該等結構蛋白中各者於本發明中係分別表示為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：10。亦參見圖5、6及10。於替代性實施例中，該等結構蛋白可自一獨立複製缺陷型腺病毒載體編碼，並做為一多價製劑與一複製缺陷型腺病毒共同提供，該複製缺陷型腺病毒載體包含一基因表現匣，其具有一編碼序列，該編碼序列編碼至少SARS-CoV-2（2019年新型冠狀病毒；2019-nCoV）棘狀（S）蛋白受體結合結構域（RBD），或其至少一免疫原性片段。
中和融合後棘狀抗原
如上所述，與B子群之其他β-冠狀病毒不同，SARS-CoV-2之S蛋白具有一獨特S1/S2 furin可識別位點，表示其S蛋白可能具有獨特傳染性質。的確，於活性SARS-CoV-2感染中，合胞現像經證明為受感染細胞自然形成，此於SARS-CoV感染中之回報相當罕見，表示其具有高度介導膜融合之能力（Xu Z. et al.，Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome，Lancet Respir Med.，2020 Apr；8（4）：420-422.）。此等細胞性合胞體可能至少部分導致於COVID-19患者中所觀察到之病理。此外，合胞體之形成亦透過使用此種獨立於受體外之細胞對細胞融合機制（非關受體之擴散）幫助病毒極迅速增殖。因此，以融合後型態誘導抵抗S抗原之中和抗體，代表一種以無關進入受體之方式限制合胞體形成與/或防止病毒快速傳播之手段。融合後棘狀抗原係於棘狀蛋白受蛋白酶切割後所形成。如Wall等人所述，切割作用誘導S2結構域之三維結構重新排列，此係如Wall et al.於2017年所表示（Walls, et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.，2017；114（42）：11157–11162.）。
於些許實施例中，SARS-CoV-2免疫作用載體亦可或替代性地包含一核苷酸，其可導致於一細胞中表現出不具S1結構域如刺突之S2結構域（約來自SEQ ID NO：686之胺基酸殘基） ID NO：3）或S2'結構域（約來自SEQ ID NO：3之胺基酸殘基816）之棘狀抗原，或自SEQ ID NO：3之殘基816開始且最少包含HR1、HR2與一跨膜結構域之一序列。於些許較佳實施例中，此等SARS-CoV-2免疫作用載體誘導可中和融合後棘狀蛋白（例如針對S2結構域之抗體）之免疫反應，並透過防止合胞體形成與/或透過防止病毒增殖以無關進入受體之方式增殖來提供保護。於些許實施例中，該免疫原性組合物之基因表現匣包含用於棘狀（S）蛋白S2部分之一編碼序列（例如，SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23）。於些許實施例中，該免疫原性組合物之基因表現匣包含用於棘狀（S）蛋白S2部分之一編碼序列，該棘狀蛋白包含額外跨膜結構域以替代融合胜肽（例如，SEQ ID NO：24）。SEQ ID NO：21、22、23、及24的多胜肽係如下所示：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGSSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT（SEQ ID NO：21；SARS-CoV-2 棘狀蛋白－S2結構域；具pTA訊號）；MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGSSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT（SEQ ID NO：22；SARS-CoV-2棘狀蛋白－S2’結構域；具pTA訊號）；MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGSGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT（SEQ ID NO：23；SARS-CoV-2棘狀蛋白－HR1 + HR2結構域；具pTA訊號）；以及GPPLSSSLGLALLLLLLALLFWLYIVMGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT（SEQ ID NO：24；SARS-CoV-2棘狀蛋白－S2’結構域+額外跨模結構域)。
T 細胞抗原決定位胜肽
在實施例中，SARS-CoV-2免疫作用載體包含一個或多個長度為8至60個胺基酸之胜肽編碼序列（且若超過一個時係為串連），其中各胜肽包含至少一個CD8+ T細胞抗原決定位與/或至少一個CD4+ T細胞抗原決定位。於此情況下，串連之胜肽編碼多核苷酸係表現一多胜肽，其中T細胞抗原決定位或包含T細胞抗原決定位之序列受含有胺基酸之間隔序列隔開，該等胺基酸包含例如甘胺酸、絲胺酸或丙胺酸殘基。該多核苷酸可進一步包含為泛蛋白或單一訊號生態編碼之多核苷酸序列。於些許實施例中，SARS-CoV-2免疫作用載體包含一種或多種編碼一種或多種S蛋白抗原之多核苷酸（Ahmed et al.，Viruses，12：254（2020））。該一種或多種S蛋白胜肽抗原可包含任何T細胞抗原決定位，例如表3A中所示之任何胜肽： [表3A]
SEQ ID NO: 胜肽 SEQ ID NO: 胜肽
27/78 ILLNKHID 155 SASAFFGMSR
28 AFFGMSRIGMEVTPSGTW 156 SPRWYFYYL
29/80 MEVTPSGTWL 157 SQASSRSSSR
30/83 GMSRIGMEV 158 TPSGTWLTY
31/87 ILLNKHIDA 159 TTLPKGFYA
32/88 ALNTPKDHI 160 VLQLPQGTTL
33 IRQGTDYKHWPQIAQFA 161 VLQLPQGTTLPKGFY
34 KHWPQIAQFAPSASAFF 162 VTPSGTWLTY
35/91 LALLLLDRL 163 AEGSRGGSQA
36/92 LLLDRLNQL 164 FLCLFLLPSL
37 LLNKHIDAYKTFPPTEPK 165 FLGRYMSAL
38/95 LQLPQGTTL 166 FLLNKEMYL
39 AQFAPSASAFFGMSR 167 FLLPSLATV
40 AQFAPSASAFFGMSRIGM 168 FLNGSCGSV
41 RRPQGLPNNTASWFT 169 FLNRFTTTL
42 YKTFPPTEPKKDKKKK 170 FLPRVFSAV
43/152 GAALQIPFAMQMAYRF 171 FRYMNSQGL
44/153 MAYRFNGIGVTQNVLY 172 FTYASALWEI
45/154 QLIRAAEIRASANLAATK 173 AIILASFSA
46/271 FIAGLIAIV 174 GVYDYLVST
47/105 ALNTLVKQL 175 ILASFSAST
48/112 LITGRLQSL 176 ILGTVSWNL
49/124 NLNESLIDL 177 IQPGQTFSV
50/313 QALNTLVKQLSSNFGAI 178 ALRANSAVK
51/133 RLNEVAKNL 179 ALWEIQQVV
52/143 VLNDILSRL 180 KLWAQCVQL
53/146 VVFLHVTYV 181 LLSAGIFGA
54/63 SEETGTLIV 182 MPASWVMRI
55 FLWLLWPVT 183 NVLAWLYAA
56 FLWLLWPVTL 184 QLMCQPILL
57 FLWLLWPVTLACFVL 185 QLMCQPILLL
58 IKDLPKEITVATSRT 186 AVLQSGFRK
59 LEQWNLVIGF 187 SLLSVLLSM
60 LFARTRSMW 188 TLGVYDYLV
61 LWLLWPVTL 189 TVLSFCAFA
62 LWPVTLACF 190 VLAWLYAAV
63/54 SEETGTLIV 191 VLSFCAFAV
64 MWSFNPETNI 192 YIFFASFYY
65 NLVIGFLFL 193 FPPTSFGPL
66 PKEITVATSRTLSYY 194 FVDGVPFVV
67 ATSRTLSYY 195 AIMTRCLAV
68 ATSRTLSYYK 196 GVAMPNLYK
69 QWNLVIGFLF 197 ALLADKFPV
70 RYRIGNYKL 198 ILGLPTQTV
71 SELVIGAVI 199 ILHCANFNV
72 SFNPETNIL 200 IPRRNVATL
73 SMWSFNPET 201 ISDYDYYRY
74 TSRTLSYYK 202 IVDTVSALV
75 TVATSRTLSY 203 KLFAAETLK
76 WLLWPVTLA 204 KLNVGDYFV
77 WPVTLACFVL 205 KLSYGIATV
78/27 ILLNKHID 206 KMQRMLLEK
79 FPRGQGVPI 207 KQFDTYNLW
80/29 MEVTPSGTWL 208 LLDDFVEII
81 GMEVTPSGTWL 209 LLLDDFVEI
82 LLLLDRLNQ 210 LLMPILTLT
83/30 GMSRIGMEV 211 LMIERFVSL
84 GTTLPKGFY 212 LQLGFSTGV
85 ALALLLLDR 213 LVLSVNPYV
86 IDAYKTFPPTEPKKD 214 MLWCKDGHV
87/31 ILLNKHIDA 215 MMISAGFSL
88/32 ALNTPKDHI 216 MVMCGGSLYV
89 KTFPPTEPK 217 NLWNTFTRL
90 KTFPPTEPKK 218 NMLRIMASL
91/35 LALLLLDRL 219 ATVVIGTSK
92/36 LLLDRLNQL 220 RILGAGCFV
93 LLLLDRLNQL 221 RLYYDSMSY
94 APSASAFFGM 222 RQLLFVVEV
95/38 LQLPQGTTL 223 SSNVANYQK
96 AQFAPSASA 224 TLIGDCATV
97 LSPRWYFYY 225 TLVPQEHYV
98 MSRIGMEVTPSGTWL 226 TMADLVYAL
99 ASAFFGMSR 227 TTLPVNVAF
100 NKHIDAYKTFPPTEP 228 VLQAVGACV
101 ATEGALNTPK 229 VLWAHGFEL
102 QLPQGTTLPK 230 VMCGGSLYV
103 QQQGQTVTK 231 VVDKYFDCY
104 QQQQGQTVTK 232 VVYRGTTTY
105/47 ALNTLVKQL 233 YLDAYNMMI
106 ISGINASVVNIQKEI 234 YLNTLTLAV
107 LDKYFKNHTSPDVDL 235 YQKVGMQKY
108 APHGVVFLHV 236 YTMADLVYA
109 LGDISGINASVVNIQ 237 YVFCTVNAL
110 LGFIAGLIAIVMVTI 238 HLVDFQVTI
111 LIDLQELGKY 239 HPLADNKFAL
112/48 LITGRLQSL 240 KLFIRQEEV
113 LLLQYGSFC 241 QECVRGTTVLLKEPC
114 LLQYGSFCT 242 CELYHYQECV
115 LNTLVKQLSSNFGAI 243 SVSPKLFIR
116 LQDVVNQNAQALNTL 244 YEGNSPFHPL
117 LQIPFAMQM 245 AFLLFLVLI
118 LQSLQTYVTQQLIRA 246 AFLLFLVLIMLIIFW
119 LQTYVTQQLIRAAEI 247 FLAFLLFLV
120 AQALNTLVK 248 FLAFLLFLVL
121 AQKFNGLTVLPPLLT 249 FLAFLLFLVLIMLII
122 MTSCCSCLK 250 FLLFLVLIM
123 ASANLAATK 251 FLLFLVLIML
124/49 NLNESLIDL 252 FLLFLVLIMLIIFWF
125 PCSFGGVSVITPGTN 253 FLVLIMLII
126 PYRVVVLSF 254 FLVLIMLIIFWFSLE
127 QELGKYEQYI 255 FYLCFLAFL
128 QIPFAMQMAYRFNGI 256 FYLCFLAFLL
129 QPYRVVVLSF 257 IDFYLCFLAF
130 QQLIRAAEIRASANL 258 IMLIIFWFSL
131 QTYVTQQLIRAAEIR 259 LAFLLFLVLIMLIIF
132 RLDKVEAEV 260 LFLVLIMLIIFWFSL
133/51 RLNEVAKNL 261 LIDFYLCFL
134 RLQSLQTYV 262 LLFLVLIML
135 RVDFCGKGY 263 LLFLVLIMLI
136 AYRFNGIGVTQNVLY 264 LLFLVLIMLIIFWFS
137 SLIDLQELGK 265 MLIIFWFSL
138 SSNFGAISSVLNDIL 266 YLCFLAFLL
139 SVLNDILSR 267 YLCFLAFLLFLVLIM
140 TGRLQSLQTYVTQQL 268 DSFKEELDKY
141 TQNVLYENQK 269 AEVQIDRLI
142 CMTSCCSCLK 270 AEVQIDRLIT
143/52 VLNDILSRL 271/46 FIAGLIAIV
144 VQIDRLITGR 272 FPNITNLCPF
145 VRFPNITNL 273 GAALQIPFAMQMAYR
146/53 VVFLHVTYV 274 GLIAIVMVTI
147 WLGFIAGLIAIVMVT 275 GRLQSLQTY
148 CVNFNFNGLTGTGVL 276 GSFCTQLNR
149 YEQYIKWPWY 277 GVVFLHVTY
150 DKYFKNHTSPDVDLG 278 GWTFGAGAALQIPFA
151 AEIRASANLA 279 GYQPYRVVVL
152/43 GAALQIPFAMQMAYRF 280 IDRLITGRLQSLQTY
153/44 MAYRFNGIGVTQNVLY 281 IGAGICASY
154/45 QLIRAAEIRASANLAATK 282 IITTDNTFV
於些許較佳實施例中，該等載體可獨立或作為單一多胜肽之一部分編碼多個抗原決定位（例如，串聯，選擇性地受2至10個胺基酸之一連接胺基酸序列隔開）。於些許實施例中，該等載體可編碼多個抗原決定位，如表3B中所示之示例性群組： [表3B]
群組 胜肽
1 FIAGLIAIV (SEQ ID NO: 46), GLIAIVMVTI (SEQ ID NO: 274), IITTDNTFV (SEQ ID NO: 282), ALNTLVKQL (SEQ ID NO: 105), LITGRLQSL (SEQ ID NO: 48), LLLQYGSFC (SEQ ID NO: 113), LQYGSFCT (SEQ ID NO: 465), NLNESLIDL (SEQ ID NO: 49), RLDKVEAEV (SEQ ID NO: 132), RLNEVAKNL (SEQ ID NO: 51), RLQSLQTYV (SEQ ID NO: 134), VLNDILSRL (SEQ ID NO: 52), VVFLHVTYV (SEQ ID NO: 53), ILLNKHID (SEQ ID NO: 27), FPRGQGVPI (SEQ ID NO: 79), LLLLDRLNQ (SEQ ID NO: 82), GMSRIGMEV (SEQ ID NO: 30), ILLNKHIDA (SEQ ID NO: 31), ALNTPKDHI (SEQ ID NO: 32), LALLLLDRL (SEQ ID NO: 35), LLLDRLNQL (SEQ ID NO: 36), LLLLDRLNQL (SEQ ID NO: 93), LQLPQGTTL (SEQ ID NO: 38), AQFAPSASA (SEQ ID NO: 96), TTLPKGFYA (SEQ ID NO: 159), VLQLPQGTTL (SEQ ID NO: 160), VRFPNITNL (SEQ ID NO: 145) 與 YEQYIKWPWY (SEQ ID NO: 149)
2 GYQPYRVVVL (SEQ ID NO: 279), PYRVVVLSF (SEQ ID NO: 126)與LSPRWYFYY (SEQ ID NO: 97)
3 DSFKEELDKY (SEQ ID NO: 268), LIDLQELGKY (SEQ ID NO: 111), PYRVVVLSF (SEQ ID NO: 126), GTTLPKGFY (SEQ ID NO: 84)與 VTPSGTWLTY (SEQ ID NO: 162)
4 GSFCTQLNR (SEQ ID NO: 276), GVVFLHVTY (SEQ ID NO: 277), AQALNTLVK (SEQ ID NO: 120), MTSCCSCLK (SEQ ID NO: 122), ASANLAATK (SEQ ID NO: 123), SLIDLQELGK (SEQ ID NO: 137), SVLNDILSR (SEQ ID NO: 139), TQNVLYENQK (SEQ ID NO: 141), CMTSCCSCLK (SEQ ID NO: 142), VQIDRLITGR (SEQ ID NO: 144), KTFPPTEPK (SEQ ID NO: 89),與 KTFPPTEPKK (SEQ ID NO: 90)
5 LSPRWYFYY (SEQ ID NO: 97), ASAFFGMSR (SEQ ID NO: 99), ATEGALNTPK (SEQ ID NO: 101), QLPQGTTLPK (SEQ ID NO: 102), QQQGQTVTK (SEQ ID NO: 103), QQQQGQTVTK (SEQ ID NO: 104), SASAFFGMSR (SEQ ID NO: 155), SQASSRSSSR (SEQ ID NO: 157)與 TPSGTWLTY (SEQ ID NO: 158)
6 GSFCTQLNR (SEQ ID NO: 276), GVVFLHVTY (SEQ ID NO: 277), AQALNTLVK (SEQ ID NO: 120), MTSCCSCLK (SEQ ID NO: 122), ASANLAATK (SEQ ID NO: 123), SLIDLQELGK (SEQ ID NO: 137), SVLNDILSR (SEQ ID NO: 139), TQNVLYENQK (SEQ ID NO: 141), CMTSCCSCLK (SEQ ID NO: 142), VQIDRLITGR (SEQ ID NO: 144), KTFPPTEPK (SEQ ID NO: 89), KTFPPTEPKK (SEQ ID NO: 90), LSPRWYFYY (SEQ ID NO: 97), ASAFFGMSR (SEQ ID NO: 99), ATEGALNTPK (SEQ ID NO: 101), QLPQGTTLPK (SEQ ID NO: 102), QQQGQTVTK (SEQ ID NO: 103), QQQQGQTVTK (SEQ ID NO: 104), SASAFFGMSR (SEQ ID NO: 155), SQASSRSSSR (SEQ ID NO: 157)與 TPSGTWLTY (SEQ ID NO: 158)
7 GYQPYRVVVL (SEQ ID NO: 279), PYRVVVLSF (SEQ ID NO: 126)與 LSPRWYFYY (SEQ ID NO: 97)
8 GSFCTQLNR (SEQ ID NO: 276), GVVFLHVTY (SEQ ID NO: 277), AQALNTLVK (SEQ ID NO: 120), MTSCCSCLK (SEQ ID NO: 122), ASANLAATK (SEQ ID NO: 123), SLIDLQELGK (SEQ ID NO: 137), SVLNDILSR (SEQ ID NO: 139), TQNVLYENQK (SEQ ID NO: 141), CMTSCCSCLK (SEQ ID NO: 142), VQIDRLITGR (SEQ ID NO: 144), KTFPPTEPK (SEQ ID NO: 89), KTFPPTEPKK (SEQ ID NO: 90), LSPRWYFYY (SEQ ID NO: 97), ASAFFGMSR (SEQ ID NO: 99), ATEGALNTPK (SEQ ID NO: 101), QLPQGTTLPK (SEQ ID NO: 102), QQQGQTVTK (SEQ ID NO: 103), QQQQGQTVTK  (SEQ ID NO: 104), SASAFFGMSR (SEQ ID NO: 155), SQASSRSSSR (SEQ ID NO: 157)與 TPSGTWLTY (SEQ ID NO: 158)
9 FPNITNLCPF (SEQ ID NO: 272), APHGVVFLHV (SEQ ID NO: 108), FPRGQGVPI (SEQ ID NO: 79)與 APSASAFFGM (SEQ ID NO: 94)
10 GAALQIPFAMQMAYR (SEQ ID NO: 273), GWTFGAGAALQIPFA (SEQ ID NO: 278), IDRLITGRLQSLQTY (SEQ ID NO: 280), ISGINASVVNIQKEI (SEQ ID NO: 106), LDKYFKNHTSPDVDL (SEQ ID NO: 107), LGDISGINASVVNIQ (SEQ ID NO: 109), LGFIAGLIAIVMVTI (SEQ ID NO: 110), LNTLVKQLSSNFGAI (SEQ ID NO: 115), LQDVVNQNAQALNTL (SEQ ID NO: 116), LQSLQTYVTQQLIRA (SEQ ID NO: 118), LQTYVTQQLIRAAEI (SEQ ID NO: 119), AQKFNGLTVLPPLLT (SEQ ID NO: 121), PCSFGGVSVITPGTN (SEQ ID NO: 125), QIPFAMQMAYRFNGI (SEQ ID NO: 128), QQLIRAAEIRASANL (SEQ ID NO: 130), QTYVTQQLIRAAEIR (SEQ ID NO: 131), AYRFNGIGVTQNVLY (SEQ ID NO: 136), SSNFGAISSVLNDIL (SEQ ID NO: 138), TGRLQSLQTYVTQQL (SEQ ID NO: 140), WLGFIAGLIAIVMVT (SEQ ID NO: 147), CVNFNFNGLTGTGVL (SEQ ID NO: 148), DKYFKNHTSPDVDLG (SEQ ID NO: 150), IDAYKTFPPTEPKKD (SEQ ID NO: 86), MSRIGMEVTPSGTWL (SEQ ID NO: 98), NKHIDAYKTFPPTEP (SEQ ID NO: 100)與 VLQLPQGTTLPKGFY (SEQ ID NO: 161)
11 FPNITNLCPF (SEQ ID NO: 272), APHGVVFLHV (SEQ ID NO: 108), FPRGQGVPI (SEQ ID NO: 79)與 APSASAFFGM (SEQ ID NO: 94)
12 LQIPFAMQM (SEQ ID NO: 117)與 RVDFCGKGY (SEQ ID NO: 135)
13 GRLQSLQTY (SEQ ID NO: 275), RVDFCGKGY (SEQ ID NO: 135)與 VRFPNITNL (SEQ ID NO: 145)
14 MTSCCSCLK (SEQ ID NO: 122), SLIDLQELGK (SEQ ID NO: 137), CMTSCCSCLK (SEQ ID NO: 142), VQIDRLITGR (SEQ ID NO: 144), SASAFFGMSR (SEQ ID NO: 155),與 SQASSRSSSR (SEQ ID NO: 157)
15 LQIPFAMQM (SEQ ID NO: 117)與 RVDFCGKGY (SEQ ID NO: 135)
如所屬技術領域中具有通常知識者可理解，本發明亦將抗原決定位之其他組合納入考量。
於些許實施例中，該等載體可編碼以下一個或多個抗原決定位，其等係可為B細胞抗原決定位：DVVNQNAQALNTLVKKL（SEQ ID NO：283）、FFGMSRIGMEVTPSGTW（SEQ ID NO：284）、EAEVQIDRLITGRLQSL（SEQ ID NO：285）、GLPNNTASWFTALTQHGK（SEQ ID NO：286）、EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY（SEQ ID NO：287）、GTTLPK（SEQ ID NO：288）、EVAKNLNESLIDLQELG（SEQ ID NO：289）、IRQGTDYKHWPQIAQFA（SEQ ID NO：290）、GAALQIPFAMQMAYRFN（SEQ ID NO：291）、KHIDAYKTFPPTEPKKDKKK（SEQ ID NO：292）、GAGICASY（SEQ ID NO：293）、KHWPQIAQFAPSASAFF（SEQ ID NO：294）、AISSVLNDILSRLDKVE（SEQ ID NO：295）、YNVTQQAFGRPE ：296）、GSFCTQLN（SEQ ID NO：297）、KTFPPTEPKKDKKKK（SEQ ID NO：298）、ILSRLDKVEAEVQIDRL（SEQ ID NO：299）、LLPAAD（SEQ ID NO：300）、KGIYQTSN（SEQ ID NO：301）、LNKHIDAYKTFPPTEPK（SEQ ID NO：302）、AMQMAYRF（SEQ ID NO：303）、LPQGTTLPKG（SEQ ID NO：304）、KNHTSPDVDLGDISGIN（SEQ ID NO：305）、LPQRQKKQ（SEQ ID NO：306）、MAYRFNGIGVTQNVLYE（SEQ ID NO：307）、PKGFYAEGSRGGSQASSR（SEQ ID NO：308）、AATKMSECVLGQSKRVD（SEQ ID NO：309）、QFAPSASAFFGMSRIGM（SEQ ID NO：310）、PFAMQMAYRFNGIGVTQ（SEQ ID NO：311）、QGTDYKHW（SEQ ID NO：312）、QALNTLVKQLSSNFGAI（SEQ ID NO：313，50）、QLPQGTTLPKGFYAE（SEQ ID NO：314）、QLIRAAEIRASANLAAT（SEQ ID NO：315）、QLPQGTTLPKGFYAEGSR（SEQ ID NO：316）、QQFGRD（SEQ ID NO：317）、QLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQ（SEQ ID NO：318）、RASANLAATKMSECVLG（SEQ ID NO：319）、TFPPTEPK（SEQ ID NO：320）、RLITGRLQSLQTYVTQQ（SEQ ID NO：321）、RRPQGLPNNTASWFT（SEQ ID NO：322）、EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY（SEQ ID NO：323）、SQASSRSS（SEQ ID NO：324）、SLQTYVTQQLIRAAEIR（SEQ ID NO：325）、SRGGSQASSRSSSRSRSR（SEQ ID NO：326）、及DLGDISGINASVVNIQK（SEQ ID NO：327）；以及/或相同者之組合。於些許較佳實施例中，該等載體可獨立或作為單一多胜肽之一部分編碼多個此等抗原決定位（例如，於些許實施例中為串聯，選擇性地受2至10個胺基酸之一連接胺基酸序列隔開）。
於些許實施例中，可根據刺激CD4+和CD8+ T細胞反應之能力選擇由SARS-CoV-2免疫作用載體編碼之SARS-CoV-2胜肽序列，且於些許實施例中，可根據於一系列經選定HLA等位基因中包含最高數量之HLA第I類及HLA第II類結合模體之蛋白體區域之預測而選擇。於些許實施例中，可使用可於IEDB獲得之NetMHCpan EL 4.0（http://tools.iedb.org/mhci/；Jurtz, et al.，J Immunol，2017；199（9）：3360-3368）對跨SARS-CoV-2序列之HLA第II類結合模體進行分析。於些許實施例中，NetMHCpan EL 4.0可用於鑑定長度為9至11個胺基酸至HLA第I類分子並經指定百分比等級（%Rank）之結合模體。於些許實施例中，高親和性結合胜肽係可經鑑定為表現出%-Rank≤0.1者，而中度親和性結合胜肽係可經認為具有介於≥0.1至≤0.5之一%-rank。於較佳實施例中，NetMHCpan EL 4.0之預測可以此處所示之一組18 HLA-A等位基因、32 HLA-B等位基因及20 HLA-C等位基因進行：HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*23:0、HLA-A*24:02、HLA-A*25:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*31:01、HLA-A*32:01、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*68:02、HLA-A*74:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-B*13:01、HLA-B*13:02、HLA-B*14:02、HLA-B*15:01、HLA-B*15:02、HLA-B*15:25、HLA-B*18:01、HLA-B*27:02、HLA-B*27:05、HLA-B*35:01、HLA-B*35:03、HLA-B*37:01、HLA-B*38:01、HLA-B*39:01、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-B*44:02、HLA-B*44:03、HLA-B*46:01、HLA-B*48:01、HLA-B*49:01、HLA-B*50:01、HLA-B*51:01、HLA-B*52:01、HLA-B*53:01、HLA-B*55:01、HLA-B*56:01、HLA-B*57:01、HLA-B*58:01、HLA-B*58:02、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*02:09、HLA-C*03:02、HLA-C*03:03、HLA-C*03:04、HLA-C*04:01、HLA-C*05:01、HLA-C*06:02、HLA-C*07:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:04、HLA-C*08:01、HLA-C*08:02、HLA-C*12:02、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02、HLA-C*15:02、HLA-C*16:01及HLA-C*17:01。如所屬技術領域中具有通常知識者可理解，其他HLA第I類等位基因亦可能適用。
於些許實施例中，可使用根據取自免疫抗原決定位數據庫（IEDB）之針對定量胜肽結合親和性數據訓練之人工神經網路總集）的NetMHCII 2.3（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/；Jensen et al.，Immunology，2018 Jul；154（3）：394-406）進行SARS-CoV-2多胜肽序列內之HLA第II類結合模體。於些許實施例中，NetMHCII 2.3可用以透確定例如百分比等級（%-Rank）（與胜肽對HLA分子之親和性有關）及核心九位胺基酸結合模體識別HLA第II類分子可呈現之胜肽。於些許實施例中，高親和性HLA第II類結合胜肽可經鑑定為表現出%-Rank≤2者，而中等親和性結合胜肽可經認為係具有%-Rank≥2及10者。於較佳實施例中，NetMHCII 2.3系統可根據此處所示之一組20 HLA-DR等位基因、20 HLA-DQ等位基因及9 HLA-DP等位基因：DRα1*0101-DRβ1*0101、DRα1*0101-DRβ1*0301、 DRα1*0101-DRβ1*0401、 DRα1*0101-DRβ1*0701、 DRα1*0101-DRβ1*0801、 DRα1*0101-DRβ1*0802、 DRα1*0101-DRβ1*0901、 DRα1*0101-DRβ1*1001、 DRα1*0101-DRβ1*1101、 DRα1*0101-DRβ1*1201、 DRα1*0101-DRβ1*1301、 DRα1*0101-DRβ1*1302、 DRα1*0101-DRβ1*150、 DRα1*0101-DRβ1*1602、 DRα1*0101-DRβ3*0101、 DRα1*0101-DRβ3*0202、 DRα1*0101-DRβ3*0301、 DRα1*0101-DRβ4*0101、 DRα1*0101-DRβ4*0103、 DRα1*0101-DRβ5*0101、 DPα1*0103-DPβ1*0301、 DPα1*0103-DPβ1*0401、 DPα1*0103-DPβ1*0402、 DPα1*0103-DPβ1*0601、 DPα1*0201-DPβ1*0101、 DPα1*0201-DPβ1*0501、 DPα1*0201-DPβ1*1401、 DPα1*0301-DPβ1*0402、 DPα1*0103-DPβ1*0201、 DQα1*0101-DQβ1*0501、 DQα1*0102-DQβ1*0501、 DQα1*0102-DQβ1*0502、 DQα1*0102-DQβ1*0602、 DQα1*0103-DQβ1*0603、 DQα1*0104-DQβ1*0503、 DQα1*0201-DQβ1*0202、 DQα1*0201-DQβ1*0301、 DQα1*0201-DQβ1*0303、 DQα1*0201-DQβ1*0402、 DQα1*0301-DQβ1*0301、 DQα1*0301-DQβ1*0302、 DQα1*0303-DQβ1*0402、 DQα1*0401-DQβ1*0402、 DQα1*0501-DQβ1*0201、 DQα1*0501-DQβ1*0301、 DQα1*0501-DQβ1*0302、 DQα1*0501-DQβ1*0303、 DQα1*0501-DQβ1*0402 及 DQα1*0601-DQβ1*0402。如所屬技術領域中具有通常知識者可理解，其他HLA第II類等位基因亦可能適用。
跨越經選定之70 HLA第I類等位基因之HLA第I類結合模體之數量以及跨越經選定具有高或高加（+）中等親和性之49 HLA第II類等位基因之HLA第II類結合模體之數量，係對於掃描SARS-CoV-2序列之各41個胺基酸長窗口分別計算並表示於圖27至70中。對此分析，經預測之跨膜結構域因為其等之高疏水性而被取消選定。根據該分析，基於跨SRAS-CoV-2蛋白體（SEQ ID NO.410）之HLA第I類與/或HLA第II類模體的最高含量，選定表4中所示長度介於34至124個胺基酸間之42個長胜肽序列。 [表4]經選定含有高密度 HLA 第 I 類及 / 或 HLA 第 II 類結合模體之 SARS-CoV-2 長胜肽序列（ SEQ ID NO ： 328 至 369 ）
SEQ ID No. 長度 SEQ ID NO: 410 中之 N 端位置 SEQ ID NO: 410 中之 C 端位置 序列
328 66 2580 2645 VGDSAEVAVKMFDAYVNTFSSTFNVPMEKLKTLVATAEAELAKNVSLDNVLSTFISAARQGFVDSD
329 106 4891 4996 DKSAGFPFNKWGKARLYYDSMSYEDQDALFAYTKRNVIPTITQMNLKYAISAKNRARTVAGVSICSTMTNRQFHQKLLKSIAATRGATVVIGTSKFYGGWHNMLKT
330 87 5238 5324 DIVKTDGTLMIERFVSLAIDAYPLTKHPNQEYADVFHLYLQYIRKLHDELTGHMLDMYSVMLTNDNTSRYWEPEFYEAMYTPHTVLQ
331 45 6407 6452 AVCRHHANEYRLYLDAYNMMISAGFSLWVYKQFDTYNLWNTFTRLQ
332 98 4704 4801 NFNVLFSTVFPPTSFGPLVRKIFVDGVPFVVSTGYHFRELGVVHNQDVNLHSSRLSFKELLVYAADPAMHAASGNLLLDKRTTCFSVAALTNNVAFQT
333 83 7757 7839 ECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYIC
334 70 1532 1601 DKSVYYTSNPTTFHLDGEVITFDNLKTLLSLREVRTIKVFTTVDNINLHTQVVDMSMTYGQQFGPTYLDG
335 82 7948 8029 AQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGK
336 117 5531 5647 DAVVYRGTTTYKLNVGDYFVLTSHTVMPLSAPTLVPQEHYVRITGLYPTLNISDEFSSNVANYQKVGMQKYSTLQGPPGTGKSHFAIGLALYYPSARIVYTACSHAAVDALCEKALK
337 84 231 314 CREHEHEIAWYTERSEKSYELQTPFEIKLAKKFDTFNGECPNFVFPLNSIIKTIQPRVEKKKLDGFMGRIRSVYPVASPNECNQ
338 85 2097 2181 AAYVDNSSLTIKKPNELSRVLGLKTLATHGLAAVNSVPWDTIANYAKPFLNKVVSTTTNIVTRCLNRVCTNYMPYFFTLLLQLCT
339 86 5107 5192 IADKYVRNLQHRLYECLYRNRDVDTDFVNEFYAYLRKHFSMMILSDDAVVCFNSTYASQGLVASIKNFKSVLYYQNNVFMSEAKCW
340 80 4961 5040 RQFHQKLLKSIAATRGATVVIGTSKFYGGWHNMLKTVYSDVENPHLMGWDYPKCDRAMPNMLRIMASLVLARKHTTCCSL
341 80 6465 6544 GHFDGQQGEVPVSIINNTVYTKVDGVDVELFENKTTLPVNVAFELWAKRNIKPVPEVKILNNLGVDIAANTVIWDYKRDA
342 92 5943 6034 LHPTQAPTHLSVDTKFKTEGLCVDIPGIPKDMTYRRLISMMGFKMNYQVNGYPNMFITREEAIRHVRAWIGFDVEGCHATREAVGTNLPLQL
343 55 2935 2989 DTNVLEGSVAYESLRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDSEYCRHGTC
344 96 4782 4877 DKRTTCFSVAALTNNVAFQTVKPGNFNKDFYDFAVSKGFFKEGSSVELKHFFFAQDGNAAISDYDYYRYNLPTMCDIRQLLFVVEVVDKYFDCYDG
345 107 822 928 KVTFGDDTVIEVQGYKSVNITFELDERIDKVLNEKCSAYTVELGTEVNEFACVVADAVIKTLQPVSELLTPLGIDLDEWSMATYYLFDESGEFKLASHMYCSFYPPD
346 80 7406 7485 KGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLND
347 91 7287 7377 EFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNE
348 102 6622 6723 EAVKTQFNYYKKVDGVVQQLPETYFTQSRNLQEFKPRSQMEIDFLELAMDEFIERYKLEGYAFEHIVYGDFSHSQLGGLHLLIGLAKRFKESPFELEDFIPM
349 97 6800 6896 SQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEKCDLQNYGDSATLPKGIMMNVAKYTQLCQYLNTLTLAVPYNMRVIHFGAGSDKGVAPGTAVLRQWLPTGTLLVDS
350 77 8568 8644 DCVVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPIYDEPTTTTSVPL
351 37 8683 8719 LCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV
352 124 8818 8941 SFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ
353 85 9039 9123 SGTYEGNSPFHPLADNKFALTCFSTQFAFACPDGVKHVYQLRARSVSPKLFIRQEEVQELYSPIFLIVAAIVFITLCFTLKRKTE
354 107 9552 9658 TKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKD
355 81 3149 3229 STKHFYWFFSNYLKRRVVFNGVSFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLRSDVLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGAMDTTSYREA
356 84 4057 4140 VPLNIIPLTTAAKLMVVIPDYNTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQVVDADSKIVQLSEISMDNSPNLAWPLIVTALRANSAVKLQ
357 80 441 520 EGSEGLNDNLLEILQKEKVNINIVGDFKLNEEIAIILASFSASTSAFVETVKGLDYKAFKQIVESCGNFKVTKGKAKKGA
358 108 523 630 IGEQKSILSPLYAFASEAARVVRSIFSRTLETAQNSVRVLQKAAITILDGISQYSLRLIDAMMFTSDLATNNLVVMAYITGGVVQLTSQWLTNIFGTVYEKLKPVLDW
359 77 993 1069 GSEDNQTTTIQTIVEVQPQLEMELTPVVQTIEVNSFSGYLKLTDNVYIKNADIVEEAKKVKPTVVVNAANVYLKHGG
360 81 1123 1203 NKGEDIQLLKSAYENFNQHEVLLAPLLSAGIFGADPIHSLRVCVDTVRTNVYLAVFDKNLYDKLVSSFLEMKSEKQVEQKI
361 104 1351 1454 SAFYILPSIISNEKQEILGTVSWNLREMLAHAEETRKLMPVCVETKAIVSTIQRKYKGIKIQEGVVDYGARFYFYTSKTTVASLINTLNDLNETLVTMPLGYVT
362 104 1409 1512 IKIQEGVVDYGARFYFYTSKTTVASLINTLNDLNETLVTMPLGYVTHGLNLEEAARYMRSLKVPATVSVSSPDAVTAYNGYLTSSSKTPEEHFIETISLAGSYK
363 82 1611 1692 NSHEGKTFYVLPNDDTLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKWKYPQVNGLTSIKWADNNCYLATALLTLQQIELKFNP
364 76 7115 7190 TTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFAS
365 83 7014 7096 REQIDGYVMHANYIFWRNTNPIQLSSYSLFDMSKFPLKLRGTAVMSLKEGQINDMILSLLSKGRLIIRENNRVVISSDVLVNN
366 61 8942 9002 MFHLVDFQVTIAEILLIIMRTFKVSIWNLDYIINLIIKNLSKSLTENKYSQLDEEQPMEID
367 84 8046 8129 DVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECV
368 63 3943 4005 AIASEFSSLPSYAAFATAQEAYEQAVANGDSEVVLKKLKKSLNVAKSEFDRDAAMQRKLEKMA
369 80 4174 4253 TTKGGRFVLALLSDLQDLKWARFPKSDGTGTIYTELEPPCRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQ
對於各經選定SEQ ID NO：328至SEQ ID NO：369長序列，其等之高或中等結合之HLA第I類及HLA第II類等位基因數量係經預測並表示於表5中。 [表5]於含有高密度 HLA 第 I 類及 / 或 HLA 第 II 類結合模體之經選定 SARS-CoV-2 長胜肽序列中（ SEQ ID NO ： 328 至 369 ），所預測高或中等結合之 HLA 第 I 類及 HLA 第 II 類等位基因之數量
SEQ ID NO. 長度 SEQ ID NO: 410 中之 N 端位置 SEQ ID NO: 410 中之 C 端位置 HLA 第 II 類等位基因之數量 HLA 第 I 類等位基因之數量
中親和性 高親和性 中 + 高親和性 中親和性 高親和性 中 + 高親和性
328 66 2580 2645 40 21 43 64 50 68
329 106 4891 4996 42 26 43 63 48 66
330 87 5238 5324 44 26 46 64 57 69
331 45 6407 6452 38 49 49 66 70 70
332 98 4704 4801 48 24 48 58 49 61
333 83 7757 7839 34 21 36 63 39 64
334 70 1532 1601 32 17 35 60 52 63
335 82 7948 8029 41 24 43 61 32 62
336 117 5531 5647 46 24 46 68 47 68
337 84 231 314 37 11 38 61 44 70
338 85 2097 2181 43 16 44 65 45 70
339 86 5107 5192 47 38 49 58 33 59
340 80 4961 5040 39 23 40 59 53 64
341 80 6465 6544 36 9 37 63 41 65
342 92 5943 6034 37 17 43 61 38 64
343 55 2935 2989 29 8 29 59 39 63
344 96 4782 4877 39 17 40 65 46 68
345 107 822 928 33 15 36 64 48 64
346 80 7406 7485 41 18 42 61 37 64
347 91 7287 7377 47 31 49 63 49 66
348 102 6622 6723 38 18 38 66 49 68
349 97 6800 6896 38 20 40 66 36 66
350 77 8568 8644 32 14 35 54 24 58
351 37 8683 8719 25 9 29 36 27 48
352 124 8818 8941 40 23 41 68 49 70
353 85 9039 9123 38 19 39 65 44 69
354 107 9552 9658 37 13 37 66 47 69
355 81 3149 3229 45 29 45 55 41 60
356 84 4057 4140 44 31 47 65 44 67
357 80 441 520 39 28 44 50 20 52
358 108 523 630 48 21 48 70 51 70
359 77 993 1069 36 12 37 59 41 62
360 81 1123 1203 41 13 43 64 41 70
361 104 1351 1454 45 24 47 64 38 67
362 104 1409 1512 41 26 44 61 35 63
363 82 1611 1692 41 14 42 59 47 69
364 76 7115 7190 39 17 39 63 26 63
365 83 7014 7096 46 21 46 63 38 67
366 61 8942 9002 37 23 43 44 11 46
367 84 8046 8129 38 19 38 60 35 62
368 63 3943 4005 35 27 40 52 26 56
369 80 4174 4253 46 27 47 64 17 64
除長胜肽序列SEQ ID NO：328至SEQ ID NO：369外，亦鑑定39個長度變化介於31至47個胺基酸殘基間之短序列。對應於SEQ ID NO：328至SEQ ID NO：369中具有HLA第I類及第II類結合模體數量最高的序列部分之該等39個較短胜肽序列係如圖6所示（SEQ ID NO：370至408）。於實施例中，可將此等較短胜肽串聯以用於自該腺病毒載體插入與表現。 [表6]經選定含有高密度 HLA 第 I 類及 / 或 HLA 第 II 類結合模體之 SARS-CoV-2 較短胜肽序列（ SEQ ID NO ： 370 至 408 ）
SEQ ID No 經包含其內之 SEQ ID NO: 長度 N 端位置 C 端位置 序列
370 328 45 2589 2633 KMFDAYVNTFSSTFNVPMEKLKTLVATAEAELAKNVSLDNVLSTF
371 329 41 4911 4951 MSYEDQDALFAYTKRNVIPTITQMNLKYAISAKNRARTVAG
372 330 45 5243 5287 DGTLMIERFVSLAIDAYPLTKHPNQEYADVFHLYLQYIRKLHDEL
373 331 43 6410 6452 RHHANEYRLYLDAYNMMISAGFSLWVYKQFDTYNLWNTFTRLQ
374 332 41 4704 4744 NFNVLFSTVFPPTSFGPLVRKIFVDGVPFVVSTGYHFRELG
375 333 45 7781 7825 RSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPV
376 334 47 1532 1578 DKSVYYTSNPTTFHLDGEVITFDNLKTLLSLREVRTIKVFTTVDNIN
377 335 45 7961 8005 LTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGI
378 336 45 5532 5576 AVVYRGTTTYKLNVGDYFVLTSHTVMPLSAPTLVPQEHYVRITGL
379 337 41 243 283 ERSEKSYELQTPFEIKLAKKFDTFNGECPNFVFPLNSIIKT
380 338 45 2097 2141 AAYVDNSSLTIKKPNELSRVLGLKTLATHGLAAVNSVPWDTIANY
381 339 41 5129 5169 VDTDFVNEFYAYLRKHFSMMILSDDAVVCFNSTYASQGLVA
382 339 33 5158 5190 FNSTYASQGLVASIKNFKSVLYYQNNVFMSEAK
383 340 43 4997 5039 VYSDVENPHLMGWDYPKCDRAMPNMLRIMASLVLARKHTTCCS
384 342 45 5972 6016 KDMTYRRLISMMGFKMNYQVNGYPNMFITREEAIRHVRAWIGFDV
385 343 41 2945 2985 YESLRPDTRYVLMDGSIIQFPNTYLEGSVRVVTTFDSEYCR
386 344 41 4817 4857 SKGFFKEGSSVELKHFFFAQDGNAAISDYDYYRYNLPTMCD
387 345 43 881 923 KTLQPVSELLTPLGIDLDEWSMATYYLFDESGEFKLASHMYCS
388 346 45 7418 7462 PTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYS
389 346 43 7443 7485 FASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLND
390 347 45 7332 7376 TRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYN
391 350 42 8570 8611 VVLHSYFTSDYYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEE
392 351 31 8689 8719 NIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV
393 352 43 8884 8926 PKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLN
394 353 42 9073 9114 VKHVYQLRARSVSPKLFIRQEEVQELYSPIFLIVAAIVFITL
395 354 42 9587 9628 HWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDD
396 355 46 3149 3194 STKHFYWFFSNYLKRRVVFNGVSFSTFEEAALCTFLLNKEMYLKLR
397 355 46 3184 3229 LLNKEMYLKLRSDVLLPLTQYNRYLALYNKYKYFSGAMDTTSYREA
398 356 44 4057 4100 VPLNIIPLTTAAKLMVVIPDYNTYKNTCDGTTFTYASALWEIQQ
399 357 42 460 501 NINIVGDFKLNEEIAIILASFSASTSAFVETVKGLDYKAFKQ
400 358 43 528 570 SILSPLYAFASEAARVVRSIFSRTLETAQNSVRVLQKAAITIL
401 359 43 994 1036 SEDNQTTTIQTIVEVQPQLEMELTPVVQTIEVNSFSGYLKLTD
402 360 43 1154 1196 FGADPIHSLRVCVDTVRTNVYLAVFDKNLYDKLVSSFLEMKSE
403 361 43 1410 1452 KIQEGVVDYGARFYFYTSKTTVASLINTLNDLNETLVTMPLGY
404 363 41 1616 1656 KTFYVLPNDDTLRVEAFEYYHTTDPSFLGRYMSALNHTKKW
405 366 46 8944 8989 HLVDFQVTIAEILLIIMRTFKVSIWNLDYIINLIIKNLSKSLTENK
406 367 44 8083 8126 VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMS
407 368 36 3943 3978 AIASEFSSLPSYAAFATAQEAYEQAVANGDSEVVLK
408 369 41 4213 4253 CRFVTDTPKGPKVKYLYFIKGLNNLNRGMVLGSLAATVRLQ
對於SEQ ID NO：370-408（表6）中各者，其等之高或中等結合之HLA第I類及HLA第II類等位基因數量係經預測並表示於表7中。 [表7]於含有高密度 HLA 第 I 類及 / 或 HLA 第 II 類結合模體之經選定 SARS-CoV-2 短胜肽序列中（ SEQ ID NO ： 370 至 408 ），所預測高或中等結合之 HLA 第 I 類及 HLA 第 II 類等位基因之數量
SEQ ID NO: 長度 SEQ ID NO: 410 中之 N 端位置 SEQ ID NO: 410 中之 C 端位置 HLA 第 II 類 等位基因之數量 HLA 第 I 類 等位基因之數量
中親和性 高親和性 中 + 高親和性 中親和性 高親和性 中 + 高親和性
370 45 2589 2633 27 14 32 59 50 67
371 41 4911 4951 31 13 32 57 30 65
372 45 5243 5287 37 15 40 61 43 65
373 43 6410 6452 35 15 39 63 37 68
374 41 4704 4744 32 14 35 48 34 55
375 45 7781 7825 31 15 33 54 35 55
376 47 1532 1578 31 16 34 56 41 60
377 45 7961 8005 35 19 37 53 30 55
378 45 5532 5576 38 18 39 59 40 64
379 41 243 283 28 5 30 47 36 60
380 45 2097 2141 34 10 35 63 36 68
381 41 5129 5169 45 32 49 44 21 47
382 33 5158 5190 33 14 37 37 13 41
383 43 4997 5039 32 15 35 45 37 57
384 45 5972 6016 32 17 38 50 31 56
385 41 2945 2985 24 6 24 56 37 61
386 41 4817 4857 23 6 23 52 32 60
387 43 881 923 25 7 26 47 36 58
388 45 7418 7462 33 15 35 51 28 58
389 43 7443 7485 31 9 34 33 14 34
390 45 7332 7376 39 24 41 48 37 56
391 42 8570 8611 28 12 31 41 19 47
392 31 8689 8719 25 9 29 36 27 48
393 43 8884 8926 34 16 35 53 24 53
394 42 9073 9114 27 16 31 58 32 67
395 42 9587 9628 29 11 30 54 28 61
396 46 3149 3194 36 24 41 45 23 52
397 46 3184 3229 34 13 35 46 27 53
398 44 4057 4100 34 16 40 43 32 47
399 42 460 501 33 26 40 46 13 48
400 43 528 570 42 16 42 62 18 63
401 43 994 1036 20 6 23 41 23 47
402 43 1154 1196 33 8 34 56 29 60
403 43 1410 1452 30 16 34 50 28 52
404 41 1616 1656 32 10 35 45 36 58
405 46 8944 8989 36 22 43 42 11 44
406 44 8083 8126 32 14 34 49 18 52
407 36 3943 3978 27 19 30 40 18 45
408 41 4213 4253 36 20 41 43 8 44
對於自SEQ ID NO：328至SEQ ID NO：369之各選定序列， HLA第I類及HLA第II類結合模體之圖譜係如圖29至70所示。於圖29至70中，各HLA第I類及第II類模體之N端胺基酸（即胺基酸#1）係以X或O識別，其中X進一步表示一高親和性模體，且O對HLA結合模體表示中親和性。示例性HLA結合模體係可由圖29至圖70推導，透過納入該X或O胺基酸殘基並納入後續之八至十個胺基酸於模體中，以使各模體包含九至十一個胺基酸殘基（即，各模體係為一9至11胺基酸胜肽），參照各圖中指示之SEQ ID編號。於本發明揭露載體中，任何此種結合模體可單獨以及/或結合用做免疫原。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者可理解，SEQ ID NO382至369中任一其他結合模體，亦可能適合經包含於本文之SARS-CoV-2免疫作用載體中。
與傳播中 SARS-CoV-2 變異體匹配之 RBD 序列
如上所述，rdAd載體可經設計以編碼與SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15同源之序列，或任何包含SEQ ID NO：446之序列，其具有或不具有額外之側翼殘基，並納入如圖17B中所述之單一或多個RBD突變。較佳者，該等RBD變異體序列係可於胺基酸位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504、及/或505處包含單一或組合突變，其中，該胺基酸位置編號對應於SEQ ID NO：3（全長棘狀蛋白）（圖17B）。更佳者，該等RBD序列於位置K417T、K417N、E484K、L452R及/或N501Y處包含單一或組合突變（圖17B）。於較佳實施例中，該等RBD變異體蛋白序列係可選自SEQ ID NO：412至417所構成之群組，其中，該RBD序列係以底線標記： 源自SARS-CoV California CAL.20C B.1.429譜系之棘狀蛋白RBD： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKCVFNFN (SEQ ID NO: 412) 源自SARS-CoV Brazil P.2譜系B.1.1.28.2譜系之棘狀蛋白RBD： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKCVFNFN (SEQ ID NO: 413) 源自SARS-CoV UK VOC 202012/01; B.1.1.7譜系之棘狀蛋白RBD（亦即20I/501Y.V1）： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKCVFNFN (SEQ ID NO: 414) 源自SARS-CoV UK B.1.1.7譜系之棘狀蛋白RBD（E484K）： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKCVFNFN (SEQ ID NO: 415) 源自SARS-CoV Brazil P.1譜系B.1.1.28.1譜系之棘狀蛋白RBD（亦即20J/501Y.V3）： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKCVFNFN (SEQ ID NO: 416) South Africa 501Y.V2 B.1.351譜系之棘狀蛋白RBD（亦即20H/501Y.V2）： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKCVFNFN (SEQ ID NO: 417)
於較佳實施例中，待rdAd（單價RBD載體）表現之RBD序列前具有一前導/信號胜肽序列，以解決細胞分泌途徑中多胜肽之表現。用於有效靶向哺乳動物細胞中所表現之重組蛋白的常用前導胜肽序列，係如表9所述。 [表9]
前導序列名稱 序列
Human OSM MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASM (SEQ ID NO: 418)
VSV-G MKCLLYLAFLFIGVNC (SEQ ID NO: 419)
Mouse Ig Kappa METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID NO: 420)
Human IgG2 H MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 421)
BM40 MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 422)
Secrecon MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA (SEQ ID NO: 423)
Human IgKVIII MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEQ ID NO: 424)
CD33 MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 425)
tPA MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS (SEQ ID NO: 426) MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGS (SEQ ID NO: 427)
Human Chymotrypsinogen MAFLWLLSCWALLGTTFG (SEQ ID NO: 428)
Human trypsinogen-2 MNLLLILTFVAAAVA (SEQ ID NO: 429)
Human IL-2 MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 430)
Gaussia luciferase MGVKVLFALICIAVAEA (SEQ ID NO: 431)
Albumin(HSA) MKWVTFISLLFSSAYS (SEQ ID NO: 432)
Influenza Haemagglutinin MKTIIALSYIFCLVLG (SEQ ID NO: 433)
Human insulin MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA (SEQ ID NO: 434)
Silkworm Fibroin LC MKPIFLVLLVVTSAYA (SEQ ID NO: 435)
adenovirus protein E3/gp19K MRYMILGLLALAAVCSAA (SEQ ID NO: 436)
IgG MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 437)
變異體 RBD 序列及多價疫苗組合物
開發可提供針對共傳播SARS-CoV-2變異體及潛在變異體提供免疫力之多價免疫原性組合物或疫苗亦可能為有利。於些許實施例中，多價基因免疫原性組合物或疫苗組合物係可透過結合數種單價基因免疫原性組合物或疫苗組合物實現，其等於相同製劑中各自表現一抗原序列變異體。於些許實施例中，亦可構建單一基因構建體以共表現多個抗原序列變異體，以提供一多價RBD SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗組合物。例如於些許實施例中，本發明揭露之rdAd載體可包含一個或多個基因表現匣，其包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，該抗原編碼序列於棘狀蛋白RBD結構域中摻入一個或多個突變，並能防護傳播中SARS-CoV-2變異體及潛在未來變異體。於些許實施例中，單一基因構建體可包含於單一基因表現匣中共同線性排列之多個RBD變異體單元。RBD變異體單元係可選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或任何包含SEQ ID NO：446之序列，其具有或不具有額外側翼殘基並且納入如圖17B中所述之單個或多個RBD突變。各RBD變異體單元可與其他透過包括例如甘胺酸及絲胺酸胺基酸殘基之彈性間隔序列呈現共同線性排列之其他RBD變異體間隔。於較佳實施例中，間隔胜肽可包含胺基酸序列（GGGGS）n、（GGGGA）n、（GGGGQ）n、（GGGPS）n、（GPGPG）n及其等之組合，其中n介於1至10之間。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者可理解，其他間隔序列，較佳者本質上係為親水性並且包含極性胺基酸者，也可能適用。於些許實施例中，間隔序列可包括供前蛋白轉化酶（PC）（亦稱為真核枯草蛋白酶（eukaryotic subtilases））之一個或多個蛋白分解切割模體，其係由一組包含furin（PACE）、PC1（PC3）、PC2、PC4、PACE4、PC5（PC6）、及PC7（LPC、PC8）之絲胺酸蛋白酶所呈現，其可透過於多鹼基模體處分解蛋白質前驅物生成生物活性蛋白及胜肽，例如荷爾蒙、受體與生長因子。於較佳實施例中，此種多鹼基模體包括下表中所述者： [表8]
前蛋白轉化酶 切割位典特異性
PC1/3 KR↓ 或 RR↓
PC2 KR↓ 或 RR↓
Furin；PACE RXK/RR↓
RXXR↓
RXRXXXR/KR↓
PC4 KXXR↓
RXK/RR↓
PC5/6A；PC5/6B RXK/RR↓
PACE4 RXK/RR↓
PC7；PC8；LPC；SPC7 RXK/RR↓
X=任何天然胺基酸；↓=切割位置
間隔序列(Spacer sequence)較佳者係經優化，以避免於假蛋白序列(pseudo-protein sequenc)內引入新抗原決定位（neo-epitope）。再者，不同間隔序列係可於相同序列內組合。於些許實施例中，間隔序列係可包含一彈性部分及一可切割部分。於些許實施例中，不同間隔序列係可使用於相同多架建構物內之RBD變異體單元之間。於一較佳多價RBD載體中，在相同基因序列中共線性排列之RBD變異體單元數量係可於2至10個單元之間變化，較佳者係可於2至6個單元之間變化。RBD變異體序列之各別順序亦可變化；利用引入之間隔序列，可使各RBD變異體皆獨立具有免疫原性。各RBD變異體單元可包含任何單一突變或組合突變，如圖17B中所述。
較佳者，RBD變異體序列係可於位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504、及/或505處包含單一或組合突變（圖17B）。更加者，RBD序列於位置K417T、K417N、E484K、L452R及/或N501Y處包含單一或組合突變，其中胺基酸位置編號對應於SEQ ID NO：3（全長棘狀蛋白）（圖17B）。SEQ ID NO：438至443與460係經提供做為RBD變異體序列之較佳實施例，可用於設計多價RBD載體。包含多個RBD變異體單元之多價RBD序列的較佳實例係以SEQ ID NO：444、SEQ ID NO：445、SEQ ID NO：475及SEQ ID NO：476所呈現。於較佳實施例中，待rdAd表現之該多價RBD序列（一「多價RBD載體」、一種多價hAd5-SARS-CoV-2）前方將具有一前導/訊號胜肽序列，以滿足細胞分泌途徑中多胜肽之表現。常用於有效靶向哺乳動物細胞中所表現之重組蛋白的常用前導胜肽序列係如表9所述。
於較佳實施例中，該等RBD變異體蛋白序列係可選自SEQ ID NO：438至443與460所構成之群組，且示例性多價RBD構建體係如下方之SEQ ID NO：444、445、475與476所示，其中RBD序列係以底線標記： 源自SARS-CoV（GenBank：MN908947.3）之棘狀蛋白RBD： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 438) (CVFNFN經取代為S VNFT ) 源自SARS-CoV California CAL.20C B.1.429譜系之棘狀蛋白RBD： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 439) (CVFNFN經取代為S VNFT ) 源自SARS-CoV Brazil P.2 lineage B.1.1.28.2譜系之棘狀蛋白RBD： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 440) (CVFNFN經取代為S VNFT ) 源自SARS-CoV UK VOC 202012/01; B.1.1.7譜系之棘狀蛋白RBD（亦即20I/501Y.V1）： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 460) (CVFNFN經取代為S VNFT ) 源自SARS-CoV UK B.1.1.7譜系之棘狀蛋白RBD（E484K）： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 441) (CVFNFN經取代為S VNFT ) 源自SARS-CoV Brazil P.1譜系B.1.1.28.1譜系之棘狀蛋白RBD（亦即20J/501Y.V3）： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 442) (CVFNFN經取代為S VNFT ) South Africa 501Y.V2 B.1.351譜系（亦即20H/501Y.V2）： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 443) (CVFNFN 經取代為S VNFT ) 包含SEQ ID NO: 438、SEQ ID NO: 443及SEQ ID NO: 441之多價RBD建構物組合： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 444) (間隔序列(GGGGS)3 ) 包含SEQ ID NO: 438、SEQ ID NO: 443及SEQ ID NO: 441之多價RBD建構物組合： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSRRKRSVGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSRRKRSVGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 445) (間隔序列(GGGGS)2 RRKRSV(GGGGS)2 ) 包含SEQ ID NO: 438、SEQ ID NO: 439、SEQ ID NO: 440、SEQ ID NO: 441、SEQ ID NO: 442及SEQ ID NO: 443之多價RBD建構物組合： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGGGGSGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 475) (間隔序列(GGGGS)2 RRKRSV(GGGGS)2 ) 包含SEQ ID NO: 438、SEQ ID NO: 439、SEQ ID NO: 440、SEQ ID NO: 441、SEQ ID NO: 442及SEQ ID NO: 443之多價RBD建構物組合： TLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGSGGGGSRRKRSVGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGSGGGGSRRKRSVGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGSGGGGSRRKRSVGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGSGGGGSRRKRSVGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTFGSGGGGSRRKRSVGGGGSGGGGSTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP KKSTNLVKNKSVNFTF (SEQ ID NO: 476) (間隔序列(GGGGS)2 RRKRSV(GGGGS)2 )
如所屬技術領域中具有通常知識者所可理解，本發明亦將其他胜肽、多胜肽、構建體及其等之組合納入考量。
受體結合拮抗物
於些許實施例中，該等SARS-CoV-2免疫作用載體（即表現一種或多種外源抗原者）可包含編碼一種或SARS-CoV-2阻斷蛋白（例如受體結合拮抗物）之多核苷酸。例如，如SARS-CoV-2之冠狀病毒已知係將棘狀（S）蛋白之同型三聚體用於宿主細胞附著、融合與進入宿主細胞，並可涉及唾液酸與/或ACE2（一種細胞膜C端錨定蛋白(anchored protein)，可催化血管收縮素1(angiotensin 1)裂解為血管收縮素1-9，並催化血管收縮素II裂解為血管擴張劑血管收縮素1-7(vasodilator angiotensin 1-7)，因此於系統性血壓調節中扮演關鍵角色（Alifano, et al.，Biochimie，174：30-33（2020））。已知宿主細胞蛋白酶可處理冠狀病毒S蛋白以生成兩個次單元（S1與S2），其等於病毒之融合前構象中保持為非共價結合（參見例如Tortorici, et al.，Nat. Struc. Mol. Biol.，26：481-489（2019））。S1子單元包含四個結構域NTD、RBD、SD1及SD2，其中NTD與RBD受連接序列(linker sequence)分隔，如圖13中所呈現。於些許實施例中，SARS-CoV-2免疫作用載體亦可或替代性地包含一多核苷酸，其可導致該等S1結構域之至少一者或兩者（NTD和/或RBD）表現於細胞中或做為該全長S蛋白（具有或不具有跨膜結構域）一部分，且，於些許較佳實施例中，該相同物之一免疫原性片段可針對上述唾液酸與/或ACE2，誘發可干擾S蛋白結合（例如，針對S1 RDB與/或NTD結構域之一抗體）之一免疫反應，進而干擾SARS-CoV-2進入宿主細胞及/或其對ACE2之作用。於些許實施例中，SARS-CoV-2免疫載體亦可或替代性地包含一多核苷酸，其可導致一蛋白（例如，一抗體或其片段、或一胜肽（例如，ACE2模擬(mimic)，RBD結合胜肽））表現於細胞中，該蛋白可結合至S蛋白（例如S1 RDB及/或其NTD結構域、及/或S2），進而干擾SARS-CoV-2進入宿主細胞（例如，阻斷S蛋白與其宿主細胞受體如ACE2之結合）及/或其對ACE2之作用（統稱為「RBD結合媒介(RBD binding agent)」）。於些許實施例中，RBD結合媒介係可為具有至少一個對應於ACE2病毒結合結構域之結構域的胜肽，例如，構象上匹配RBD之胜肽。於些許實施例中，該SARS-CoV-2免疫作用載體亦可或替代性地包含一多核苷酸，其可導致可與ACE2結合（例如，ACE2結合媒介）及/或防止S蛋白（例如，S1 RDB及/或其NTD結構域，以及/或S2，可表現為游離蛋白）與其附著之一蛋白表現於細胞中，進而干擾SARS-CoV-2進入宿主細胞及/或其對ACE2之作用，較佳者係不干擾ACE2之正常生理機能（即，除其充當SARS-CoV-2受體之能力以外）。於些許實施例中，此種ACE2結合媒介係可為一胜肽，例如干擾SARS-CoV-2與ACE2結合之胜肽。於些許實施例中，該SARS-CoV-2免疫作用載體可包含一種或多種多核苷酸，其可同時編碼RBD結合媒介與ACE2結合媒介，以及/或一雙重RBD結合與ACE2結合媒介。於較佳實施例中，RBD結合媒介與/或ACE2結合媒介於ACE2之15個殘基（24（Q）、27（T）、30（D）、31（K）、34（H）、35（E）、37（E）、38（D）、41（Y）、及42（Q）係於α1中，一殘基（殘基82 M）來自α2，殘基353（K）、354（G）、355（D）、及357（R）來自β3與β4間之連接序列）中的一個或多個殘基處干擾ACE2與RBD之相互作用，該等殘基目前經認為可與RBD交互作用(Han, et al.，April 14, 2020；Yan, et al.，Science 367：1444−1448（2020））；較佳者係不影響ACE2蛋白之正常生理功能（除其充當SARS-CoV-2受體之能力以外）。因此，於些許實施例中，本發明揭露之SARS-CoV-2免疫作用載體可包含一種或多種多核苷酸，其可編碼可結合ACE2受體並阻斷其在免疫力外添加額外活性之分泌抗原（例如S1、NTD、RBD、ACE2結合媒介）。
病毒載體佐劑 (Adjuvant)
於些許實施例中，SARS-CoV-2免疫載體亦可或替代性地包含至少一種多核苷酸，其可編碼改善或增強載體免疫原性（例如，做為佐劑（例如一分子佐劑））之多胜肽與/或胜肽，該免疫原性係由宿主細胞所表現並有助於誘導抗SARS-CoV-2免疫反應，以及/或增強進行中之抗SARS-CoV-2免疫反應，該等免疫反應係由對宿主施用載體（例如，於較佳實施例中未誘發可能干擾患者自SARS-CoV-2感染中恢復之全身性炎症反應）之結果。例如，於些許實施例中， SARS-CoV-2免疫作用載體可編碼以下一者或多者：1）可發揮如「共刺激」成分作用之多胜肽或胜肽，例如，可結合CD28家族成員（即CD28，ICOS； Hutloff, et al.，Nature 1999，397：263–265；Peach, et al.，J Exp Med 1994，180：2049–2058）之多胜肽或胜肽，例如CD28結合多胜肽B7.1（CD80；Schwartz 1992；Chen et al, 1992；Ellis, et al.，J. Immunol.，156（8）：2700-9）及B7.2（CD86；Ellis, et al.，J. Immunol，156（8）：2700-9）；整合素(integrin)家族成員（即LFA-1（CD11a/CD18）；Sedwick, et al.，J Immunol 1999，162：1367–1375；Wülfing, et al.，Science 1998，282：2266–2269；Lub, et al.，Immunol Today 1995，16：479–483），其包含ICAM家族成員（即ICAM-1、-2或-3）；CD2家族成員（即CD2，信號淋巴細胞活化分子（CDw150或「SLAM」；Aversa, et al.，J Immunol 1997，158：4036–4044），如CD58（(LFA-3；CD2 配位基；Davis, et al.，Immunol Today 1996，17：177–187)或SLAM配體（Sayos, et al.，Nature 1998，395：462–469）；耐熱抗原（HAS或CD24；Zhou, et al.，Eur J Immunol 1997，27：2524–2528）；TNF受體（TNFR）家族成員（即4-1BB（CD137；Vinay, et al.，Semin Immunol 1998，10：481–489）、OX40（CD134；Weinberg, et al.，Semin Immunol 1998，10：471–480；Higgins, et al.，J Immunol 1999，162：486–493）、以及CD27（Lens, et al.，Semin Immunol 1998，10：491–499）），例如4-1BBL（4-1BB配體；Vinay, et al.，Semin Immunol 1998，10：481–48：DeBenedette, et al.，J Immunol 1997，158：551–559）、TNFR關聯因子-1（TRAF-1；4-1BB配體；Saoulli, et al.，J Exp Med 1998，187：1849–1862，Arch, et al.，Mol Cell Biol 1998，18：558–565）、TRAF-2（4-1BB及OX40配體；Saoulli, et al.，J Exp Med 1998，187：1849–1862；Oshima, et al. ，Int Immunol 1998，10：517–526，Kawamata, et al. ，J Biol Chem 1998，273：5808–5814）、TRAF-3（4-1BB及OX40配體；Arch, et al.，Mol Cell Biol 1998，18：558–565；Jang, et al.，Biochem Biophys Res Commun 1998，242：613–620；Kawamata S, et al.，J Biol Chem 1998，273：5808–5814）、OX40L（OX40配位體；Gramaglia, et al.，J Immunol 1998，161：6510–6517）、TRAF-5（OX40配位體；Arch, et al.，Mol Cell Biol 1998，18：558–565；Kawamata, et al.，J Biol Chem 1998，273：5808–5814）、以及CD70（CD27配位體；Couderc, et al.，Cancer Gene Ther.，5（3）：163-75）、CD154（CD40配位體或「CD40L」；Gurunathan, et al.，J. Immunol.,  1998，161：4563-4571；Sine, et al.，Hum. Gene Ther. ，2001，12：1091-1102）；2）一種或多種細胞激素(cytokine)（例如，如Ohs et al.，PLos One，8(12)：e82528（Dec. 2013）所述之逆轉錄病毒），例如介白素-2（IL-2）（Rosenberg, et al.，Nature Med. 4：321-327（1998））、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12（Harries, et al.，J. Gene Med. 2000 Jul-Aug；2（4）：243-9；Rao, et al.，J. Immunol. 156：3357-3365（1996））、IL-15（Xin, et al.，Vaccine，17:858-866, 1999）、IL-16（Cruikshank, et al.，J. Leuk Biol. 67（6）：757-66, 2000）、IL-18（J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2001.，127（12）：718-726）、GM-CSF（CSF（Disis, et al.，Blood, 88：202-210（1996））、IL-23、腫瘤壞死因子-alpha（TNF-α）、或干擾素（如干擾素-gamma（INF-γ））；3）趨化因子(chemokine)，例如與腫瘤自身抗原融合之包含CXCL10（IP-10）及CCL7（MCP-3）的融合蛋白，其已經證明可誘導抗腫瘤免疫力（Biragyn, et al.，Nature Biotech. 1999，17：253-258）、CCL3（MIP-1α）、及/或CCL5（RANTES）（Boyer, et al.，Vaccine，1999，17（Supp. 2）：S53-S64）；4）免疫抑制蛋白及/或胜肽，例如抗CTLA-4試劑（Shrikant, et al.，Immunity，1996, 14：145-155；Sutmuller, et al.，J. Exp. Med. ，2001，194：823-832）、抗CD25試劑（Sutmuller, supra）、抗CD4試劑（Matsui, et al.，J. Immunol. ，1999，163：184-193）、融合蛋白IL13Rα2-Fc（Terabe, et al.，Nature Immunol. ，2000，1：515-520）、抗細胞激素試劑（如，抗體或其片段，例如抗IL6、抗IL6受體、抗IL17（如BMS-945429（ALD518）、clazakizumab、dupilumab、elsilimomab、olokizumab（CDP6038）、siltuximab（Sylvant）、sirukumab（CNTO 136）、toclizumab（Actemra）；亦參見本發明表4所列用劑）；5）一種或多種TLR促效劑(agonist)（LPS模擬 7-mer胜肽（TLR4促效劑；如，Gln Glu Ile Asn Ser Ser Tyr（SEQ ID NO：463）（RS01）；Ser His Pro Arg Leu Ser Ala（SEQ ID NO：464）（RS02）；Ser Met Pro Asn Pro Met Val（SEQ ID NO：465）（RS03）；Gly Leu Gln Gln Val Leu Leu（SEQ ID NO：466）（RS04）；His Glu Leu Ser Val Leu Leu（SEQ ID NO：467）（RS05）；Tyr Ala Pro Gln Arg Leu Pro（SEQ ID NO：468）（RS06）；Thr Pro Arg Thr Leu Pro Thr（SEQ ID NO：469）（RS07）；Ala Pro Val His Ser Ser Ile（SEQ ID NO：470）（RS08）；Ala Pro Pro His Ala Leu Ser（SEQ ID NO：471）（RS09）；Thr Phe Ser Asn Arg Phe Ile（SEQ ID NO：472）（RS10）；Val Val Pro Thr Pro Pro Tyr（SEQ ID NO：473）（RS11）；以及Glu Leu Ala Pro Asp Ser Pro（SEQ ID NO：474）（RS12））；或Flagellin（TLR5促效劑（e.g., FliC；Skountzou, et al.，Vaccine， May 28；28（24）：4103–4112（2010））；如，S1具有整合TLR促效劑序列之次單元（Kim et al.，EBioMedicine（2020））；以及其等之組合。如所屬技術領域中具有通常知識者可理解，本發明亦將使用其他種類之分子佐劑納入考量。
製劑
於些許實施例中，可針對人類受試者進行密碼子優化，且包含並表現SARS-CoV-2棘狀（S）抗原或其免疫原性片段之本複製缺陷型腺病毒載體，係可與其他冠狀病毒抗原（例如表現病毒載體之抗原）組合以形成多價冠狀病毒藥用製劑。可包括其他成分以誘導對於與本發明包含棘狀蛋白抗原之腺病毒載體中呈現不同抗原決定位之抗體的體液反應。於其他實施例中，可包括該等其他組分以誘導免疫系統之不同部分，例如對冠狀病毒抗原之細胞介導或黏膜免疫反應。
於本發明提供之些許實施例中，係為適於鼻內給藥予人類受試者之單價或多價冠狀病毒藥用製劑，包含：一有效量的至少107 個病毒顆粒（vp）或感染單位（ifu）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu）之rdAd載體（即一個或多個SARS-CoV-2載體）；以及一藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑、及/或載體。於些許實施例中，rdAd載體包含並表現針對人類受試者密碼子優化之SARS-CoV-2棘狀抗原或其免疫原性片段；以及一藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑和/或載體。於些許實施例中，該有效量可誘導保護性免疫反應，其係用以向人類受試者提供血清、黏膜保護或細胞保護（例如根據如T細胞之細胞免疫反應）至少1個月（例如28天或4週）、至少2個月、至少3個月、至少6個月、至少8個月、至少12個月、至少13個月、或至少14個月以抵抗SARS-CoV-2感染。該至少一個月至至少14個月之期間可視為保護期。於些許實施例中，保護性免疫反應包括黏膜、體液及/或T細胞反應之組合。於實施例中，係透過單次鼻內劑量誘導保護性免疫反應。於替代性實施例中，係透過兩次或更多刺鼻內劑量，例如一初打藥劑，隨後約2至3週後追加一加強藥劑，以誘導保護性免疫反應。
於本發明提供之示例性實施例中，係為鼻內給藥予人類受試者之SARS-CoV-2免疫原性組合物（例如，疫苗）藥用製劑，包含：一有效量之至少107 個病毒顆粒（vp）或感染單位（ifu）（例如至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu）之一複製缺陷型腺病毒載體，其包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，其編碼針對人類受試者密碼子優化之至少SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）或其至少一免疫原性片段，其中該組合物經配置以誘導針對該人類受試者體內誘導中和抗體至該棘狀蛋白RBD；以及一藥學上可接受之稀釋劑或載體。
關於劑量、給藥途徑、製劑、佐劑以及對於重組病毒及其表達產物之用途，本發明之組合物可透過腸胃外、局部或黏膜給藥，較佳者係透過皮內、皮下、鼻內或肌內途徑。當使用黏膜給藥時，可以利用口部、眼部或鼻部途徑。於示例性實施例中，本發明之免疫原性組合物（例如疫苗）係經鼻內給藥。於示例性實施例中，本發明之免疫原性組合物（例如疫苗）係經鼻內給藥予哺乳動物受試者。於些許實施例中，可以使用如微針之一裝置（例如Kim et al. EBioMedicine， 00 (2020)中所述）施用該SARS-CoV-2免疫原性組合物。
包含相關腺病毒載體之免疫原性組合物（例如，製劑）可根據藥學或獸醫學領域中具有通常知識者所習知之標準技術製備。參見範例1及2。此種製劑係可透過將例如年齡、性別、體重及施用途徑等因素納入考量，以臨床領域中具有通常知識者習知之劑量與技術施用。該等製劑係可單獨施用（即做為單一活性用劑）或可與組合物如「其他」免疫原性組合物或減毒、滅活、重組免疫原性組合物（例如，疫苗）或治療組合物共同或連續施用，進而提供本發明之多價或「雞尾酒」或組合性組合物以及使用其等之方法。於些許實施例中，該等製劑可包含蔗糖做為低溫保護劑與聚山梨醇酯-80（polysorbate-80）做為非離子型介面活性劑。於些許實施例中，該等製劑進一步包含自由基氧化抑製劑乙醇與組胺酸、金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）或具有類似活性之其他用劑（例如，阻斷或防止金屬離子催化之自由基氧化作用）。
該等組合物（例如製劑）可以懸浮液存在於用於如口部、鼻部、眼部等黏膜施用製劑之液體製劑中，以及如無菌懸浮液或乳劑等腸胃外、皮下、皮內、肌內、靜脈內（ 例如可注射施用）施用製劑。於此類製劑中，腺病毒載體可與合適之載體、稀釋劑或賦形劑如無菌水、生理食鹽水、增黏賦形劑等混合。可使用些許用於黏膜施用之專門製劑，包括黏膜黏附劑、黏膜滲透劑與黏膜破壞劑。該等製劑亦可經凍乾或冷凍。根據施用途徑與所期望製劑，該等製劑可包含輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑、佐劑、防腐劑等。該等製劑可包含至少一種佐劑化合物。於示例性實施例中，本發明之免疫原性組合物（例如疫苗）係為不含佐劑。可以參考標準文本，例如「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE」，第17版，1985，其係以引用方式併入本發明，以製備合適之製劑，而無需進行過度實驗。
於些許實施例中，腺病毒載體之一有效量（例如，可誘導保護性免疫反應之量）係為至少107 個病毒顆粒（vp）或傳染單位（ifu）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu）之含有並表達冠狀病毒棘狀蛋白抗原或其片段之複製缺陷型腺病毒載體，其等係對於人類經過密碼子優化。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者可理解，密碼子優化可改善宿主生物中異源基因之表現。
於較佳實施例中，一「有效量」之腺病毒載體與/或免疫原性組合物係以足以誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如體液、黏膜與/或細胞介導之免疫反應）之形式、劑量與/或施用方案給予宿主，其於些許實施例中可對於SARS-CoV-2感染（與/或CoV疾病進程）之影響具有保護性。於些許實施例中，例如於本發明範例中所描述者，受對其施用有效量之宿主可表現出對抗SARS-CoV-2抗體產生細胞（例如B細胞、漿細胞）之誘導效果（例如使其出現）與/或數量與/或功能上之增加，該等細胞可產生可結合CoV與/或其抗原（或免疫原）之抗體，例如SARS-CoV-2特異性免疫球蛋白G（IgG）反應。於些許實施例中，例如於本發明範例中所描述者，受對其施用有效量之宿主可表現出對於可形成抗SARS-CoV-2細胞介導反應（例如，T細胞、顆粒球、自然殺手（NK）細胞等）之細胞的誘導效果（例如使其出現）與/或數量與/或功能上之增加。於些許實施例中，受對其施用有效量之宿主可表現出對於抗SARS-CoV-2抗體產生細胞與可形成抗SARS-CoV-2細胞介導反應之細胞的誘導效果（例如使其出現）與/或數量與/或功能上之增加。
為確定受對其施用有效量之宿主是否表現出對於抗SARS-CoV-2抗體產生細胞的誘導效果（例如使其出現）與/或數量與/或功能上之增加，於些許實施例中，可使用產生SARS-CoV-2 -特異性酵素連結免疫吸附分析法（ELISA）。如使用鼠科模型之實施例所示，於施用一免疫原性組合物後（例如，於施用後21天），小鼠可經放血以提供用於利用SARS-CoV-2特異性ELISA確定全身性抗體反應存在之樣本（例如以確定SARS-CoV-2特異性IgG反應是否已產生）。簡言之，可透過於碳酸鈉緩衝液（pH 9.3）中以1 µg/ml之SARS-CoV-2 S蛋白在4°C下將聚苯乙烯96孔盤塗覆隔夜，以進行ELISA。培養盤可經洗滌（例如，於含有0.02% Tween 20之PBS中洗滌3次），隨後經阻隔（例如使用脫脂奶粉）適當之時間與溫度（例如以含有2% BSA與0.02% Tween 20的PBS於37°C下達1小時）。可對經接種hAd5-SARS-CoV-2之小鼠血清連續稀釋（例如於PBS中），並於適當溫度與時間（例如37°C）下培養、洗滌（例如以含0.02% Tween 20之PBS洗滌四次），再與一經標記二級抗體（例如，生物素標記之山羊抗小鼠二級抗體）培養適當時間（例如，一小時）。樣本隨後可經洗滌並以適當藥劑（例如，與HRP共軛之鏈親和素）共同培養，並使用適當藥劑（例如，四甲基聯苯胺底物）顯影，透過添加適當的藥劑（例如，2N H2 SO4 ）中止反應，並使用微量盤檢測儀發射（450 nm）讀取。於些許實施例中，對宿主以一有效量施用包含編碼一種或多種CoV抗原（例如棘狀蛋白）之腺病毒載體的免疫原性組合物，可導致特定種類（例如IgA、IgM、IgG）與/或數量（例如，表示某種反應之特定倒數平均終點）之SARS-CoV-2特異性（例如CoV S蛋白特異性）抗體的表現（例如，與未施用宿主相比）。亦可使用其他測定系統以確定是否已施用一有效量，其例如但不限於中和抗體測定法。
為確定受對其施用一有效量之宿主是否表現對於形成抗SARS-CoV-2細胞介導反應之細胞的誘導作用（例如使其出現）與/或細胞數量與/或功能之增加，可使用細胞類型與/或數量與/或細胞激素表現與/或功能測定法。例如，於些許實施例中，可分離與研究經施用免疫原性組合物之宿主的T細胞（例如，與其他細胞物理分離與/或存在於例如血液等生物樣本）。於些許實施例中，可進行細胞內細胞激素染色測定法，以確定表現特定細胞激素之細胞類型與/或數量，以及/或於其中所表現此種細胞激素之濃度。簡言之，可於施用後（例如，施用後8至21天）於特定時點分離經施用免疫原性組合物之宿主的生物樣本（例如，血液、脾臟）。而後，可將自所述生物樣本中分離之細胞（例如，於細胞培養液（例如，含有10%FBS及HEPES之RPMI）中中大約106 個細胞）鋪於培養板（例如，圓底96孔盤）中，於存在刺激物（例如10 μg/ ml之brefeldin A與α-CD3（2C11 clone）或10 μg CoV胜肽（例如90%DMSO中之棘狀抗原SARS-CoV-2胜肽（SEQ ID NO 3）中之一種或多種）的情況下，在適當時間、溫度等條件下進行刺激（例如於37°C、5%之CO2下進行6小時）。於CoV胜肽刺激後，細胞可經洗滌（例如以磷酸鹽緩衝液（PBS）洗滌一次）並針對以下指示細胞類型之細胞表面標記進行染色（例如，α-CD8-PerCP-Cy 5.5（clone 53-6.7）、α-CD3-AF700（clone 500A2）與α-CD19- BV605（clone 1D3））。而後可將細胞固定（例如，使用福馬林）、透化、對細胞內細胞激素標記物（例如，α-IFN-γ-APC（clone B27））染色，並透過流式細胞儀進行分析（例如，使用Attune-NXT）。於些許實施例中，一有效量可為免疫原性組合物之數量，以增加表現細胞激素之細胞數量（例如IFN-γ）及/或由此種細胞表現之量。
於些許實施例中，抗SARS-CoV-2免疫反應係具有保護性，意即其可保護宿主免受SARS-CoV-2感染之一種或多種症狀。於一實施例中，一保護性免疫反應可預防SARS-CoV-2感染，其可透過對於受施用該有效量之宿主發動之攻擊來證明。於一實施例中，具有保護性之免疫原性組合物與/或其一有效量者係為一疫苗。為確定免疫原性組合物是否具有保護性，可使用臨床前動物模型。例如，於一實施例中，可向易感染與生病之小鼠施用一SARS-CoV-2免疫原性組合物，並可以於一後續時間（例如施用後之7至21天）以活SARS-CoV-2攻擊小鼠，並監測其控制組相比較之生存率與/或症狀。亦可監測SARS-CoV-2感染之症狀，包括疾病之臨床體徵（例如，上下呼吸道症狀）。因此，於些許實施例中，為確定hAd5-SARS-CoV-2免疫原性組合物是否具有保護性（即，為疫苗），本發明所屬技術領域中具有通常知識者可進行動物攻擊研究。
於些許實施例中，於一動物模型接種疫苗後進行測定中和抗體效價之測定法，例如溶斑減少中和試驗（PRNT）或灶點減少中和測試（FRNT），其將證明保護性免疫反應之誘導作用。於此情況下，自接種疫苗（例如hAd5-SARS-CoV-2）後之動物採集血清或其他生物液體，並與SARS-CoV-2懸浮液混合並培養一段時間，使血清抗體與SARS-CoV-2反應。將血清抗體/SARS-CoV-2混合物澆淋於宿主（即SARS-CoV-2允許）細胞之融合單層上。該細胞層表面係覆蓋一層瓊脂或羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose），以防止SARS-CoV-2病毒任意擴散。溶斑形成單位（pfu）之濃度可透過數天後所形成之溶斑數量（受感染細胞之區域）進行估計。溶斑形成單位可透過顯微鏡觀察、與受感染細胞反應之螢光抗體或特定染料測量。與無血清病毒相比，將溶斑數量減少50%之血清濃度可衡量有多少中和抗體存在或其有效性（即保護性）為何。此測量值係表示為PRNT50 值。此外，於一FRNT測定中，可使用抗體標記將病毒可視化以相似地計算FRNT50 。使用偽病毒中和測定法或ACE-2結合抑制測定法之其他方法係可用於對SARS-CoV-2中和抗體之存在進行定量。
於些許實施例中，本發明之免疫原性組合物（例如疫苗）包含之一有效量為約107 個病毒顆粒（vp）或傳染單位（ifu）（例如至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu）之複製缺陷型腺病毒載體。在示例性實施例中，本發明之免疫原性組合物（例如疫苗）包含一有效量為約108 個病毒顆粒（vp）之複製缺陷型腺病毒載體。於些許其他示例性實施例中，本發明之免疫原性組合物（例如疫苗）包含一有效量為約109 個病毒顆粒（vp）之複製缺陷型腺病毒載體。於些許其他示例性實施例中，本發明之免疫原性組合物（例如疫苗）包含一有效量為約1010 個或更多病毒顆粒（vp）之複製缺陷型腺病毒載體。於些許其他示例性實施例中，本發明之免疫原性組合物（例如疫苗）包含一有效量為約1011 個或更多病毒顆粒（vp）之複製缺陷型腺病毒載體。於些許實施例中，哺乳動物係為用於陪伴或馴養或生產食物或生產飼料或家畜或遊戲或競速或運動之一動物，例如牛、狗、貓、山羊、綿羊、兔子、或豬或馬，或甚至為家禽如火雞、鴨或雞。於示例性實施例中，該哺乳動物受試者係為人類。
使用方法
本發明提供誘導抵抗冠狀病毒之免疫反應的方法，該方法包含向哺乳動物受試者施用一有效量之SARS-CoV-2免疫原性組合物。於些許實施例中，係提供用於經鼻黏膜施用一藥物劑量之本發明治療性/免疫原性組合物（例如疫苗）的方法，該組合物係經配置以透過鼻內給藥以誘導免疫反應（例如，做為疫苗之保護性免疫反應）。於些許實施例中，本發明之免疫原性組合物包含複製缺陷型腺病毒載體，包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，該編碼序列編碼至少一冠狀病毒抗原或其至少一免疫原性片段，其中，該編碼序列編碼至少一個或多個B細胞抗原決定位、一個或多個CD8+ T細胞抗原決定位、及/或一個或多個CD4 + T細胞抗原決定位。於示例性實施例中，該哺乳動物受試者係為人類，且該冠狀病毒抗原係來自SARS-CoV-2。於些許實施例中，該哺乳動物受試者係為受SARS-CoV-2感染之人類（例如住院之人類）。於些許實施例中，該SARS-CoV-2免疫原性組合物可用於治療SARS-CoV-2感染（例如，於此種感染與/或住院之人體內）。
於些許實施例中，本發明之方法可包括向哺乳動物（較佳者為人類）施用本發明揭露內容之一種或多種免疫原性組合物，以誘導一抗SARS-CoV-2免疫反應，較佳者為統計上顯著之抗SARS-CoV-2免疫反應；誘導保護性與/或治癒性抗SARS-CoV-2免疫反應；誘導具有可接受安全性之抗SARS-CoV-2免疫反應；給予針對SARS-CoV-2之預防性治療；降低早期發作COVID-19之患者的重症加護病房（ICU）入住率與機械換氣需求率；降低需住院之早期發作COVID-19患者之COVID-19嚴重程度；於SARS-CoV-2感染期間抑制、壓抑與/或預防「細胞激素風暴」之發展（於較佳實施例中，將一種或多種免疫原性組合物與一種或多種抗細胞激素試劑共同施用）；於患有COVID-19之患者（即感染SARS-CoV-2之患者）體內顯著降低（與安慰劑控制組相比）IL-1α、IL-6、及/或IL-12p70，以及/或肺間質炎症；加快感染SARS-CoV-2之患者（例如住院患者）的臨床改善與/或康復時間；誘導抗SARS-CoV-2中和抗體（於較佳實施例中為IgG與/或IgA）；誘導抗SARS-CoV-2 T細胞免疫性（例如全身性與/或黏膜性）；誘導骨髓與肺駐留記憶抗體分泌細胞；誘導有效且/或可受測得長達至少4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、或至少約12個月之免疫反應（例如中和抗體與/或T細胞免疫）；以及/或在不會引起針對該腺病毒載體本身之顯著免疫反應的情況下提供重複施用（例如，做為大約每11至14個月施用一次之季節性疫苗）。
當搭配或不搭配佐劑使用時，該免疫原性組合物（例如，Ad載體SARS-CoV-2疫苗）之劑量可介於約107 至約1012 個感染單位或溶斑形成單位（ifu或pfu）之範圍內，或該劑量單位係可為病毒顆粒（vp），其中1 vp等於約1至100 ifu或pfu。於一實施例中，施用予哺乳動物受試者之Ad載體SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗之劑量為約或至少約107 vp或感染單位（ifu）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu）。於另一態樣中，施用予哺乳動物受試者之Ad載體SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗之劑量為約或至少約108 vp。於另一態樣中，施用予哺乳動物受試者之Ad載體SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗之劑量為約或至少約109 vp。於另一態樣中，施用予哺乳動物受試者之Ad載體SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗之劑量為約或至少約1010 vp。於另一態樣中，施用予哺乳動物受試者之Ad載體SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗之劑量為約或至少約1011 vp。於另一態樣中，施用予哺乳動物受試者之Ad載體SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗之劑量為約或至少約1012 vp。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者理解，針對較大之動物，例如人、狗、豬、非人靈長類、鼬、雪貂、貓、馬/馬科等，可按比例縮放對於小鼠之有效劑量；且此等較大動物係為根據本發明揭露內容施用之對象。以此方式，通過異速生長定標（allometric scaling）（也稱為生物學定標（biological scaling）），可自小鼠之劑量推斷出較大動物之劑量，以獲得根據動物體重或體表面積之等效劑量。
於些許實施例中，該Ad載體SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗之非侵入性施用包括但不限於局部施用於皮膚，以及/或鼻內與/或黏膜與/或舌部與/或頰部與/或口部與/或口腔施用。用以應用Ad載體SARS-CoV-2免疫原性組合物或疫苗之劑型可包括液體劑、軟膏劑、粉劑與噴霧劑。可於無菌條件下將活性成分與生理上可接受之載體及可能需要知任何防腐劑、緩衝劑、推進劑、或吸收促進劑混合。
於些許實施例中，本發明提供對人類受試者經黏膜施用一治療劑量之非複製型病毒載體免疫原性組合物（例如疫苗）的方法，其中，該方法包括對人類受試者鼻內給藥該免疫原性組合物（例如疫苗），其包含一有效量為至少107 個病毒顆粒（vp）或傳染單位（ifu）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu）之複製缺陷型腺病毒載體，其含有並表現針對哺乳動物受試者經密碼子優化之異源SARS-CoV-2抗原；藉此該經黏膜施用之治療劑量可誘導保護性免疫反應。
於實施例中，對於（經）黏膜施用之組合物形式與施用係可為擠壓噴霧分配器、泵分配器、多劑量分配器、滴管型分配器或氣溶膠分配器，並以此等方式進行分配。此類分配器亦可用於將組合物遞送至口部或口腔（例如頰部或舌部）黏膜。氣溶膠通常係利用烴處於壓力狀態下。泵分配器較佳者可分配經計量或具有特定粒度之劑量。氣溶膠顆粒/液滴尺寸之分布係可用以下各種形式表現：質量中位數空氣動力學直徑（MMAD），即於該液滴尺寸下，氣溶膠質量之一半係包含於較小液滴中，一半係包含於較大液滴中；體積平均直徑（VMD）；質量中位數直徑（MMD）；或細顆粒分數（FPF），即直徑之顆粒百分比小於5 um。此等測量係可透過緊壓（MMD和MMAD）或透過雷射（VMD）進行。就液體顆粒而言，若可維持環境條件（例如標準濕度），則VMD、MMD與MMAD係可能相同。然而，若未保持濕度，由於撞擊器測量期間之脫水作用，MMD與MMAD之測定結果將小於VMD。為便於說明，VMD、MMD與MMAD之測量係經視為於標準條件下進行，因此VMD、MMD與MMAD之描述係可相互比較。質量中位數空氣動力學直徑（MMAD）大於約5微米之顆粒通常無法到達肺部；相反地，若透過口不施用，其等往往可撞擊喉嚨後方，並經吞嚥而可能透過口服吸收；此外，此等大小之顆粒經鼻部施用將滯留於鼻黏膜中。直徑約1至約5微米之顆粒夠小，可到達上肺至中肺部區域（傳導氣道），但卻又過大而無法到達肺泡。較小之顆粒，即約0.5至約2微米者，可到達肺泡區域。直徑小於約0.5微米之顆粒亦可透過沉澱沉積於肺泡區域中，縱使極小之顆粒可能被呼氣攜出。根據是否欲對鼻黏膜或對肺部上部至中部區域或對肺泡內進行黏膜施用，所屬技術領域中具有通常知識者可根據本發明揭露內容與本領域知識實現任何或所有此等目標。此外，對於鼻內給藥，係可有利地使用霧化器裝置，例如取自Teleflex LLC之LMA MAD300（鼻內黏膜霧化裝置LMATM #MAD300無注射器鼻用裝置，其長度為1.65英寸，尖端直徑為0.17英寸）。於本發明之實施中可有利地使用將典型粒徑為約30至約100微米之薄霧遞送至嗅覺器官黏膜或鼻黏膜，之氣溶膠裝置或分配器，例如霧化器，且有利於鼻內實施本發明揭露製劑之液滴尺寸係可為約30至約100微米，例如約30或約40或約50至約60或約70或約80或約90或約100微米。
於實施例中，本發明之SARS-CoV-2藥用製劑係用以提供針對季節性冠狀病毒之保護。於些許其他實施例中，本發明之CoV藥用製劑係用以提供針對流行性SARS-CoV-2之保護。於些許其他實施例中，本發明之SARS-CoV-2藥用製劑係用以提供針對SARS-CoV-2的保護。於實施例中，血清保護可持續至少約1個月、2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、12個月或至少約13個月。
於些許實施例中，係提供一種誘導抵抗冠狀病毒之免疫反應的方法，該方法包括對哺乳動物受試者（例如人類）施用單次劑量之本發明免疫原性組合物(composition)/製劑(formulation)/劑量(dosage)。於些許實施例中，該方法包括對哺乳動物受試者鼻內給藥一有效量之免疫原性組合物，其中，該免疫反應提供針對SARS-CoV-2攻擊之保護。於些許實施例中，係提供一種在人類受試者體內誘導抵抗冠狀病毒之黏膜、體液及/或T細胞之聯合保護性免疫反應的方法，包括對人類受試者鼻內給藥單次劑量之SARS-CoV-2藥用製劑（免疫原性組合物）或其之一藥用劑量，其中，該施用可誘導抵抗冠狀病毒之血清抗體、黏膜抗體及T細胞。於實施例中，人類受試者受到血清保護至少約1個月、2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、12個月或至少約13個月。於些許實施例中，人類受試者受血清保護至少約9個月。
於替代性實施例中，係提供一種誘導抵抗冠狀病毒之免疫反應的方法，其中，該方法包含施用至少初打與加強藥劑之本發明免疫原性組合物/製劑/劑量。於些許實施例中，該加強藥劑係於初次施藥約2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15。週、16週、17週、18週、19週、20週、21週、22週、23週、24週、25週、26週、27週、28週、29週、30週、31週、 32週、33週、34週、35週、36週、37週、38週、39週、40週、41週、42週、43週、44週、45週、46週、47週、48週、49週、50週、51週或52週後施用。
於實施例中，初打加強藥劑係為同源，意即其等係為相同製劑。於些許實施例中，所提供之方法與組合物包括施用異源免疫原性組合物或疫苗之初打藥劑與加強藥劑，進而誘導免疫反應（例如T細胞、體液與/或黏膜），其中「異源」係指初打藥劑係不同於加強藥劑，但前提係二者均包含SARS-Cov-2抗原抗原決定位中之至少一個或多個。於些許實施例中，此意指初打藥劑與加強藥劑，其中，抗原/免疫原/胜肽係透過不同之遞送載體（carrier）與/或載體（vector）傳遞予免疫系統。如本發明中所用，「異源施藥方案」係指初打藥劑與加強藥劑，其中抗原/免疫原/胜肽係透過不同之遞送載體（carrier）與/或載體（vector）傳遞予免疫系統。例如，於本發明中，一第一組合物（可做為初始藥劑或加強藥劑）包含病毒載體抗原或免疫原，而第二組合物（可做為初始藥劑或加強藥劑）包含碳氟連接胜肽，其中該胜肽包含與病毒載體抗原或免疫原共用之一個或多個T細胞抗原決定位。換言之，於些許實施例中，本發明之免疫原性組合物或疫苗組合係為兩種可誘導免疫原性組合物或疫苗組合物之不同T細胞，其中，各組合物可誘導抵抗相同抗原之抗原特異性CD8+ T細胞。於替代性實施例中，一第一組合物（可做為初始藥劑或加強藥劑）包含一病毒載體抗原或免疫原，而一第二組合物（可做為初始藥劑或加強藥劑）包含一RNA免疫原性組合物或疫苗組合物，例如一種包含於脂質體或脂質奈米顆粒中構成之一經修飾mRNA、一未經修飾mRNA或一自我複製mRNA之組合物、透過電穿孔或利用脂質基製劑施用之一DNA組合物、一活性減毒之免疫原性組合物或疫苗組合物、以佐劑或遞送系統與否構成之一蛋白質基組合物、一死亡免疫原性組合物或疫苗組合物、一如HAdV-1至57等不同腺病毒載體免疫原性組合物或疫苗組合物、一猴腺病毒或非腺病毒載體，例如但不限於腺相關病毒（AAV）、一慢病毒(lentivirus)或一痘病毒(poxvirus)。可先施用該第一組合物以局部或全身性引發免疫反應，而該第二免疫原性組合物或疫苗，如腺病毒，可做為加強藥劑經黏膜施用，以局部「吸引」經引發之免疫細胞，並以一抗原特異性方式對其等重新刺激。
於實施例中，初打與加強藥劑之施用係間隔至少7天、間隔至少14天或更長時間。於實施例中，初打藥劑與加強藥劑之施用係間隔約7天、間隔約14天、間隔約20天、間隔約25天、間隔約30天、間隔約35天、間隔約40天、間隔約45天、間隔約50天、間隔約55天、間隔約60天或間隔約65天。有利地而言，該等藥劑之施用係間隔約40天、間隔約41天、間隔約42天、間隔約43天、間隔約44天、間隔約45天、間隔約46天、間隔約47天、間隔約48天、間隔約49天或間隔約50天。於些許實施例中，初打藥劑與加強藥劑之施用係間隔約1週、間隔約2週、間隔約3週、間隔約4週、間隔約5週、間隔約6週、間隔約7週、間隔約8週、間隔約9週、間隔約10週、間隔約11週或間隔約12週。於些許其他實施例中，初打藥劑與加強藥劑之施用係間隔約1個月、間隔約2個月、間隔約3個月、間隔約4個月、間隔約5個月、間隔約6個月、間隔約7個月、間隔約8個月、間隔約9個月、間隔約10個月、間隔約11個月、或間隔約12個月。
於實施例中，該第一或第二免疫原性組合物或疫苗組合物係做為一初打及加強藥劑間隔至少7天、間隔至少14天或間隔更長時間施用。於實施例中，初打藥劑與加強藥劑之施用係間隔約7天、間隔約14天、間隔約20天、間隔約25天、間隔約30天、間隔約35天、間隔約40天、間隔約45天、間隔約50天、間隔約55天、間隔約60天或間隔約65天。有利地而言，該等劑量之施用係間隔約40天、間隔約41天、間隔約42天、間隔約43天、間隔約44天、間隔約45天、間隔約46天、間隔約47天、間隔約48天、間隔約49天或建隔約50天。於些許實施例中，該初打藥劑與加強藥劑之施用係間隔約1週、間隔約2週、間隔約3週、間隔約4週、間隔約5週、間隔約6週、間隔約7週、間隔約8週施、間隔約9週、間隔約10週、間隔約11週或間隔約12週。於些許其他實施例中，該初打藥劑與加強藥劑之施用係間隔約1個月、間隔約2個月、間隔約3個月、間隔約4個月、間隔約5個月、間隔約6個月、間隔約7個月、間隔約8個月、間隔約9個月、間隔約10個月、間隔約11個月或間隔約12個月。
於些許實施例中，rdAd抗SARS-CoV-2載體（例如SARS-CoV-2免疫原性組合物（其可以包含超過一種rdAd抗SARS-CoV-2載體））可與一種或多種抗細胞激素試劑共同施用。如範例2所示，將AdE施用予小鼠經顯示可降低已知與由如流感等病毒引起之傳染病進展與症狀相關之細胞激素表現。例如，AdE於施用予未感染之哺乳動物後，可引起單核球趨化蛋白（MCP-1（CCL2））、干擾素γ（IFN-γ）與RANTES（CCL5）之表現增加，其係可伴隨IL-12之表現降低。暴露於流感三天後，發現經施用AdE之動物的IL-1α、IL-6、IL-12、MCP-1表現降低，且IL-1α與IL-12係顯著降低。暴露於流感六天後，顯示動物的IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1與GM-CSF之表現降低，且巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1α（CCL3））與RANTES（CCL5）表現增加。此等結果係與SARS-CoV-2感染期間之「細胞激素風暴」發展相吻合。而後，於些許實施例中，為預防並/或治療SARS-CoV-2感染，可將SARS-CoV-2免疫原性組合物與一種或多種抗細胞激素試劑施用（共同施用）於哺乳動物，例如人類。此種共同施用係可做為單一混合物實施（例如，該SARS-CoV-2免疫原性組合物中可包括一種或多種抗細胞激素試劑），或做為獨立組合物實質上同時與/或於相同解剖點位上或附近施用，或透過一適當途徑（例如，鼻內給藥該SARS-CoV-2免疫原性組合物與皮內或靜脈內施用該一種或多種抗細胞激素試劑）施用於不同解剖點位，且其有效量係可根據各種類型之抗細胞激素試劑有所改變（此係為本領域所習知）。於些許實施例中，SARS-CoV-2免疫原性組合物可以一單劑形式施用，該一種或多種抗細胞激素試劑亦同。於些許實施例中，可於施用SARS-CoV-2組合物（於些許實施例中包括與該SARS-CoV-2組合物共同實施之初次施用）後多次施用該一種或多種抗細胞激素試劑（例如約隔7、14、21天中任一者，或約1、2或3個月中任一者）。因此，用於對哺乳動物施用以預防與/或治療SARS-CoV-2之抗細胞激素試劑範例可包括但不限於一種或多種抗IL-1α試劑、一種或多種抗IL-5試劑、一種或多種抗IL-6試劑、一種或多種抗IL-12試劑、一種或多種抗IL-17試劑、一種或多種抗MCP-1試劑、一種或多種抗TNF-α試劑、一種或多種抗GM-CSF試劑、及/或一種或多種抗RANTES試劑。於些許實施例中，該一種或多種抗細胞激素試劑可不包括一種或多種抗MIPα試劑及/或一種或多種抗RANTES試劑。如本發明所述用途之示例性抗細胞激素試劑可包括如表10中所示中之任一者。 [表10]
細胞激素 示例性抗細胞激素試劑
IL-1α anakinra (Kineret® )、canakinumab (Ilaris® )、rilonacept (Arcalyst® )
IL-5 mepolizumab (GlaxoSmithKline)；benralizumab (Fasenra)
IL-6 tocilzumab (Actemra) 、sarilumab (Kevzara) 、siltuximab (Sylvant)
IL-12 briakinumab (ABT-874，Abbott)；ustekinumab
IL-17 brodalumab (Siliq；Amgen) 、ixekizumab (Taltz® ，Eli Lilly) 、secukinumab (Cosentyx；Novartis)
TNF-α inflixibmab (Remicade) 、adalimumab (Humira) 、certolizumab pegol (Cimzia) 、golimumab (Simponi) 、etanercept (Enbrel) 、thalidomide (Immunoprin) 、lenalidomide (Revlimid) 、pomalidomide (Pomalyst，Imnovid) 、a xanthine derivative (如pentoxifylline) 、bupropion
GM-CSF otilimab (MOR103，GSK3196165)
於些許實施例中，亦可將一種或多種額外抗SARS-CoV-2藥劑於施用SARS-CoV-2免疫原性組合物之前、與其實質上同時或其之後施用予受試者，其係例如氯奎寧(chloroquine)（例如藥用鹽與/或其衍生物；例如羥氯奎寧(hydroxychloroquine)，每天400毫克共5天，或每天3次每次200毫克共10天）及/或亞茲索黴素(azithromycin)（例如，第一天500毫克，而後每天4次每次250毫克劑量）及/或瑞德西韋(remdesivir)（例如200毫克初打劑量，而後每天100毫克劑量）及/或一種或多種抗發炎藥（例如強體松(prednisone)、地塞松(甲基脫氫皮質固醇)(dexamethasone)）及/或任何其他合適藥劑。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者可理解，所屬技術領域中具有通常知識者所可取得之其他施用/劑量方案、抗細胞激素試劑、其等之組合、及與其他抗SARS-CoV-2藥劑之組合係可適用於本發明所揭露之用途。
於些許實施例中，可透過適當技術（例如，聚合酶連鎖反應（PCR）、鼻拭子檢測病毒顆粒）測試受試者（例如人類）之冠狀病毒感染。而後可將包含一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體（例如，做為病毒顆粒；SARS-CoV-2免疫原性組合物）之免疫原性組合物施予對冠狀病毒感染測試呈現陽性之個體。較佳者，此種施用係可於初次暴露於冠狀病毒後的七至十天內完成。於些許實施例中，可將包含一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體（例如，做為病毒顆粒）之一SARS-CoV-2免疫原性組合物施用予具有高度感染與/或症狀風險（例如呼吸道症狀、死亡）之個體，例如免疫力低下之個體與/或患有另一種病症（例如腎衰竭），以及/或處於高風險狀態之人（例如前往大流行地區、封閉空間如油輪），無論此等個體是否為冠狀病毒感染檢測陽性皆可。
於些許實施例中，可將本發明揭露之組合物施用予具有鼻孔之宿主，其中係使鼻孔向上（即，背側位置）傾斜，以透過鼻內給藥產生一強烈免疫原性反應。如所屬技術領域中具有通常知識者可理解，本發明中亦將其他施用方法與施藥策略納入考量。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供一種免疫原性組合物，包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，該rdAd載體：a）缺少編碼一外源性、非腺病毒抗原之編碼序列（例如AdE）；b）包括一基因表現匣，其包含編碼至少一種SARS-CoV-2抗原之編碼序列，其中，該抗原選擇性包含一SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）；c）包括一基因表現匣，其包含編碼除SARS-CoV-2以外之傳染源至少一種抗原的編碼序列（例如，AdD）；d）來自a）與b）載體之組合，其中該等載體係共同或分開施用；e）來自b）與c）之rdAd載體的組合，其中該等載體係共同或分開施用；f）於a）、b）或c）中任一項之任何rdAd載體的組合，其中該等rdAd載體係共同或分開施用；以及/或g）來自b）中兩種不同類型rdAd載體之組合，其中，各類型rdAd載體均包含一基因表現匣，其編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，該抗原不同於該組合中其他類型之rdAd載體所編碼者，其中該等rdAd載體係共同或分開施用；其中該免疫原性組合物經配置以於經施用該免疫原性組合物之哺乳動物受試者體內誘導抵抗SARS-CoV-2之中和抗體與/或細胞免疫反應。於些許實施例中，該免疫原性組合物可包含a）至c）中任兩種rdAd載體之組合，例如於一兩部分之組合物中，其包含至少一組合物，包含a）至c）中之rdAd載體，以及至少一第二組合物，包含不同的a）至c）中之rdAd載體。於些許實施例中，該基因表現匣包含一編碼序列，其編碼選自下列之至少一種SARS-CoV-2抗原：用於棘狀蛋白（S）蛋白或該棘狀蛋白之S1結構域的編碼序列；如SEQ ID NO：3所示之一序列，或與SEQ ID NO：3具有至少80%同源性之一序列；包含至少SEQ ID NO：3之胺基酸331至527；編碼一棘狀蛋白RBD序列，其包含一個或多個以下殘基（編號係對應於SEQ ID NO：3）：L455、F486、Q493、S494及/或N501，較佳者於些許實施例中為Q493與N501，較佳者於些許實施例中為選自Y455、F455或S455之殘基，較佳者於些許實施例中為選自L486或P486之殘基，較佳者於些許實施例中為選自N493、R493或K493之殘基，較佳者於些許實施例中為選自D494或G494之的殘基，較佳者於些許實施例中為選自T501或S501之殘基；包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14之胺基酸序列，較佳者為SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：446；SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476或460中任一者；或其之一免疫原性片段；包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17之胺基酸序列，其中，胺基酸455係選自Y、F、L或S；胺基酸486係選自L、F或P；胺基酸493係選自N、Q、R或K；胺基酸494係選自D、G或S；且胺基酸501係選自T、S或N；編碼一種或多種SARS-CoV-2結構蛋白外套膜（E）、膜（M）或核殼（N）之一編碼序列。於些許實施例中，該基因表現匣包含用於SEQ ID NO：411一經修飾形式之編碼序列，其包含：胺基酸333至388、390至395、397至399、401至411、413至415、417至419、424、426至435、437、439至442、444至446、449、450、452、453、455至463、465、467至473、475至479、481至486、490、491、493至495、499至510、及/或513至526中任一者或多者之一個或多個取代；胺基酸367、403、417、439、446、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、490、493、494、495、496、499、500、501、502、503、504、及/或505中任一者或多者之一個或多個取代；以及/或，一個或多個選自由以下所構成之群組的取代：胺基酸367（V）經F、I、L、S或A取代，胺基酸403（R）經K或S取代，胺基酸417（K）經N或T取代；胺基酸439（N）經K取代，胺基酸446（G）經V、S或A取代；胺基酸449（Y）經N取代，胺基酸452（L）經L、M或Q取代，胺基酸453（Y）經F取代；胺基酸455（L）經F取代；胺基酸456（F）經L取代；胺基酸470（T）經I、A或N取代，胺基酸473（Y）經V取代；胺基酸475（A）經V取代；胺基酸476（G）經S或A取代；胺基酸477（S）經N、R、T、G、A或I取代；胺基酸476（G）經S或A取代，胺基酸477（S）經N、R、T、G、A或I取代，胺基酸478（T）經I、K、R或A取代，胺基酸484（E）經Q、K、D、A或R取代；胺基酸486（F）經L或S取代；胺基酸490（F）經L或S取代，胺基酸493（Q）經L或R取代；胺基酸494（S）經P或L取代，胺基酸495（Y）經N或F取代；胺基酸496（G）經V或S取代，胺基酸499（P）經H、S或R取代，胺基酸500（T）經I取代；胺基酸501（N）經Y、T或S取代；胺基酸502（G）經R、D或C取代；胺基酸503（V）經L、I或F取代；以及胺基酸504（G）經V、D或S取代，胺基酸505（Y）經H、E、W或C取代。於些許實施例中，除SARS-CoV-2以外之一傳染源之該至少一種抗原係衍生自一流感病毒。於些許實施例中，該免疫原性組合物係進一步經配置以誘導抵抗SARS-CoV-2之黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應。於些許實施例中，該編碼序列編碼至少一個或多個B細胞抗原決定位、一個或多個CD8+ T細胞抗原決定位、及/或一個或多個CD4+ T細胞抗原決定位。於些許實施例中，該編碼序列係對於哺乳動物受試者經過密碼子優化。於些許實施例中，該免疫原性組合物於哺乳動物受試者體內誘導產生針對SARS-CoV-2感染之血清保護性中和抗體，其中該哺乳動物受試者係選擇性為人類。於些許實施例中，該複製缺陷型腺病毒載體（rdAd）係為人類腺病毒，選擇性地係為Ad5或Ad26。於些許實施例中，該rdAd係為一靈長類腺病毒、雞腺病毒或豬或豬類腺病毒。於些許實施例中，該rdAd係為一E1、E3與/或E4缺失或破壞之腺病毒。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供藥用製劑，包含一有效量之此種免疫原性組合物（即，包含一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體之組合物）以及藥學上可接受之稀釋劑或載體，其中該稀釋劑係選擇性為磷酸鹽緩衝液。於些許實施例中，該藥用製劑經配置用以非侵入性施用與/或鼻內給藥予哺乳動物受試者。於些許實施例中，對哺乳動物受試者施用藥用製劑可於哺乳動物受試者體內誘導保護性免疫反應，其選擇性為黏膜、體液與T細胞之聯合保護性免疫反應。於些許實施例中，該藥學上可接受載體係為噴霧或氣溶膠形式。於些許實施例中，該有效量係為至少107 個病毒顆粒（vp）、至少108 個病毒顆粒（vp）、或至少109 個病毒顆粒（vp）（之rdAd抗SARS-CoV-2載體））。於些許實施例中，該藥用製劑經配置為一單次鼻內藥劑。於些許實施例中，該藥用製劑經配置為兩劑或更多劑鼻內藥劑。於些許實施例中，本揭露內容提供適用於單次鼻內給藥予人類受試者之冠狀病毒藥用製劑，其包含：一有效量為至少107 個病毒顆粒（vp）或感染單位（ifu）（例如，至少1x107 、或至少1×108 、或至少1×109 、或至少1×1010 、或至少1×1011 vp或ifu）之免疫原性組合物，其包含至少一種複製缺陷型腺病毒載體，其包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，該編碼序列編碼至少SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）或其至少一免疫原性片段，其中該有效量可誘導黏膜、體液與T細胞之聯合保護性免疫反應；以及藥學上可接受之稀釋劑或載體。於些許實施例中，該製劑經配置以對人類受試者提供針對SARS-CoV-2之血清保護至少6個月或較佳者為9個月。於些許實施例中，本發明揭露內容提供用於鼻內給藥之藥用製劑，其包含與本發明所揭露免疫原性組合物混合之噴霧或氣溶膠形式之一藥學上可接受載體，其中，該藥劑經配置用於鼻內給藥以非侵入性地誘導抵抗SARS-CoV-2之保護性免疫反應。於些許實施例中，該免疫原性組合物包含一有效量為至少107 個病毒顆粒（vp）、至少108 個病毒顆粒（vp）或至少109 個病毒顆粒（vp）之rdAd抗SARS-CoV-2載體。於些許實施例中，該有效量可誘導抵抗冠狀病毒之黏膜、體液和T細胞之聯合保護性免疫反應，較佳者係針對SARS-CoV-2。於些許實施例中，該藥物劑量經配置為兩劑或更多劑，以誘導抵抗SARS-CoV-2之一保護性免疫反應。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供誘導抵抗冠狀病毒之免疫反應的方法，較佳者係針對SARS-CoV-2，該方法包括對哺乳動物受試者施用一有效量之本發明所揭露免疫原性組合物（或製劑(formulation)或劑型(dosage form)），其中較佳者該免疫反應係針對SARS-CoV-2提供保護。於些許實施例中，該方法包括對哺乳動物受試者鼻內給藥一有效量之本發明所揭露免疫原性組合物，其中該免疫反應係針對SARS-CoV-2之攻擊提供。於些許實施例中，本發明揭露內容提供用於在人類受試者體內誘導抵抗冠狀病毒之黏膜、體液及/或T細胞之聯合保護性免疫反應的方法，包括：對人類受試者鼻內給藥本發明所揭露之單劑冠狀病毒（較佳者為SARS-CoV-2）藥用製劑或藥劑，其中，該施用可誘導抵抗SARS-CoV-2之血清抗體、黏膜抗體與T細胞，藉此選擇性對該人類受試者提供血清保護至少約6個月，或較佳者為至少約9個月。較佳者，該血清保護持續至少12個月、至少13個月或至少14個月。
於較佳實施例中，該rdAd抗SARS-CoV-2載體包含SEQ ID NO：15（或包含編碼SEQ ID NO：15之一核酸序列），較佳者係於一基因表現匣中。於較佳實施例中，該rdAd抗SARS-CoV-2載體包含一基因表現匣，其包含S1結構域之一SARS-CoV-2棘狀蛋白受體結合域（RBD）、pTA訊號序列（斜體）以及長側翼序列（底線標記），如圖19所示。SEQ ID NO：15之變異體亦經納入考量。例如，圖19所示之任何前導序列與側翼序列係可經刪除（即，不包括在內）或以其他前導序列及/或側翼序列取代。於較佳實施例中，可將包含SEQ ID NO：15（或包含編碼SEQ ID NO：15之一核酸序列）或其變異體之該rdAd抗SARS-CoV-2載體做為一藥物組合物施用，其包含之一有效量為至少107 個病毒顆粒（vp）、至少108 個病毒顆粒（vp）、至少109 個病毒顆粒（vp）、至少1010 個病毒顆粒（vp）或至少1011 個病毒顆粒（vp）；較佳者係經鼻內給藥（其中較佳者該哺乳動物（較佳者為人類）於施用過程中處於仰臥位置）；且較佳者係做為單次施用（藥劑），但於些許實施例中包含至少兩次根據時間（例如7至21天）實行之獨立施用（藥劑）。於較佳實施例中，該施用可誘導產生抗SARS-CoV-2中和抗體以及/或抗SARS-CoV-2細胞反應（例如T細胞），以提供保護（例如於較佳實施例中為血清保護）持續至少約6、9、10、11、12、13或更多個月。於較佳實施例中，該包含SEQ ID NO：15（或包含編碼SEQ ID NO：15之一核酸序列）之rdAd抗SARS-CoV-2載體的施用可導致針對SARS-CoV-2感染之保護、加速受SARS-CoV-2感染之恢復、減緩並/或逆轉SARS-CoV-2感染患者之臨床惡化，以及/或減少或消除SARS-CoV-2感染患者住進ICU病房以及/或於其中所需照護之需求。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供上述該等方法，並進一步包括對人類施用一種或多種抗細胞激素試劑（參見例如表4），以預防並/或治療SARS-CoV-2，其中該一種或多種抗細胞激素試劑選擇性地包括一種或多種抗IL-1α試劑、一種或多種抗IL-5試劑、一種或多種抗IL-6試劑、一種或多種抗IL-12試劑、一種或多種抗IL-17試劑、一種或多種抗MCP-1試劑、一種或多種抗TNF-α試劑、一種或多種抗GM-CSF試劑、及/或一種或多種抗RANTES藥劑。於些許實施例中，該一種或多種抗細胞激素試劑不包含一種或多種抗MIPα藥劑及/或一種或多種抗RANTES藥劑。於些許實施例中，將該一種或多種抗細胞激素試劑與該有效量之免疫原性組合物實質上共同施用。於些許實施例中，該一種或多種抗細胞激素試劑實質上不與該有效量之免疫原性組合物共同施用。於些許實施例中，將該免疫原性組合物施用予哺乳動物一次，並將該一種或多種抗細胞激素試劑施用多次。於些許實施例中，將該免疫原性組合物與該一種或多種抗細胞激素試劑共同施用予哺乳動物，後續再將該一種或多種抗細胞激素試劑共同施用予該哺乳動物。於些許實施例中，本發明揭露內容提供用於治療並/或抑制（例如減輕）哺乳動物體內呼吸道病毒感染症狀之方法，該呼吸道病毒感染係引起該哺乳動物肺中介白素6（IL-6）、介白素1α（IL-1α）以及/或介白素12（IL-12）之表現升高，此係可能對宿主造成有害影響。於些許實施例中，此種方法包括對受試者鼻內給藥一有效量之E1與E3剔除腺病毒載體，藉以減緩肺中IL-6、IL-1α及/或IL-12之表現，進而於施用該載體後減輕該症狀長達約28天。於些許實施例中，此種方法可導致施用該載體後肺中單核球趨化蛋白1（MCP-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、RANTES、及/或IL-17之表現減少。於些許實施例中，在施用該載體後，巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1α）與/或RANTES之表現並未減少。於些許實施例中，本發明揭露內容於有其需求之呼吸道病毒感染或有感染風險之哺乳動物受試者體內誘導抗病毒免疫反應之方法，該方法包括：對受試者鼻內給藥一有效量之E1與E3剔除腺病毒載體，其中於施用步驟後，該抗病毒免疫反應產生單核球趨化蛋白1（MCP-1）與/或干擾素γ（IFN-γ）之表現增加。於此種方法之些許實施例中，哺乳動物受試者（例如人類）於接受施用該藥用製劑前，係經感染SARS-CoV-2（例如，於醫院中接受SARS-CoV-2感染治療）。於些許實施例中，可於施用SARS-CoV-2免疫原性組合物例如氯奎寧（chloroquine）（例如其藥用鹽與/或其衍生物；例如羥氯奎寧(hydroxychloroquine)，每天400毫克共5天，或每天3次每次200毫克共10天）及/或亞茲索黴素(azithromycin)（例如，第一天500毫克，而後每天4次每次250毫克劑量）及/或瑞德西韋(remdesivir)（例如200毫克初打劑量，而後每天100毫克劑量）及/或任何其他合適藥劑之前、與其實質上同時或之後，將一種或多種額外抗SARS-CoV-2藥劑施用予受試者。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供SARS-CoV-2免疫原性組合物，其包含一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體，包含一種或多種SARS-CoV-2抗原編碼序列，其編碼一種或多種胜肽，該胜肽包含表3A中之一個或多個T細胞抗原決定位、表3B中之一組或多組T細胞抗原決定位、或SEQ ID NO：27至282；以及/或SEQ ID NO：283至327之一個或多個B細胞抗原決定位；以及/或SEQ ID NO：328至408之一個或多個，其中該胜肽係選擇性為串聯，並且選擇性地受2至10個胺基酸之一連接胺基酸序列隔開。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供SARS-CoV-2免疫原性組合物，包含一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體，其包含至少一多核苷酸，其編碼至少一種選自以下所構成群組之分子佐劑：一種或多種做為共刺激成分之多胜肽或胜肽；一種或多種細胞激素；一種或多種趨化因子；一種或多種免疫抑制蛋白；一種或多種TLR促效劑，其中，該一種或多種TLR促效劑係選擇性選自SEQ ID NO：463至474；以及其等之組合。
於些許實施例中，本揭露內容提供SARS-CoV-2免疫原性組合物，包含一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體，其包含至少一多核苷酸序列，其編碼至少一種SARS-CoV-2阻斷蛋白；其中該至少一多核苷酸序列編碼至少一胜肽或多胜肽：其中誘導干擾SARS-CoV-2 S蛋白與其細胞受體結合之一免疫反應、直接干擾SARS-CoV- 2 S蛋白與其細胞受體結合者，係為一RBD結合劑、係為一ACE2結合劑，並且/或同時為一RBD結合劑及ACE2結合劑。
於些許實施例中，本發明揭露內容提供一種或多種多核苷酸，其編碼本發明所揭露之一rdAd抗SARS-CoV-2載體。於些許實施例中，本發明揭露內容提供一種或多種rdAd抗SARS-CoV-2載體，其係於該多核苷酸表現於宿主細胞中之後產生。於些許實施例中，本揭露內容提供包含此種多核苷酸與/或rdAd抗SARS-CoV-2載體之一種或多種組合物，其於些許實施例中係為藥物組合物(composition)或藥物劑型(dosage form)。
本發明揭露內容之較佳態樣
本發明揭露內容之較佳態樣包括：
一種複製免疫原性組合物，包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其中該rdAd載體係選自： a）一rdAd載體，缺少編碼一外源性、非腺病毒抗原之一編碼序列； b）一rdAd載體，包含一基因表現匣，其包含編碼至少一種SARS-CoV-2抗原之一SARS-CoV-2抗原編碼序列，選擇性地，其中該抗原包含一SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）； c）一rdAd載體，包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，編碼除SARS-CoV-2以外之一傳染源至少一種外源抗原； d）a）與b）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； e）b）和c）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； f）a）、b）或c）之該等rdAd載體中任一者之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； g）b）中兩種不同類型之rdAd載體之一組合，其中，各類型之rdAd載體皆包含一基因表現匣，其編碼至少一SARS-CoV-2抗原，該抗原不同於該組合中其他類型之rdAd載體所編碼者，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； 該免疫原性組合物經配置施用於一哺乳動物受試者內，以誘導抵抗SARS-CoV-2之中和抗體及/或細胞免疫反應。
前述態樣之免疫原性組合物，其中，該基因表現匣包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，用於該棘狀蛋白之棘狀（S）蛋白或該S1結構域。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中所述基因表現匣包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，其係選自以下所構成群組：SEQ ID NO：3；與SEQ ID NO：3具有至少80%（例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）之同源性與/或同一性之一序列；SEQ ID NO：12；與SEQ ID NO：12具有至少80%（例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）之同源性與/或同一性之一序列；SEQ ID NO：15；與SEQ ID NO：15具有至少80%（例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）之同源性與/或同一性之一序列；SEQ ID NO：446；與SEQ ID NO：446具有至少80%（例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）之同源性與/或同一性之一序列；SEQ ID NO：412至417之任一者；SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476、SEQ ID NO：460中之任一者；與SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476及SEQ ID NO：460中之任一者具有至少80%（例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）之同源性及/或同一性之一序列。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列編碼一棘狀蛋白序列，其包含其中S1/S2可切割位點及/或S2'對蛋白體降解具有抗性之一序列，以及/或其中該融合胜肽已經缺失或經過修飾以防止其融合活性之一序列，以及/或其中胞內結構域已經修飾或部分修飾以改變內質網滯留模體之一序列。任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該基因表現匣包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，其係選自由下列所組成之群組以及/或包括其中至少一者，NSPQQAQSVAS（SEQ ID NO：451）、NSPSGAGSVAS（SEQ ID NO： 456）或NSP ----- VAS（SEQ ID NO：461）於S1/S2切割位點、KRSFIADA（SEQ ID NO：453）、PSKPSKQSF（SEQ ID NO：457）、PSKPSKNSF（SEQ ID NO：458）、PSKPSNASF（SEQ ID NO：459）於S2'切割位點、或SRLDPPEAEV（SEQ ID NO：455），以及/或表1及/或表2中所列之任何序列修飾。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列為SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20所示之一序列或其之一免疫原性片段。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列至少編碼SEQ ID NO：3之胺基酸331至527。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列編碼一棘狀蛋白受體結合域（RBD）序列，其包含下列取代中之一者或多者：K417N、K417T、R403K、N439K、G446V 、G446S、L452R、G476A、S477N、T478K、E484D、T478I、E484K、F490S、Q493R、S494P、P499H及/或N501Y。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列編碼一棘狀蛋白受體結合域（RBD）序列或其免疫原性片段，及/或包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、 SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：446、SEQ ID NO ：460、SEQ ID NO：475及SEQ ID NO：476中之一胺基酸序列；或其一免疫原性片段。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體之基因表現匣進一步包含一編碼序列，其編碼SARS-CoV-2結構蛋白外套膜（E）、膜（M）或核殼（N）中之一個或多個。
任何前述態樣之免疫原性組合物，包含一額外複製缺陷型腺病毒載體，其包含一編碼序列，其編碼SARS-CoV-2結構蛋白外套膜（E）、膜（M）或核殼（N）中之一個或多個。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體之基因表現匣包含用於SEQ ID NO：411之一修飾版本之一編碼序列，其包含： 胺基酸333至388、390至395、397至399、401至411、413至415、417至419、424、426至435、437、439至442、444至446、449、450、452、453、455至463、465、467至473、475至479、481至486、490、491、493至495、499至510、及/或513至526中任一者或多者之一個或多個取代； 胺基酸367、403、417、439、446、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、490、493、494、495、496、499、500、501、502、503、504、及/或505中任一者或多者之一個或多個取代； 一個或多個取代，其選自以下所構成之群組：胺基酸367（V）經F、I、L、S或A取代，胺基酸403（R）經K或S取代，胺基酸417（K）經N或T取代；胺基酸439（N）經K取代，胺基酸446（G）經V、S或A取代；胺基酸449（Y）經N取代；胺基酸452（L）經L、M或Q取代，胺基酸453（Y）經F取代；胺基酸455（L）經F取代；胺基酸456（F）經L取代；胺基酸470（T）經I、A或N取代，胺基酸473（Y）經V取代；胺基酸475（A）經V取代；胺基酸476（G）經S或A取代；胺基酸477（S）經N、R、T、G、A或I取代；胺基酸476（G）經S或A取代，胺基酸477（S）經N、R、T、G、A或I取代，胺基酸478（T）經I、K、R或A取代，胺基酸484（E）經Q、K、D、A或R取代；胺基酸486（F）經L或S取代；胺基酸490（F）經L或S取代，胺基酸493（Q）經L或R取代；胺基酸494（S）經P或L取代，胺基酸495（Y）經N或F取代；胺基酸496（G）經V或S取代，胺基酸499（P）經H、S或R取代，胺基酸500（T）經I取代；胺基酸501（N）經Y、T或S取代；胺基酸502（G）經R、D或C取代；胺基酸503（V）經L、I或F取代；以及胺基酸504（G）經V、D或S取代，胺基酸505（Y）經H、E、W或C取代。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，除SARS-CoV-2以外之一傳染源之至少一種抗原係衍生自一流感病毒。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其包含a）至c）之任兩種rdAd載體之組合。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該免疫原性組合物為一兩部分之組合物，其包含至少一組合物，包含a）至c）中之rdAd載體，以及至少一第二組合物，包含不同的a）至c）中之rdAd載體。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其進一步經配置以誘導抵抗SARS-CoV-2之一黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該編碼序列編碼至少一個或多個B細胞抗原決定位、一個或多個CD8+ T細胞抗原決定位以及/或一個或多個CD4+ T細胞抗原決定位。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該編碼序列係針對哺乳動物受試者進行密碼子優化。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該等中和抗體係對於哺乳動物受試者體內之SARS-CoV-2感染具有血清保護，其中，該哺乳動物受試者較佳者為一人類。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一人類腺病毒，選擇性地為Ad5或Ad26。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一牛腺病毒、犬腺病毒、非人靈長類腺病毒、雞腺病毒或豬或養豬類腺病毒。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一E1、E3、及/或E4剔除或破壞之腺病毒。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列編碼一種或多種胜肽，其包含表3A中之一個或多個T細胞抗原決定位、表3B中之一組或多組T細胞抗原決定位、或SEQ ID NO：27至282；以及/或SEQ ID NO：25至68之一個或多個B細胞抗原決定位；以及/或SEQ ID NO：328至369之一個或多個；其中，該等胜肽係選擇性為串聯，並且選擇性地受2至10個胺基酸之一連接胺基酸序列隔開。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該rdAd載體進一步包含至少一分子佐劑，其選自以下所構成之群組：一種或多種做為共同刺激成分之多肽或肽；一種或多種細胞激素；一種或多種趨化因子；一種或多種免疫抑制蛋白；一種或多種TLR促效劑，其選擇性選自SEQ ID NO：463至474所構成之群組；以及其等之一組合。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該rdAd載體包含至少一多核苷酸序列，其編碼至少一種SARS-CoV-2阻斷蛋白；其中，該至少一多核苷酸序列編碼至少一肽或多肽：其誘導干擾SARS-CoV-2 S蛋白與其細胞受體結合之一免疫反應、直接干擾SARS-CoV- 2 S蛋白與其細胞受體結合、為一RBD結合劑、為一ACE2結合劑、及/或同時為一RBD結合劑及ACE2結合劑。
一種編碼前述態樣任一者之免疫原性組合物之一rdAd載體之多核苷酸、一種於該多核苷酸表現於宿主細胞中時產生之一rdAd載體，以及一種包含該rdAd載體之組合物。
一種藥用製劑(formulation)，其包含：一有效量之任何前述態樣之免疫原性組合物；以及一種藥學上可接受之稀釋劑或載體，其中，該稀釋劑係選擇性為一磷酸鹽緩衝液。
前述態樣之藥用製劑，其經配置用於非侵入性施用。
任何前述態樣之藥用製劑，其經配置以鼻內給藥予哺乳動物受試者。
任何前述態樣之藥用製劑，其中，對哺乳動物受試者施用該藥用製劑可於該哺乳動物受試者體內誘導一保護性免疫反應，其選擇性為一黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應。
任何前述態樣之藥用製劑，其中，該藥學上可接受之載體為一噴霧或氣溶膠形式。
任何前述態樣之藥用製劑，其中，該有效量係為至少107 個病毒顆粒（vp）、至少108 個病毒顆粒（vp）、或至少109 個病毒顆粒（vp）。
任何前述態樣之藥用製劑，其經配置為一單次鼻內劑量(dose)。
任何前述態樣之藥用製劑，其經配置為兩劑或更多劑之鼻內劑量(dose)。
一種藥用製劑(formulation)，其適用於對一人類受試者進行單次劑量(single dose)之鼻內給藥，該藥用製劑其包含： 一有效量為至少107 個病毒顆粒（vp）之任何前述態樣之免疫原性組合物，其包含至少一包含一基因表現匣之複製缺陷型腺病毒載體，該基因表現匣包含一編碼序列，以編碼至少SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）或其至少一免疫原性片段，其中，該有效量可誘導一黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應；以及 一藥學上可接受之稀釋劑或載體。
前述態樣之藥用製劑，其中，該製劑經配置以對人類受試者提供抵抗SARS-CoV-2之血清保護至少6個月。
任何前述態樣之藥用製劑，其中，該編碼序列係針對人類受試者進行密碼子優化。
一種用於鼻內給藥之藥用劑量(dosage)，其包含： 一藥學上可接受之載體，其以噴霧或氣溶膠形式與任何前述態樣之免疫原性組合物混合，其中，該劑量經配置用於鼻內給藥，以非侵入性地誘導抵抗SARS-CoV-2之一保護性免疫反應。
前述態樣之藥用劑量，其中，該免疫原性組合物之一有效量為至少107 個病毒顆粒（vp）、至少108 個病毒顆粒（vp）、或至少109 個病毒顆粒（vp）。
任何前述態樣之藥用劑量，其中，該有效量可誘導一黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應。
任何前述態樣之藥用劑量，其經配置為單次劑量(single dose)以誘導抵抗冠狀病毒之一保護性免疫反應。
任何前述態樣之藥用劑量，其經配置為兩劑量或更多劑量(dose)以誘導抵抗SARS-CoV-2之一保護性免疫反應。
一種誘導抵抗冠狀病毒之一免疫反應之方法，該方法包含對一哺乳動物受試者施用一有效量之任何前述態樣之免疫原性組合物。
前述態樣之方法，其中，該免疫反應係針對SARS-CoV-2具有保護性。
一種誘導抵抗SARS-CoV-2之一免疫反應之方法，該方法包含對一哺乳動物受試者施用任何前述態樣之一藥用製劑(formulation)或任何前述態樣之一藥用劑量(dosage)。
前述態樣之方法，其中，該免疫反應係針對SARS-CoV-2具有保護性。
任何前述態樣之方法，該方法包含對該哺乳動物受試者進行鼻內給藥一有效量之該免疫原性組合物，其中，該免疫反應可針對SARS-CoV-2之攻擊提供保護。
一種於一人類受試者體內誘導抵抗冠狀病毒之一黏膜、體液及/或T細胞之聯合保護性免疫反應之方法，其包含： 對一人類受試者進行鼻內給藥一單次劑量之任何前述態樣之冠狀病毒（SARS-CoV-2）藥用製劑(formulation)或任何前述態樣之藥用劑量(dosage)，其中，該給藥可誘導抵抗SARS-CoV-2之血清抗體、黏膜抗體及T細胞，藉以選擇性對該人類受試者提供血清保護至少約6個月或較佳者為至少約9個月。
前述態樣之方法，其中，該血清保護持續至少12個月、至少13個月或至少14個月。
任何前述態樣之方法，進一步包含對該人類施用一種或多種抗細胞激素試劑，以預防及/或治療SARS-CoV-2，其中，該一種或多種抗細胞激素試劑包含一種或多種抗IL-1α試劑、一種或多種抗IL-5試劑、一種或多種抗IL-6試劑、一種或多種抗IL-12試劑、一種或多種抗IL-17試劑、一種或多種抗MCP-1試劑、一種或多種抗TNF-α試劑、一種或多種抗GM-CSF試劑、及/或一種或多種抗RANTES試劑。
任何前述態樣之方法，其中，該一種或多種抗細胞激素試劑不包括一種或多種抗MIPα試劑及/或一種或多種抗RANTES試劑。
任何前述態樣之方法，其中： 該一種或多種抗細胞激素試劑係實質上與該有效量之該免疫原性組合物共同施用； 該一種或多種抗細胞激素試劑係實質上非與該有效量之該免疫原性組合物搭配施用； 該免疫原性組合物係施用於該哺乳動物一次，而該一種或多種抗細胞激素試劑係多次施用；或 該免疫原性組合物係與該一種或多種抗細胞激素共同施用於該哺乳動物，且該一種或多種抗細胞激素試劑係於後續繼續施用於該哺乳動物。
一種治療或抑制一哺乳動物體內呼吸道病毒感染症狀之方法，該呼吸道病毒感染引起該哺乳動物肺中之介白素6（IL-6）、介白素1α（IL-1α）及/或介白素12（IL-12）之表現升高，該方法包括：對受試者鼻內給藥一有效量之E1與E3剔除腺病毒載體，或包含任何前述態樣之同等物之製劑或組合物，藉以減緩肺中之IL-6、IL-1α、及/或IL-12之表現，進而於施用該載體後減輕該症狀長達約28天。
前述態樣之方法，其中，於施用該載體後，肺中之單核球趨化蛋白1（MCP-1）、干擾素γ（IFN-γ）、及/或RANTES之表現增加。
任何前述態樣之方法，其中，於施用該載體後，巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1α）及/或RANTES之表現並未減少。
一種於一哺乳動物受試者體內誘導一抗病毒免疫反應之方法，該哺乳動物受試者有其需求或有呼吸道病毒感染風險，該方法包含：對該受試者鼻內給藥一有效量之E1與E3剔除腺病毒載體，或包含任何前述態樣之同等物之製劑或組合物，其中，於給藥步驟後，該抗病毒免疫反應產生單核球趨化蛋白1（MCP-1）及/或干擾素γ（IFN-γ）之表現增加。
前述態樣之方法，其中，於施用該E1與E3剔除腺病毒載體之前、實質上同時、或之後，對受試者施用一種或多種額外抗SARS-CoV-2藥劑，其中，該一種或多種額外藥劑選擇性選自由氯奎寧(chloroquine)、亞茲索黴素(azithromycin)、瑞德西韋(remdesivir)、一抗發炎藥劑、及其等之一組合所構成之群組。
任何前述態樣之方法，其中，哺乳動物受試者於接受施用該藥用製劑前，係經感染SARS-CoV-2。
任何前述態樣之方法，其中，該哺乳動物受試者為一人類。
一種免疫原性組合物，其包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其中，該rdAd載體係選自： a）一rdAd載體，缺少編碼一外源性、非腺病毒抗原之一編碼序列； b）一rdAd載體，包含一基因表現匣，其包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，選擇性地，其中，該抗原包含一SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）； c）一rdAd載體，包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，編碼除SARS-CoV-2以外之一傳染源之至少一種外源抗原； d）a）與b）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； e）b）與c）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； f）a）、b）或c）之該等rdAd載體中任一者之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； g）b）中兩種不同類型之rdAd載體之一組合，其中，各類型之rdAd載體皆包含一基因表現匣，其編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，該抗原不同於該組合中其他類型之rdAd載體所編碼者，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； 該免疫原性組合物經配置施用於一哺乳動物受試者體內，以誘導抵抗SARS-CoV-2之中和抗體及/或細胞免疫反應，用於治療或預防SARS-CoV-2。
一種免疫原性組合物之用途，該免疫原性組合物包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其中，該rdAd載體係選自： a）一rdAd載體，缺少編碼一外源性、非腺病毒抗原之一編碼序列； b）一rdAd載體，包括一基因表現匣，其包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，選擇性地，其中，該抗原包含一SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）； c）一rdAd載體，包括一基因表現匣，其包含一編碼序列，編碼除SARS-CoV-2以外之一傳染源之至少一種外源抗原； d）a）與b）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； e）b）與c）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； f）a）、b）或c）之該等rdAd載體中任一者之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； g）b）中兩種不同類型之rdAd載體之一組合，其中，各類型之rdAd載體皆包含一基因表現匣，其編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，該抗原不同於該組合中其他類型之rdAd載體所編碼者，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； 該免疫原性組合物經配置施用於一哺乳動物受試者體內，以誘導抵抗SARS-CoV-2之中和抗體及/或細胞免疫反應， 其中，該用途係用於製造治療或預防SARS-CoV-2之藥物。
一種免疫原性組合物，其包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，該rdAd載體包含一核酸序列，編碼SEQ ID NO：446或與SEQ ID NO：446具有至少90%或至少95%同一性之一變異體。
前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：15。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：13。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476及SEQ ID NO：460中之一個或多個。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼一序列，該序列包含SEQ ID NO：3之一個或多個點突變。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼包含一個或多個突變之一序列，所述突變係位於胺基酸位置333至388、390至395、397至399、401至411、413至415、417至419、424、426至435、437、439至442、444至446、449、450、452、453、455至463、465、467至473、475至479、481至486、490、491、493至495、499至510、或513至526，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼包含一個或多個突變之一序列，所述突變係位於胺基酸位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504、及/或505，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該一個或多個突變係選自：以N取代胺基酸417（K）；以V、S或A取代胺基酸446（G）；以N取代胺基酸449（Y）；以F取代胺基酸453（Y）；以F取代胺基酸455（L）；以L取代胺基酸456（F）；以V取代胺基酸473（Y）；以V取代胺基酸475（A）；以S或A取代胺基酸476（G）；以N、R、T、G、A或I取代胺基酸477（S）；以Q、K、D、A或R取代胺基酸484（E）；以L或S取代胺基酸486（F）；以F取代胺基酸453（Y）；以L或R取代胺基酸493（Q）；以N或F取代胺基酸495（Y）；以I取代胺基酸500（T）；以Y、T或S取代胺基酸501（N）；以R、D或C取代胺基酸502（G）；以L、I或F取代胺基酸503（V）；或者，以H、E、W或C取代胺基酸505（Y）；其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼包含一個或多個突變之一序列，所述突變係選自K417T、K417N、E484K、L452R及/或N501Y，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：412至417中之一者或多者。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：438至443或460中之一者或多者。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，編碼SEQ ID NO：446之該核酸序列進一步包含一前導序列，其係由編碼選自SEQ ID NO：418至437之一序列之一核酸序列所編碼。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該編碼序列係針對一哺乳動物受試者進行密碼子優化。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一牛腺病毒、犬腺病毒、非人靈長類腺病毒、雞腺病毒、或豬或養豬類腺病毒、或人類腺病毒。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，非人靈長類腺病毒為黑猩猩或大猩猩腺病毒。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一人類腺病毒。
任何前述態樣之免疫原性組合物，其中，該人類腺病毒為Ad5或Ad26。
一種藥用製劑(formulation)，其包含一有效量之任何前述態樣之免疫原性組合物，該組合物包含至少一種藥學上可接受之稀釋劑或載體，其中，該稀釋劑係選擇性為磷酸鹽緩衝液。
前述態樣之藥用製劑，其經配置用於非侵入性或鼻內給藥，其中，該藥學上可接受之載體選擇性為一噴霧或氣溶膠形式。
一種誘導抵抗SARS-CoV-2之免疫反應之方法，該方法包含對一人類施用一有效量之任何前述態樣之免疫原性組合物。
前述態樣之方法，其中，該有效量為至少108 個病毒顆粒（vp）、至少109 個病毒顆粒（vp）、或至少1010 個病毒顆粒（vp）。
任何前述態樣之方法，其中，該免疫原性組合物係經鼻內給藥。
任何前述態樣之方法，其中，於施用予一人類受試者後，抵抗SARS-CoV-2之免疫反應係持續至少6個月、至少9個月或至少12個月。
任何前述態樣之方法，其中，抵抗SARS-CoV-2之免疫反應包含於施用該免疫原性組合物後所誘導抵抗SARS-CoV-2之一黏膜IgA及/或T細胞反應。
任何前述態樣之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低輕度或中度COVID-19相關疾病之發生率。
任何前述態樣之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低嚴重COVID-19相關疾病之發生率。
任何前述態樣之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低COVID-19相關疾病之嚴重性。
任何前述態樣之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低感染SARS-CoV-2之發生率。
任何前述態樣之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低無症狀COVID-19之發生率。
任何前述態樣之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低SARS-CoV-2之傳播。
如所屬技術領域中具有通常知識者可理解，本發明亦已將其他實施例納入考量。範例
下述範例係經提出以提供所屬技術領域中具有通常知識者關於如何使用本文所提供實施例之完整揭露及描述，且無意於限制本發明揭露內容之範圍，或表示其等係指下述範例代表已實施過之所有或僅有之實驗。於此已盡力確保所使用數字（例如含量、溫度等）之準確性，但亦應將些許實驗誤差與偏差納入考量。除非另有說明，否則部分係以體積表示，且溫度係以攝氏度為單位。應理解，可於不改變範例所意圖說明之基礎態樣的情況下對所述方法進行變化。
範例 1 ：原料及方法
重組複製缺陷型腺病毒 5 型。 使用先前所述之方法（Miravet, et al.，Methods Mol Biol 2014，1089，159-173）產生複製缺陷型人類腺病毒5（hAd5）。簡言之，有缺陷之hAd5缺少E1與E3基因，以為轉基因插入提供基因組空間。於些許實施例中，hAd5缺乏用於任何外源抗原（即，如AdE載體中之非腺病毒抗原）之編碼序列。於些許實施例中，該hAd5編碼一種或多種SARS-CoV-2抗原（本文稱為「hAd5-SARS-CoV-2」）。於些許實施例中，該hAd5編碼一種或多種流感抗原（如於AdD載體中）。該等hAd5-SARS-CoV-2載體及AdD載體可分別編碼任何SARS-CoV-2或流感抗原，此係對於人類或非人類動物（例如哺乳動物）中之此類抗原具有免疫原性。例如，SARS-CoV-2抗原插入片段可編碼由SEQ ID NO：1（圖1A至J）所編碼之任何蛋白質（以及/或其之任一個或多個片段及/或衍生物），例如SEQ ID NO：2至11、13或15中任一者或多者，以及/或其等之任一個或多個片段及/或衍生物（例如，具有其等之至少3、6、9或11個連續胺基酸之一胜肽）。該基因表現匣(expression cassette)係為一巨細胞病毒（CMV）立即早期驅動轉基因，選擇性編碼一組織血纖維蛋白溶酶原活化因子訊號序列（tPA），隨後經一密碼子優化之SARS-CoV-2棘狀（S）卡匣（cassette），插入該腺病毒之E1區域。透過於允許複製之CAP細胞中增殖RD-Ad5載體（Wölfel, et al.，BMC Proceedings，2011，5（Supp 8）：P133；Cevec），以製造本發明之免疫原性組合物，隨後自受感染細胞收取物中純化病毒，且最終產物可能包括下列賦形劑：Tris HCl（pH 7.4）、組胺酸、蔗糖、氯化鈉、氯化鎂、聚山梨醇酯80、乙二胺四乙酸、及乙醇，該最終產物儲存在-80°C。
對於動物與/或臨床研究，本發明之藥用製劑係以一次性玻璃藥瓶中提供，各玻璃藥瓶包含標稱體積為0.7 mL之免疫原性組合物（例如疫苗）之無菌冷凍懸浮液，其經配製以遞送1×107 、1×108 、1×109 、1×1010 或1×1011 個病毒顆粒（vp）之標稱劑量。替代性地，本發明藥物製劑係於一次性（預填充）注射器中提供，選擇性配有霧化器（例如BD Accuspray），其包含標稱體積為0.5mL之免疫原性組合物（例如疫苗）之無菌冷凍懸浮液，其經配製以遞送1×107 、1×108 、1×109 、1×1010 或1×1011 個病毒顆粒（vp）之標稱劑量。
灶點形成測定法。 透過灶點形成測定法（FFA）或其他適用測定法，進行hAd5載體（例如，AdE，hAd5-SARS-CoV-2，AdD）效價測定。簡言之，關於FFA，於檢測前一天將表現病毒受體（例如ACE2受體（血管收縮素轉換酶2））之細胞鋪於96孔盤中，之後，將病毒原液連續稀釋，並使其感染細胞，隨後可選擇性覆蓋甲基纖維素。將細胞於37°C下培養48小時，再以多聚甲醛固定。使用冠狀病毒單株抗體及二級抗體進行免疫染色，以可視出各個受感染細胞被hAd5-SARS-CoV-2原液感染處(foci)。
西方點墨法。 為確認來自hAd5（例如重組hAd5-SARS-CoV-2病毒）之蛋白表現，將293細胞（例如293、Calu-3、Caco-2或Vero）感染hAd5-SARS-CoV-2。於37°C、5% CO2 培養一段時間（例如48小時）後，將細胞以PBS沖洗一次，並使用2xNuPage緩衝液收取。將樣本於95°C加熱10分鐘，冷卻，再載至NuPage 4-12%凝膠上。將蛋白質轉印至硝化纖維素膜上，以脫脂牛奶阻隔，並於TBST中以一種或多種類型之一級抗體進行探測，其對於一種或多種SARS-CoV-2抗原皆具有特異性。於隔夜培養後，將膜以TBST洗滌3次，並以帶有螢光之二級抗體（分子探針）墨點。於二次培養一小時後，將膜於TBST中洗滌3次並於PBS中洗滌1次，再以成像儀擷取螢光訊號。
胞內細胞激素染色。 接種疫苗八天後，自接種小鼠取得脾臟。將脾臟於100 μm細胞濾器上研磨，並於含10% FBS及HEPES之RPMI中培養。於96孔培養盤中各個孔鋪設約106 個細胞，並於含有10 μg/ml brefeldin A與α-CD3（2C11克隆）或10μg胜肽之90% DMSO存在之情況下，於37°C、5% CO2 刺激細胞6小時。於胜肽刺激後，將細胞以PBS洗滌一次並針對表面標記物染色。之後將細胞固定並透化，並針對細胞內標記物（例如IFN-γ）染色。透過流式細胞儀分析細胞。
ELISA 。 將含有1 µg/ml SARS-CoV-2抗原之碳酸鈉緩衝液（pH 9.3）塗覆於聚苯乙烯96孔培養盤，並於於4°C下塗覆隔夜。將培養盤於含0.02% Tween 20之PBS中洗滌3次，並以脫脂奶粉與PBS、2% BSA、0.02 Tween 20於37°C下阻隔1小時。將取自hAd5（例如hAd5-SARS-CoV-2）接種小鼠之血清於PBS中連續稀釋，並於37°C下培養。以含0.02% Tween 20之PBS將培養盤洗滌四次，並與經標記之二級抗體共同培養一小時。根據需求進行洗滌與培養後，使用微量盤檢測儀讀取培養盤。
以重組複製缺陷型腺病毒 5 型進行疫苗接種。 使用Ketamine/Xylazine（90mg/kg：10mg/kg）麻醉小鼠，再將經PBS稀釋之1x107 顆粒hAd5-SARS-CoV-2以適當體積對其鼻內給藥。
動物攻擊。 將SARS-CoV-2於無菌PBS pH 7.4中稀釋，以獲得適合每隻小鼠（例如，該等表達病毒受體者）之最終濃度的SARS-CoV-2，其最終體積為10至50µL。於接種hAd5-SARS-CoV-2疫苗21天後，透過鼻內給藥進行病毒攻擊。於此過程中使用Ketamine/Xylazine（90mg/kg：10mg/kg）麻醉小鼠。攻擊過後，檢查各小鼠之可見創傷，並放回籠中恢復。
臨床監測。 於SARS-CoV-2攻擊後每天觀察動物之臨床結果。每天記錄各動物之體重變化、SARS-CoV-2病毒感染症狀、及死亡率。
範例 2 ：用於免疫抵抗呼吸道感染之 AdE 組合物
本實施例中所述研究評估了施用AdE後用於預防及/或治療呼吸道感染（例如，可能由流感引起）之免疫反應，包括透過血球凝集抑制測定法及肺部灌洗液中分泌IgA程度，以測量血清抗體量。透過ELISpot測定法定量於肺部灌洗液中釋放IFN-γ和IL-4之細胞，以評估細胞免疫力。此外，透過使用來自接種小鼠血清之腺病毒中和作用，以評估腺病毒特異性免疫。本研究確定空腺病毒載體（AdE）針對小鼠體內A型H1N1、H3N2、H5N1流感病毒及B型流感病毒之感染，提供保護的能力。此外，於疫苗接種與攻擊後評估肺部灌洗液中之細胞激素，以試圖確定AdE載體提供之保護機制。
原料及方法
於此實例中使用之縮寫包括：IL－介白素；MCP－單核球趨化蛋白；IFN－干擾素；TNF－腫瘤壞死因子；MIP－巨噬細胞炎性蛋白； GM-CSF－顆粒球/巨噬細胞集落刺激因子；以及RANTES－受活化調節，正常T細胞表現和分泌因子。
動物：取自Charles River Laboratories之六隻六周大雌性BALB/c小鼠。小鼠於使用前受隔離72小時，並於猶他州立大學實驗動物研究中心以Teklad齧齒動物飲食（Teklad Rodent Diet（Harlan Teklad））及自來水飼養。
病毒：自田納西州孟菲斯市聖裘德兒童研究醫院傳染病科（Department of Infectious Diseases, St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis TN）之埃琳娜．戈沃科娃（Elena Govorkova）醫師，取得A型/加利福尼亞/04/2009（Influenza A/California/04/2009）（大流行性H1N1），編號175190流感病毒株。透過經由小鼠肺部繼代九次，使該病毒適應於BALB/c小鼠肺部中複製。病毒於Madin-Darby犬腎（MDCK）細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）中進行蝕斑純化（plaque purified），並透過於有胚雞蛋以及其後於MDCK細胞中生長以取得一病毒庫。自馬納薩斯，弗吉尼亞州美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection (Manassas, VA)），取得A型/維多利亞/3/75（Influenza A/Victoria/3/75）（H3N2）流感病毒，該病毒於經感染動物肺部連續繼代七次後，開始對小鼠具有致命性。於小鼠適應後，透過於MDCK細胞中培養以製備一病毒庫。自喬治亞州亞特蘭大疾病控制中心（Centers for Disease Control (Atlanta, GA)），取得A型/越南/1203/2004（Influenza A/Vietnam/1203/2004）（H5N1）流感病毒，於MDCK細胞中進行病毒增殖與測定。親代病毒經繼代一次以準備一攻擊病毒庫。自喬治亞州亞特蘭大疾病控制中心取得B型/四川/379/99流感病毒，該病毒於MDCK細胞中增殖兩次，其後於小鼠體內連續繼代十次。於小鼠適應後，透過於MDCK細胞中培養以製備一病毒庫。
AdE組合物：AdE之病毒效價為6.4×109 感染形成單位（ifu）/ ml（3.2×108 ifu/0.05ml）。該疫苗透過鼻內途徑以50μl體積單次給藥（請參見實驗設計）。
實驗設計：動物數量及研究組係如表1至表3中所述。於研究第0或20天透過鼻內途徑對分組小鼠進行疫苗接種。安慰劑組透過相同途徑接受50μl生理食鹽水（PSS）。對於流感病毒攻擊組，透過腹膜內注射ketamine/xylazine（50 mg/kg//5 mg/kg）麻醉小鼠，再於鼻內給藥90μl之A型/CA/04/2009（H1N1p）、A型/Victoria/3/1975（H3N2）、B型/Sichuan/379/1999流感病毒，或75μl之A型/Vietnam/1203/2004（H5N1）流感病毒。各小鼠之病毒攻擊劑量約為3x LD50 CCID50（細胞培養感染劑量）。於研究第22天對所有小鼠施用病毒攻擊。於攻擊後，觀測所有小鼠於攻擊後第21天之體重減輕與死亡率。 [表11]研究組之死亡率與體重觀測
小鼠數量 組別編號 是否感染 疫苗 攻擊 觀察 / 測試
劑量 (IFU/ 小鼠 ) 天數 / 途徑 病毒 天數
10 1 是 無 (安慰劑) 第0天, IN IA /CA/04/2009 (H1N1) 第22天 存活與體重測定
10 3 是 無 (安慰劑) 第0天, IN IA /Vic/3/1975 (H3N2) 第22天
10 5 是 無 (安慰劑) 第0天, IN IA /Vietnam/1203/2004 (H5N1) 第22天
10 7 是 無 (安慰劑) 第0天, IN IB /Sichuan/379/1999 第22天
10 9 是 AdE (3.2X108 ) 第0天, IN IA /CA/04/2009 (H1N1) 第22天
10 11 是 AdE (3.2X108 ) 第0天, IN IA /Vic/3/1975 (H3N2) 第22天
10 13 是 AdE (3.2X108 ) 第0天, IN IA /Vietnam/1203/2004 (H5N1) 第22天
10 15 是 AdE (3.2X108 ) 第0天, IN IB /Sichuan/379/1999 第22天
10 17 是 無 (安慰劑) 第20天, IN IA /CA/04/2009 (H1N1) 第22天
10 19 是 無 (安慰劑) 第20天, IN IA /Vic/3/1975 (H3N2) 第22天
10 21 是 無 (安慰劑) 第20天, IN IA /Vietnam/1203/2004 (H5N1) 第22天
10 23 是 無 (安慰劑) 第20天, IN IB /Sichuan/379/1999 第22天
10 25 是 AdE (3.2X108 ) 第20天, IN IA /CA/04/2009 (H1N1) 第22天
10 27 是 AdE (3.2X108 ) 第20天, IN IA /Vic/3/1975 (H3N2) 第22天
10 29 是 AdE (3.2X108 ) 第20天, IN IA /Vietnam/1203/2004 (H5N1) 第22天
10 31 是 AdE (3.2X108 ) 第20天, IN IB /Sichuan/379/1999 第22天
5 2 否 普通控制組僅觀察體重增加
[表12]用於細胞激素分析之研究組
小鼠數量 組別編號 是否感染 疫苗 攻擊 觀察 / 測試
劑量 (IFU/ 小鼠 ) 天數 / 途徑 病毒 天數
20 1a 是 無 (安慰劑) 第0天, IN IA /CA/04/2009 (H1N1) 第22天   各組於疫苗接種後第3及第6天，犧牲5隻小鼠用於肺部灌洗   各組於病毒攻擊後第3及第6天，犧牲5隻小鼠用於肺部灌洗
20 5a 是 AdE (3.2X108 ) 第0天, IN IA /CA/04/2009 (H1N1) 第22天
20 9a 是 無 (安慰劑) 第20天, IN IA /CA/04/2009 (H1N1) 第22天
20 13a 是 AdE (3.2X108 ) 第20天, IN   IA /CA/0/2009 (H1N1) 第22天
[表13]用於細胞激素分析之陰性控制組
小鼠數量 組別編號 是否感染 疫苗 觀察 / 測試
劑量 (IFU/ 小鼠 ) 天數 / 途徑
6 4 否 無 (安慰劑) 第0天, IN 各組於疫苗接種後第25及第28天，犧牲3隻小鼠用於肺部灌洗
6 6 否 AdE (3.2X108 ) 第0天, IN
於研究第0或20天透過鼻內途徑對分組小鼠進行疫苗接種。安慰劑組透過相同途徑接受50μl生理食鹽水（PSS）。對於流感病毒攻擊組，透過腹膜內注射ketamine/xylazine（50 mg/kg//5 mg/kg）麻醉小鼠，再於鼻內給藥90μl之A型/CA/04/2009（H1N1p）、A型/Victoria/3/1975（H3N2）、B型/Sichuan/379/1999流感病毒，或75μl之A型/Vietnam/1203/2004 (H5N1)流感病毒。各小鼠之病毒攻擊劑量約為3x LD50 CCID50（細胞培養感染劑量）。於研究第22天對所有小鼠施用病毒攻擊。於攻擊後，觀測所有小鼠於攻擊後第21天之體重減輕與死亡率。
統計分析：產生Kaplan-Meier存活曲線，並透過Log-rank（Mantel-Cox）測試比對，再使用於Prism 5.0f（GraphPad Software Inc., La Jolla, CA）中之Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗進行成對比較。透過變異數分析（ANOVA）進行平均體重分析，再使用Prism 5.0f進行Tukey多重比較測試。
支氣管肺泡灌洗（BAL）：採集血液後立即開始灌洗程序，並於各動物死亡5至10分鐘內完成。將0.75 ml之磷酸鹽緩衝液（PBS）透過氣管導管緩慢輸送至肺部。輸送後立即透過輕抽緩慢抽出液體，並將樣本保存於-80°C。該程序共重複三次，並將各小鼠之灌洗液集中。
肺病毒效價測定：將BAL樣本以2000 × g離心5分鐘。將BAL上清液之10倍稀釋液以一式三份測定MDCK細胞中之感染性病毒，其病毒效價測定係以如前所述（1、2）方式計算。假設變異數相等與常態分布，透過ANOVA於對數轉換數值上評估病毒效價差異。於ANOVA後，使用Prism 5.0f透過Tukey成對比較測試，將各治療值與安慰劑控制組進行比較。
肺細胞激素/趨化因子測定：根據製造商之說明（Quansys Biosciences Q-Plex™Array，Logan，UT），使用基於化學螢光ELISA之測定法，測試取自各肺部灌洗液中樣本（200μl）中之細胞激素與趨化因子。Quansys多重ELISA係為一種定量測試，其以經定義之陣列將16種不同捕獲抗體施用於96孔盤之各孔中。各樣本上清液係以兩種稀釋度測試下列項目：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、MCP-1、IFN-γ、TNF-α、MIP-1α、GM-CSF、及RANTES。
細胞激素與趨化因子之效價係以於肺部灌洗液的pg/ml回報。假設變異數相等與常態分布，透過ANOVA於數值上評估效價差異。此外，使用Prism 5.0f根據感染後的天數，透過雙向ANOVA分析評估治療組之平均值。
結果與討論
本研究確定空腺病毒載體（AdE）針對小鼠體內A型H1N1、H3N2、H5N1流感病毒與B型流感病毒之攻擊感染，提供保護的能力。此外，於接種以及受A型/CA/04/2009（大流行性H1N1）流感病毒攻擊後，評估肺部灌洗液中之細胞激素表現量，以試圖確定AdE載體提供之保護機制。透過鼻內途徑將小鼠接種3.2×108 ifu/50μl之AdE。於攻擊感染之三週前進行單次疫苗接種。此外，本研究評估於攻擊感染2天前施用AdE載體之抗病毒作用。於感染後，在攻擊後第21天觀察所有小鼠之體重減輕與死亡率。
AdE載體經發現於攻擊前20天施用時，可針對A型/CA/04/2009（大流行H1N1）流感病毒攻擊提供100%之保護，而於攻擊前2天施用時可提供80%之保護。在攻擊前20天施用時，AdE載體可針對A型/Victoria/3/75（H3N2）流感病毒提供提供90%之防護。然而，於攻擊前2天施用AdE載體所提供之保護作用並不明顯。於A型/Vietnam/1203/2004（H5N1）流感病毒攻擊前20天施用時，AdE載體無法提供免於死亡之保護，但確實可顯著提升平均死亡天數。然而，於攻擊前2天施用AdE載體時，無法提供針對A型/Vietnam/1203/2004（H5N1）流感病毒之保護。於攻擊前20天施用時，AdE載體亦針對B型/Sichuan/379/9流感病毒提供100%之保護。此外，當受B型/Sichuan/379/9病毒攻擊前2天施用時，AdE載體可提供90%之保護。AdE載體僅可針對B型/Sichuan/379/9流感病毒攻擊後之體重減輕提供顯著保護。於第0天及第20天之兩次AdE施用，皆針對受攻擊後之體重減輕提供保護。於攻擊前20天接受AdE之小鼠組與同等天數之安慰劑控制組相比，顯示出A型/CA/04/2009（大流行性H1N1）流感病毒效價降低了1至2個對數。
為辨明透過由AdE載體之免疫作用所提供保護之免疫機制，測定於A型/CA/04/2009（大流行性H1N1）流感病毒感染之肺部灌洗液中細胞激素與趨化因子之表現。於接種後第3天及第6天、接種後第25天及第28天、以及攻擊後第3天及第6天（等同於接種後第25天及第28天），測量IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、MCP-1、IFN-γ、TNF-α、MIP-1α、GM-CSF、及RANTES之表現。據此觀察到細胞激素及趨化因子表現量之顯著變化。與安慰劑控制組相比，攻擊感染後發現IL-1α、IL-6與IL-12p70顯著降低，對於IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、TNF-α、MIP-1α、及GM-CSF則未觀察到顯著變化。當於攻擊前20天施用AdE時，於攻擊後第3天觀察到IL-1α表現顯著降低（p＜0.01）。於接種AdE而後遭受攻擊時，觀察到肺部灌洗液中之IL-6表現顯著降低（p＜0.01）（例如，當於攻擊前20天施用AdE，於攻擊之後第6天）。當於攻擊前20天施用AdE時，於攻擊後第3天觀察到肺部灌洗液中之IL-12p70表現顯著降低（p＜0.01）。疫苗接種後與攻擊感染後，觀察到肺部灌洗液中之MCP-1與IFN-γ表現發生顯著（p＜0.01）變化。所有AdE治療組之MCP-1表現量於疫苗接種後第3、6、25及28天均增加。然而，當於攻擊前20天施用AdE，則於攻擊後第6天之MCP-1表現量下降。當於攻擊前2天施用AdE，疫苗接種後第6天之IFN-γ表現量提升，且當於攻擊前20天施用AdE時，維持升高直到疫苗接種後第25天及第28天（p ＜0.001）。此外，當於攻擊前2天施用AdE，於攻擊後第6天之IFN-γ表現量提升約10倍。接種後第3天（p＜0.0001）、第6天（p＜0.001）與第25天（p＜0.01），觀察到RANTES表現量顯著變化。此數據係總結於表14中。 [表14]
施用 AdE 是否感染 ? 施用 AdE 後肺部灌洗液收集 下降 提升
第0天 否 第3天   MCP-1 RANTES (CCL5)
第0天 否 第6天   MCP-1 IFN-γ RANTES (CCL5)
第0天 否 第25天   MCP-1 IFN-γ RANTES (CCL5)
第0天 否 第28天   MCP-1 IFN-γ
研究於第22天攻擊
第0天 是 第25天 (攻擊後第3天) IL-1　 IL-12  
第0天 是 施用AdE後第28天 (攻擊後第6天) IL-6 MCP-1  
第20天 是 第5天(攻擊後第3天；等同此研究第25天)    
第20天 是 第8天(攻擊後第6天；等同此研究第28天)   IFN-γ
結論
本範例描述空腺病毒載體（AdE）做為疫苗之用途，以抵抗小鼠體內A型H1N1、H3N2、H5N1流感病毒與B型流感病毒攻擊感染。於攻擊感染前3週或攻擊感染前2天進行單次疫苗接種。值得注意者，當於攻擊前20天施用AdE時，提供了針對所有攻擊病毒株之保護。所觀察到針對H5N1病毒之存活效果實際上並非來自死亡率，而係為死亡之平均天數增加。此外，當於攻擊前2天施用，透過AdE載體係可提供針對H1N1與B型流感病毒攻擊之保護。於疫苗接種後2天觀察到之保護作用係代表先天免疫機制。然而，先天免疫力預期無法持續超過於病毒感染後第4天。因此，經觀察，小鼠受病毒攻擊後僅有2天受到免疫保護，接種疫苗後則可維持3週受到保護，此係代表具有一種以上之作用機制。根據疫苗接種後與受攻擊後MCP-1及IFN-γ之表現量上升，係代表提示一種可能機制為接種AdE疫苗將導致MCP-1升高，進而徵集單核球、嗜中性球、及/或淋巴細胞，並刺激IFN-γ之產生。
範例 3 ：針對 SARS-CoV-2 疫苗接種之 AdE 人類臨床試驗
於此範例中，係描述鼻內（i.n.）施用AdE載體（即，複製缺陷型ΔE1E3腺病毒5型（Ad5）病毒顆粒，其Ad5基因組中未編碼一外源性非Ad病原體抗原），以提供針對SARS-CoV-2之預防性療法。為建立包含AdE載體之免疫原性組合物針對SARS-CoV-2之免疫原性與/或保護能力，將包含AdE病毒顆粒（vp）之AdE免疫原性組合物施用於人類受試者，並測試其中針對SARS-CoV-2之免疫反應。為此，可進行一項隨機、雙盲、安慰劑控制、劑量遞增之臨床試驗，以評估AdE免疫原性組合物於18至49歲健康成年人體內之安全性與免疫原性。受試者通常係於隨機分配中28天內經過篩選（第1天）。
例如，研究可包括兩部分；A部分評估AdE免疫原性組合物之安全性，B部分評估其免疫原性。於A部分中，徵集約120名滿足所有納入及不排除標準、並經提供書面告知同意之受試者，分為各30名受試者之四個連續群組，各組分別由AdE劑量定義（1×108 、1×109 、1×1010 、與1×1011 vp）。於各群組中（以及第一劑量群組中之前哨組）中，將受試者以4:1:1之比例隨機分配，以接受一劑AdE免疫原性組合物（第1天）之鼻內用劑或一劑安慰劑（生理食鹽水）（第1天）之鼻內用劑。該AdE免疫原性組合物及安慰劑係以雙盲方式施用。透過判定發生局部事件受試者之數量與百分比，以確定反應原性，該等事件包括但不限於接種後14天內出現鼻腔刺激、打噴嚏、鼻塞、咳嗽、咽喉痛、嗅覺改變、味覺改變、視力改變、眼睛痛、疼痛、易壓痛、硬結、紅斑、局部淋巴結腫大、及全身性事件（頭痛、疲勞、肌肉痛、噁心、嘔吐、腹瀉、咳嗽、發冷、發燒）。不良事件（AE）之判定係根據自第1天至第57天產生AE之受試者計數與百分比；於施用AdE免疫原性組合物後第1天至第181天之就醫性AE（MAAE）、嚴重AE（SAE）、及新發慢性病（NCI）。例如，可於第4、8、15、22、29、及57天進行針對性與症狀驅動之身體檢查，包括生命徵像檢查；可於第57天進行心電圖檢查；可於第8天及第57天進行安全性實驗室測試；以及於第8、15、22、29、57、91、181、及361天採集血清樣本用於免疫原性測試。A部分中安全性評估之主要終點，為受試者於接種後所記錄之設定紀錄不良事件(solicited AEs)與非設定紀錄不良事件(unsolicited AEs)之數量及百分比（95%信賴區間（CI））。使用「安全性分析群體(Safety Population)」執行安全性分析。按組別總結發生局部事件與全身事件之受試者數量（百分比，95% CI）以及反應原性。依照選用詞（preferred term，PT）與組別對各調節活動醫學詞典（Medical Dictionary for Regulatory Activities）器官系統分類（SOC）匯總了第1天到第57天發生AE之受試者（包括MAAE、NCI、SAE）人數（百分比，95% CI）。自第1天至第181天，發生MAAE、NCI與SAE之受試者的數量（百分比）係以類似方式匯總。根據嚴重程度以及與研究產品（IP）之關係所導致發生AE之受試者人數（百分比，95% CI）亦加以匯總。並提供AE、MAAE、NCI、及SAE之清單。
於B部分，係確定AdE免疫原性組合物之免疫原性。以單次劑量為1×108 、1×109 、1×1010 、與1×1011 vp，以及對於受試者於這些劑量中耐受性最佳係做為兩劑（相隔3週），透過鼻內噴霧施用AdE免疫原性組合物後，可透過ELISA測量血清中抗SARS-CoV-2抗原之抗體以測量免疫反應，並確定幾何平均效價(GMT)、幾何平均效價比值（GMR）（同一劑量組內接種後與接種前之GMT比值）、及反應率（施藥後IgG升高＞4倍）。例如，將約25名滿足所有納入與不排除標準、並經提供書面告知同意之受試者，以4：1的比例隨機分配，以接受來自A部分之最佳耐受性劑量於鼻內間隔21天（第1天和第22天）施用兩次AdE免疫原性組合物或安慰劑。該AdE免疫原性組合物及安慰劑係以雙盲方式施用。AdE免疫原性組合物及安慰劑之鼻內藥劑係施用予呈坐姿或斜躺姿勢之受試者。於B部分，可於第8、15、22、29、36、43、50、及57天進行針對性與症狀驅動之身體檢查，包括生命徵像檢查；可於第57天進行心電圖檢查；可於第8天、第29天、及第57天進行安全性實驗室測試；可於第8、15、22、29、57、91、181、及361天採集血清樣本用於免疫原性檢查；以及於第8、15、29、36、43、50、57、及91天採集鼻咽拭子。篩檢時以及第29與57天採集之鼻咽樣本亦於隨後進行測試，以評估黏膜免疫反應。
於些許實施例中，可使用已受SARS-CoV-2感染且已經確定臨床改善與/或恢復時間之患者（或於些許實施例中，為接受過測試之患者群體），進行臨床試驗。主要成果基準係為臨床改善時間（TTCI）與/或臨床恢復時間（TTCR），其等係於施用前述AdE組合物達28天後所確定。TTCI係定義為自研究治療（主動或安慰劑）之起始至臨床狀態自1（出院）至6（死亡）之六類序數量表隨機等級中下降兩類序數之時間（以天為單位）。該六類序數量表如下：6為死亡；5為ICU，需要葉克膜（ECMO）與/或侵入性機械通氣（IMV）；4為加護病房（ICU）/住院治療，需要非侵入性機械通氣（NIV）/高流量鼻導管（HFNC）治療；3為住院治療，需要補充氧氣（但不需要NIV/HFNC）；2為住院治療，不需要補充氧氣；1為出院或達出院標準（出院標準係定義為臨床恢復，即發燒、呼吸頻率、血氧飽和度恢復正常，以及止咳）。次要結果TTCI基準包括總死亡率（篩選時基線SpO2、PaO2/FiO2 ＜300mmHg、或無補充氧氣下呼吸速率≥24次/分鐘）；呼吸進程之頻率（室內空氣中SpO2≤94%或PaO2/FiO2 ＜300mmHg，並需要補充氧氣或需要更進一步之呼吸器支持）；退燒時間（入院時發燒者）；咳嗽經回報為輕度或無的時間（入院時咳嗽為嚴重或中度者）；呼吸困難經回報為輕度或無的時間（於入院時呼吸困難程度判定為重度或中度者，按嚴重、中度、輕度與無之比例）；需補充氧氣或非侵入性通氣之頻率；咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中，SARS-CoV-2 RT-PCR呈陰性之時間；根據病毒載量曲線下之面積（例如，使用聚合酶連鎖反應（PCR）測定），評估咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中SARS-CoV-2病毒載量之變化（減少）；機械通氣之需求頻率；以及嚴重不良事件之頻率。TTCI之定義係為自開始研究治療（活性或安慰劑）至發燒、呼吸頻率與血氧飽和度正常化以及持續至少72小時之咳嗽緩解為止的時間（以小時為單位）。主要TTCR結果基準包括正常化與緩解標準；發燒：腋溫≤36.9°C或口溫≤37.2°C；呼吸頻率：於室內空氣中≤24/分鐘；血氧飽和度：於室內空氣中＞ 94%；以及咳嗽：據患者回報為嚴重、中度、輕度、無等程度中之輕度或無。次要TTCR結果基準係與上述TTCI次要結果相同。
利用標準臨床試驗設計及統計方法進行其等之分析。例如，本研究之樣本大小係為充足且合理，以便於耐受性佳之劑量下初步檢視AdE免疫原性組合物之安全性及免疫原性，而非以統計效力（例如，如上所述之120名受試者）為主要訴求。樣本大小允許反應原性之初步評估。例如，假設共100名受試者接受AdE免疫原性組合物，則該研究係經設計為具有80%之概率檢測到至少一種發生率為1.6%之AE。若於接受AdE免疫原性組合物之100名受試者中未觀察到SAE，則SAE發生率之95%信賴區間（CI）之單尾上限將趨近為3%。免疫學分析係使用可評估(Evaluable)及依計畫書（Per-protocol，PP）群體進行，主要結論係取自PP群體。僅當將任何一組別中之＞1個受試者排除於PP群體外時，才進行並提出根據可評估群體之分析。如下所述，透過例外反應者分析，不對缺失數據進行任何插補。於分析前，將數據進行適當轉換。基線定義為於第1天施用AdE免疫原性組合物之前收集之樣本。評估對SARS-CoV-2之體液與細胞免疫反應（例如，細胞介導之反應）所需之主要變數係經過確定。於些許實施例中，亦可使用Fisher精確檢驗將各AdE免疫原性組合物劑量組中之反應者與安慰劑組者進行比較。為確定施藥前Ad5血清抗體程度對於第29天（A部分）或第50天（B部分）之AdE免疫組合物之免疫原性的影響，分析係使用ANCOVA進行，以基線Ad5效價為共變數。黏膜免疫原性分析係使用可評估及PP群體進行。不對缺失之數據進行插補。分析終點為透過ELISA測量之IgA抗體表現量的GMT和GMR。連續參數（安全實驗室測試與生命徵像）之匯總統計數據按組別顯示如下：疫苗接種前、疫苗接種後、以及自疫苗接種前至疫苗接種後之評估變化。於研究疫苗接種後，將具有疫苗接種後安全實驗室值或生命徵像值經回報為新進異常（即，毒性等級相對於基線值增加，且嚴重程度等級為中度或更高之事件）之受試者數量及百分比加以羅列。將根據嚴重程度等級交叉列出各受試者之疫苗接種前與疫苗接種後安全實驗室數值之變化表製妥。將具有正常、異常無臨床顯著意義、及異常有臨床顯著意義之ECG判讀的受試者之數量與百分比作匯總。對於Ad5載體之脫落(shedding)，數據係以時間點的計數與陽性百分比進行匯總，並提供中位拷貝數。對於各AdE免疫原性組合物組別以及所有免疫原性組合物劑量組，呈現Ad5脫落之中位持續時間、四分位數間距、Ad5脫落之最小與最大持續時間。亦列出用於評估腺病毒感染之病毒培養結果。
此等研究將顯示，該AdE組合物可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其係為一免疫原性組合物），並表現出可接受之安全性。較佳者，該免疫反應於統計學上具有顯著意義，甚至更理想地為一保護性免疫反應（即，其係為SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，數據顯示該AdE組合物可用於治療感染SARS-CoV-2之受試者（例如住院患者）。
範例 4
A. 重組人類腺病毒 5 型 SARS-CoV-2 （ hAd5-SARS-CoV-2 ）之產生
E1/E3剔除之複製缺陷型hAd5，其選擇性使用組織血纖維蛋白溶酶原活化因子（tPA）前導序列並後接一經密碼子優化核苷酸序列，該核苷酸序列編碼至少一種SARS-CoV-2蛋白（例如SEQ ID NO：2至11中任一者或多者，以及/或其等之一個或多個片段及/或衍生物）。將含有巨細胞病毒（CMV）啟動子及SARS-CoV-2編碼序列之基因表現匣插入hAd5之E1區域。該載體於本文中稱為「hAd5-SARS-CoV-2」。
為研究來自hAd5-SARS-CoV-2疫苗之SARS-CoV-2蛋白的表現量，以使用抗SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白之兔多株抗體之西方點墨法，比較SARS-CoV-2感染的Vero細胞之SARS-CoV-2蛋白表現。西方點墨法顯示hAd5-SARS-CoV-2疫苗於感染細胞中表現出S。亦將該經表現S抗原定序以驗證天然序列。
B. hAd5-SARS-CoV-2 疫苗的免疫原性
為理解hAd5-SARS-CoV-2疫苗之免疫原性，用足夠數量（例如1x107 ）之hAd5-SARS-CoV-2病毒顆粒對八周大之小鼠（例如，野生型或轉基因型，條件為其等表現出對SARS-CoV-2之受體）施以鼻內（i.n.）免疫。於第8天，即T細胞適應性免疫反應之高峰期，對一部分疫苗接種小鼠實施安樂死，並透過細胞內細胞激素染色及/或IFN-γ ELISpot，評估SARS-CoV-2抗原特異性CD8+ T細胞反應。以覆蓋該抗原及/或一免疫顯性SARS-CoV-2胜肽之胜肽庫刺激脾臟或PBMCs T細胞，並測定產生IFN-γ之T細胞頻率。接種疫苗二十一天後，對小鼠放血以估算血清抗體反應。SARS-CoV-2特異性ELISA係用以確定SARS-CoV-2 S特異性免疫球蛋白（IgG）反應。單次hAd5-SARS-CoV-2疫苗接種可能產生一SARS-CoV-2 S特異性IgG反應，例如，相對於倒數平均終點效價低於檢測底限之未接種動物，具有較高倒數平均終點。為確定中和抗體之量，係完成灶點減少中和試驗(focus reduction neutralization test)。
C. SARS-CoV-2 之中和
可使用取自如此段B節所述免疫小鼠之血清，利用溶斑減少或感染foci減少之方法，確定該疫苗之病毒中和能力。將具有SARS-CoV-2 S之野生型、減毒型或VSV假型，與免疫接種疫苗之小鼠血清的各種稀釋度混合，並於室溫下培養30分鐘，再感染Vero或其他合適細胞株。其後，將病毒中和作用量化為可將溶斑或感染foci數量減少一預定值（例如50%）之最高抗體稀釋度。
D. hAd5-SARS-CoV-2 免疫原性組合物之保護能力
為建立SARS-CoV-2免疫原性組合物之保護能力，鼻腔內施用足量之hAd5-SARS-CoV-2病毒顆粒（例如1x107 ）予小鼠或其他合適囓齒動物（例如表現該病毒受體之轉基因囓齒動物）。於21天後，以SARS-CoV-2對該等動物以及接種磷酸鹽緩衝液（PBS）之控制組同時進行感染攻擊，並監測其存活率。於激烈攻擊後，發現所有接種PBS之控制組小鼠均表現出症狀並/或死於SARS-CoV-2感染，而多數接種hAd5-SARS-CoV-2之小鼠存活。對疾病之臨床徵像紀錄十二天，發現與未接種疫苗之控制組相比，於接種hAd5-SARS-CoV-2疫苗之小鼠有所改善。此種結果將證明，該hAd5-SARS-CoV-2疫苗可誘導保護性反應，進而降低此動物模型中之疾病嚴重程度。
E. 其他
如所屬技術領域中具有通常知識者可理解，可將另一種此類載體（例如，AdE、AdD）取代hAd5-SARS-CoV-2，以使用一種或多種其他rdAd抗SARS-CoV-2載體（例如，AdE，AdD）進行上述之測試。如所屬技術領域中具有通常知識者可理解，可根據所測試之特定rdAd抗SARS-CoV-2載體，調整結果之產生與解釋。
範例 5 ：用於 SARS-CoV-2 疫苗接種之 hAd5-SARS-CoV-2 人體臨床試驗
為建立包含hAd5-SARS-CoV-2病毒顆粒（vp）與至少一種藥學上可接受賦形劑之hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物的免疫原性及/或保護能力，將同等物施用於人類受試者，並測試其對於此類受試者針對SARS-CoV-2之免疫反應的影響，以及對於感染SARS-CoV-2患者（例如住院患者）之臨床改善時間及/或恢復時間的影響。為此進行一項隨機、雙盲、安慰劑控制、劑量遞增之臨床試驗，以評估hAdv5-SARS-CoV-2組合物於18至49歲健康成年人體內之安全性與免疫原性。受試者通常係於隨機分配中28天內經過篩選（第1天）。
例如，研究可包括兩個部分；A部分評估hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物之安全性，B部分評估免疫原性。於A部分中，徵集約120名滿足所有納入及不排除標準、並經提供書面告知同意之受試者，分為各30名受試者之四個連續群組，各組分別由hAdv5-SARS-CoV-2劑量定義（1×108 、1×109 、1×1010 、與1×1011 vp）。於各群組中（以及第一劑量群組中之前哨組）中，將受試者以4:1:1之比例隨機分配，以接受一劑hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物（第1天）之鼻內用劑或一劑安慰劑（生理食鹽水）（第1天）之鼻內用劑。該hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物及安慰劑係以雙盲方式施用。透過判定發生局部事件受試者之數量與百分比，以確定反應原性，該等事件包括但不限於接種後14天內出現鼻腔刺激、打噴嚏、鼻塞、咳嗽、咽喉痛、嗅覺改變、味覺改變、視力改變、眼睛痛、疼痛、易壓痛、硬結、紅斑、局部淋巴結腫大、及全身性事件（頭痛、疲勞、肌肉痛、噁心、嘔吐、腹瀉、咳嗽、發冷、發燒）。不良事件（AE）之判定係根據自第1天至第57天產生AE之受試者計數與百分比；於施用hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物後第1天至第181天之就醫性AE（MAAE）、嚴重AE（SAE）、及新發慢性病（NCI）。例如，可於第4、8、15、22、29、及57天進行針對性與症狀驅動之身體檢查，包括生命徵像檢查；可於第57天進行心電圖檢查；可於第8天及第57天進行安全性實驗室測試；以及於第8、15、22、29、57、91、181、及361天採集血清樣本用於免疫原性測試（例如，酵素連結免疫吸附分析法（ELISA），以測量血清中抗SARS-CoV-2抗原之抗體，與第0天（基線）相比之幾何平均效價（GMT））。亦可依以下說明確定反應率（例如，給藥後IgG升高≥4倍）。A部分中安全性評估之主要終點，為受試者於接種後所記錄之設定紀錄不良事件(solicited AEs)與非設定紀錄不良事件(unsolicited AEs)之數量及百分比（95%信賴區間（CI））。使用「安全性分析群體(Safety Population)」執行安全性分析。按組別總結發生局部事件與全身事件之受試者數量（百分比，95% CI）以及反應原性。依照選用詞（preferred term，PT）與組別對各調節活動醫學詞典器官系統分類（SOC）匯總自第1天到第57天發生AE之受試者（包括MAAE、NCI、SAE）人數（百分比，95% CI）。自第1天至第181天，發生MAAE、NCI與SAE之受試者的數量（百分比）係以類似方式匯總。根據嚴重程度以及與研究產品（IP）之關係所導致發生AE之受試者人數（百分比，95% CI）亦加以匯總。並提供AE、MAAE、NCI、及SAE之清單。
於B部分，係確定hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物之免疫原性。以單次劑量1×108 、1×109 、1×1010 、與1×1011 vp，以及對於受試者於這些劑量中耐受性最佳係做為兩劑（相隔3週），透過鼻內噴霧施用hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物後，可透過ELISA測量血清中抗SARS-CoV-2抗原之抗體以測量免疫反應，並確定幾何平均效價(GMT)、幾何平均效價比值（GMR）（同一劑量組內接種後與接種前之GMT比值）、及反應率（施藥後IgG升高≥4倍）。例如，將約25名滿足所有納入與不排除標準、並經提供書面告知同意之受試者，以4：1的比例隨機分配，以接受來自A部分之最佳耐受性劑量於鼻內間隔21天（第1天和第22天）施用兩次hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物或安慰劑。該hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物及安慰劑係以雙盲方式施用。該hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物及安慰劑之鼻內藥劑係施用予呈坐姿之受試者。於B部分，可於第8、15、22、29、36、43、50、及57天進行針對性與症狀驅動之身體檢查，包括生命徵像檢查；可於第57天進行心電圖檢查；可於第8天、第29天、及第57天進行安全性實驗室測試；可於第8、15、22、29、57、91、181、及361天採集血清樣本用於免疫原性檢查；以及於第8、15、29、36、43、50、57、及91天採集鼻咽拭子。篩檢時以及第29與57天採集之鼻咽樣本亦於隨後進行測試，以評估黏膜免疫反應。
可使用已受SARS-CoV-2感染且已經確定臨床改善與/或恢復時間之患者（或於些許實施例中，為接受過測試之患者群體），進行臨床試驗。主要成果基準係為臨床改善時間（TTCI）與/或臨床恢復時間（TTCR），其等係於施用前述hAdv5-SARS-CoV-2組合物達28天後所確定。TTCI係定義為自研究治療（主動或安慰劑）之起始至臨床狀態自1（出院）至6（死亡）之六類序數量表隨機等級中下降兩類序數之時間（以天為單位）。該六類序數量表如下：6為死亡；5為ICU，需要葉克膜（ECMO）與/或侵入性機械通氣（IMV）；4為加護病房（ICU）/住院治療，需要非侵入性機械通氣（NIV）/高流量鼻導管（HFNC）治療；3為住院治療，需要補充氧氣（但不需要NIV/HFNC）；2為住院治療，不需要補充氧氣；1為出院或達出院標準（出院標準係定義為臨床恢復，即發燒、呼吸頻率、血氧飽和度恢復正常，以及止咳）。次要結果TTCI基準包括總死亡率（篩選時基線SpO2、PaO2/FiO2 ＜300mmHg、或無補充氧氣下呼吸速率≥24次/分鐘）；呼吸進程之頻率（室內空氣中SpO2≤94%或PaO2/FiO2 ＜300mmHg，並需要補充氧氣或需要更進一步之呼吸器支持）；退燒時間（入院時發燒者）；咳嗽經回報為輕度或無的時間（入院時咳嗽為嚴重或中度者）；呼吸困難經回報為輕度或無的時間（於入院時呼吸困難程度判定為重度或中度者，按嚴重、中度、輕度與無之比例）；需補充氧氣或非侵入性通氣之頻率；咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中，2019-nCoV-2 RT-PCR呈陰性之時間；咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中SARS-CoV-2病毒載量之變化（減少）；咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中2019-nCoV-2病毒載量之變化（減少）；根據病毒載量曲線下之面積（例如，使用聚合酶連鎖反應（PCR）測定）評估之咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中SARS-CoV-2病毒載量之變化（減少）；機械通氣之需求頻率；以及嚴重不良事件之頻率。TTCI之定義係為自開始研究治療（活性或安慰劑）至發燒、呼吸頻率與血氧飽和度正常化以及持續至少72小時之咳嗽緩解為止的時間（以小時為單位）。主要TTCR結果基準包括正常化與緩解標準；發燒：腋溫≤36.9°C或口溫≤37.2°C；呼吸頻率：於室內空氣中≤24/分鐘；血氧飽和度：於室內空氣中＞ 94%；以及咳嗽：據患者回報為嚴重、中度、輕度、無等程度中之輕度或無。次要TTCR結果基準係與上述TTCI次要結果相同。
利用標準臨床試驗設計及統計方法分析自試驗取得之數據。例如，本研究之樣本大小係為充足且合理，以便於耐受性佳之劑量下初步檢視hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物之安全性及免疫原性，而非以統計效力（例如，如上所述之120名受試者）為主要訴求。樣本大小允許反應原性之初步評估。例如，假設共100名受試者接受hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物，則該研究係經設計為具有80%之概率檢測到至少一種發生率為1.6%之AE。若於接受hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物之100名受試者中未觀察到SAE，則SAE發生率之95%信賴區間（CI）之單尾上限將趨近為3%。免疫學分析係使用可評估(Evaluable)及依計畫書（Per-protocol，PP）群體進行，主要結論係取自PP群體。僅當將任何一組別中之＞1個受試者排除於PP群體外時，才進行並提出根據可評估群體之分析。如下所述，透過例外反應者分析，不對缺失數據進行任何插補。於分析前，將數據進行適當轉換。基線定義為於第1天施用hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物之前收集之樣本。評估對SARS-CoV-2之體液免疫反應之主要變數係為抗SARS-CoV-2抗原之IgG效價。於基線與疫苗接種後第8、15、22、29、57、91、及181天（A部分）以及第8、15、22、29、36、43、50、91、及181天（B部分）確定GMT，並按劑量分組進行匯總。於hAdv5-SARS-CoV-2組合物劑量與安慰劑之間的比較透過共變異數分析（ANCOVA）進行評估，其以抗SARS-CoV-2 IgG之基線後對數轉換表現量(post-baseline log-transformed level)做為依變項(dependent variable)中，係將實驗處理(treatment)做為固定效果，將基線對數轉換表現量做為共變數(covariate)。自此等分析中取得於對數尺度上之最小平方（LS）平均值、LS實驗處理差異、以及實驗處理差異之95% CI。透過指數化將結果轉換回原始尺度，以提供各研究日之實驗處理幾何LS平均值、幾何LS平均比值之點估計值、以及該等比值之95% CI。「反應者」係定義為於第8、15、22、29、57、91、及181天（A部分）以及第8、15、22、29、36、43、50、91、及181天（B部分），抗SARS-CoV-2抗原之效價較基線升高4倍之受試者。利用未經+1轉換之插補後數值計算用於確定反應者狀態之倍數變化，即倍數變化=當前插補值/基線插補值。根據各劑量組別之百分比與該百分比之95% Clopper-Pearson精確CI，羅列反應率。提出95% CI之差異，以比較各hAdv5-SARS-CoV-2組合物劑量組對安慰劑組之反應率。於些許實施例中，亦可使用Fisher精確檢驗將各hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物劑量組中之反應者與安慰劑組者進行比較。為確定施藥前Ad5血清抗體程度對於第29天（A部分）或第50天（B部分）之hAdv5-SARS-CoV-2免疫組合物之免疫原性的影響，分析係使用ANCOVA進行，以基線Ad5效價為共變數。黏膜免疫原性分析係使用可評估及PP群體進行。不對缺失之數據進行插補。分析終點為透過ELISA測量之IgA抗體表現量的GMT和GMR。所使用方法與體液免疫原性分析相同。連續參數（安全實驗室測試與生命徵像）之匯總統計數據按組別顯示如下：疫苗接種前、疫苗接種後、以及自疫苗接種前至疫苗接種後之評估變化。於研究疫苗接種後，將具有疫苗接種後安全實驗室值或生命徵像值經回報為新進異常（即，毒性等級相對於基線值增加，且嚴重程度等級為中度或更高之事件）之受試者數量及百分比加以羅列。將根據嚴重程度等級交叉列出各受試者之疫苗接種前與疫苗接種後安全實驗室數值之變化表製妥。將具有正常、異常無臨床顯著意義、及異常有臨床顯著意義之ECG判讀的受試者之數量與百分比作匯總。對於Ad5載體之脫落(shedding)，數據係以時間點的計數與陽性百分比進行匯總，並提供中位拷貝數。對於各hAdv5-SARS-CoV-2免疫原性組合物組別以及所有hAdv5-SARS-CoV-2組合物劑量組，呈現Ad5脫落之中位持續時間、四分位數間距、Ad5脫落之最小與最大持續時間。亦列出用於評估腺病毒感染之病毒培養結果。
此等研究將顯示，該hAdv5-SARS-CoV-2組合物可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其係為一免疫原性組合物），並表現出可接受之安全性。較佳者，該免疫反應於統計學上具有顯著意義，甚至更理想地為一保護性免疫反應（即，其係為SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，數據顯示該hAdv5-SARS-CoV-2組合物可用於治療感染SARS-CoV-2之受試者（例如住院患者）。
範例 6 ：針對 SARS-CoV-2 疫苗接種之 AdD 載體人體臨床試驗
於此範例中，係描述鼻內（i.n.）施用AdD載體（即，複製缺陷型ΔE1E3腺病毒5型（Ad5）病毒顆粒，其編碼來自SARS-CoV-2以外之傳染原的病原體抗原，例如流感，如NasoVAX，其為表現流感血凝素（HA）抗原之Ad載體（Ad5），如2019年4月6日申請之第62/830,444號美國專利申請案所述，該文獻經引用方式併入本文並揭露NasoVAX之製備），以提供針對SARS-CoV-2之預防性治療之用途。於實施例中，該AdD載體誘導一免疫反應，較佳者為一保護性免疫反應，以抵抗SARS-CoV-2以及與AdD載體表現的外源抗原相關的病原體。例如，NasoVAX將誘導一免疫反應，以抵抗流感及包括SARS-CoV-2之冠狀病毒。以此方式，AdD係為一雙重疫苗，可誘導針對兩種呼吸道傳染源之免疫反應。
為建立包含AdD載體之組合物針對SARS-CoV-2之免疫原性及/或保護能力，將包含AdD病毒顆粒（vp）之AdD組合物施用於人類受試者，並測試其中針對SARS-CoV-2之免疫反應。為此，可進行一項隨機、雙盲、安慰劑控制、劑量遞增之臨床試驗，以評估AdD免疫原性組合物於18至49歲健康成年人體內之安全性與免疫原性。受試者通常係於隨機分配中28內經過篩選（第1天）。
例如，研究可包括兩個部分；A部分評估AdD組合物（例如NasoVax）之安全性，B部分評估免疫原性。於A部分中，徵集約120名滿足所有納入及不排除標準、並經提供書面告知同意之受試者，分為各30名受試者之四個連續群組，各組分別由AdD劑量定義（1×108 、1×109 、1×1010 、與1×1011 vp），各受試者施用一總量為0.5 ml之單次鼻內劑量，其以一鼻噴霧形式平均分配於鼻孔間（「安慰劑」受試者接受0.5 ml不含AdD之普通生理食鹽水，該劑量亦以鼻噴霧形式平均分配於鼻孔間）。於各群組中（以及第一劑量群組中之前哨組）中，將受試者以4:1:1之比例隨機分配，以接受一劑AdD組合物（第1天）之鼻內用劑或一劑安慰劑（普通生理食鹽水）（第1天）之鼻內用劑。該AdD組合物及安慰劑係以雙盲方式施用。透過判定發生局部事件受試者之數量與百分，以比確定反應原性，該等事件包括但不限於接種後14天內出現鼻腔刺激、打噴嚏、鼻塞、咳嗽、咽喉痛、嗅覺改變、味覺改變、視力改變、眼睛痛、疼痛、易壓痛、硬結、紅斑、局部淋巴結腫大、及全身性事件（頭痛、疲勞、肌肉痛、噁心、嘔吐、腹瀉、咳嗽、發冷、發燒）。不良事件（AE）之判定係根據自第1天至第57天產生AE之受試者計數與百分比；於施用AdD組合物後第1天至第181天之就醫性AE（MAAE）、嚴重AE（SAE）、及新發慢性病（NCI）。例如，可於第4、8、15、22、29、及57天進行針對性與症狀驅動之身體檢查，包括生命徵像檢查；可於第57天進行心電圖檢查；可於第8天及第57天進行安全性實驗室測試；以及於第8、15、22、29、57、91、181、及361天採集血清樣本用於免疫原性測試（例如，酵素連結免疫吸附分析法（ELISA），以測量血清中抗SARS-CoV-2抗原及/或抗D抗原之抗體，與第0天（基線）相比之幾何平均效價（GMT）），以及/或抗SARS-CoV-2及/或抗AdD之免疫細胞反應（例如T細胞反應）。亦可依以下說明確定反應率（例如，給藥後IgG升高≥4倍）。A部分中安全性評估之主要終點，為受試者於接種後所記錄之設定紀錄不良事件(solicited AEs)與非設定紀錄不良事件(unsolicited AEs)之數量及百分比（95%信賴區間（CI））。使用「安全性分析群體(Safety Population)」執行安全性分析。按組別總結發生局部事件與全身事件之受試者數量（百分比，95% CI）以及反應原性。依照選用詞（preferred term，PT）與組別對各調節活動醫學詞典器官系統分類（SOC）匯總自第1天到第57天發生AE之受試者（包括MAAE、NCI、SAE）人數（百分比，95% CI）。自第1天至第181天，發生MAAE、NCI與SAE之受試者的數量（百分比）係以類似方式匯總。根據嚴重程度以及與研究產品（IP）之關係所導致發生AE之受試者人數（百分比，95%CI）亦加以匯總。並提供AE、MAAE、NCI、及SAE之清單。
於B部分，係確定AdD組合物之免疫原性。以單次劑量1×108 、1×109 、1×1010 、與1×1011 vp，以0.5 ml之總量之鼻噴霧形式平均分配於鼻孔間（於些許實施例中，於這些劑量中耐受性最佳係做為兩劑（相隔3週））施用AdD組合物予受試者，可透過ELISA測量血清中抗SARS-CoV-2抗原之抗體及/或抗AdD之抗體，以測量免疫反應，並確定幾何平均效價(GMT)、幾何平均效價比值（GMR）（同一劑量組內接種後與接種前之GMT比值）、反應率（施藥後IgG升高≥4倍）、與免疫細胞反應（例如T細胞反應）。例如，將約25名滿足所有納入與不排除標準、並經提供書面告知同意之受試者，以4：1的比例隨機分配，以接受來自A部分之最佳耐受性劑量於鼻內間隔21天（第1天和第22天）施用兩次AdD組合物或安慰劑。該AdD組合物及安慰劑係以雙盲方式施用。該AdD組合物及安慰劑之鼻內藥劑係施用予呈坐姿或斜躺姿勢之受試者。於B部分，可於第8、15、22、29、36、43、50、及57天進行針對性與症狀驅動之身體檢查，包括生命徵像檢查；可於第57天進行心電圖檢查；可於第8天、第29天、及第57天進行安全性實驗室測試；可於第8、15、22、29、57、91、181、及361天採集血清樣本用於免疫原性檢查；以及於第8、15、29、36、43、50、57、及91天採集鼻咽拭子。篩檢時以及第29與57天採集之鼻咽樣本亦於隨後進行測試，以評估黏膜免疫反應。
於些許實施例中，可使用已受SARS-CoV-2感染且已經確定臨床改善與/或恢復時間之患者（或於些許實施例中，為接受過測試之患者群體），進行臨床試驗。主要成果基準係為臨床改善時間（TTCI）與/或臨床恢復時間（TTCR），其等係於施用前述AdD組合物達28天後所確定。TTCI係定義為自研究治療（主動或安慰劑）之起始至臨床狀態自1（出院）至6（死亡）之六類序數量表隨機等級中下降兩類序數之時間（以天為單位）。該六類序數量表如下：6為死亡；5為ICU，需要葉克膜（ECMO）與/或侵入性機械通氣（IMV）；4為加護病房（ICU）/住院治療，需要非侵入性機械通氣（NIV）/高流量鼻導管（HFNC）治療；3為住院治療，需要補充氧氣（但不需要NIV/HFNC）；2為住院治療，不需要補充氧氣；1為出院或達出院標準（出院標準係定義為臨床恢復，即發燒、呼吸頻率、血氧飽和度恢復正常，以及止咳）。次要結果TTCI基準包括總死亡率（篩選時基線SpO2、PaO2/FiO2 ＜300mmHg、或無補充氧氣下呼吸速率≥24次/分鐘）；呼吸進程之頻率（室內空氣中SpO2≤94%或PaO2/FiO2 ＜300mmHg，並需要補充氧氣或需要更進一步之呼吸器支持）；退燒時間（入院時發燒者）；咳嗽經回報為輕度或無的時間（入院時咳嗽為嚴重或中度者）；呼吸困難經回報為輕度或無的時間（於入院時呼吸困難程度判定為重度或中度者，按嚴重、中度、輕度與無之比例）；需補充氧氣或非侵入性通氣之頻率；上呼吸道樣本中SARS-CoV-2 RT-PCR呈陰性之時間；根據病毒載量曲線下之面積（例如，使用聚合酶連鎖反應（PCR）測定）評估之上呼吸道樣本中SARS-CoV-2病毒載量之變化（減少）；機械通氣之需求頻率；以及嚴重不良事件之頻率。TTCI之定義係為自開始研究治療（活性或安慰劑）至發燒、呼吸頻率與血氧飽和度正常化以及持續至少72小時之咳嗽緩解為止的時間（以小時為單位）。主要TTCR結果基準包括正常化與緩解標準；發燒：腋溫≤36.9°C或口溫≤37.2°C；呼吸頻率：於室內空氣中≤24/分鐘；血氧飽和度：於室內空氣中＞ 94%；以及咳嗽：據患者回報為嚴重、中度、輕度、無等程度中之輕度或無。次要TTCR結果基準係與上述TTCI次要結果相同。
於些許實施例中，可將約120名50歲以上SARS-CoV-2呈陽性之受試者隨機分為安慰劑組及治療組，以進行臨床試驗。安慰劑組接受不包括任何AdD載體之0.5 ml生理食鹽水，以單次鼻內劑量形式做為鼻噴霧劑於鼻孔間平均分配。治療組經施用包括任何AdD載體（即，NasoVax）之0.5ml生理食鹽水，以單次鼻內劑量形式做為鼻噴霧劑於鼻孔間平均分配。主要療效終點為根據用力呼氣1秒量（FEV-1）及放射線攝影標準，產生急性呼吸窘迫症狀（ARDS）與COVID-19最高嚴重程度（即SARS-CoV-2感染症狀）之受試者比例。次要終點包括病毒脫落、機械通氣天數及住院時間。
於其等之分析中利用標準臨床試驗設計及統計方法。例如，本研究之樣本大小係為充足且合理，以便於耐受性佳之劑量下初步檢視AdD組合物之安全性及免疫原性，而非以統計效力（例如，如上所述之120名受試者）為主要訴求。樣本大小允許反應原性之初步評估。例如，假設共100名受試者接受AdD組合物，則該研究係經設計為具有80%之概率檢測到至少一種發生率為1.6%之AE。若於接受hAdv5-D（AdD）免疫原性組合物之100名受試者中未觀察到SAE，則SAE發生率之95%信賴區間（CI）之單尾上限將趨近為3%。免疫學分析係使用可評估(Evaluable)及依計畫書（Per-protocol，PP）群體進行，主要結論係取自PP群體。僅當將任何一組別中之＞1個受試者排除於PP群體外時，才進行並提出根據可評估群體之分析。如下所述，透過例外反應者分析，不對缺失數據進行任何插補。於分析前，將數據進行適當轉換。基線定義為於第1天施用AdD組合物之前收集之樣本。確定評估對SARS-CoV-2之體液與細胞免疫反應之主要變數（例如抗SARS-CoV-2及/或抗AdD抗原之IgG效價、T細胞反應）。於基線與疫苗接種後第8、15、22、29、57、91、及181天（A部分）以及第8、15、22、29、36、43、50、91、及181天（B部分）確定GMT，並按劑量分組進行匯總。於AdD組合物劑量與安慰劑之間的比較透過共變異數分析（ANCOVA）進行評估，其以抗SARS-CoV-2 IgG之基線後對數轉換表現量(post-baseline log-transformed level)做為依變項(dependent variable)中，係將實驗處理(treatment)做為固定效果，將基線對數轉換表現量做為共變數(covariate)。自此等分析中取得於對數尺度上之最小平方（LS）平均值、LS實驗處理差異、以及實驗處理差異之95% CI。透過指數化將結果轉換回原始尺度，以提供各研究日之實驗處理幾何LS平均值、幾何LS平均比值之點估計值、以及該等比值之95% CI。「反應者」係定義為於第8、15、22、29、57、91、及181天（A部分）以及第8、15、22、29、36、43、50、91、及181天（B部分），抗SARS-CoV-2抗原之效價較基線升高4倍之受試者。利用未經+1轉換之插補後數值計算用於確定反應者狀態之倍數變化，即倍數變化=當前插補值/基線插補值。根據各劑量組別之百分比與該百分比之95% Clopper-Pearson精確CI，羅列反應率。提出95% CI之差異，以比較各AdD組合物劑量組對安慰劑組之反應率。於些許實施例中，亦可使用Fisher精確檢驗將各AdD組合物劑量組中之反應者與安慰劑組者進行比較。為確定施藥前Ad5血清抗體程度對於第29天（A部分）或第50天（B部分）之AdD組合物之免疫原性的影響，分析係使用ANCOVA進行，以基線Ad5效價為共變數。黏膜免疫原性分析係使用可評估及PP群體進行。不對缺失之數據進行插補。分析終點為透過ELISA測量之IgA抗體表現量的GMT和GMR。所使用方法與體液免疫原性分析相同。連續參數（安全實驗室測試與生命徵像）之匯總統計數據按組別顯示如下：疫苗接種前、疫苗接種後、以及自疫苗接種前至疫苗接種後之評估變化。於研究疫苗接種後，將具有疫苗接種後安全實驗室值或生命徵像值經回報為新進異常（即，毒性等級相對於基線值增加，且嚴重程度等級為中度或更高之事件）之受試者數量及百分比加以羅列。將根據嚴重程度等級交叉列出各受試者之疫苗接種前與疫苗接種後安全實驗室數值之變化表製妥。將具有正常、異常無臨床顯著意義、以及異常有臨床顯著意義之ECG判讀的受試者之數量與百分比作匯總。對於Ad5載體之脫落(shedding)，數據係以時間點的計數與陽性百分比進行匯總，並提供中位拷貝數。對於各AdD組合物組別以及所有AdD組合物劑量組，呈現Ad5脫落之中位持續時間、四分位數間距、Ad5脫落之最小與最大持續時間。亦列出用於評估腺病毒感染之病毒培養結果。
此等研究將顯示，該AdD組合物可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其係為一免疫原性組合物），並表現出可接受之安全性。較佳者，該免疫反應於統計學上具有顯著意義，甚至更理想地為一保護性免疫反應（即，其係為SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，數據顯示該AdD組合物可用於治療感染SARS-CoV-2之受試者（例如住院患者）。
範例 7 ： NasoVAX 於預防早發性 COVID-19 患者臨床惡化之雙盲、隨機、安慰劑控制研究
於本實施例中，NasoVAX係做為感染早期階段之療法或搭配直接抗病毒劑之合併療法。與COVID-19之治療相關，於臨床前小鼠模型中顯示NasoVAX（及AdE）可提供保護，使其免受呼吸道病毒之致命性攻擊，此效果係發生於最短2天之內並持續3週或以上。參見美國專利第9,175,310號。於前述範例2中，使用AdE（無轉基因表現）係與IL-6、IL-1α、及IL-12之調控降低有關。其等為經顯示可介導COVID-19中之肺間質炎症的細胞激素。NasoVAX與AdE於臨床前小鼠模型中提供之保護作用可能係歸因於腺病毒載體，因為該載體於表現流感血凝素（HA）抗原之轉基因存在與否的情況下皆具有相稱之效果。NasoVAX之保護作用可視為調節先天免疫力之生物學反應，其可減輕對呼吸道病原體之過度與病原性免疫反應。此係類似於使用IL-6抑製劑Kevzara（sarilumab）與Actemra（tocilizumab），以調節與COVID-19相關之肺部炎症。於實施例中，當鼻內給藥腺病毒載體（無論來自呼吸道病原體之轉基因表現與否）時可改善COVID-19疾病症狀。
該載體方法之優勢在於，與可用於調節COVID-19相關肺部炎症之其他藥物（例如，Kevzara（sarilumab）與Actemra（tocilizumab））不同，NasoVAX係經鼻內給藥，可為其他藥物留下靜脈(IV)注射座(access port)；不限於單一細胞激素；不具血液學上之副作用（例如嗜中性球減少症）；並表現較長作用時間，此於疾病過程之極早期階段可用於調節隨後之細胞激素損傷。此外，如下述範例9中所示，腺病毒載體免疫原性組合物經鼻內給藥時，可繞過受試者（例如，對病毒載體，即Ad5，呈血清陽性者）之腺病毒免疫，進而允許對腺病毒呈血清陽性之受試者重複給藥和/或施用。
因此，於些許實施例中，NasoVAX可做為COVID-19感染早期階段之療法或做為合併療法，於些許實施例中與直接抗病毒劑（例如氯奎寧(chloroquine)、亞茲索黴素(azithromycin)）結合。於些許情況下，該藥物物質(substance)可轉變成一種產品，其中係單獨施用該載體（例如，如同AdE無轉基因）。
NasoVAX係透過分離含有大型重組腺病毒質體之細菌菌落而製備，該質體帶有來自A型/California/04/2009流感病毒（pAdcoCA09.HA）之人類密碼子優化血凝素cDNA。使用流式細胞電穿孔技術（Model STX-100，Maxcyte Inc. Gaithersburg，MD）於單次操作中將pAdcoCA09.HA質體大規模轉染至約4 x 109 個細胞，自懸浮液中之PER.C6細胞中回收AdcoCA09.HA重組載體。於收取時，將感染細胞與含有任何經釋放載體之生長培養液進行三次凍融循環，再透過CsCl等密度離心及針對終產物形成緩衝液之透析以分離與純化載體。經純化載體係於PER.C6細胞中擴增，透過三次凍融循環自感染細胞團塊中釋出，以形成一感染細胞溶解產物，其並經離心分離與無菌過濾以做為前種原病毒株（Pre-Master Virus Seed，Pre-MVS）。於測試後釋出NasoVAX Pre-MVS。AdcoCA09.HA之製作包括一載體擴增步驟，藉以於cGMP下擴增preMVS載體，以增加可用於生產過程感染之種原庫。此中間擴增步驟之產物為AdcoCA09.HA MVS。AdcoCA09.HA MVS之生產中，首先為pre-MVS之cGMP載體擴增，而後為MVS之衍生、生產與特徵化。藥物物質(substance)之生產包括於懸浮液中以AdcoCA09.HA感染PER.C6細胞，而後為於細胞團塊中濃縮載體、自細胞團塊中釋放載體、澄清溶解產物，並使用兩連續陰離子交換層析樹脂純化載體。產物洗出液經過製劑緩衝液滲濾，於必要時濃縮，並經無菌過濾以產生原料藥（BDS）。以製劑緩衝液稀釋至適當濃度，並經無菌過濾後填充入最終容器中，藉此自BDS取得最終藥物產品（FDP）。於此範例中，欲使用之測試產品係以一次性玻璃注射器提供之NasoVAX（例如1x109 、1010 與/或1011 vp），該注射器包含500 μL於A195緩衝液（10 mM Tris、10 mM組胺酸、5%（w/v）蔗糖、75 mM 氯化鈉、1 mM 氯化鎂、0.02%（w/v）聚山梨醇酯-80、0.1 mM EDTA、0.5%（v/v）乙醇，pH 7.4）中之無菌冷凍懸浮液。該注射器（BD，Accuspray™）係設計用以向各鼻孔遞送250 μL之鼻噴霧劑。或者，將NasoVAX以2 mL玻璃小瓶提供，其中於鼻內給藥前，將藥劑取出至結核菌素注射器，並固定於LMA MAD300霧化器裝置（Teleflex, Israel）上。將穩定性樣本包裝於相同劑型與容器（BD Accuspray™）中做為測試產品，並使用穩定性指示測定法進行測試，該測定包括病毒顆粒之物理穩定性（病毒顆粒測試，HPLC）、病毒之感染性（感染效價，腺病毒螢光灶點單位（FFU）測定）、腺病毒載體之功能性（轉基因表現）（效價）、製劑之物理穩定性（外觀及pH）、以及無菌性。
於本實施例中係描述一項臨床試驗，其包括約120名早發性COVID-19患者，其等經1：1隨機分配為NasoVAX（1x1011 vp劑量）或安慰劑組別，並按年齡分層。各患者將參與研究長達約6週（2週治療期及1個月電話追蹤）。包含於本研究之患者係利用以下非限制性標準選擇：有能力並願意提供告知後同意書；35歲及以上之男女；早發性COVID-19，其經定義為口腔溫度≥38.0°C、於48小時內發作、並於隨機24小時內透過根據PCR之診斷確認COVID-19；兩次間隔5分鐘之連續測量飽和O2 （SaO2 ）≥96.0%；有生育能力之婦女（非永久不孕之婦女(有子宮切除術、雙側輸卵管結紮術、輸卵管切除術、或卵巢切除術)或絕經後之婦女(無其他醫學原因停經12個月)），於篩選時經尿液妊娠試驗為陰性，並且有意願實施一高效避孕方法，包括但不限於禁慾、僅與同性者發生性行為、與絕經後伴侶之一夫一妻制、與輸精管切除術伴侶伴侶之一夫一妻制、輸精管結紮術、經許可荷爾蒙方法、子宮內避孕器、或於最後一次服用研究藥物後28天內搭配殺精劑持續實施之屏障方法（例如，避孕套、子宮帽）；於最後一劑研究藥物使用後45天內，性伴侶具有生育能力之男性願意採用如上定義之高效避孕方法；以及於完整研究期間有能力及意願於各層面配合研究。排除標準包括：孕婦或哺乳期婦女；休息時出現中度或嚴重呼吸急促；體格檢查結果發現疾病進程迅速、需立即住院、阻塞性氣道疾病，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）與氣喘，或其他可能與COVID-19引起之疾病無關而加劇之呼吸道疾病；可能會影響鼻內藥物適用性之鼻部疾病，例如慢性鼻炎、鼻中隔缺損、上顎缺裂、鼻息肉、或除鼻整形外之鼻腔手術；曾於過去30天內使用氯奎寧(chloroquine)與羥氯奎寧(hydroxychloroquine)及其他研究劑治療COVID-19；篩選後30天內與免疫功能低下有關之病史或已知將影響免疫系統之治療史，包括但不限於口服或靜脈注射皮質類固醇、烷化藥物、抗代謝物、細胞毒性藥物、放射線、免疫調節生物製劑；以及，根據研究人員判斷，任何醫療、精神病學、或社會狀況或職業或其他責任，將干擾或成為依從研究方案、安全性評估（包括反應原性）或患者給予告知後同意書之能力之禁忌症(contraindication)。
於COVID-19診斷之24小時內，將患者以1：1之比例隨機分配，以接受0.5mL單次鼻內劑量（各鼻孔0.25mL）之NasoVAX或安慰劑。前20名研究參與者（約10名接受NasoVAX與10名接受安慰劑），係由年齡介於35至49歲間之前哨群組組成。提供患者拋棄式指尖血氧儀及數位體溫計，並於試驗期間返家。使用行動/智慧型電話脈搏血氧測定法與網路日記，在休息狀態下遠程監測SaO2 、口腔溫度和脈搏呼吸頻率，每天2次各2分鐘，持續14天，以記錄口腔溫度、症狀及伴隨用藥，並每天致電記錄臨床狀況與不良事件（AE）。於遠程監測最後一天後，約每7±2天致電患者一次以記錄最終結果與不良事件(AE)。將記錄SAE、住院天數與ICU天數、以及住院患者死亡率。於研究過程中預期不會進行面對面的訪問。
關於療效，本研究主要目的為評估NasoVAX於預防早發性COVID-19患者臨床惡化之有效性；次要目的為評估NasoVAX於降低早發性COVID-19患者之ICU入院率與機械通氣率、以及降低需住院之早發性COVID-19患者之COVID-19嚴重程度的有效性。主要終點為臨床惡化患者之比例，其定義為居家追蹤或住院期間進行任何測量時，透過行動式脈搏血氧儀測得平均SaO2降低4%至數值為94%或更低。於門診患者中，次要療效終點包括COVID-19之嚴重程度，透過居家追蹤期間門診脈搏血氧儀測定中SaO2與自發通氣率之最大降低量、以及需要機械通氣之患者比例加以評估。於住院患者中，次要療效終點包括不需呼吸器之天數，其定義為患者於研究藥物劑量之第1天及第30天（相對於研究藥物的第一劑）之間的每天算為一點（天），其中患者同時為存活並不使用機械通氣者，以及動脈血氧分壓與吸入氧分率之比（P/F比）。
關於安全性，主要目的為評估NasoVAX於預防早發性COVID-19患者臨床惡化之安全性及耐受性。此等包括不良事件（AE）之發生率與嚴重性、死亡率、住院天數、及ICU天數。安全終點係於家中回報之AE與住院治療期間回報之AE之間分別分類。
統計方法包括檢定力與樣本數假設(Power and Sample Size Assumptions)，即接受NasoVAX之患者中有10%發生臨床惡化，而接受安慰劑之患者則為29%，各治療組之60位患者於單尾a值為0.05時提供77%之統計檢定力，以於主要療效變數上達到統計顯著差異。群體定義包括：「安全性分析集(Safety Analysis Set)」：所有接受任何研究藥物之患者；「治療意向」（Intent to treat，ITT）：所有接受任意劑量研究藥物之隨機分配患者，具有一基線及至少一基線後SaO2 測量值。將受試者根據其等接受之治療方法進行分析；以及「符合計劃」（Per Protocol，PP）：所有隨機分配患者根據正確之治療分配接受任意劑量之研究藥物，並於第14天或住院期間每天取得兩次SaO2 測量結果。基線係定義為於任何研究藥物給藥前最接近隨機分配收集之數據。所有分析及匯總統計資料均按治療組別（NasoVAX、安慰劑）列出。透過治療組別提供描述性統計訊息，包括分類變數之數量與百分比，以及連續變數之數量、平均值、標準差、中位數、最小值及最大值。將患者按1：1比例隨機分配接受NasoVAX或安慰劑，並按年齡組別（35至49歲，與50歲及以上）進行分層。為確保前哨群組中NasoVax與安慰劑之1：1分佈（20名患者中各10名患者），該組隨機分配患者未進行分層。對於療效分析，使用描述性統計數據評估人口統計與基線特徵之差異。對於主要分析，使用Cochran Mantel Haenszel檢測於單尾0.05%達顯著差異，比較NasoVAX與安慰劑組中出現臨床惡化之患者比例，其中臨床惡化之定義為，居家追蹤或住院期間進行任何測量時，透過行動式脈搏血氧儀測得平均SaO2 降低4%至數值為94%或更低。相同方法適用於本質上明確之次要或探索性終點。過早中斷或缺少數據之受試者係視為對該終點無反應者。進行敏感度分析以評估對研究藥物反應之影響部位。採用線性與邏輯回歸檢驗基線因素之影響，例如年齡、性別、藥物與醫療合併症對反應之影響。使用描述性統計數據及頻率分佈總結定量安全性數據，所有總結均由治療組別提供。使用國際醫學用語詞典（Medical Dictionary for Regulatory Activities）（MedDRA® ）對不良事件(AE)進行編碼，並使用世界衛生組織（WHO）藥物詞典對伴隨用藥進行編碼。使用重複測量混合模型（MMRM）分析COVID-19嚴重程度相對於基線之變化，其中COVID-19嚴重程度係透過於居家追蹤時門診脈搏血氧儀測定中SaO2 與自發通氣率之最大降低量進行評估。該模型將包括治療之固定效果、分層因子、每周及每次就診之相互作用(treatment-by-visit interaction)，以及基線水平之連續、共變數。該模型將採用非結構化的患者共變異數矩陣與限制性極大似然（ReML）之估計方法。使用t測試或Mann-Whitney對不需呼吸器之天數進行分析以獲得連續數據。開發Kaplan-Meier模型以比較治療組之間SaO2 隨時間之變化。並未對次要或探索性終點進行多重性調整。
此等研究將顯示NasoVAX可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其係為一免疫原性組合物），並表現出可接受之安全性。數據亦將顯示，NasoVAX可有效降低早發性COVID-19患者之ICU入院率及機械通氣率，並降低需住院治療之早發性COVID-19患者之COVID-19嚴重程度。於些許實施例中，對受試者施用NasoVAX後，可降低例如IL-1α、IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、及/或RANTES（CCL5）等炎性細胞激素之表現（參見例如範例2），且於些許實施例中可用於診斷COVID-19，及/或預測自其恢復之時間並用以對應調整治療方案（例如，非NasoVAX治療）。於些許實施例中，於施用NasoVAX後不久所出現之MCP1及/或RANTES之增加，可用於預測（例如，做為標記）自COVID-19之恢復與症狀之改善。較佳者，該免疫反應於統計學上具有顯著意義，甚至更理想地為一保護性免疫反應（即，其係為SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，數據顯示該NasoVAX可用於治療感染SARS-CoV-2之受試者（例如住院患者）。
範例 8 ： NasoVAX 之室溫穩定度
本實施例敘述NasoVAX在液體製劑中於室溫下之長期穩定性。對於在冷藏或以其他方式穩定製劑之手段皆不可行之疫苗而言，於室溫下長期穩定係為期望特徵。此於傳染或大流行情況下將非常重要，於此期間需要將疫苗運送到缺乏將製劑維持於較低溫之設備的偏遠地區，或直接運送至終端用戶，例如於家中或醫院中自我隔離之個體。如下表15與表16所示，分別製備低劑量（2 x 109 vp/mL劑量）與高劑量（2 x 1011 vp/mL劑量）製劑，並將其於室溫下保持在玻璃小瓶中一、三及六個月。使用腺病毒螢光灶點單位（FFU）測定法確定NasoVAX載體之生存力。簡言之，透過以適當NasoVAX稀釋液感染細胞單層並培養24至48小時，以進行FFU測定。將該等細胞洗滌、檢查、固定（例如以冰冷之90%甲醇持續4分鐘），並再次洗滌。而後以不同稀釋液加入抗Ad5抗體（於控制組樣本中省去抗體），之後於適當條件下（例如於室溫下搖動十分鐘）加入檢測劑（例如NCL-Adeno（Novocastra，Newcastle，UK）。隨後洗滌細胞，並確定感染顆粒之總數（例如，透過動態光散射（DLS））。如表15及16所示，低劑量與高劑量NasoVAX製劑於室溫下穩定至少三個月。
本研究顯示腺病毒載體疫苗組合物（例如，NasoVAX）於環境溫度如室溫（例如15至30℃，較佳者為20至25℃）下穩定約3個月。於實施例中，無需冷藏或特定儲存條件即可儲存或運輸腺病毒載體疫苗組合物。於些許實施例中，本發明之鼻內腺病毒載體疫苗經配置為誘導一免疫反應，以抵抗SARS-CoV-2病毒（大流行性冠狀病毒株）感染及/或減輕COVID-19疾病症狀，並且可直接運送予使用者以供鼻內給藥。 [表15]NasoVAX （ 2 x 109 vp/mL 劑量）之穩定性數據
分析 穩定性時間點
T=0M T=1M T=3M T=6M
外觀 液體、無色；半透明；未觀察到可見微粒物質 液體、無色；半透明；未觀察到可見微粒物質 液體、無色；清澈；未觀察到可見微粒物質 液體、無色；透明；未觀察到可見微粒物質
pH 7.5 7.5 7.7 7.5
HPLC所得vp 1.2 x 109 vp/mL 1.1 x 109 vp/mL 0.9 x 109 vp/mL 1.2 x 109 vp/mL
腺病毒螢光灶點單位 (FFU) 測定 1.1 x 108 FFU/mL 2.3 x 108 FFU/mL 0.7 x 108 FFU/mL 0.1 x 108 FFU/mL
% 感染顆粒 9% 21% 8% 0.4%
DLS所得聚集 66.7 nm 139.7 nm (23% PD) 91.9 nm (14% PD) 107.5 nm (8% PD)
[表16]NasoVAX （ 2 x 1011 vp/mL 劑量）之穩定性數據
分析 穩定性時間點
T=0M T=1M T=3M T=6M
外觀 液體、無色；半透明；未觀察到可見微粒物質 液體、無色；半透明；未觀察到可見微粒物質 液體、無色；半透明；未觀察到可見微粒物質 液體、無色；半透明；未觀察到可見微粒物質
pH 7.6 7.5 7.5 7.6
HPLC所得vp 1.3 x 1011 vp/mL 1.0 x 1011 vp/mL 0.4 x 1011 vp/mL 1.2 x 1011 vp/mL
腺病毒螢光灶點單位 (FFU) 測定 0.9 x 1010 FFU/mL 0.9 x 1010 FFU/mL 0.5 x 1010 FFU/mL 0.1 x 1010 FFU/mL
% 感染顆粒 7% 9% 12% 0.5%
DLS所得聚集 122 nm 118.2 nm (19% PD) 116.9 nm (13% PD) 115.5nm (14% PD)
範例 9 ： NasoVAX 脫落 (Shedding) 及抗 NasoVAX 載體之抗體
NasoVAX先前於2a階段、隨機、雙盲、安慰劑控制組之臨床試驗中經過評估，以評估NasoVAX（單價Adco.CA.HA）對18至49歲健康成人之安全性與免疫原性。將受試者隨機分組，並給予單次劑量之1×109 、1×1010 及1×1011 病毒顆粒（vp）或生理食鹽水安慰劑，所有劑量皆為0.5 mL劑量平均分配，即各鼻孔中約0.25 ml鼻噴霧劑。於2019年4月6日遞交之第62/830,442號美國專利申請案對該實驗流程有所描述。
該研究之次要目的為，評估於施用NasoVAX時對於Ad5呈血清陽性之受試者（與血清陰性之受試者相比）對腺病毒載體（Ad5）之免疫反應。於施用後第4、8及15天，自各受試者收集鼻咽拭子樣本，並透過聚合酶連鎖反應（PCR）測定法定量各受試者之Ad5載體脫落濃度。如圖25所示，直到施用後第8天才檢測到NasoVAX載體之劑量依賴性脫落，而於第15天並未檢測到。未檢測到具有複製能力之病毒。
圖25亦顯示於施用109 vp、1010 vp、或1011 vp之NasoVAX的單次鼻內劑量後，針對NasoVAX之Ad5載體成分的抗體GMR。如其中所示，與控制組相比，最高劑量（1011 vp）之施用出乎意料地僅導致受試者體內抗Ad5載體抗體約2.3倍之誘導效果。此為一重要發現，因其表示鼻內給藥途徑可用於重複給予NasoVAX或潛在其他腺病毒載體免疫原性組合物，包括以Ad5為基礎之載體。
圖26顯示對受試者施用單次鼻內劑量（1011 vp）之NasoVAX後，預存在之抗Ad5免疫力對於Ad5血清狀態之影響。如其中所示，預存在之抗Ad5免疫力（「Ad5血清陽性」（中位數效價較定量下限「LLOQ」高22倍））對於施用鼻內劑量NasoVAX後之體液（HAI）、微中和（MN）、黏膜（IgA）、或細胞性（ELISpot）抗Ad5免疫力幾乎沒有影響。此為另一重要發現，因其表示即使對Ad5已預先具有免疫力之受試者，亦可對其鼻內施用NasoVAX。於實施例中，本發明之鼻內腺病毒載體疫苗係可重複施用（例如，作為季節性疫苗，約每11至14個月施用一次），而不會引起針對病毒載體之重大免疫反應。
範例 10 ：做為 SARS-CoV-2 疫苗之 rdAd 抗 SARS-CoV-2 載體組合人類臨床試驗
於本範例中，係敘述鼻內（i.n.）施用rdAd抗SARS-CoV-2載體之一組合（例如，「組合性之SARS-CoV-2組合物」），以提供針對SARS-CoV-2之預防性治療。為了建立此種免疫原性組合物之免疫原性及/或保護能力，首先將包含AdE之組合物施用一人類，再於七天後施用包含hAd5-SARS-CoV-2之組合物，並測試此組合對人類體內抗SARS-CoV-2免疫反應之作用。連續施用該AdE組合物以及包含hAd5-SARS-CoV-2之組合物，於本文中係稱為「組合性SARS-CoV-2組合物」。為此，可進行一項隨機、雙盲、安慰劑控制、劑量遞增之臨床試驗，以評估組合性SARS-CoV-2組合物於18至49歲健康成年人體內之安全性與免疫原性。受試者通常係於隨機分配中28天內經過篩選（第1天）。
例如，研究可包括兩個部分；A部分評估組合性SARS-CoV-2組合物之安全性，B部分評估免疫原性。於A部分中，徵集約120名滿足所有納入及不排除標準、並經提供書面告知同意之受試者，分為各30名受試者之四個連續群組，各組分別由組合性SARS-CoV-2組合物劑量定義（1×108 、1×109 、1×1010 、與1×1011 vp）。於各群組中（以及第一劑量群組中之前哨組）中，將受試者以4:1:1之比例隨機分配，以接受一劑組合性SARS-CoV-2組合物（第1天接受AdE組合物，並於第7天接受hAd5-SARS-CoV-2組合物）之鼻內用劑或一劑安慰劑（普通生理食鹽水）（第1天及第7天）之鼻內用劑。該組合性SARS-CoV-2組合物及安慰劑係以雙盲方式施用。透過判定發生局部事件受試者之數量與百分比，以確定反應原性，該等事件包括但不限於接種後14天內出現鼻腔刺激、打噴嚏、鼻塞、咳嗽、咽喉痛、嗅覺改變、味覺改變、視力改變、眼睛痛、疼痛、易壓痛、硬結、紅斑、局部淋巴結腫大、及全身性事件（頭痛、疲勞、肌肉痛、噁心、嘔吐、腹瀉、咳嗽、發冷、發燒）。不良事件（AE）之判定係根據自第1天至第57天產生AE之受試者計數與百分比；於施用組合性SARS-CoV-2組合物後第1天至第181天之就醫性AE（MAAE）、嚴重AE（SAE）、及新發慢性病（NCI）。例如，可於第4、8、15、22、29、及57天進行針對性與症狀驅動之身體檢查，包括生命徵像檢查；可於第57天進行心電圖檢查；可於第8天及第57天進行安全性實驗室測試；以及於第8、15、22、29、57、91、181、及361天採集血清樣本用於免疫原性測試（例如，酵素連結免疫吸附分析法（ELISA），以測量血清中抗SARS-CoV-2抗原之抗體，與第0天（基線）相比之幾何平均效價（GMT））。亦可依以下說明確定反應率（例如，給藥後IgG升高≥4倍）。A部分中安全性評估之主要終點，為受試者於接種後所記錄之設定紀錄不良事件(solicited AEs)與非設定紀錄不良事件(unsolicited AEs)之數量及百分比（95%信賴區間（CI））。使用「安全性分析群體(Safety Population)」執行安全性分析。按組別總結發生局部事件與全身事件之受試者數量（百分比，95%CI）以及反應原性。依照選用詞（preferred term，PT）與組別對各調節活動醫學詞典器官系統分類（SOC）匯總自第1天到第57天發生AE之受試者（包括MAAE、NCI、SAE）人數（百分比，95% CI）。自第1天至第181天，發生MAAE、NCI與SAE之受試者的數量（百分比）係以類似方式匯總。根據嚴重程度以及與研究產品（IP）之關係所導致發生AE之受試者人數（百分比，95%CI）亦加以匯總。並提供AE、MAAE、NCI及、SAE之清單。
於B部分，係確定組合性SARS-CoV-2組合物之免疫原性。以單次劑量1×108 、1×109 、1×1010 、與1×1011 vp，透過鼻內噴霧施用組合性SARS-CoV-2組合物後（即對於受試者於這些劑量中耐受性最佳之組合性SARS-CoV-2組合物（第一天接受AdE組合物，並於第7天接受hAd5-SARS-CoV-2組合物）），可透過ELISA測量血清中抗SARS-CoV-2抗原之抗體以測量免疫反應，並確定幾何平均效價(GMT)、幾何平均效價比值（GMR）（同一劑量組內接種後與接種前之GMT比值）、反應率（施藥後IgG升高≥4倍）、以及免疫細胞反應（例如T細胞反應）。例如，將約25名滿足所有納入與不排除標準、並經提供書面告知同意之受試者，以4：1的比例隨機分配，以接受來自A部分之最佳耐受性劑量於鼻內間隔21天（第1天和第22天）施用兩次組合性SARS-CoV-2組合物或安慰劑。該組合性SARS-CoV-2組合物及安慰劑係以雙盲方式施用。該組合性SARS-CoV-2組合物及安慰劑之鼻內藥劑係施用予呈坐姿或斜躺姿勢之受試者。於B部分，可於第8、15、22、29、36、43、50、及57天進行針對性與症狀驅動之身體檢查，包括生命徵像檢查；可於第57天進行心電圖檢查；可於第8天、第29天、及第57天進行安全性實驗室測試；可於第8、15、22、29、57、91、181、及361天採集血清樣本用於免疫原性檢查；以及於第8、15、29、36、43、50、57及91天採集鼻咽拭子。篩檢時以及第29與57天採集之鼻咽樣本亦於隨後進行測試，以評估黏膜免疫反應。
可使用已受SARS-CoV-2感染且已經確定臨床改善與/或恢復時間之患者（或於些許實施例中，為接受過測試之患者群體），進行臨床試驗。主要成果基準係為臨床改善時間（TTCI）與/或臨床恢復時間（TTCR），其等係於施用前述組合性SARS-CoV-2組合物達28天後所確定。TTCI係定義為自研究治療（主動或安慰劑）之起始至臨床狀態自1（出院）至6（死亡）之六類序數量表隨機等級中下降兩類序數之時間（以天為單位）。該六類序數量表如下：6為死亡；5為ICU，需要葉克膜（ECMO）與/或侵入性機械通氣（IMV）；4為加護病房（ICU）/住院治療，需要非侵入性機械通氣（NIV）/高流量鼻導管（HFNC）治療；3為住院治療，需要補充氧氣（但不需要NIV/HFNC）；2為住院治療，不需要補充氧氣；1為出院或達出院標準（出院標準係定義為臨床恢復，即發燒、呼吸頻率、血氧飽和度恢復正常，以及止咳）。次要結果TTCI基準包括總死亡率（篩選時基線SpO2、PaO2/FiO2 ＜300mmHg、或無補充氧氣下呼吸速率≥24次/分鐘）；呼吸進程之頻率（室內空氣中SpO2≤94%或PaO2/FiO2 ＜300mmHg，並需要補充氧氣或需要更進一步之呼吸器支持）；退燒時間（入院時發燒者）；咳嗽經回報為輕度或無的時間（入院時咳嗽為嚴重或中度者）；呼吸困難經回報為輕度或無的時間（於入院時呼吸困難程度判定為重度或中度者，按嚴重、中度、輕度與無之比例）；需補充氧氣或非侵入性通氣之頻率；咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中，2019-nCoV-2 RT-PCR呈陰性之時間；咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中SARS-CoV-2病毒載量之變化（減少）；咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中2019-nCoV病毒載量之變化（減少）；根據病毒載量曲線下之面積（例如，使用聚合酶連鎖反應（PCR）測定）評估之咽喉拭子、痰、下呼吸道樣本、及/或上呼吸道樣本中SARS-CoV-2病毒載量之變化（減少）；機械通氣之需求頻率；以及嚴重不良事件之頻率。TTCI之定義係為自開始研究治療（活性或安慰劑）至發燒、呼吸頻率與血氧飽和度正常化以及持續至少72小時之咳嗽緩解為止的時間（以小時為單位）。主要TTCR結果基準包括正常化與緩解標準；發燒：腋溫≤36.9°C或口溫≤37.2°C；呼吸頻率：於室內空氣中≤24/分鐘；血氧飽和度：於室內空氣中＞ 94%；以及咳嗽：據患者回報為嚴重、中度、輕度、無等程度中之輕度或無。次要TTCR結果基準係與上述TTCI次要結果相同。
利用標準臨床試驗設計及統計方法分析自試驗取得之數據。例如，本研究之樣本大小係為充足且合理，以便於耐受性佳之劑量下初步檢視組合性SARS-CoV-2組合物之安全性及免疫原性，而非以統計效力（例如，如上所述之120名受試者）為主要訴求。樣本大小允許反應原性之初步評估。例如，假設共100名受試者接受組合性SARS-CoV-2組合物，則該研究係經設計為具有80%之概率檢測到至少一種發生率為1.6%之AE。若於接受組合性SARS-CoV-2組合物之100名受試者中未觀察到SAE，則SAE發生率之95%信賴區間（CI）之單尾上限將趨近為3%。免疫學分析係使用可評估(Evaluable)及依計畫書（Per-protocol，PP）群體進行，主要結論係取自PP群體。僅當將任何一組別中之＞1個受試者排除於PP群體外時，才進行並提出根據可評估群體之分析。如下所述，透過例外反應者分析，不對缺失數據進行任何插補。於分析前，將數據進行適當轉換。基線定義為於第1天（接受AdE組合物）以及第7天（接受hAdv5-SARS-CoV-2組合物）施用組合性SARS-CoV-2組合物之前收集之樣本。確定評估對SARS-CoV-2之體液與細胞免疫反應（例如抗SARS-CoV-2抗原之IgG效價、T細胞反應）之主要變數。於基線與疫苗接種後第8、15、22、29、57、91、及181天（A部分）以及第8、15、22、29、36、43、50、91、及181天（B部分）確定GMT，並按劑量分組進行匯總。於組合性SARS-CoV-2組合物劑量與安慰劑之間的比較透過共變異數分析（ANCOVA）進行評估，其以抗SARS-CoV-2 IgG之基線後對數轉換表現量(post-baseline log-transformed level)做為依變項(dependent variable)中，係將實驗處理(treatment)做為固定效果，將基線對數轉換表現量做為共變數(covariate)。自此等分析中取得於對數尺度上之最小平方（LS）平均值、LS實驗處理差異、以及實驗處理差異之95% CI。透過指數化將結果轉換回原始尺度，以提供各研究日之實驗處理幾何LS平均值、幾何LS平均比值之點估計值、以及該等比值之95% CI。「反應者」係定義為於第8、15、22、29、57、91、及181天（A部分）以及第8、15、22、29、36、43、50、91、及181天（B部分），抗SARS-CoV-2抗原之效價較基線升高4倍之受試者。利用未經+1轉換之插補後數值計算用於確定反應者狀態之倍數變化，即倍數變化=當前插補值/基線插補值。根據各劑量組別之百分比與該百分比之95% Clopper-Pearson精確CI，羅列反應率。提出95% CI之差異，以比較各組合性SARS-CoV-2組合物劑量組對安慰劑組之反應率。於些許實施例中，亦可使用Fisher精確檢驗將各組合性SARS-CoV-2組合物劑量組中之反應者與安慰劑組者進行比較。為確定施藥前Ad5血清抗體程度對於第29天（A部分）或第50天（B部分）之組合性SARS-CoV-2組合物之免疫原性的影響，分析係使用ANCOVA進行，以基線Ad5效價為共變數。黏膜免疫原性分析係使用可評估及PP群體進行。不對缺失之數據進行插補。分析終點為透過ELISA測量之IgA抗體表現量的GMT和GMR。所使用方法與體液免疫原性分析相同。連續參數（安全實驗室測試與生命徵像）之匯總統計數據按組別顯示如下：疫苗接種前、疫苗接種後、以及自疫苗接種前至疫苗接種後之評估變化。於研究疫苗接種後，將具有疫苗接種後安全實驗室值或生命徵像值經回報為新進異常（即，毒性等級相對於基線值增加，且嚴重程度等級為中度或更高之事件）之受試者數量及百分比加以羅列。將根據嚴重程度等級交叉列出各受試者之疫苗接種前與疫苗接種後安全實驗室數值之變化表製妥。將具有正常、異常無臨床顯著意義、以及異常有臨床顯著意義之ECG判讀的受試者之數量與百分比作匯總。對於Ad5載體之脫落(shedding)，數據係以時間點的計數與陽性百分比進行匯總，並提供中位拷貝數。對於各組合性SARS-CoV-2組合物組別以及所有免疫原性組合物劑量組，呈現Ad5脫落之中位持續時間、四分位數間距、Ad5脫落之最小與最大持續時間。亦列出用於評估腺病毒感染之病毒培養結果。
此等研究將顯示，該組合性SARS-CoV-2組合物可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2免疫反應（例如，其為一免疫原性組合物），並表現出可接受之安全性。較佳者，該免疫反應於統計學上具有顯著意義，甚至更理想地為一保護性免疫反應（即，其為SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，數據顯示該組合性SARS-CoV-2組合物可用於治療感染SARS-CoV-2之受試者（例如住院患者）。
範例 11 ：細胞激素抑制作用之抗 SARS-CoV-2 人體臨床試驗
如範例2中所示，對小鼠施用AdE可降低些許細胞激素之表現，其等係已知與例如流感等病毒引起之傳染病進程與症狀有關。例如，未受（流感）感染之小鼠於施用AdE 25天後，單核球趨化蛋白（MCP-1（CCL2））、干擾素-γ（IFN-γ）、及RANTES（CCL5）之表現量增加。施用AdE之28天後，該未受感染之小鼠出現MCP-1及IFN-γ之表現量增加，但IL-12之表現量亦有所下降。施用AdE之小鼠於流感攻擊感染之第3天，發現小鼠出現IL-1α、IL-6、IL-12、MCP-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、及RANTES之表現量下降。施用AdE小鼠於攻擊感染之第6天，受感染小鼠出現IL-5、IL-6、IL-12、IL-17、MCP-1及GM-CSF之表現量下降，而巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1α (CCL3)）及RANTES（CCL5）之表現量增加。此等結果與SARS-CoV-2感染期間「細胞激素風暴(cytokine storm)」之發展相吻合。此後，於些許實施例中，為透過例如抑制細胞激素風暴之發展或抑制細胞激素風暴，以預防及/或治療SARS-CoV-2感染，將一種SARS-CoV-2免疫原性組合物伴隨一種或多種抗細胞激素試劑（例如，一種或多種抗IL-1α試劑、一種或多種抗IL-5試劑、一種或多種抗IL-6試劑、一種或多種抗IL-12試劑、一種或多種抗IL-17試劑、一種或多種抗MCP-1試劑、一種或多種抗TNF-α試劑、一種或多種抗GM-CSF試劑、及/或一種或多種抗RANTES試劑）共同施用於一人類。於些許實施例中，該一種或多種抗細胞激素試劑不包括一種或多種抗MIPα試劑以及/或一種或多種抗RANTES試劑。如本文所述可使用之範例抗細胞激素試劑可包括，例如，本文表10中所示者。
可將此類抗細胞激素試劑與SARS-CoV-2免疫原性組合物共同施用（例如同時），或透過各藥劑之適當途徑（例如鼻內給藥SARS-CoV-2免疫原性組合物，並皮下注射有效量之抗細胞激素試劑（s））以其實質上同時施用。於些許實施例中，可將該一種或多種抗細胞激素試劑與SARS-CoV-2免疫原性組合物共同施用，且於些許實施例中，該一種或多種抗細胞激素試劑係於後續做為一活性劑施用。此等研究將顯示，SARS-CoV-2組合物與一種或多種抗細胞激素試劑之結合可用於在人體內誘導抗SARS-CoV-2之免疫反應（例如，其為一免疫原性組合物），其具有可接受之安全性，並減輕與些許患者所經歷細胞激素之有害作用相關的症狀（例如，前述之細胞激素風暴）。較佳者，該免疫反應於統計學上具有顯著意義，甚至更理想地為一保護性及/或治療性免疫反應（即，其為一SARS-CoV-2疫苗）。於較佳實施例中，數據顯示SARS-CoV-2組合物與一種或多種抗細胞激素試劑之該組合可用於治療受SARS-CoV-2感染之受試者（例如住院患者）。
範例 12 ：動物研究給藥策略
於些許實施例中，將一種或多種抗SARS-CoV-2載體及/或抗SARS-CoV-2載體之組合（即「SARS-CoV-2疫苗」）以各種劑量施用於動物，以評估其臨床前驗證(pre-clinical validation)。於些許實施例中，係確定於動物體內之疫苗誘導保護機制。於些許實施例中，係確定對於更常見之循環冠狀病毒預先存在免疫力（對大多數人而言亦如此）之動物體內的疫苗誘導保護機制。此等研究提供：（i）SARS-CoV-2疫苗誘導之肺部炎症評估；（ii）至第28天具有同型與反應性廣度之SARS-CoV-2疫苗抗體效價；（iii）至施用後第28天之抗SARS-CoV-2抗體（Ab）中和效價；以及（iv）確定SARS-CoV-2疫苗劑量/給藥之最佳方案。
於些許實施例中，可使用Yu, et al. (PLOS ONE，DOI：10.1371/journal.pone.0150606，March 3，2016)所述之流式細胞技術，研究該等動物之免疫力，該技術經證實可用以準確量化11種不同免疫細胞類型，包括T細胞、B細胞、自然殺手（NK）細胞、嗜中性球、嗜酸性球、炎性單核球、駐留單核球、巨噬細胞（例如組織特異性巨噬細胞、駐留/間質巨噬細胞、肺泡巨噬細胞、小神經膠質細胞）、肥大細胞、嗜鹼性球、及/或漿細胞樣樹突細胞，以及/或對特定細胞類型進行詳細表型分析。例如，於些許實施例中，可將SSC與MHC II類表現之比較用於自成熟骨髓細胞中分離NK細胞與單核球；以及/或CD64與CD24表現之比較可用於區分巨噬細胞與樹突狀細胞，CD11c與MHC II類表現之比較亦可（雖然前者可能較準確）。亦可用於研究所屬技術領域中已知的其他標記（例如，CD11b、CD14、CD24、CD68、CD103、CD169、CD206、CX3 CR1、CCR2、F4/80、IA-IE、Ly6C、及/或MerTK中之任一者或多者）。於些許實施例中，係確定肺部氣道與血清中之抗SARS-2-CoV-2特異性抗體效價（例如，使用微珠陣列(bead arrays)）；測定滲入肺部之炎性細胞（例如，使用流式細胞儀）；確定抗SARS-CoV-2中和效價（例如，使用SARS-2微中和測定法）；評估局部與全身性細胞激素表現量；確定於未接種小鼠及對地方流行性冠狀病毒預先存在免疫力之小鼠中，接種疫苗後自早期（7-14天）至記憶（1至4個月）時間點間，抗SARS-2特異性B細胞（例如，與子集）、T細胞（例如，使用ICCS或細胞激素ELISPOT）及漿細胞（例如，使用抗體ELISPOT）之數量及功能性屬性。亦可使用所屬技術領域中習知或所屬技術領域中具有通常識者所理解可適用之其他類型的分析方法。
於些許實施例中，透過研究以表17所示劑量方案施用SARS-CoV-2疫苗之動物，確定動物體內疫苗誘導保護之機制。 [表17]
實驗1 及2 ( 候選疫苗#1 及#2)*
疫苗 品系數量 (C57BL/6 或 CD1) 7 天 (n=10) 14 天(n=10) 21 天(n=10) 28 天(n=10)
高劑量 單次施用** 30 BALa 組織b 血清c,d BALa 組織b 血清c,d 無(Not done) BALa 組織b 血清c,d
中劑量 單次施用 30 BALa 組織b 血清c,d BALa 組織b 血清c,d 無(Not done) BALa 組織b 血清c,d
低劑量 單次施用 30 BALa 組織b 血清c,d BALa 組織b 血清c,d 無(Not done) BALa 組織b 血清c,d
高劑量 兩次施用  (第0天及第14天) 20 無(Not done) 無(Not done) BALa 組織b 血清c,d BALa 組織b 血清c,d
對照(Mock) 10 BALa 組織b 血清c,d NA NA NA
*候選疫苗#1：S1載體 (SEQ ID NO：13)；候選疫苗#2：RBD載體 (SEQ ID NO：15)a 微珠陣列測得BAL中之抗體(Ab)b BAL、肺組織、縱隔淋巴結、脾臟、血液T細胞、B細胞NK及骨髓譜系亞群(T細胞、B細胞、NK細胞、嗜中性球、嗜酸性球、炎性單核球、駐留單核球、肺泡巨噬細胞、駐留/間質巨噬細胞、CD11b-樹突細胞與CD11b +樹突細胞)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4777539/pdf/pone.0150606.pdf c 微珠陣列檢測對流行性冠狀病毒之血清抗體COVID特異性、結構域特異性、及交叉反應性(包括同種型與亞同種型)d 血清中和或病毒減少測定(根據所收集血清樣本之結合測定，選擇最相關之時間點與候選疫苗)
於些許實施例中，例如為評估B細胞與T細胞對候選疫苗之反應，以確定最佳劑量及給藥時程，係使用表17中所示之劑量方案。於些許實施例中，係使用表18所示方案所決定之最佳劑量及給藥時程，使動物接受SARS-CoV-2疫苗（或如表17所示之兩種不同SARS-CoV-2疫苗）。於四個時間點（例如，n=7/組/時間點/功能性測定，於0至120天間之時間點）收集數據。測量SARS-CoV-2疫苗誘導之肺部炎症及抗體反應至第28天，確定具有同種型與反應性廣度之抗SARS-CoV-2抗體效價至第120天，確定抗SARS-CoV-2抗體中和效價至第120天，確定SARS-CoV-2疫苗誘導之T細胞反應至第28天，並確定SARS-CoV-2疫苗誘導之ASC及記憶B細胞反應至第120天。 [表18]
疫苗接種後抗SARS-CoV-2 功能性及抗原特異性測定
最佳疫苗/ 劑量/ 時間 品系數量 7-14 天(n=20) 14-28 天 (n=20) 60 天(n=10) 120 天 (n=10)
SARS-CoV-2疫苗#1 ( 最佳劑量) 60 (近親系) BALf,g,h 組織i,j,k 血清l BALf,g,h 組織i,j,k 血清l,m BALg 組織i,k 血清l,m BALg 組織i,k 血清l,m
SARS-CoV-2疫苗#2 ( 最佳劑量) 60 (近親系) BALf,g,h 組織i,j,k 血清l BALf,g,h 組織i,j,k 血清l,m BALg 組織i,k 血清l,m BALg 組織i,k 血清l,m
對照(Mock) 20 (近親系) BALf,g,h 組織i,j,k 血清l NA NA NA
f BAL上清液中之細胞激素/抗體 (例如，從此列表中IL-6、IL-10、TNF-α、IL-5、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1a與MIP-2之5種細胞激素)g BAL細胞-ELISPOT (SARS2特異性IgA、M及G).h BAL細胞T細胞召回IFN-γ ICCS (抗CD3及/或表現SARS2 S蛋白之EL4細胞重新刺激(restim)CD4與CD8)i 肺組織、縱隔淋巴結、脾臟、骨髓ELISPOT (SARS2特異性IgA、M及G)j 肺組織、縱隔淋巴結、脾臟抗原特異性T細胞召回IFN-γ ICCS (抗CD3及/或表現SARS2 S蛋白之EL4細胞重新刺激(restim)CD4與CD8)k BAL、肺、縱隔淋巴結、脾臟SARS2特異性B細胞反應流式細胞儀l 根據需求重複血清抗體m 根據需求之血清中和或病毒減少測定
於些許實施例中，無論對於流行性β冠狀病毒之預存在免疫力是否影響疫苗對SARS2之反應，皆使用下述方案。於本實驗中（表3），係評估預存在之抗冠狀病毒棘狀蛋白記憶B細胞對流行性β冠狀病毒之影響。使近親品系小鼠（BALB/c或B6）接種使用兩種不同佐劑（完全弗氏佐劑(CFA)或鋁鹽佐劑(Alum)）之重組OC43或HKU1棘狀蛋白，以建立對流行冠狀病毒棘狀蛋白之記憶B細胞反應（即「記憶小鼠(memory mice)」）。隨後，使經免疫小鼠與控制組小鼠接受該最佳SARS-CoV-2疫苗。評估記憶小鼠體內之肺部炎症、抗SARS-CoV-2抗體與B細胞反應，以及抗SARS-CoV-2抗體之品質。關於施用計畫之額外細節係提供於表19。 [表19]
實驗#4 – 對相關冠狀病毒S 蛋白預存在免疫力 – 對以SARS2 棘狀蛋白疫苗接種之影響
疫苗#1 第0&14 天 疫苗#2 第60 天 品系數量 Vac2 (n=10) 後7 天 14 天(n=10) 28 天(n=10)
佐劑1中之HKU1或OC43重組S nil 30 (近親系) BALn,o 組織p,q,r 血清s BALn,o 組織p,q,r 血清s 血清s,t
佐劑2中之HKU1或OC43重組S nil 30 (近親系) BALn,o 組織p,q,r 血清s BALn,o 組織p,q,r 血清s 血清s,t
佐劑1中之HKU1或OC43重組S 最佳SARS2 Ad5 30 (近親系) BALn,o 組織p,q,r 血清s BALn,o 組織p,q,r 血清s 血清s,t
佐劑2中之HKU1或OC43重組S 最佳SARS2 Ad5 30 (近親系) BALn,o 組織p,q,r 血清s BALn,o 組織p,q,r 血清s 血清s,t
對照(Mock) 最佳SARS2 Ad5 30 (近親系) BALn,o 組織p,q,r 血清s BALn,o 組織p,q,r 血清s 血清s,t
n Luminex測得 BAL中之細胞激素(IL-6、IL-10、TNF-α、IL-5、IFN-α、IFN-β及IFN-γ)o 微珠陣列測得BAL中之抗體p BAL、肺組織、縱隔淋巴結、脾臟、血液T細胞、B細胞NK與骨髓譜系亞群(T細胞、B細胞、NK細胞、嗜中性球、嗜酸性球、炎性單核球、駐留單核球、肺泡巨噬細胞、駐留/間質巨噬細胞、CD11b- 樹突細胞與CD11b + 樹突細胞) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4777539/pdf/pone.0150606.pdfq BAL、肺臟、縱隔淋巴結、脾臟SARS2特異性B細胞反應流式細胞儀r 克隆SARS2特異性B細胞受體並檢視反應性之廣度與深度(與親和性/結合性)s 微珠陣列測得對流行性冠狀病毒之血清抗體COVID特異性、結構域特異性、及交叉反應性(包括同種型與亞同種型)t 血清中和或病毒減少測定(第一為假型(pseudotyped)病毒，第二為初級SARS2)
範例 13A ：用於臨床前試驗之腺病毒載體（ S1 及 RBD ）製備
使用複製缺陷型、E1及E3剔除之腺病毒5型載體平台（Tang et al 2009）製備範例13A至18中使用之候選疫苗，以表現SARS-CoV-2棘狀蛋白（登錄號QHD43416.1）之S1結構域（殘基16至684）或RBD結構域（殘基302至543）之人類密碼子優化基因。Ad5載體之S1與RBD轉基因包括人類組織血纖維蛋白溶酶原活化因子前導序列，並係於巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子之控制下表現(分別為SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：15)。使用可擴展轉染系統（Maxcyte STX-100）將重組載體質體大規模轉染至E1互補PER.C6細胞中，以獲得初始種原庫(seed stock)。細胞轉染係透過使用CL1.1加工組合程序（Li LH, Shivakumar R, Feller S, Allen C, Weiss JM, Dzekunov S, Singh V, Holaday J, Fratantoni J, Liu LN，Highly efficient, large volume flow electroporation，Technol Cancer Res Treat，2002 Oct；1（5）：341-50）之靜電電穿孔進行。進一步擴增後，於感染後70小時收集感染細胞，並透過凍融循環自團塊細胞中釋放病毒。透過離心澄清細胞溶解產物，再使用0.22µm之截留值(cutoff)過濾。將RBD與S1 Ad5載體透過一CsCl梯度純化，於含有pH 7.4之10 mM Tris、75 mM NaCl、1 mM MgCl2 、10 mM組胺酸、5%（wt/vol）蔗糖、0.02%聚山梨醇酯-80（wt/vol）、0.1 mM EDTA、及0.5%（vol/vol）乙醇之一配方緩衝液(A195)透析，再經冷凍並保存於-65°C。為證實S1及RBD轉基因已經表現並具有抗原完整性，先以S1載體或RBD載體感染PerC6細胞，再利用針對SARS-CoV-2 S1（SinoBiologics Cat：40591-MM43）及SARS-CoV-2 RBD（SinoBiologics，Cat：40592-MM57）之兩種不同中和單株抗體進行胞內染色，並透過流式細胞儀進行分析（圖93）。
範例 13B ：於 C57BL/6 小鼠鼻內給藥表現 RDB 結構域之 Ad5 載體
於C57BL/6小鼠鼻內給藥複製缺陷型Ad5載體，該載體表現來自SARS-CoV-2棘狀抗原之RBD結構域（SEQ ID NO：15），以評估抵抗SARS-CoV-2之全身性與黏膜免疫力之誘導作用。如表20所示，以50µl之體積分別以三種不同劑量，對C57BL/6小鼠鼻內給藥一次或兩次Ad5載體。高劑量為於A195緩衝液中含有6.7E+09 ifu/ml（於50 µL中含3.35E+08 ifu），中劑量為1.2E+09 ifu/ml（於50 µL中含6E+07 ifu），低劑量為1.2E+08 ifu/ml（於50 µL中含6E+06 ifu）。控制組僅以鼻內給藥50 µl之A195緩衝液。接種後第7天、第14天、第21天或第28天，根據下表自每組各10隻動物收集血清、支氣管肺泡灌洗液（BAL）、與包括肺臟、縱隔淋巴結及脾臟在內之組織。免疫學讀數包含測量血清與BAL中SARS-CoV-2棘狀抗原特異性IgG、BAL中SARS-CoV-2棘狀抗原特異性IgA、血清中針對SARS-CoV-2之中和抗體反應，以及肺臟、淋巴結、BAL及脾臟中不同時間點之免疫細胞數量。此等參數係匯總於表20。 [表20]
疫苗/ 控制組 鼻內劑量 各組動物數量 疫苗接種 樣本採集( 各時間點採10 隻動物)
RBD Ad5 50 µL中含3.35E+08 ifu 30 第0天 第7、14、28天
RBD Ad5 50 µL中含6E+07 ifu 30 第0天 第7、14、28天
RBD Ad5 50 µL中含6E+06 ifu 30 第0天 第7、14、28天
RBD Ad5 50 µL中含3.35E+08 ifu 20 第0及14天 第21、28天
A195緩衝液 50 µL 10 第0天 第7天
使用與一重組SARS-CoV-2胞外域棘狀蛋白共軛結合之一細胞計數微珠陣列(cytometric bead array)，自免疫動物獲得之血清或BAL樣本中對SARS-CoV-2棘狀IgG及IgA進行定量。為生產重組SARS-CoV-2 S胞外域蛋白，生成兩個密碼子優化構建體，其線性序列順序編碼：一人類IgG前導序列、SARS-CoV-2 S胞外域（胺基酸14至1211）、一GGSG連接子(linker)、T4 Fibritin Foldon序列、一GS連接子(linker)、及最後為一AviTag（構建體1）或6X-HisTag（構建體2）。各構建體經過了兩組突變工程以穩定融合前構象中之蛋白質。此等包括在S1/S2切割位點對RRAR＞SGAG（Walls et al 2020中所述之殘基682至685）之取代，以及兩個脯胺酸殘基之引入(如Walls et al 2020及Wrapp et al 2020所述之K983P、V984P)。透過將質體構建體1及2（比例為1：2）共轉染至FreeStyle 293-F細胞中，以生產Avi/His標記三聚體。細胞經生長三天並透過離心回收上清液（培養液）。藉由使用HisTrap HP管柱（GE）及以250mM咪唑（imidazole）沖提之FPLC，自培養液中純化重組S三聚體。於交換為pH 8.0之10mM Tris-HCl或pH 8.3之50mM Bicine後，透過加入生物素蛋白連接酶(biotin-protein ligase)（Avidity, Aurora, CO），將純化之棘狀胞外域三聚體生物素化(biotinylated)。將生物素化之棘狀胞外域三聚體經緩衝交換至PBS中，並經無菌過濾、等分，再儲存於-80ºC直至使用為止。經過親和性純化帶有His標記之蛋白質以及酶促生物素化後，將所得之重組SARS-CoV-2三聚體被動吸收至經鏈親和素(streptavidin)官能化之螢光微粒上（Spherotech 3.6um 目錄號 CPAK-3567-4K，peak 4）。將500 µg之生物素化SARS2-CoV-2與2x1e7鏈親和素官能化螢光微粒於400ul之1%BSA PBS中培養。於偶聯後，將SARS-CoV-2棘狀共軛之微珠於1 ml之1%BSA、PBS、0.05% NaN3中洗滌兩次，最終再懸浮(resuspension)至1x108 微珠/mL之濃度。SARS-CoV-2偶聯微珠係儲存於4°C。重組SARS2-CoV-2棘狀於微珠上之負載量，係透過以稀釋範圍為1ug至2ng/ml之重組抗SARS棘狀抗體CR3022將1x105 圓珠染色，並以抗人類IgG二級抗體進行可視化加以評估。IgG及IgA標準品係透過將同種型特異性多株抗體與螢光微粒共價偶聯所獲得。簡言之，將抗小鼠IgG（southern Biotech目錄號1013-01）、抗IgM（目錄號1022-01）、及抗IgA（目錄號1040-01）之0.2 mg山羊多株抗體於PBS中與5x1e7螢光微粒混合，各個螢光微粒於遠紅外線通道具有獨特的螢光強度（Spherotech 3.6um 目錄號CPAK-3567-4K，peaks 1-3），並再懸浮於pH 5.0之0.1 M MES緩衝液。將等體積之EDC（1-乙基-3-（3-二甲基胺基丙基）-碳二亞胺）（EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)）以10mg/mL混合於pH 5.0之0.1 M MES（2-（N-嗎啉代）乙磺酸）（(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid）緩衝液中，並將混合物於室溫培養過夜。透過離心和於PBS中再懸浮沉澱物以將微珠洗滌兩次。於洗滌後，將微珠再懸浮於含有0.005%NaN3 做為防腐劑之1%BSA、PBS中。將經稀釋1/4至1/8之BAL樣本或於50µl PBS中稀釋至1/1000至1/5000之血清樣本，以及以0.75倍稀釋、濃度範圍介於1µg/ml至2ng/ml之50ul的小鼠IgG、IgM、或IgA所構成之標準品（southern biotech IgM：目錄號0106-01，IgG：目錄號0107-01，IgA：目錄號0106-01），一同排列於96孔U型底聚苯乙烯培養盤中。將5 µl各含5x1e5之SARS-CoV-2棘狀、抗IgM、抗IgA、及抗IgG微珠的懸浮液，添加至稀釋樣本中。透過移液(pipetting)將懸浮液混合，並於室溫下培養15分鐘。透過加入200µl之PBS洗滌微珠，並於室溫以3000g離心5分鐘。將CBA顆粒重懸於二級染色溶液中，該溶液係由抗IgG 488之多株抗體（southern Biotech目錄號1010-30）與抗IgM（southern Biotech目錄號1020-09）或抗IgA之山羊多株抗體所組成（southern biotech目錄號1040-09），該等多株抗體係與PE共軛，並於含有1%BSA之PBS中稀釋至1/400。將懸浮液在黑暗中於室溫培養15分鐘。透過加入200µl之PBS洗滌微珠，並於室溫下以3000g離心5分鐘使其結成沉澱物。將顆粒重懸於75µl之PBS中，並在BD Cytoflex流式細胞儀之盤式模式(plate mode)以每分鐘100ul之採樣速率直接分析。採得75 µL後停止樣本收集。於採集後，將所得FCS檔案於flowJo（treestar）中分析。簡言之，透過於正向散射與側向散射參數中以對數尺度門控單線3.6um粒子以辨識微珠。APC-Cy7通道螢光閘門係用以透過辨別微珠以分離粒子。於488通道中計算PE幾何平均螢光強度(mean fluorescent intensity)。基於盤式基礎，使用標準品於培養盤中的已知濃度，產生Ig擷取微珠之最佳擬合功效曲線(fit power curve)。此公式適用於相對應檢測之所有樣本中SARS-COV-2棘狀粒子之平均螢光強度(MFI)，用以將MFI轉換為ng/ml或µg/ml。此等計算值已針對稀釋係數經過校正。
使用灶點減少中和測試（foci reduction neutralization test，FRNT），定量針對SARS-CoV-2USA-WA1/2020病毒株之中和抗體效價。使Vero E6細胞於96孔盤上生長至匯合。於測定之感染階段當天，製備抗血清之連續稀釋液（1：20 - 1：2560）並組合，並與等體積之病毒原液一同培養(以特定稀釋度於室溫培養30分鐘)，以使抗血清之最終稀釋度介於（1:40 – 1：5120）。病毒原液係稀釋自濃縮之生產病毒株(working stock)，以使各孔估計產生30個病毒灶點單位。於培養後，將血清：病毒混合物添加至孔中（100µL），並於35°C在Vero細胞上允許感染進行1小時。於1小時培養完成後，將含有4%FBS、抗生素及1.2% Avicell之Eagle MEM黏稠覆蓋物添加於血清：病毒混合物之細胞單層上，使各孔之最終體積為200 µL。允許感染進行24小時。隔天，透過將整體培養盤與內容物浸沒於10%福馬林/PBS中24小時，使各培養盤固定。於固定後之96孔盤上進行病毒灶點減少之檢測。簡言之，將培養盤於水中清洗，並將甲醇：過氧化氫添加至孔中30分鐘，同時搖動以淬滅內源性過氧化酶(peroxidase)活性。淬滅後，將培養盤於水中清洗以去除甲醇，並加入5% Blotto做為封閉溶液(blocking solution)至孔中1小時。對於初級抗體偵測，將SARS-CoV-2棘狀/RBD抗體（兔，多株，SinoBiologics Ct No. 40592-T62）添加至5% Blotto，並於細胞單層上培養過夜。將培養盤以PBS洗滌5次，並於5% Blotto中與接合山葵過氧化物酶（horseradish peroxidase）之山羊抗兔IgG的二級抗體（Boster Biological Technology Co.， #BA1054-0.5）進一步培養1小時。將培養盤於含有0.05% tween之1X PBS中洗滌一次，之後於1X PBS中洗滌5次。按製造商之說明，使用Impact DAB檢測用組（Vector Labs #SK-4105）檢測過氧化酶活性。自各孔之掃描圖像中手動計數棕色灶點(foci)、記錄，並與等效未接種之小鼠血清對照組相比，確定灶點減少。亦使用4PL曲線擬合計算FRNT50 效價。
透過流式細胞術之支氣管肺泡灌洗（BAL）細胞之分析係如下述方式進行。透過BAL液於4°C以700 x g離心5分鐘，取得存在之BAL細胞。將細胞重懸於500 µl紅血球細胞裂解緩衝液（ACK緩衝液（10 mM KHCO3，pH 7.2-7.4，150 mM NH4Cl及0.1mM EDTA））中。於1分鐘後，加入2 ml含有2 mM EDTA之染色培養液（PBS + 2%胎牛血清）。此培養液係稱為SME。再使樣本透過70 um Nitex®尼龍過濾膜並濾入乾淨之15 ml錐形管中。於4°C以700 x g離心5分鐘後，將細胞重懸於225 µl SME中。再將25ul之各樣本轉移至96孔盤中，以進行使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10 µm微球之流式細胞儀對細胞計數。將剩餘細胞轉移至一獨立之V底96孔盤中進行抗體染色，以進行流式細胞術分析。將BAL細胞樣本於4°C在黑暗中與Fc-Block（1：1000稀釋度）培養10分鐘，再使用以下BAL染色組(staining panel)染色：Autofluorescence（空FITC通道）、Ly6G-PE（克隆1A8；1:200稀釋度）、CD64-PerCP-Cy5.5（克隆X54-5/7.1；1：150稀釋度）、CD8a-APC（克隆53-6.7；1：200稀釋度）、CD11c-PE-Cy7（克隆N418；1：200稀釋度）、CD19-APC-Fire750（克隆6D5；1：200稀釋度）、CD4-eFluor450（克隆GK1.5；1：200稀釋度）以及Aqua LIVE/DEAD（1:1000稀釋度）。於4°C在黑暗中與抗體混合物（50 µl總體積）培養20分鐘後，以200ul SME洗滌細胞。隨後將細胞重懸於200 µl 10%福馬林中，再於2天內於FACSCanto II上進行分析。
透過流式細胞術之縱隔淋巴結之分析係如下述方式進行。採集縱隔淋巴結（Mediastinal lymph node，mLN），並將其置入24孔盤的各孔中，各孔含有添加2 mM EDTA之1 ml染色培養液（PBS + 2%胎牛血清）。此培養液係稱為SME。將mLN透過於兩顯微鏡載玻片之間摩擦以輕輕研磨並粉碎，並以1 ml SME清洗，再轉移至15 ml錐形管中。使用SME將該體積增加至10 ml。隨後使細胞懸浮液透過70 um Nitex®尼龍過濾膜並濾入乾淨之15 ml錐形管中，再以另外之2 ml SME清洗過濾膜。於4°C以1800 rpm離心5分鐘後，將細胞重懸於1 ml SME。將50ul之各樣本轉移至96孔盤中，以進行使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10 µm微球之流式細胞儀對細胞計數。將200至250 µl之各樣本轉移至3個獨立V底96孔盤中進行抗體染色，以進行流式細胞術分析。將該mLN組織以3種不同流式組(flow panel)染色。將該mLN樣本於4°C在黑暗中與Fc-Block（1：1000稀釋度）培養10分鐘，以200ul SME洗滌，再使用以下3個panel染色。骨髓panel係由以下所組成：B220/CD45R-FITC（克隆RA3-6B2；1：200稀釋度）、Ly6G-PE（克隆1A8；1：200稀釋度）、CD64-PerCP-Cy5.5（克隆X54-5/7.1；1：150稀釋度）、CD11b-APC（克隆M1/70；1：200稀釋度）、CD11c-PE-Cy7（克隆N418；1：300稀釋度）、Ly6C-APC-Cy7（克隆AL-21；1：200稀釋度）、MHCII-PB（克隆M5/114.15.4；1：600稀釋度）、CD3-BV510（克隆17A2；1：200稀釋度）、CD19-BV510（克隆HIB19；1：200稀釋度）及Aqua LIVE/DEAD（1:1000稀釋度）。對於此骨髓panel染色，將細胞與抗體混合物（總體積50ul）於4°C在黑暗中培養20分鐘。之後將細胞以200 µl SME洗滌，並重懸於200 µl 10%福馬林（固定劑）中，再於2天內於FACSCanto II上進行分析。T細胞panel係由以下所組成：CXCR5/CD185-FITC（克隆J252D4；1：50稀釋度）、PD1/CD279-PE（克隆J43；1：200稀釋度）、CD8a-PerCP-Cy5.5（克隆53-6.7；1：200稀釋度）、CD25-PE-Cy7（克隆PC61；1：300稀釋度）、CD4-AF647（克隆GK1.5；1：200稀釋度）、CD3-APC-eFluor780（克隆17A2；1：200稀釋度）、NK1.1-eFlour450（克隆PK136；1：200稀釋度）及Aqua LIVE/DEAD（1:1000稀釋度）。對於此T細胞panel染色，將細胞單獨與抗CXCR5-FITC（30 ul總體積；1：50稀釋度）於4°C在黑暗中培養30分鐘，並以200 µl SME洗滌。隨後將細胞與其餘抗體混合物（總體積為50 µl）於4°C在黑暗中培養15分鐘，並以200 ul SME洗滌。將細胞重懸於200 ul 10%福馬林（固定劑）中，再於2天內於FACSCanto II上進行分析。B細胞panel係由以下所組成：CD95/FAS-FITC（克隆Jo2；1：200稀釋度）、SPIKE（Covid-19）-PE（1:50稀釋度）、7-AAD（1:1000稀釋度）、F4/80-PerCP-Cy5.5（克隆BM8；1：200稀釋度）、CD3-PerCP-Cy5.5（克隆17A2；1：200稀釋度）、SPIKE（Covid-19）-APC（1:50稀釋度）、CD38-PE-Cy7（克隆90；1：400稀釋度）、CD19-APC-Fire750（克隆6D5；1：200稀釋度）、CD138-BV421（克隆281-2；1：200稀釋度）及IgD-BV510（克隆11-26c.2a；1：500稀釋度）。對於此B細胞panel染色，將細胞與抗體混合物（50 ul總體積）於4°C在黑暗中培養20分鐘，並以200 ul SME洗滌。將細胞重懸於200 ul SME（無固定劑）中，並立即於FACSCanto II上進行分析。
透過流式細胞術之肺組織之分析係如下述方式進行。用剪刀將切除之肺部切成極小碎片，再添加膠原蛋白酶(Collagenase)/去氧核糖核酸酶(DNase)。於37°C下培養30分鐘後，將肺均質物以1ml SME稀釋。使用注射器柱塞之平坦端將消化後之組織輕輕研磨並壓碎到過濾器上，再以10至15 ml SME清洗。於4°C以1800 rpm離心5分鐘後，將沉澱物重懸於3 ml紅血球細胞裂解緩衝液（ACK緩衝液（10 mM KHCO3，pH 7.2-7.4，150 mM NH4Cl及0.1mM EDTA））。於室溫培養5分鐘後，透過加入3 ml SME將樣本以1：2的比例稀釋，並使該裂解緩衝液失去活性。使各裂解產物通過Nitex®尼龍過濾膜並濾入乾淨之50 ml錐形管中，以過濾細胞。以另外5至10 ml SME清洗後，將細胞離心，再將細胞團塊重懸於1 ml SME中。將50 µl之各樣本置於96孔盤中，以進行使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10 µm微球之流式細胞儀對細胞計數。將200 µl之各樣本置入3個獨立V底96孔盤中進行抗體染色，以進行流式細胞術分析。將樣本於4°C在黑暗中與Fc-Block（1:1000稀釋度）培養10分鐘，並以200 µl SME洗滌，再利用與淋巴結檢測相同之3種panel染色。
透過流式細胞術之脾細胞之分析係如下述方式進行。將脾臟轉移至安裝於50 ml錐形管上之70um細胞過濾器中，並以注射器柱塞之平坦端輕輕研磨並壓碎，再以10至15 ml SME清洗過濾器。於4°C以1800 rpm離心5分鐘後，將沉澱物重懸於5 ml紅血球細胞裂解緩衝液（ACK緩衝液（10 mM KHCO3，pH 7.2-7.4，150 mM NH4Cl及0.1mM EDTA））。於室溫培養5分鐘後，對各裂解產物加入20 ml SME以稀釋該ACK緩衝液。隨後使細胞通過70 um Nitex®尼龍過濾膜過濾。以另外5 ml SME清洗過濾物。於離心後，將細胞團塊重懸於20 ml SME中。將50 µl之各樣本置於96孔盤中，以進行使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10 µm微球之流式細胞儀對細胞計數。將200 µl之各樣本置入3個獨立V底96孔盤中進行抗體染色，以進行流式細胞術分析。將樣本於4°C在黑暗中與Fc-Block（1:1000稀釋度）培養10分鐘，並以200 µl SME洗滌，再利用與淋巴結檢測相同之3種panel染色。
於單次鼻內給藥後，表現棘狀蛋白之RBD結構域（SEQ ID NO：15）的複製缺陷型Ad5載體，其經證明可刺激血清中IgG抗體之產生，表示對於全身性反應之誘導，亦可刺激支氣管肺泡灌洗中IgG與IgA抗體之產生，表示對於黏膜反應之誘導，如圖71A至71C所示。於不同抗體標記物上觀察到一種劑量反應，即高劑量疫苗導致最高之反應，低劑量導致微小之反應，而中等劑量則產生中等之反應。值得注意者，於使用單次高劑量疫苗之第14天及第28天，血清中之棘狀蛋白特異性IgG反應達到極高表現量，超過每毫升1毫克，代表約佔血清總IgG之5%。於第14天鼻內給藥一次相同載體加強免疫後，BAL中之IgA產量顯著增加，於第21天及第28天高於施用單次劑量疫苗之IgA反應，然而對IgG反應之影響有限。
如透過灶點減少中和試驗（FRNT）所測得，自接受單次高劑量疫苗接種之組別中，測試之所有十隻動物（100%）皆顯示出對SARS-CoV-2之中和抗體存在（圖72A至72J），而接受單次中劑量疫苗接種之組別中，只有五分之三的動物（60%）顯示出明顯中和反應（圖73A至73E）。
該疫苗之鼻內給藥可誘導不同免疫區室(immune compartment)中之先天性及適應性免疫細胞之徵集及/或增殖。圖74A至74L、75A至75E、76A至76J、及77A至77L，分別顯示經單次鼻內給藥高劑量疫苗後，於肺臟、BAL、縱隔淋巴結及脾臟中免疫細胞數量之變化。重要的是，於肺臟、BAL及淋巴結中所觀察到CD19細胞、記憶B細胞、生發中心（Germinal Center，GC）B細胞及/或T濾泡輔助（follicular helper，fh）細胞之數量升高，以及其等於脾臟中較小之擴增程度，係表示疫苗刺激長生型體液及黏膜抗體反應之能力。此外，於肺臟、BAL及淋巴結中觀察到之巨噬細胞、樹突狀細胞、CD4+ 及/或CD8+ T細胞之升高，以及其等於脾臟中較小之擴增程度，係表示疫苗刺激黏膜及全身性、先天性及細胞介導之免疫反應之能力，該些反應於SARS-CoV-2感染的情況下為預期有益。。以較低劑量疫苗所獲得之結果未顯示於此，因其等表現出相似之趨勢，但表現量較低。
範例 14 ：於 C57BL/6 小鼠鼻內給藥表現 S1 結構域之 Ad5 載體
於C57BL/6小鼠鼻內給藥複製缺陷型Ad5載體，該載體表現來自SARS-CoV-2棘狀抗原之S1結構域（SEQ ID NO：13），以評估抵抗SARS-CoV-2之全身性與黏膜免疫力之誘導作用。如表21所示，以50µl之體積分別以三種不同劑量，對C57BL/6小鼠鼻內給藥一次或兩次Ad5載體。高劑量為於A195緩衝液中含有1.2E+09 ifu/ml（於50 µL中含6E+08 ifu），中劑量為1.2E+09 ifu/ml（於50 µL中含6E+07 ifu），低劑量為1.2E+08 ifu/ml（於50 µL中含6E+06 ifu）。控制組僅以鼻內給藥50 µl之A195緩衝液。接種後第7天、第14天、第21天或第28天，根據下表自每組各10隻動物收集血清、支氣管肺泡灌洗液（BAL）、與包括肺臟、縱隔淋巴結及脾臟在內之組織。免疫學讀數包含測量血清與BAL中SARS-CoV-2棘狀抗原特異性IgG、BAL中SARS-CoV-2棘狀抗原特異性IgA、血清中針對SARS-CoV-2之中和抗體反應，以及肺臟、淋巴結、BAL及脾臟中不同時間點之免疫細胞數量。此等參數係匯總於表21。 [表21]
疫苗/ 控制組 鼻內劑量 各組動物數量 疫苗接種 樣本採集( 各時間點採10 隻動物)
S1 Ad5 50 µL中含6E+08 ifu 30 第0天 第7、14、28天
S1 Ad5 50 µL中含6E+07 ifu 30 第0天 第7、14、28天
S1 Ad5 50 µL中含6E+06 ifu 30 第0天 第7、14、28天
S1 Ad5 50 µL中含6E+08 ifu 20 第0及14天 第21、28天
A195緩衝液 50 µL 10 第0天 第7天
定量血清或BAL樣本中SARS-CoV-2棘狀IgG與IgA、灶點減少中和測試、以及支氣管肺泡灌洗（BAL）細胞、縱隔淋巴結、肺組織與脾細胞之流式細胞術分析之方法，皆已描述於範例13B中。
於單次鼻內給藥後，表現棘狀蛋白之S1結構域（SEQ ID NO：13）的複製缺陷型Ad5載體，其經證明可刺激血清中IgG抗體之產生，表示對於全身性反應之誘導，亦可刺激支氣管肺泡灌洗中IgG與IgA抗體之產生，表示對於黏膜反應之誘導，如圖78A至78C所示。於不同抗體標記物上觀察到一種劑量反應，即高劑量疫苗導致最高之反應，低劑量導致微小之反應，而中等劑量則產生中等之反應。整體而言，相較於如範例13B所示施用RBD載體之結果，施用S1載體後血清與BAL中之IgG反應較低。於第14天鼻內給藥一次相同載體加強免疫後，BAL中之IgA產量顯著增加，於第21天及第28天高於施用單次劑量疫苗之IgA反應，然而對IgG反應之影響有限。
如透過灶點減少中和試驗（FRNT）所測得，自接受單次高劑量疫苗接種之組別中，測試之五隻動物中有三隻顯示出對SARS-CoV-2中和抗體之誘導作用（圖79A至79E）。於單次中劑量組別中，五分之二的動物（圖80B及D）顯示出低度中和反應（圖80A至80E）。
該疫苗之鼻內給藥可誘導不同免疫區室中之先天性及適應性免疫細胞之徵集及/或增殖。圖81A至81L、82A至82E、83A至83J、及84A至84L，分別顯示經單次鼻內給藥高劑量疫苗後，於肺臟、BAL、縱隔淋巴結及脾臟中免疫細胞數量之變化。重要的是，於肺臟、BAL及淋巴結中所觀察到CD19細胞、記憶B細胞、生發中心（GC）B細胞及/或T濾泡輔助（fh）細胞之數量升高，以及其等於脾臟中較小之擴增程度，係表示疫苗刺激長生型體液及黏膜抗體反應之能力。此外，於肺臟、BAL及淋巴結中觀察到之巨噬細胞、樹突狀細胞、CD4+及/或CD8+ T細胞之升高，以及其等於脾臟中較小之擴增程度，係表示疫苗刺激黏膜及全身性、先天性及細胞介導之免疫反應之能力，該些反應於SARS-CoV-2感染的情況下為預期有益。以較低劑量疫苗所獲得之結果未顯示於此，因其等表現出相似之趨勢，但表現量較低。
範例 15 ：於 CD-1 小鼠鼻內給藥表現 RBD 結構域之 Ad5 載體
於CD-1小鼠鼻內給藥複製缺陷型Ad5載體，該載體表現來自SARS-CoV-2棘狀抗原之RBD結構域（SEQ ID NO：15），以評估抵抗SARS-CoV-2之全身性與黏膜免疫力之誘導作用。以50µl之體積分別以三種不同劑量，對CD-1小鼠鼻內給藥一次或兩次Ad5載體。高劑量為於A195緩衝液中含有6.7E+09 ifu/ml（於50 µL中含3.35E+08 ifu），中劑量為1.2E+09 ifu/ml（於50 µL中含6E+07 ifu），低劑量為1.2E+08 ifu/ml（於50 µL中含6E+06 ifu）。控制組僅以鼻內給藥50 µl之A195緩衝液。接種後第7天、第14天及/或第21天，根據表22自每組各10隻動物收集血清與支氣管肺泡灌洗液（BAL）。免疫學讀數包含測量血清與BAL中SARS-CoV-2棘狀抗原特異性IgG、BAL中SARS-CoV-2棘狀抗原特異性IgA，以及血清中針對SARS-CoV-2之中和抗體反應。此等參數係匯總於表22。 [表22]
疫苗/ 控制組 鼻內劑量 各組動物數量 疫苗接種 樣本採集( 各時間點採10 隻動物)
RBD Ad5 50 µL中含3.35E+08 ifu 30 第0天 第7、14、21天
RBD Ad5 50 µL中含6E+07 ifu 30 第0天 第7、14、21天
RBD Ad5 50 µL中含6E+06 ifu 30 第0天 第7、14、21天
RBD Ad5 50 µL中含3.35E+08 ifu 20 第0及14天 第21天
A195 緩衝液 50 µL 10 第0天 第7天
定量血清或BAL樣本中SARS-CoV-2棘狀IgG與IgA、以及灶點減少中和測試之方法，皆已描述於範例13B中。
於單次鼻內給藥後，表現棘狀蛋白之RBD結構域（SEQ ID NO：15）的複製缺陷型Ad5載體，其經證明可刺激血清中IgG抗體之產生，表示對於全身性反應之誘導，亦可刺激支氣管肺泡灌洗中IgG與IgA抗體之產生，表示對於黏膜反應之誘導，如圖85A至85C所示。於不同抗體標記物上觀察到一種劑量反應，即高劑量疫苗導致最高之反應，低劑量導致微小之反應，而中等劑量則產生中等之反應。於第14天鼻內給藥一次相同載體加強免疫後，與施用單次劑量疫苗者相比，對於IgG及IgA反應之影響有限。
如透過灶點減少中和試驗（FRNT）所測得，自接受單次高劑量疫苗接種之組別中，測試之十隻動物中有八隻（圖92A、92C至92E及92G至92J）顯示出對SARS-CoV-2之中和抗體之顯著誘導作用（圖92A至92J）。
範例 16 ：於 CD-1 小鼠鼻內給藥表現 S1 結構域之 Ad5 載體
於CD-1小鼠鼻內給藥複製缺陷型Ad5載體，該載體表現來自SARS-CoV-2棘狀抗原之S1結構域（SEQ ID NO：15），以評估抵抗SARS-CoV-2之全身性與黏膜免疫力之誘導作用。以50µl之體積分別以三種不同劑量，對CD-1小鼠鼻內給藥一次Ad5載體。高劑量為於A195緩衝液中含有6.7E+09 ifu/ml（於50 µL中含3.35E+08 ifu），中劑量為1.2E+09 ifu/ml（於50 µL中含6E+07 ifu），低劑量為1.2E+08 ifu/ml（於50 µL中含6E+06 ifu）。控制組僅以鼻內給藥50 µl之A195緩衝液。接種後第7天、第14天及第21天，根據表23自每組各10隻動物收集血清與支氣管肺泡灌洗液（BAL）。免疫學讀數包含測量血清與BAL中SARS-CoV-2棘狀抗原特異性IgG、BAL中SARS-CoV-2棘狀抗原特異性IgA，以及血清中針對SARS-CoV-2之中和抗體反應。此等參數係匯總於表23。 [表23]
疫苗/ 控制組 鼻內劑量 各組動物數量 疫苗接種 樣本採集( 各時間點採10 隻動物)
S1 Ad5 50 µL中含3.35E+08 ifu 30 第0天 第7、14、21天
S1 Ad5 50 µL中含6E+07 ifu 30 第0天 第7、14、21天
S1 Ad5 50 µL中含6E+06 ifu 30 第0天 第7、14、21天
A195 緩衝液 50 µL 10 第0天 第7天
定量血清或BAL樣本中SARS-CoV-2棘狀IgG與IgA、以及灶點減少中和測試之方法，皆已描述於範例13B中。
於單次鼻內給藥後，表現棘狀蛋白之S1結構域（SEQ ID NO：13）的複製缺陷型Ad5載體，其經證明可刺激血清中IgG抗體之產生，表示對於全身性反應之誘導，亦可刺激支氣管肺泡灌洗中IgG與IgA抗體之產生，表示對於黏膜反應之誘導，如圖86A至86C所示。於不同抗體標記物上觀察到一種劑量反應，即高劑量疫苗導致最高之反應，低劑量及中等劑量則產生微小之免疫反應。
範例 17 ：於 CD-1 小鼠鼻內給藥表現 RBD 結構域之 Ad5 載體
於CD-1小鼠鼻內給藥複製缺陷型Ad5載體，該載體表現來自SARS-CoV-2棘狀抗原之RBD結構域（SEQ ID NO：15），以評估抵抗SARS-CoV-2之全身性與黏膜T細胞免疫力之誘導作用。對CD-1小鼠鼻內給藥一次Ad5載體，其劑量為於A195緩衝液中含有6.7E+09 ifu/ml（於50 µL中含3.35E+08 ifu）。控制組僅以鼻內給藥50 µl之A195緩衝液。接種後第7天、第14天與第28天，根據表24自疫苗組之10隻動物與控制組之3隻動物收集肺臟與脾臟。免疫學讀數包含透過流式細胞術測量肺臟與脾臟中CD4+及CD8+ T細胞反應、透過IFN-gamma ELISpot測定法測量肺臟與脾臟中之T細胞反應，以及用RBD衍生胜肽於體外召回(in vitro recall)後測量T細胞之細胞激素。 [表24]
疫苗/ 控制組 鼻內劑量 各組動物數量 疫苗接種 樣本採集( 各時間點採10 隻動物)
RBD Ad5 50 µL中含3.35E+08 ifu 30 第0天 第7、14、28天
A195 緩衝液 50 µL 9 第0天 第7、14、28天
透過IFN-gamma ELISpot測定法測量肺臟與脾臟中之RBD特異性T細胞反應之分析係如下述方式進行。將脾臟轉移至安裝於50 ml錐形管上之70um細胞過濾器中，並以注射器柱塞之平坦端輕輕研磨並壓碎，再以10至15 ml SME清洗過濾器。於4°C以1800 rpm離心5分鐘後，將沉澱物重懸於5 ml紅血球細胞裂解緩衝液（ACK緩衝液（10 mM KHCO3，pH 7.2-7.4，150 mM NH4Cl及0.1mM EDTA））。於室溫培養5分鐘後，對各裂解產物加入20 ml SME以稀釋該ACK緩衝液。隨後使細胞通過Nitex®尼龍過濾膜過濾。以另外5 ml SME清洗過濾物細胞。於離心後，將細胞團塊重懸於20 ml SME中。將50 µl之各樣本置於96孔盤中，以進行使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10 µm微球之流式細胞儀對細胞計數。
用剪刀將切除之肺部切成極小碎片，再添加膠原蛋白酶(Collagenase)/去氧核糖核酸酶(DNase)。於37°C下培養30分鐘後，將肺均質物以1ml SME稀釋。使用注射器柱塞之平坦端將消化後之組織輕輕研磨並壓碎到過濾器上，再以10至15 ml SME清洗。於4°C以1800 rpm離心5分鐘後，將沉澱物重懸於3 ml紅血球細胞裂解緩衝液（ACK緩衝液（10 mM KHCO3，pH 7.2-7.4，150 mM NH4Cl及0.1mM EDTA））。於室溫培養5分鐘後，透過加入3 ml SME將樣本以1：2的比例稀釋，並使該裂解緩衝液失去活性。使細胞通過Nitex®尼龍過濾膜並濾入乾淨之50 ml錐形管中。以另外5至10 ml SME清洗後，將細胞離心，再將細胞團塊重懸於1 ml SME中。將50 µl之各樣本置於96孔盤中，以進行使用Fluoresbrite Carboxylate YG 10 µm微球之流式細胞儀對細胞計數。
對於T細胞反應之分析，由JPT（JPT Peptide technologies，柏林，德國）設計並合成一包含53種胜肽之胜肽庫，該等胜肽係衍生自透過SARS-CoV-2棘狀醣蛋白之RBD（319-541）的胜肽掃描。胜肽經設計具有15 a.a.之長度與11a.a之重疊。於使用前，先將含有15 nmol（約25μg）各種肽之各個小瓶於50μl DMSO中重新溶解，再稀釋於完全培養液中。
將脾細胞與肺細胞懸浮液（150,000個細胞/孔）置於預先塗覆抗IFN-γ（AN18，（5μg/ ml））之ELIspot盤（Millipore-Sigma）的各個孔中。使用上述RBD胜肽庫(peptide pool)以0.5至2.0μg/胜肽/ml刺激細胞。刺激24小時後，將培養盤以生物素化(biotinylated)之抗IFN-γ（R4-6A2）染色，再進行洗滌，並與鏈親和素ALP（streptavidin-ALP）共同培養。與NBT/NCPI基質培養7至10分鐘後，檢測到分泌之IFN-γ。自各孔之數位影像中手動計數IFN-γ斑點形成細胞之數量。使用Mann-Whitney檢驗於GraphPad Prism中進行統計分析。
透過流式細胞術之肺組織與脾臟中之CD4+及CD8+ T細胞反應之分析係如下述方式進行。於存在Brefeldin A之情況下，以RBD胜肽庫刺激脾臟與肺臟單細胞懸浮液5小時（5小時，12.5 ug/mL濃度）。隨後將細胞與一螢光染料標記之抗體組合於冰上共同培養，該抗體組合包括抗CD4-V500（克隆GK1.5；1：200稀釋度）、抗CD8α-APC-Fire750（克隆53-6.7；1：200稀釋度）、抗CD11a/CD18- Pacific Blue（H155-78；1：200稀釋度）、抗CD103-PE（M290；1：200稀釋度）、抗CD69-FITC（H1-2F3；1：200稀釋度）、抗Ly6G-PerCP-Cy5.5（克隆1A8；1：200稀釋度）、抗CD64-PerCP-Cy5.5（克隆X54-5/7.1；1：200稀釋度）、抗B220/CD45R-PerCP（克隆RA3-6B2；1：200稀釋度）、及Red LIVE/DEAD（1:1000稀釋度）。於表面染色後，使用BD Biosciences Cytofix/Cytoperm套組透化細胞，並以抗IFN-γ-PE-Cy7（XMG1.2；1：200稀釋度）及抗TNF-α-APC（MP6-XT22；1：200稀釋度）將其染色。與抗體培養共同後，將細胞洗滌並重懸，再於12小時內在FACSCanto II上進行分析。使用Mann-Whitney檢驗於GraphPad Prism中進行統計分析。
使用小鼠特異性Milliplex®多重分析盤套組MT17MAG-47K（Millipore；Sigma）以及具有相關xPONENT®軟體（Luminex Corporation）之MagPix®儀器平台，於培養上清液中定量IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17A及TNFα之蛋白表現量。使用標準版EMD Millipore之Milliplex®Analyst軟體分析讀數。使用Mann-Whitney檢驗於GraphPad Prism中進行統計分析。
單次鼻內給藥後，表現棘狀蛋白之RBD結構域（SEQ ID NO：15）的複製缺陷型Ad5載體，其經證實可於肺臟與脾臟中誘導大量生成產生IFN-γ之T細胞，如圖88A至88D所示。疫苗接種後第10天及第14天，於肺臟中高頻率檢測到產生IFN-γ之RBD特異性T細胞，分別達到每百萬輸入細胞為915與706斑點之平均反應，參見圖88。透過ELISpot於脾臟中亦檢測到產生IFN-γ之RBD特異性T細胞，儘管頻率較肺臟低。此表示響應於黏膜遞送之抗原所引發之功能性效應T細胞可轉移至周邊淋巴組織。此外，於肺臟（圖89A至89D）及脾臟（圖90A至90D）中亦發現顯著表現量之RBD特異性CD4+與CD8+ T細胞，該等T細胞表現早期活化歸巢標記(activation homing marker)CD11a及IFN-γ及/或TNF-α。整合素(integrin)CD11a之表現僅於最近活化之T細胞中被提升，且為組織中最佳血管黏附與保留於呼吸道中所必需（Thatte J et.al，，Blood，2003 Jun 15；101（12）：4916-22），其支持此等細胞最近曾受徵集至肺部之假設。經發現於肺中具有較大量之T細胞反應，並且以CD8+ T細胞為主。鼻內RBD載體亦誘導了於肺中具有大量的CD4+及CD8+ 組織駐留記憶T細胞（TRM）（圖91A及91B）。
為評估疫苗誘導之T細胞是否可能代表駐留記憶T細胞（Trm），於肺臟CD4+和CD8+細胞上評估Trm標記物CD103與CD69（Takamura S.，，Viral Immunol，2017 Jul/Aug；30（6）：438-450，doi：10.1089/vim.2017.0016）之表現。與鼻內給藥途徑一致地，可觀察到對於表現IFN-γ、TNF-α、或此兩種細胞激素皆表現之肺臟RDB特異性CD4+及CD8 + Trm之誘導作用（圖95）。
數據顯示鼻內給藥RBD載體疫苗誘導了T細胞能產生與Th-1偏倚(Th-1 biased)細胞反應相關之IFN-γ與TNF-α細胞激素。此外，我們觀察到該疫苗引起高頻率之抗原特異性CD8+ T細胞，其等通常與IFN調節之T細胞反應有關，此對於病毒感染之控制相當重要。為進一步評估來自接種小鼠之T細胞的細胞激素產生能力，以RBD胜肽再刺激脾T細胞48小時，隨後使用細胞激素微珠陣列測量上清液中之細胞激素表現量。如同預期，觀察到T細胞對於IFN-γ及TNF-α之誘導作用。此外，與載體控制組之小鼠相比，來自接種疫苗動物的T細胞產生了中等量的IL-10。重要的是，來自疫苗接種小鼠之再刺激細胞上清液中的介白素（IL）-4、IL-5、IL-13及IL-17a之表現量，與來自載體控制組動物之經胜肽刺激細胞的培養所見表現量相同（圖96）。
範例 18 ：於 C57BL/6 小鼠鼻內給藥表現 RBD 結構域之 Ad5 載體，可誘出持久性抗體反應
透過隨時間變化測量棘狀蛋白特異性血清IgG反應，於近親品系C57BL/6小鼠體內評估鼻內複製缺陷型Ad5載體的免疫原性，該載體編碼SARS-Cov-2之RBD結構域殘基302至543（SEQ ID NO：15）。如表25所述，於疫苗接種前第0天及單次鼻內接種疫苗後第15、30、63及120天（例如約2週、約1個月、約2個月及約4個月）收集血清。定量血清中SARS-CoV-2棘狀IgG之方法係已描述於範例13B。 [表25]
疫苗/ 載體控制 鼻內劑量 各組動物數量 疫苗接種 樣本採集
AdtPAWHSRBD 30 µL 中含有3.78E +08 ifu 20 C57BL/6 第0天 第0(接種前)、15、30、63及120天
結果係顯示於圖97中，其中30x基線係以虛線表示。於第15天，於所有20隻接種疫苗動物中檢測到棘狀蛋白特異性IgG反應後，反應維持穩定直至120天，根據威爾克森配對組符號等級檢定（Wilcoxon matched-pairs signed rank test），於不同接種後時間點之間並無統計學差異。本範例證實，於疫苗接種後30天至120天之間自血清中測得之抗棘狀IgG無顯著衰減。於實施例中，本發明係提供一疫苗或RBD載體，當以單次鼻內劑量對哺乳動物施用時，可誘導針對棘狀蛋白之抗體反應，且該反應可持續至少4個月。於些許實施例中，本發明係提供一疫苗或RBD載體，當以單次鼻內劑量對哺乳動物施用時，可誘導針對棘狀蛋白之抗體反應，且該反應可持續（若約4個月時檢測未衰減）至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月或至少約12個月（按年計算）。
範例 19 ：於 CD-1 小鼠鼻內給藥表現 RBD 結構域之 Ad5 載體，可於骨髓及肺臟誘導出長生型抗體分泌細胞
透過測量骨髓（BM）及肺部中可產生棘狀蛋白特異性IgG與IgA之RBD特異性漿細胞（抗體分泌細胞；antibody secreting cells，ASC），於遠親品系CD-1小鼠體內評估鼻內複製缺陷型Ad5載體的免疫原性，該載體編碼SARS-Cov-2之RBD結構域殘基302至543（SEQ ID NO：15）。如表26所述，於單次鼻內接種疫苗後第69天採集骨髓與肺臟。 [表26]
疫苗/ 載體控制 鼻內劑量 各組動物數量 疫苗接種 樣本採集
RBD載體 30 µL中含有3.78E+08 ifu 5 CD-1 第0天 第69天
透過ELISPOT對於骨髓（BM）及肺部中可產生棘狀蛋白特異性IgG與IgA之RBD特異性ASC的檢測係匯總如下。自疫苗接種小鼠製備取自骨髓（2脛骨+2股骨/小鼠）與肺臟細胞之單細胞懸液。將細胞於完全培養液中一式兩份進行連續稀釋，並於事先塗覆純化重組RBD蛋白（Sino Biological）之多層纖維素過濾器ELISPOT培養盤（Millipore）上於37°C培養5小時。使用AP共軛之山羊抗小鼠IgG抗體（Jackson ImmunoResearch）或AP共軛之山羊抗小鼠IgA（Jackson ImmunoResearch），檢測存在此等組織中由漿細胞分泌之RBD特異性抗體。使用S6 Ultra-V分析器（Cellular Technology Limited）對ELISPOTS進行成像與計數。
結果係顯示於圖98中。於第69天之疫苗接種小鼠骨髓中辨識出RBD特異性ASC。由於此等ASC係處於特別支持ASC長期生存之區位(niche)，本發明預期由RBD載體誘導之全身性RBD特異性抗體效價將具有高持久性。此外，鼻內疫苗接種亦使肺中建立持久之ASC群落，其中包括可於未來感染部位提供黏膜保護之IgA ASC。如目前所知，呼吸道病毒之感染亦可於肺中建立長生型ASC，而此等細胞於再次感染之早期預防中相當重要。因此，可合理假設此等由鼻內疫苗誘導之ASC的存在亦可為疫苗接種動物提供局部保護。於本發明實施例中，係提供用於誘導骨髓與肺臟駐留記憶抗體分泌細胞之組合物（例如，RBD載體）及方法。於些許實施例中，本發明係提供一疫苗或RBD載體，當以單次鼻內劑量對哺乳動物施用時，可誘導同時分泌抗棘狀IgG與IgA之骨髓與肺臟駐留記憶抗體分泌細胞。
範例 20 ：於 C57BL/6 小鼠鼻內給藥表現 RBD 結構域之 Ad5 載體，可誘導出長生型 RBD 特異性記憶 B 細胞
透過測量縱隔淋巴結中之長生型RBD特異性記憶B細胞以及骨髓（BM）中之RBD特異性漿細胞（抗體分泌細胞；ASC），於近親品系C57BL/6小鼠體內評估鼻內複製缺陷型Ad5載體的免疫原性，該載體編碼SARS-Cov-2之RBD結構域殘基302至543（SEQ ID NO：15）。如表27所述，於單次鼻內接種疫苗後第168天（例如24週或6個月），採集縱隔淋巴結與骨髓。將未接種之C57BL/6小鼠（n = 5）做為陰性控制組。 [表27]
疫苗/ 載體控制 鼻內劑量 各組動物數量 疫苗接種 樣本採集
RBD載體 30 µL中含有3.78E +08 ifu 5 C57BL/6 第0天 第168天
對於RBD特異性記憶B細胞之流式細胞術分析，B細胞抗體panel係由以下所組成：CD95/FAS-FITC（克隆Jo2；1：200稀釋度）、SARS-CoV-2 RBD-PE（1:200稀釋度）、SARS-CoV-2 RBD-APC（1:200稀釋度）、7-AAD（1:1000稀釋度）、CD3-PerCP-Cy5.5（克隆17A2；1：200稀釋度）、CD38-PE-Cy7（克隆90；1：400稀釋度）、CD19-APC-Fire750（克隆6D5；1：200稀釋度）、CD138-BV421（克隆281-2；1：200稀釋度）及IgD-BV510（克隆11-26c.2a；1：500稀釋度）。將細胞與抗體混合物（總體積為50 ul）於4°C在黑暗中培養20分鐘，再以200 ul SME洗滌。將細胞重懸於200 ul SME（無固定劑）中，並立即於FACSCanto II上進行分析。
RBD特異性記憶B細胞之結果係如圖99所示。圖99B顯示與未接種動物相比，疫苗接種動物之縱隔淋巴結中存在之RBD特異性記憶B細胞的絕對數量較高。於單次鼻內給藥RBD載體後168天檢測到抗原特異性記憶B細胞之存在，係強烈表示該鼻內疫苗所誘導之RBD特異性B細胞的長生型特性。存在於縱隔淋巴結中之RBD特異性記憶B細胞可隨時對例如SARS-CoV-2之呼吸道感染快速反應。
依照與範例19中所述之相同方法測量骨髓中之ASC。結果係如圖100所示。在單次鼻內給藥RBD載體之168天後，可於大多數動物之骨髓中檢測到長生型RBD特異性ASC產生之IgG與IgA抗體。
討論：以 S1 與 RBD 腺病毒載體進行單劑鼻內疫苗接種，可誘導出小鼠抵抗 SARS-CoV-2 之快速、持久性之全身及黏膜免疫力
於近親品系C57BL/6及遠親品系CD-1小鼠單次施用編碼取自SARS-CoV-2（登錄號QHD43416.1）之Wuhan-1病毒株的S1結構域（殘基16至685）（SEQ ID NO：13）或RBD結構域（殘基302至543）（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體後，透過測量血清與支氣管肺泡灌洗液（BAL）中棘突特異性抗體表現量之誘導作用，評估S1與RBD載體之免疫原性。如上所述，以三種不同劑量程度（高、中或低）評估各疫苗。於第0天單次接種疫苗後，於第7至28天（C57BL/6）或7至21天（CD-1）間收集血清及支氣管肺泡灌洗液（BAL）樣本。使用棘狀蛋白細胞計數微珠陣列，於血清或BAL樣本中測量針對SARS-CoV-2棘狀蛋白之IgG和IgA抗體。於活病毒中和測定中測量此等由疫苗誘發之抗體的功能性。除了誘導抵抗SARS-CoV-2的強大中和抗體反應及黏膜IgA外，RBD亦刺激全身性及黏膜細胞介導之免疫反應，其特徵為TH1輔助細胞（Th-1）型之細胞激素分泌型態，並且係透過對可產生細胞激素之CD4+與CD8+ T細胞的誘導作用，包括肺部駐留記憶T（Trm）細胞。
於接受單次鼻內給藥S1載體或RBD載體疫苗之兩種小鼠體內，皆檢測到系統性棘狀蛋白特異性IgG抗體反應。如圖78及85。於中等劑量與高劑量疫苗時，與S1載體相比，RBD載體可誘導較大程度之血清棘狀蛋白特異性IgG反應，且與CD-1小鼠相比，該作用於C57BL/6小鼠體內更為顯著。此外，鼻內給藥S1或RBD載體導致兩種小鼠品系之BAL中的棘狀蛋白特異性IgG迅速提升。亦證實單次鼻內給藥S1或RBD後對IgA之誘導作用。如範例18所示，經鼻內給藥後，由RBD載體（編碼SEQ ID NO：15）誘導之全身性棘狀蛋白特異性IgG抗體反應亦經證實具有持久性，於接種後長達120天皆未出現隨時間下降之跡象。參見圖97。此外，鼻內接種疫苗亦導致於肺臟環境中建立持久之RBD特異性ASC及長生型記憶B細胞群落，其中包括可為疫苗接種動物提供局部保護之IgA ASC。參見圖98至100。
透過灶點減少中和試驗（FRNT）（類似溶斑減少中和試驗（PRNT）），於使用野生型SARS-CoV-2分離株USA-WA1/2020之允許感染Vero E6細胞中，檢測鼻內給藥S1載體或RBD載體誘導出針對SARS-CoV-2之中和抗體反應。該分析包括取自以中等或高劑量之S1和RBD疫苗接種4週後之C57BL/6小鼠樣本，以及取自以高劑量RBD載體疫苗接種3週後之CD1小鼠樣本（圖94A）。與在所有經評估條件下使用S1載體相比，鼻內給藥RBD載體可顯著誘導出較高的中和效價。於最高劑量時，鼻內接種RBD載體於10/10 C57BL/6與8/10 CD-1小鼠中誘導出高於背景之中和抗體反應，其中位數效價分別為563及431（圖94A）。中和抗體反應之表現量與在各動物體內測得之棘狀蛋白特異性血清IgG反應的大小密切相關（圖94B），表示對於施用RBD載體之強烈抗體反應係與具潛在保護性之中和抗體的產生有關。
範例13、15與17顯示本發明疫苗組合物（例如一種經配置用於鼻內給藥之腺病毒載體疫苗，其編碼SARS-CoV-2棘狀蛋白之RBD序列（SEQ ID NO：15））於近親與遠親品系小鼠體內均具有高度免疫原性，並可誘發強大的全身性與局部之黏膜抗體及T細胞反應。於單次鼻內接種疫苗後，該RBD載體組合物透過誘導可中和野生型SARS-CoV-2感染的容許感染細胞(permissive cell)之功能性抗體，以及誘導生成黏膜IgA及細胞激素之肺CD4+與CD8+ T細胞，以誘發抵抗SARS-CoV-2棘狀蛋白之強烈且集中的免疫反應。由該RBD載體組合物所誘導之細胞介導反應係偏向一種抗病毒反應，如抗原特異性CD8 + T細胞之高比率以及包括IFN-γ和TNF-α等細胞激素之表現所證實。於肺臟中建立駐留記憶CD8+ T細胞群落，可補足針對棘狀蛋白之黏膜IgA抗體的穩健誘導作用，並代表對RBD載體組合物之整體免疫反應的重要補強。此等數據亦表示鼻內給藥RBD載體疫苗組合物不會引發潛在有害之Th2反應，反而係由於使用鼻內給藥之腺病毒載體所誘導之抗病毒反應，而誘發預期中的抗病毒T細胞反應。參見美國專利號9,605,275。整體而言，該數據顯示鼻內給藥表現SARS-CoV-2棘狀RBD序列（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體，可於全身性與黏膜部位皆產生體液與細胞免疫反應，特別係於感染及臨床疾病之主要部位的肺部。
儘管已根據較佳實施例描述了特定實施例，但應可理解，本發明所屬技術領域中具有通常知識者將可思及各種變化與修改。因此，所附請求項係旨在涵蓋所有落入下述請求項範圍內之此類同等變型。
無
經結合於本說明書並構成其中一部分之圖式示出本發明提供之一個或多個實施例，並伴隨實施方式及範例部分，以用於解釋本發明揭露之原理及實施方式。 ［圖1A］至［1J］為示例性SARS-CoV-2完整基因組（武漢海鮮市場肺炎病毒分離株Wuhan -Hu-1，完整基因組；GenBank：MN908947.3；SEQ ID NO：1）。 ［圖2A］至［2E］為SARS-CoV-2 ORF1ab多聚蛋白（GenBank：QHD43415.1；SEQ ID NO：2）。 ［圖3A］為包含天然前導序列之SARS-CoV-2表面醣蛋白（例如棘狀蛋白）（GenBank：QHD43416.1；SEQ ID NO：3）。 ［圖3B］為SARS-CoV-2表面醣蛋白棘狀蛋白之RBD區域（SED ID NO：446）。 ［圖4］為SARS-CoV-2 ORF3A蛋白（GenBank：QHD43417.1；SEQ ID NO：4）。 ［圖5］為SARS-CoV-2外套膜蛋白（GenBank：QHD43418.1；SEQ ID NO：5）。 ［圖6］為SARS-CoV-2膜醣蛋白（GenBank：QHD43419.1；SEQ ID NO：6）。 ［圖7］為SARS-CoV-2 ORF6蛋白（GenBank：QHD43420.1；SEQ ID NO：7）。 ［圖8］為SARS-CoV-2 ORF7a蛋白（GenBank：QHD43421.1；SEQ ID NO：8）。 ［圖9］為SARS-CoV-2 ORF8蛋白（GenBank：QHD43422.1；SEQ ID NO：9）。 ［圖10］為SARS-CoV-2核殼磷蛋白（GenBank：QHD43423.2；SEQ ID NO：10）。 ［圖11］為SARS-CoV-2 ORF10蛋白（GenBank：QHI42199.1；SEQ ID NO：11）。 ［圖12］顯示Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2完整基因組之示意圖（GenBank MN908497；NCBI參考序列：NC_045512.2；SEQ ID NO：1）。 ［圖13］顯示該棘狀蛋白多肽及其結構域（例如SEQ ID NO：3）之示意圖。 ［圖14］顯示透過冠狀病毒棘狀蛋白之S1及S2結構域進行之冠狀病毒分類學。 ［圖15］顯示棘狀蛋白S1部分之受體結合域（RBD）中位置455、486、493、494及501處之保守胺基酸取代表。 ［圖16］為SARS-CoV-2表面醣蛋白（例如棘狀蛋白）（GenBank：QHD43416.1），其具有經底線標記之一pTA訊號序列。（SEQ ID NO：12）。 ［圖17A］為SARS-CoV-2棘狀蛋白S1結構域，其具有經底線標記之pTA訊號序列。（SEQ ID NO：13）。當SEQ ID NO：13經嵌入腺病毒載體中時，其於本文中稱為「S1載體」。 ［圖17B］為SARS-CoV-2變異體於S1結構域中之突變（「序列」為SEQ ID NO：411）。 ［圖18］為S1結構域之SARS-CoV-2棘狀蛋白受體結合域（RBD），其具有經底線標記之pTA訊號序列以及短側翼序列。（SEQ ID NO：14）。 ［圖19］為S1結構域之SARS-CoV-2棘狀蛋白受體結合域（RBD），其具有經底線標記之pTA訊號序列以及長側翼序列。（SEQ ID NO：15）。當SEQ ID NO：15經嵌入腺病毒載體中時，其於本文中稱為「RBD載體」。 ［圖20］為S1結構域之SARS-CoV-2棘狀蛋白受體結合域（RBD），其於位置455、486、493、494及501處具有保守取代。（SEQ ID NO：16）。 ［圖21］為SARS-CoV-2棘狀蛋白，該S1結構域之受體結合域（RBD）的一部分於位置455、486、493、494及501處具有保守取代。（SEQ ID NO：17）。 ［圖22］為SARS-CoV-2表面醣蛋白（例如棘狀蛋白），其具有經底線標記之一pTA訊號序列，且於S1/S2、S2'及HR1位點具有取代。（SEQ ID NO：18）。 ［圖23］為SARS-CoV-2表面醣蛋白（例如棘狀蛋白），其具有經底線標記之一pTA訊號序列，且於S1/S2、S2'及HR1位點具有取代。（SEQ ID NO：19）。 ［圖24］為SARS-CoV-2表面醣蛋白（例如棘狀蛋白），其具有經底線標記之一pTA訊號序列，且於S1/S2、S2'、HR1、融合胜肽及ER滯留模體位點（retention motif site）具有取代。（SEQ ID NO：20）。 ［圖25］顯示施用（本發明之單價流感疫苗組合物（即，NasoVAX）的）2週後不存在劑量依賴性載體脫落(vector shedding)，未發現具有高複製能力之病毒（如透過聚合酶連鎖反應（「PCR」）測定），並以GMR表現第29天與基線相比之抗載體抗體，其中，於最高劑量下之1個月後僅表現出2.3倍之誘導率。本發明之單價流感疫苗組合物顯示一具有有限抗載體（Ad-vector）免疫反應之瞬時脫落（Advector）。 ［圖26］顯示施用NasoVAX（高劑量；1×1011 vp）對預先存在之（基線Ad5血清狀態）抗載體（Ad5）免疫力之作用，如對體液（第29天之「HAI」或微中和「MN」）、黏膜（第29天之「IgA」）及細胞（第8天之「ELISpot」）之測量結果，其中，未觀察到Ad5血清陰性或Ad5血清陽性受試者間之免疫反應有所差異。Ad5+受試者之中位數效價係較定量下限（LLOQ）高22倍。 ［圖27］為跨整體SARS-CoV-2蛋白質組之高親和性第I類HLA及第II類HLA結合模體(binding motif)之概況。 ［圖28］為跨整體SARS-CoV-2蛋白質組之高親和性及中等親和性之第I類HLA及第II類HLA結合模體之概況。 ［圖29］為SEQ ID NO：328之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖30］為SEQ ID NO：329之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖31］為SEQ ID NO：330之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖32］為SEQ ID NO：331之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖33］為SEQ ID NO：332之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖34］為SEQ ID NO：333之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖35］為SEQ ID NO：334之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖36］為SEQ ID NO：335之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖37］為SEQ ID NO：336之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖38］為SEQ ID NO：337之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖39］為SEQ ID NO：338之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖40］為SEQ ID NO：339之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖41］為SEQ ID NO：340之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖42］為SEQ ID NO：341之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖43］為SEQ ID NO：342之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖44］為SEQ ID NO：343之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖45］為SEQ ID NO：344之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖46］為SEQ ID NO：345之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖47］為SEQ ID NO：346之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖48］為SEQ ID NO：347之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖49］為SEQ ID NO：348之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖50］為SEQ ID NO：349之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖51］為SEQ ID NO：350之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖52］為SEQ ID NO：351之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖53］為SEQ ID NO：352之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖54］為SEQ ID NO：353之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖55］為SEQ ID NO：354之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖56］為SEQ ID NO：355之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖57］為SEQ ID NO：356之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖58］為SEQ ID NO：357之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖59］為SEQ ID NO：358之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖60］為SEQ ID NO：359之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖61］為SEQ ID NO：360之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖62］為SEQ ID NO：361之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖63］為SEQ ID NO：362之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖64］為SEQ ID NO：363之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖65］為SEQ ID NO：364之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖66］為SEQ ID NO：365之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖67］為SEQ ID NO：366之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖68］為SEQ ID NO：367之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖69］為SEQ ID NO：368之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖70］為SEQ ID NO：369之第I類HLA及第II類HLA結合模體圖譜。 ［圖71］為對於曾接受單次鼻內劑量表現RBD結構域（如SEQ ID NO：15中所示）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，於不同時間點取自支氣管肺泡灌洗之血清中anti-SAR-CoV-2 IgG (µg/ml)（A）、BAL anti-SARS-Cov-2 IgG（ng/ml）（B）及BAL anti-SARS-CoV-2 IgA（ng/ml）（C）之測量結果。結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。第0日對所有組別回報控制組之值。第7日及第14日對於接受2次鼻內劑量之組別回報接受相同劑量單次給藥之組別之值。 ［圖72］為於十隻曾接受單次鼻內高劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠中，透過灶點減少中和試驗（FRNT）測量抵抗SARS-CoV-2之血清中和抗體。各圖（圖72A至72J）對應於自一免疫小鼠獲得之結果。圓點折線對應於陰性對照血清，方形點折線對應於測試之血清樣本。 ［圖73］為於五隻曾接受單次鼻內中劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠中，透過灶點減少中和試驗（FRNT）測量抵抗SARS-CoV-2之血清中和抗體。各圖（圖73A至73E）對應於自一免疫小鼠獲得之結果。圓點折線對應於陰性對照血清，方形點折線對應於測試之血清樣本。 ［圖74A］至［圖74L］為取自曾接受單次鼻內高劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，其肺臟中免疫細胞之流式細胞儀分析。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖75A］至［圖75E］為取自曾接受單次鼻內中劑量之表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，其支氣管肺泡灌洗中免疫細胞之流式細胞儀分析。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖76A］至［圖76J］為取自曾接受單次鼻內高劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，其縱膈腔淋巴節中免疫細胞之流式細胞儀分析。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖77A］至［圖77L］為取自曾接受單次鼻內高劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，其脾臟中免疫細胞之流式細胞儀分析。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖78］為對於曾接受單次鼻內劑量表現S1結構域（SEQ ID NO：13）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，於不同時間點取自支氣管肺泡灌洗(BAL)之血清中anti-SAR-CoV-2 IgG (µg/ml)（A）、BAL anti-SARS2 S IgG (ng/ml)（B）及BAL anti-SARS-2 S IgA (ng/ml)（C）之測量結果。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。第0日對所有組別回報控制組之值。第7日及第14日對於接受2次鼻內劑量之組別回報接受相同劑量單次給藥之組別之值。 ［圖79］為於五隻曾接受單次鼻內高劑量表現S1結構域（SEQ ID NO：13）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠中，透過灶點減少中和試驗（FRNT）測量抵抗SARS-CoV-2之血清中和抗體。各圖（圖79A至79E）對應於自一免疫小鼠獲得之結果。圓點折線對應於陰性對照血清，方形點折線對應於陽性對照血清，三角形點或菱形點折線對應於測試之血清樣本。 ［圖80］為於五隻曾接受單次鼻內中劑量表現S1結構域（SEQ ID NO：13）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠中，透過灶點減少中和試驗（FRNT）測量抵抗SARS-CoV-2之血清中和抗體。各圖（圖80A至80E）對應於自一免疫小鼠獲得之結果。圓點折線對應於陰性對照血清，方形點折線對應於陽性對照血清，三角形點折線對應於測試之血清樣本。 ［圖81A］至［圖81L］為取自曾接受單次鼻內高劑量表現S1結構域（SEQ ID NO：13）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，其肺臟中免疫細胞之流式細胞儀分析。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖82A］至［圖82E］為取自曾接受單次鼻內中劑量表現S1結構域（SEQ ID NO：13）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，其支氣管肺泡灌洗中免疫細胞之流式細胞儀分析。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖83A］至［圖83J］為取自曾接受單次鼻內高劑量表現S1結構域（SEQ ID NO：13）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，其縱膈腔淋巴節中免疫細胞之流式細胞儀分析。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖84A］至［圖84L］為取自曾接受單次鼻內高劑量表現S1結構域（SEQ ID NO：13）之複製缺陷型Ad5載體的C57BL/6小鼠個體，其脾臟中免疫細胞之流式細胞儀分析。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖85］為對於曾接受單次或2次鼻內劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體的CD-1小鼠個體，於不同時間點取自支氣管肺泡灌洗(BAL)之血清中anti-SAR-CoV-2 IgG (µg/ml)（A）、BAL anti-SARS-CoV-2 IgG (ng/ml)（B）及BAL anti-SARS-COV-2 IgA (ng/ml)（C）之測量結果。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。第0日對所有組別回報控制組之值。第7日及第14日對於接受2次鼻內劑量之組別回報接受相同劑量單次給藥之組別之值。 ［圖86］為對於曾接受單次鼻內劑量表現S1結構域（SEQ ID NO：13）之複製缺陷型Ad5載體的CD-1小鼠個體，於不同時間點取自支氣管肺泡灌洗(BAL)之血清中anti-SAR-CoV-2 IgG (µg/ml)（A）、BAL anti-SARS-CoV-2 IgG (ng/ml)（B）及BAL anti-SARS-CoV-2 IgA (ng/ml)（C）之測量結果。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。第0日對所有組別回報控制組之值。 ［圖87A］至［圖87E］為SARS-CoV-2串聯多聚蛋白；衍生自SEQ ID NO：1（GenBank：MN908947.3）。 ［圖88］為曾接受單次鼻內劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體（「RBD載體」）的CD-1小鼠個體，或僅接受A195緩衝液之控制組，於第10日（A）、第14日（B）之肺臟T細胞以及第10日（C）、第14日（D）之脾臟T細胞之測量結果。各組結果經表示為幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖89］為曾接受單次鼻內劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體（「RBD載體」）的CD-1小鼠個體，或僅接受對照A195緩衝液的CD-1小鼠個體，於第14日之肺CD4+ IFN-g+ CD11a+ T細胞（A）、肺CD4+ TNF-a+ CD11a+ T細胞（B）、肺CD8+ IFN-g+ CD11a+ T細胞（C）及肺CD8+ TNF-a+ CD11a+ T細胞（D）之測量結果。於流式細胞儀分析之前，細胞係經一RBD胜肽庫以2mcg/peptide/mL重新刺激。線條對應於幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖90］為曾接受單次鼻內劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體（「RBD載體」）的CD-1小鼠個體，或僅接受對照A195緩衝液的CD-1小鼠個體，於第14日之脾CD4+ IFN-g+ CD11a+ T細胞（A）、脾CD4+ TNF-a+ CD11a+ T細胞（B）、脾CD8+ IFN-g+ CD11a+ T細胞（C）及脾CD8+ TNF-a+ CD11a+ T細胞（D）之測量結果。線條對應於幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖91］為曾接受單次鼻內劑量表現RBD結構域（SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體（「RBD載體」）的CD-1小鼠個體，或僅接受對照A195緩衝液的CD-1小鼠個體，於第14日之肺CD4+（A）及CD8+（B）駐留記憶T細胞之測量結果。線條對應於幾何平均反應+/- 95%信賴區間。 ［圖92］為於十隻曾接受單次鼻內高劑量表現RBD結構域（ SEQ ID NO：15）之複製缺陷型Ad5載體的CD-1小鼠中，透過灶點減少中和試驗（FRNT）測量抵抗SARS-CoV-2之血清中和抗體。各圖對應於自一免疫小鼠（圖92A至92J）獲得之結果。圓點折線對應於陰性對照血清，方形點折線對應於測試之血清樣本。 ［圖93］為於S1或RBD載體感染細胞中棘狀轉基因之表現及檢測。Per.C6細胞分別於MOI：5處感染S1（SEQ ID NO：13）或RBD（SEQ ID NO：15）載體（「S1載體」或「RBD載體」）。感染後24小時，細胞經收集、固定並透化，再以小鼠中和棘狀特異性單株抗體MM-43（上圖）或MM-57（下圖）染色，如填滿直方圖所示。未感染之細胞係作為陰性對照（空白直方圖）。 ［圖94］為於鼻內單次給藥S1載體及RBD載體後，血清中之SARS-CoV-2中和抗體反應。A：如圖所示，28天前接種中劑量或高劑量之S1或RBD載體之C57BL/6或CD-1小鼠的中和抗體反應。結果表現為感染野生型SARS-CoV-2之permissive Vero E6 cells其血清樣本達到50%中和（FRNT50）的稀釋倍數的倒數，線代表組別之中位數。B：經接種動物血清中之中和抗體反應與棘狀蛋白特異性IgG反應間之相關性。相關性分析係透過雙尾Spearman測試法進行。於10/10 C57BL / 6及8/10 CD-1小鼠中，以RBD載體進行之高劑量鼻內疫苗接種可誘發高於背景值之中和抗體反應。 ［圖95］為鼻內單次給藥RBD載體後14天，由肺臟駐留記憶T細胞產生之細胞內細胞激素。如範例17中所述，對CD-1小鼠進行鼻內單次給藥一載體（Ctrl）或高劑量RBD載體。於第14天分離出肺細胞（n = 10隻小鼠/疫苗，3小鼠/對照），以RBD胜肽庫重新刺激5小時，並透過流式細胞儀分析以鑑定CD69+ CD103+ 駐留記憶T細胞（Trm）。結果表示為各小鼠之CD4+ 或CD8+ T細胞之百分比。線條表示為各組別之平均反應+/- SD。使用Mann-Whitney檢驗法進行統計分析：*，P ＜ 0.05；**，P ＜ 0.01；***，P ＜ 0.001；****，P ＜ 0.0001。 ［圖96］為鼻內單次給藥RBD載體10天後，脾臟T細胞分泌產生之細胞激素。如範例18中所述，對CD-1小鼠進行鼻內單次給藥一載體（Ctrl）或高劑量RBD載體。於第10天分離出脾細胞（n = 10小鼠/疫苗，3小鼠/對照），並以RBD胜肽庫重新刺激48小時。使用細胞激素多重測定法於上清液中檢測經分泌之細胞激素。結果係以pg/ml表示。線條代表平均反應+/- SD。使用Mann-Whitney檢驗進行統計分析：*，P ＜ 0.05；**，P ＜ 0.01；***，P ＜ 0.001；****，P ＜ 0.0001。 ［圖97］為鼻內單次給藥RBD載體後之縱向棘狀蛋白特異性血清IgG反應。C57BL/6J小鼠（n = 20）接受鼻內單次給藥RBD載體。於接種前第0天以及接種後第15、30、63及120天收集血清，並分別進行分析以定量棘狀蛋白特異性IgG。結果係以µg/ml表示。參見範例18。 ［圖98］為鼻內單次給藥RBD載體後，RBD特異性抗體分泌細胞（「ASC」）於骨髓及肺中所產生IgG和IgA抗體之定量。CD-1小鼠（n = 5）接受鼻內單次給藥RBD載體。於免疫作用後69天（「69 dpi」）收集肺細胞（LG）及骨髓細胞（BM），並透過ELISpot分別分析ASC定量。（A）顯示B細胞ELISpot板孔之範例。（B）顯示產生IgG及IgA之RBD特異性ASC之測量結果，其顯示為骨髓中每106 個細胞總數之頻率或數量。（C）顯示產生IgG及IgA之RBD特異性ASC之測量結果，其顯示為肺中每106 個細胞總數之頻率或數量。參見範例19。 ［圖99］為鼻內單次給藥RBD載體後第168天，長生型RBD特異性記憶B細胞之定量。C57BL/6J（n=4）小鼠接受單次鼻內給藥RBD載體。免疫作用後168天（24週）收集縱隔淋巴結，並透過流式細胞術對RBD特異性記憶B細胞進行個別定量分析。將未接種之C57BL/6J（n = 5）做為陰性對照。（A）顯示流式細胞儀分析之門控策略。（B）顯示與未接種之動物相比，經接種疫苗動物中測得之RBD特異性記憶B細胞的絕對數量。參見範例20。 ［圖100］為鼻內單次給藥RBD載體後，長生型RBD特異性ASC於骨髓中所產生IgG和IgA抗體之定量。C57BL/6J（n=4）小鼠接受單次鼻內給藥RBD載體。免疫作用後168天（24週）收集骨髓細胞（BM），並透過ELISpot分別分析ASC定量。將未接種之C57BL/6J（n = 5）做為陰性對照。（A）顯示B細胞ELISpot板孔之範例。（B）顯示產生IgG及IgA之RBD特異性ASC之測量結果，其顯示為骨髓中每106 個細胞總數之數量。參見範例20。
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Claims (92)

  1. 一種免疫原性組合物，其包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其中，該rdAd載體係選自： a）一rdAd載體，缺少編碼一外源性、非腺病毒抗原之一編碼序列； b）一rdAd載體，包含一基因表現匣，其包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，選擇性地，其中，該抗原包含一SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）； c）一rdAd載體，包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，編碼除SARS-CoV-2以外之一傳染源之至少一種外源抗原； d）a）與b）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； e）b）和c）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； f）a）、b）或c）之該等rdAd載體中任一者之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； g）b）中兩種不同類型之rdAd載體之一組合，其中，各類型之rdAd載體皆包含一基因表現匣，其編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，該抗原不同於該組合中其他類型之rdAd載體所編碼者，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； 該免疫原性組合物經配置施用於一哺乳動物受試者內，以誘導抵抗SARS-CoV-2之中和抗體及/或細胞免疫反應。
  2. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中，該基因表現匣包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，用於該棘狀（S）蛋白或該棘狀（S）蛋白之S1結構域。
  3. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中，該基因表現匣包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，其選自以下所構成之群組：SEQ ID NO：3；與SEQ ID NO：3具有至少80%之同源性及/或同一性之一序列；SEQ ID NO：12；與SEQ ID NO：12具有至少80%之同源性及/或同一性之一序列；SEQ ID NO：15；與SEQ ID NO：15具有至少80%之同源性及/或同一性之一序列；SEQ ID NO：446；與SEQ ID NO：446具有至少80%之同源性及/或同一性之一序列；SEQ ID NO：412至417之任一者；SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476及SEQ ID NO：460中之任一者；與SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476及SEQ ID NO：460中之任一者具有至少80%之同源性及/或同一性之一序列。
  4. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列編碼一棘狀蛋白序列，其包含其中S1/S2可切割位點及/或S2'對蛋白質體降解具有抗性之一序列，以及/或其中融合胜肽已經缺失或經過修飾以防止其融合活性之一序列，以及/或其中胞內結構域已經修飾或部分修飾以改變內質網滯留模體之一序列，且選擇性包含一編碼序列以編碼具有以下至少一者之一序列：NSPQQAQSVAS（SEQ ID NO：451）、NSPSGAGSVAS（SEQ ID NO：456）或NSP ----- VAS（SEQ ID NO：461）於S1/S2切割位點、KRSFIADA（SEQ ID NO：453）、PSKPSKQSF（SEQ ID NO：457）、PSKPSKNSF（SEQ ID NO：458）、PSKPSNASF（SEQ ID NO：459）於S2'切割位點、或SRLDPPEAEV（SEQ ID NO：455），以及/或表1及/或表2中所列之任何序列修飾。
  5. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列為SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20所示之一序列或其之一免疫原性片段。
  6. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列至少編碼SEQ ID NO：3之胺基酸331至527。
  7. 如請求項6所述之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列編碼一棘狀蛋白受體結合域（RBD）序列，其包含下列取代中之一者或多者：K417N、K417T、R403K、N439K、G446V、G446S、L452R、G476A、S477N、T478K、E484D、T478I、E484K、F490S、Q493R、S494P、P499H及/或N501Y。
  8. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列編碼一棘狀蛋白受體結合域（RBD）序列或其免疫原性片段，及/或包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、 SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476、SEQ ID NO：446及SEQ ID NO ：460中之一胺基酸序列；或其之一免疫原性片段。
  9. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體之基因表現匣進一步包含一編碼序列，其編碼SARS-CoV-2結構蛋白外套膜（E）、膜（M）或核殼（N）中之一個或多個。
  10. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，包含一額外複製缺陷型腺病毒載體，其包含一編碼序列，其編碼SARS-CoV-2結構蛋白外套膜（E）、膜（M）或核殼（N）中之一個或多個。
  11. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體之基因表現匣包含用於SEQ ID NO：411之一修飾版本之一編碼序列，其包含： 胺基酸333至388、390至395、397至399、401至411、413至415、417至419、424、426至435、437、439至442、444至446、449、450、452、453、455至463、465、467至473、475至479、481至486、490、491、493至495、499至510、及/或513至526中任一者或多者之一個或多個取代； 胺基酸367、403、417、439、446、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、490、493、494、495、496、499、500、501、502、503、504、及/或505中任一者或多者之一個或多個取代； 一個或多個取代，其選自以下所構成之群組：胺基酸367（V）經F、I、L、S或A取代，胺基酸403（R）經K或S取代，胺基酸417（K）經N或T取代；胺基酸439（N）經K取代，胺基酸446（G）經V、S或A取代；胺基酸449（Y）經N取代；胺基酸452（L）經L、M或Q取代，胺基酸453（Y）經F取代；胺基酸455（L）經F取代；胺基酸456（F）經L取代；胺基酸470（T）經I、A或N取代，胺基酸473（Y）經V取代；胺基酸475（A）經V取代；胺基酸476（G）經S或A取代；胺基酸477（S）經N、R、T、G、A或I取代；胺基酸476（G）經S或A取代，胺基酸477（S）經N、R、T、G、A或I取代，胺基酸478（T）經I、K、R或A取代，胺基酸484（E）經Q、K、D、A或R取代；胺基酸486（F）經L或S取代；胺基酸490（F）經L或S取代，胺基酸493（Q）經L或R取代；胺基酸494（S）經P或L取代，胺基酸495（Y）經N或F取代；胺基酸496（G）經V或S取代，胺基酸499（P）經H、S或R取代，胺基酸500（T）經I取代；胺基酸501（N）經Y、T或S取代；胺基酸502（G）經R、D或C取代；胺基酸503（V）經L、I或F取代；以及胺基酸504（G）經V、D或S取代，胺基酸505（Y）經H、E、W或C取代。
  12. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中，除SARS-CoV-2以外之一傳染源之該至少一種抗原係衍生自一流感病毒。
  13. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其包含a）至c）之任兩種rdAd載體之組合。
  14. 如請求項13所述之免疫原性組合物，其中，該免疫原性組合物為一兩部分之組合物，其包含至少一組合物，包含a）至c）中之rdAd載體，以及至少一第二組合物，包含不同的a）至c）中之rdAd載體。
  15. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其進一步經配置以誘導抵抗SARS-CoV-2之一黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應。
  16. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該編碼序列編碼至少一個或多個B細胞抗原決定位、一個或多個CD8+ T細胞抗原決定位、以及/或一個或多個CD4+ T細胞抗原決定位。
  17. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該編碼序列係針對該哺乳動物受試者進行密碼子優化。
  18. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該等中和抗體係對於哺乳動物受試者體內之SARS-CoV-2感染具有血清保護，其中，該哺乳動物受試者為一人類。
  19. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一人類腺病毒，選擇性地為Ad5或Ad26。
  20. 如請求項1所述之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一牛腺病毒、犬腺病毒、非人靈長類腺病毒、雞腺病毒、或豬或養豬類腺病毒。
  21. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一E1、E3、及/或E4剔除或破壞之腺病毒。
  22. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該SARS-CoV-2抗原編碼序列編碼一種或多種胜肽，其包含：表3A中之一個或多個T細胞抗原決定位、表3B中之一組或多組T細胞抗原決定位、或SEQ ID NO：27至282；以及/或SEQ ID NO：25至68之一個或多個B細胞抗原決定位；以及/或SEQ ID NO：328至369之一個或多個；其中，該等胜肽係選擇性為串聯，並且選擇性地受2至10個胺基酸之一連接胺基酸序列隔開。
  23. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該rdAd載體進一步包含至少一分子佐劑，其選自以下所構成之群組：一種或多種做為共同刺激成分之多肽或肽；一種或多種細胞激素；一種或多種趨化因子；一種或多種免疫抑制蛋白；一種或多種TLR促效劑，其選擇性選自SEQ ID NO：463至474所構成之群組；以及其等之一組合。
  24. 如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該rdAd載體包含至少一多核苷酸序列，其編碼至少一種SARS-CoV-2阻斷蛋白；其中，該至少一多核苷酸序列編碼至少一肽或多肽：其誘導干擾SARS-CoV-2 S蛋白與其細胞受體結合之一免疫反應、直接干擾SARS-CoV- 2 S蛋白與其細胞受體結合、為一RBD結合劑、為一ACE2結合劑、及/或同時為一RBD結合劑及ACE2結合劑。
  25. 一種多核苷酸，其編碼如前述請求項中任一項所述之免疫原性組合物之一rdAd載體。
  26. 一種rdAd載體，其於如請求項25所述之多核苷酸表現於宿主細胞中時產生。
  27. 一種組合物，其包含如請求項26所述之rdAd載體。
  28. 一種藥用製劑，其包含：一有效量之如請求項1至24中任一項所述之免疫原性組合物；以及一種藥學上可接受之稀釋劑或載體，其中，該稀釋劑係選擇性為一磷酸鹽緩衝液。
  29. 如請求項28所述之藥用製劑，其經配置用於非侵入性施用。
  30. 如請求項28或29所述之藥用製劑，其經配置以鼻內給藥予該哺乳動物受試者。
  31. 如請求項28至30中任一項所述之藥用製劑，其中，對該哺乳動物受試者施用該藥用製劑可於該哺乳動物受試者體內誘導一保護性免疫反應，其選擇性為一黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應。
  32. 如請求項28至31中任一項所述之藥用製劑，其中，該藥學上可接受之載體為一噴霧或氣溶膠形式。
  33. 如請求項28至32中任一項所述之藥用製劑，其中，該有效量係為至少107 個病毒顆粒（vp）、至少108 個病毒顆粒（vp）、或至少109 個病毒顆粒（vp）。
  34. 如請求項28至33中任一項所述之藥用製劑，其經配置為一單次鼻內劑量。
  35. 如請求項28至34中任一項所述之藥用製劑，其經配置為兩劑或更多劑之鼻內劑量。
  36. 一種藥用製劑，其適用於對一人類受試者進行單次劑量之鼻內給藥，該藥用製劑其包含： 一有效量為至少107 個病毒顆粒（vp）之如請求項1至24中任一項所述之免疫原性組合物，其包含至少一包含一基因表現匣之複製缺陷型腺病毒載體，該基因表現匣包含一編碼序列，以編碼至少SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）或其至少一免疫原性片段，其中，該有效量可誘導一黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應；以及 一藥學上可接受之稀釋劑或載體。
  37. 如請求項36所述之藥用製劑，其中，該製劑經配置以對該人類受試者提供抵抗SARS-CoV-2之血清保護至少6個月，或較佳者為至少9個月。
  38. 如請求項36或37所述之藥用製劑，其中，該編碼序列係針對該人類受試者進行密碼子優化。
  39. 一種用於鼻內給藥之藥用劑量，其包含： 一藥學上可接受之載體，其以噴霧或氣溶膠形式與如請求項1至24中任一項所述之免疫原性組合物混合，其中，該劑量經配置用於鼻內給藥，以非侵入性地誘導抵抗SARS-CoV-2之一保護性免疫反應。
  40. 如請求項39所述之藥用劑量，其中，該免疫原性組合物之一有效量為至少107 個病毒顆粒（vp）、至少108 個病毒顆粒（vp）、或至少109 個病毒顆粒（vp）。
  41. 如請求項39所述之藥用劑量，其中，該有效量可誘導一黏膜、體液及T細胞之聯合保護性免疫反應。
  42. 如請求項39至41中任一項所述之藥用劑量，其經配置為單次劑量以誘導抵抗冠狀病毒之一保護性免疫反應。
  43. 如請求項39至42中任一項所述之藥用劑量，其經配置為兩劑量或更多劑量以誘導抵抗SARS-CoV-2之一保護性免疫反應。
  44. 一種誘導抵抗冠狀病毒之一免疫反應之方法，該方法包含對一哺乳動物受試者施用一有效量之如請求項1至24中任一項所述之免疫原性組合物。
  45. 如請求項44所述之方法，其中，該免疫反應係針對SARS-CoV-2具有保護性。
  46. 一種誘導抵抗SARS-CoV-2之一免疫反應之方法，該方法包含對一哺乳動物受試者施用如請求項28至38中任一項所述之藥用製劑或如請求項39至43任一者所述之藥用劑量。
  47. 如請求項46所述之方法，其中，該免疫反應係針對SARS-CoV-2具有保護性。
  48. 如請求項44至47中任一項所述之方法，該方法包含對該哺乳動物受試者進行鼻內給藥一有效量之該免疫原性組合物，其中，該免疫反應可針對SARS-CoV-2之攻擊提供保護。
  49. 一種於一人類受試者體內誘導抵抗冠狀病毒之一黏膜、體液及/或T細胞之聯合保護性免疫反應之方法，其包含： 對一人類受試者進行鼻內給藥一單次劑量之如請求項28至38中任一項所述之藥用製劑或如請求項39至43中任一項所述之藥用劑量，其中，該給藥可誘導抵抗SARS-CoV-2之血清抗體、黏膜抗體及T細胞，藉以選擇性對該人類受試者提供血清保護至少約6個月或較佳者為至少約9個月。
  50. 如請求項49所述之方法，其中，該血清保護持續至少12個月、至少13個月或至少14個月。
  51. 如請求項44至50中任一項所述之方法，進一步包含對該人類施用一種或多種抗細胞激素試劑，以預防及/或治療SARS-CoV-2，選擇性地其中，該一種或多種抗細胞激素試劑包含一種或多種抗IL-1α試劑、一種或多種抗IL-5試劑、一種或多種抗IL-6試劑、一種或多種抗IL-12試劑、一種或多種抗IL-17試劑、一種或多種抗MCP-1試劑、一種或多種抗TNF-α試劑、一種或多種抗GM-CSF試劑、及/或一種或多種抗RANTES試劑。
  52. 如請求項51所述之方法，其中，該一種或多種抗細胞激素試劑不包括一種或多種抗MIPα試劑及/或一種或多種抗RANTES試劑。
  53. 如請求項51所述之方法，其中： 該一種或多種抗細胞激素試劑係實質上與該有效量之該免疫原性組合物共同施用； 該一種或多種抗細胞激素試劑係實質上非與該有效量之該免疫原性組合物搭配施用； 該免疫原性組合物係施用於該哺乳動物一次，而該一種或多種抗細胞激素試劑係多次施用；或 該免疫原性組合物係與該一種或多種抗細胞激素共同施用於該哺乳動物，且該一種或多種抗細胞激素試劑係於後續繼續施用於該哺乳動物。
  54. 一種治療或抑制一哺乳動物體內呼吸道病毒感染症狀之方法，該呼吸道病毒感染引起該哺乳動物肺中之介白素6（IL-6）、介白素1α（IL-1α）及/或介白素12（IL-12）之表現升高，該方法包括：對受試者鼻內給藥一有效量之E1與E3剔除腺病毒載體，其表達或不表達一SARS-CoV-2抗原，藉以減緩肺中之IL-6、IL-1α、及/或IL-12之表現，進而於施用該載體後減輕該症狀長達約28天。
  55. 如請求項54所述之方法，其中，於施用該載體後，肺中之單核球趨化蛋白1（MCP-1）、干擾素γ（IFN-γ）、及/或RANTES之表現增加。
  56. 如請求項54所述之方法，其中，於施用該載體後，巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1α）及/或RANTES之表現並未減少。
  57. 一種於一哺乳動物受試者體內誘導一抗病毒免疫反應之方法，該哺乳動物受試者有其需求或有呼吸道病毒感染風險，該方法包含：對該受試者鼻內給藥一有效量之E1與E3剔除腺病毒載體，其表達或不表達一SARS-CoV-2抗原，其中，於給藥步驟後，該抗病毒免疫反應產生單核球趨化蛋白1（MCP-1）及/或干擾素γ（IFN-γ）之表現增加。
  58. 如請求項44至57中任一項所述之方法，其中，於施用該E1與E3剔除腺病毒載體之前、實質上同時、或之後，對受試者施用一種或多種額外抗SARS-CoV-2藥劑，其中，該一種或多種額外藥劑選擇性選自由氯奎寧(chloroquine)、亞茲索黴素(azithromycin)、瑞德西韋(remdesivir)、及其等之一組合所構成之群組。
  59. 如請求項44至58中任一項所述之方法，其中，該哺乳動物受試者於接受施用該藥用製劑前，係經感染SARS-CoV-2。
  60. 如請求項44至59中任一項所述之方法，其中，該哺乳動物受試者為一人類。
  61. 一種免疫原性組合物，其包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其中，該rdAd載體係選自： a）一rdAd載體，缺少編碼一外源性、非腺病毒抗原之一編碼序列； b）一rdAd載體，包含一基因表現匣，其包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，選擇性地，其中，該抗原包含一SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）； c）一rdAd載體，包含一基因表現匣，其包含一編碼序列，編碼除SARS-CoV-2以外之一傳染源之至少一種外源抗原； d）a）與b）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； e）b）與c）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； f）a）、b）或c）之該等rdAd載體中任一者之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； g）b）中兩種不同類型之rdAd載體之一組合，其中，各類型之rdAd載體皆包含一基因表現匣，其編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，該抗原不同於該組合中其他類型之rdAd載體所編碼者，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； 該免疫原性組合物經配置施用於一哺乳動物受試者體內，以誘導抵抗SARS-CoV-2之中和抗體及/或細胞免疫反應，用於治療或預防SARS-CoV-2。
  62. 一種免疫原性組合物之用途，該免疫原性組合物包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，其中，該rdAd載體係選自： a）一rdAd載體，缺少編碼一外源性、非腺病毒抗原之一編碼序列； b）一rdAd載體，包括一基因表現匣，其包含一SARS-CoV-2抗原編碼序列，編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，選擇性地，其中，該抗原包含一SARS-CoV-2棘狀（S）蛋白受體結合域（RBD）； c）一rdAd載體，包括一基因表現匣，其包含一編碼序列，編碼除SARS-CoV-2以外之一傳染源之至少一種外源抗原； d）a）與b）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； e）b）與c）之該等載體之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； f）a）、b）或c）之該等rdAd載體中任一者之一組合，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； g）b）中兩種不同類型之rdAd載體之一組合，其中，各類型之rdAd載體皆包含一基因表現匣，其編碼至少一種SARS-CoV-2抗原，該抗原不同於該組合中其他類型之rdAd載體所編碼者，其中，該等rdAd載體係共同或分開施用； 該免疫原性組合物經配置施用於一哺乳動物受試者體內，以誘導抵抗SARS-CoV-2之中和抗體及/或細胞免疫反應， 其中，該用途係用於製造治療或預防SARS-CoV-2之藥物。
  63. 一種免疫原性組合物，其包含一複製缺陷型腺病毒（rdAd）載體，該rdAd載體包含一核酸序列，編碼SEQ ID NO：446或與SEQ ID NO：446具有至少90%或至少95%同一性之一變異體。
  64. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：15。
  65. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：13。
  66. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：412至417、SEQ ID NO：438至445、SEQ ID NO：475至476及SEQ ID NO：460中之一個或多個。
  67. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼一序列，該序列包含SEQ ID NO：3之一個或多個點突變。
  68. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼包含一個或多個突變之一序列，所述突變係位於胺基酸位置333至388、390至395、397至399、401至411、413至415、417至419、424、426至435、437、439至442、444至446、449、450、452、453、455至463、465、467至473、475至479、481至486、490、491、493至495、499至510、或513至526，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411。
  69. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼包含一個或多個突變之一序列，所述突變係位於胺基酸位置367、403、439、417、446、447、449、452、453、455、456、470、473、475、476、477、478、484、486、487、490、493、494、496、499、500、501、502、503、504、及/或505，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411。
  70. 如請求項68所述之免疫原性組合物，其中，該一個或多個突變係選自：以N取代胺基酸417（K）；以V、S或A取代胺基酸446（G）；以N取代胺基酸449（Y）；以F取代胺基酸453（Y）；以F取代胺基酸455（L）；以L取代胺基酸456（F）；以V取代胺基酸473（Y）；以V取代胺基酸475（A）；以S或A取代胺基酸476（G）；以N、R、T、G、A或I取代胺基酸477（S）；以Q、K、D、A或R取代胺基酸484（E）；以L或S取代胺基酸486（F）；以F取代胺基酸453（Y）；以L或R取代胺基酸493（Q）；以N或F取代胺基酸495（Y）；以I取代胺基酸500（T）；以Y、T或S取代胺基酸501（N）；以R、D或C取代胺基酸502（G）；以L、I或F取代胺基酸503（V）；或者，以H、E、W或C取代胺基酸505（Y）；其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411。
  71. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼包含一個或多個突變之一序列，所述突變係選自K417T、K417N、E484K、L452R及/或N501Y，其中，胺基酸編號對應於SEQ ID NO：411。
  72. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：412至417中之一者或多者。
  73. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該核酸序列編碼SEQ ID NO：438至443或460中之一者或多者。
  74. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，編碼SEQ ID NO：446之該核酸序列進一步包含一前導序列，其係由編碼選自SEQ ID NO：418至437之一序列之一核酸序列所編碼。
  75. 如請求項63至74中任一項所述之免疫原性組合物，其中，該編碼序列係針對一哺乳動物受試者進行密碼子優化。
  76. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一牛腺病毒、犬腺病毒、非人靈長類腺病毒、雞腺病毒、豬或養豬類腺病毒、或人類腺病毒。
  77. 如請求項76所述之免疫原性組合物，其中，該非人靈長類腺病毒為一黑猩猩或大猩猩腺病毒。
  78. 如請求項63所述之免疫原性組合物，其中，該複製缺陷型腺病毒載體為一人類腺病毒。
  79. 如請求項78所述之免疫原性組合物，其中，該人類腺病毒為Ad5或Ad26。
  80. 一種藥用製劑，其包含一有效量之如請求項63所述之免疫原性組合物，該組合物包含至少一種藥學上可接受之稀釋劑或載體，其中，該稀釋劑係選擇性為磷酸鹽緩衝液。
  81. 如請求項80所述之藥用製劑，其經配置用於非侵入性或鼻內給藥，其中，該藥學上可接受之載體選擇性為一噴霧或氣溶膠形式。
  82. 一種誘導抵抗SARS-CoV-2之免疫反應之方法，該方法包含對一人類施用一有效量之如請求項63所述之免疫原性組合物。
  83. 如請求項82所述之方法，其中，該有效量為至少108 個病毒顆粒（vp）、至少109 個病毒顆粒（vp）、或至少1010 個病毒顆粒（vp）。
  84. 如請求項82所述之方法，其中，該免疫原性組合物係經鼻內給藥。
  85. 如請求項82所述之方法，其中，於施用予一人類受試者後，抵抗SARS-CoV-2之免疫反應係持續至少6個月、至少9個月或至少12個月。
  86. 如請求項82所述之方法，其中，抵抗SARS-CoV-2之免疫反應包含於施用該免疫原性組合物後所誘導抵抗SARS-CoV-2之一黏膜IgA及/或T細胞反應。
  87. 如請求項82所述之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低輕度或中度COVID-19相關疾病之發生率。
  88. 如請求項82所述之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低嚴重COVID-19相關疾病之發生率。
  89. 如請求項82所述之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低COVID-19相關疾病之嚴重性。
  90. 如請求項82所述之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低感染SARS-CoV-2之發生率。
  91. 如請求項82所述之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低無症狀COVID-19之發生率。
  92. 如請求項82所述之方法，其中，該有效量之該免疫原性組合物可於施用予該人類受試者後，降低SARS-CoV-2之傳播。
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