SK287694B6

SK287694B6 - Pevný nosič imunoeseje a spôsob jeho prípravy, spôsob detekcie infekcie HIV a súprava na imunodiagnostickú skúšku

Info

Publication number: SK287694B6
Application number: SK1777-2002A
Authority: SK
Inventors: David Y. Chien; Phillip Arcangel; Laura Tandeske; Carlos George-Nasciemento; Doris Coit; Angelica Medina-Selby
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc.
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2011-06-06
Also published as: CN1256591C; DK1354204T4; HUP0500444A3; US7241879B2; PT1354204E; BRPI0111731B1; DE60129598T2; SI1354204T1; CA2412035A1; HK1079796A1; NO20025878D0; DE60125240T3; AU2001272945A1; DE60125240T2; JP2004510133A; WO2001096870A3; CN1660913A; SK17772002A3; US6632601B2; AU2001272948A1

Abstract

Pevný nosič pre imunoeseje, ku ktorému je pripojená aspoň jedna protilátka proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a aspoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a. Spôsob jeho prípravy, spôsob detekcie infekcie HIV a súprava na imunodiagnostickú skúšku.

Description

Tento vynález sa všeobecne týka vírusovej diagnostiky. Konkrétne sa tento vynález týka kombinovaného stanovenia antigén/protilátka na presnú diagnózu infekcií vírusom hepatitídy C. Vynález sa konkrétne týka pevného nosiča pre imunoeseje a spôsobu jeho prípravy, spôsobu detekcie infekcie HIV a súpravy na imunodiagnostickú látku.

Doterajší stav techniky

Vírus hepatitídy C (HCV) je zásadnou príčinou parenterálnej hepatitídy iného typu ako A a B (NANBH), ktorá sa väčšinou prenáša transfúziou krvi a pohlavným stykom. Tento vírus je prítomný u 0,4 až 2,0 % darcov krvi. Chronická hepatitída sa rozvinie zhruba pri 50 % infekcií a zhruba u 20 % infikovaných osôb sa vyvinie cirhóza, ktorá niekedy vedie k hepatocelulámemu karcinómu. Preto má štúdium a kontrola tejto choroby lekársky význam.

Houghten a kol. ako prví identifikovali a charakterizovali HCV ako príčinu NANBH. Vírusová genómová sekvencia HCV je známa a k dispozícii sú taktiež spôsoby zistenia tejto sekvencie. Pozri napríklad Medzinárodné publikácie č. WO 89/04669, WO 90/11089 a WO 90/14436. HCV má genóm jednovláknovej RNA 9,5 kb v kladnom smere a patrí do skupiny vírusov Flaviridae. Bolo identifikovaných aspoň šesť rozlíšených, ale príbuzných genotypov HCV na základe fylogenetických analýz [Simmonds a kol., J. Gen. Virol., 74, 2391-2399 (1993)]. Vírus kóduje jednotlivý polyproteín majúci viac ako 3000 aminokyselinových zvyškov [Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991), Han a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1711-1715 (1991)]. Polyproteín sa spracováva kotranslačne a posttranslačne na štruktúrne a neštruktúme (NS) proteíny.

Konkrétne, ako ukazuje obrázok 1, sa niekoľko proteínov kóduje HCV genómom. Poradie a nomenklatúra produktov štiepenia HCV polyproteínu je nasledujúce: NH₂-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Počiatočné štiepenie polyproteínu sa katalyzuje proteázami hostiteľa, ktoré uvoľňujú tri štruktúrne proteíny, N-terminálny nukleokapsidový proteín (zvaný , jadro,,) a glykoproteíny obálky, „El“ (tiež známe ako E) a „E2“ (tiež známe ako E2/NS1), rovnako ako neštruktúme (NS) proteíny obsahujúce vírusové enzýmy. Oblasti NS sa nazývajú NS2, NS3, NS4 a NS5. NS2 je proteín integrálnej membrány s proteolytickou aktivitou. NS2, buď samotný, alebo v kombinácii s NS3, štiepi väzbu NS2, NS3, čím sa ďalej tvorí koniec N NS3 a uvoľňuje sa veľký polyproteín, ktorý zahŕňa aktivity serínproteázy a RNA helikázy. NS3 proteáza slúži na spracovanie zvyšného polyproteínu. Dokončenie zrenia polyproteínu začína autokatalyktickým štiepením spojenia NS3-NS4a katalyzovaným NS3 serín proteázou. Nasledujúce štiepenia HCV polyproteínu sprostredkované NS3 zahŕňajú rozpoznanie miest štiepenia polyproteínu molekulou NS3 iného polypeptidu. V týchto reakciách uvoľňuje NS3 kofaktor NS3 (NS4a), dva proteíny (NS4b a NS5a) a RNA-dependentnú RNA polymerázu (NS5b).

Opisuje sa rad všeobecných a špecifických polypeptidov použiteľných ako imunologické a diagnostické prostriedky pre HCV odvodené z HCV polyproteínu. Pozri napríklad Houghton a kol., európska publikácia č. 318 216 a 388 232, Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Kuo a kol., Science, 244, 362-364 (1989), Houghton a kol., Hepatology, 14, 381-388 (1991), Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993), Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, D. Y. Chien, medzinárodná publikácia č. WO 94/01778. Tieto publikácie poskytujú rozsiahly základ pojednávajúci všeobecne o HCV rovnako tak ako o príprave a použití HCV polypeptidových imunologických reakčných prostriedkov.

Citlivé a špecifické spôsoby pre skríning a identifikáciu nosičov HCV a HCV kontaminovanej krvi či krvných produktov by poskytli dôležitý pokrok v lekárstve. Posttransfuzna hepatitída (PHT) sa vyskytuje zhruba u 10 % pacientov po transfúzii a HCV zodpovedá za 90 % týchto prípadov. Starostlivosť o pacientov rovnako tak aj o prevenciu prenosu HCV krvou a krvnými produktmi alebo tesným osobným kontaktom vyžaduje diagnostické a prognostické prostriedky. Existuje niekoľko spôsobov rozboru pre sérodiagnózu infekcie HCV. Pozri napríklad Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Kuo a kol., Science, 244, 362-364 (1989), Choo a kol., Br. Med. Bull., 46, 423-441 (1990), Ebeling a kol., Lancet, 335, 982-983 (1990), van der Poel a kol., Lancet, 335, 558-560 (1990), van der Poel a kol., Lancet, 337, 317-319 (1991), D. Y. Chien, medzinárodná publikácia č. WO 94/01778, Valenzuela a kol., medzinárodná publikácia č. WO 97/44469 a Kashiwakuma a kol., US patent č. 5 871 904.

Značným problémom pri rozboroch založených na krvnom sére je dlhý interval medzi infekciou a detekciou vírusu, ktorý často prekračuje 80 d. Tento interval môže predstavovať pre príjemcu krvnej transfúzie značné riziko. Na prekonanie tohto problému slúžia vypracované testy založené na nukleových kyselinách (NAT) detekujúce priamo vírusovú ribonukleovú kyselinu a testy antigénu jadra HCV, ktoré stanovujú vírusový antigén namiesto protilátkovej odpovede. Pozri napríklad Kashiwakuma a kol., US patent č. 5 871 904, Beld a kol., Transíusion, 40. 575 - 579 (2000).

Ostáva však potreba citlivého diagnostického a prognostického spôsobu zaisťujúceho adekvátnu starostlivosť o pacienta rovnako tak ako prevenciu prenosu HCV krvou a krvnými produktmi alebo tesným osobným kontaktom.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je pevný nosič pre imunoeseje, ktorého podstata spočíva v tom, že sa k nemu pripája aspoň jedna protilátka proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a aspoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a.

Predmetom tohto vynálezu je pevný nosič pre imunoeseje, ktorého podstata spočíva v tom, že sa k nemu pripájajú aspoň dve monoklonálne protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a NS3/4a konformačný epitop zahŕňajúci sekvenciu aminokyselín znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.

Predmetom tohto vynálezu je tiež pevný nosič pre imunoeseje, ktorého podstata spočíva v tom, že sa k nemu pripájajú aspoň dve monoklonálne protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a NS3/4a konformačný epitop zahŕňajúci sekvenciu aminokyselín znázornenú na obrázkoch 4A až 4D a antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov zahŕňajúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.

Ďalej je predmetom tohto vynálezu spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich HCV antigénom a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazať sa aspoň s jednou protilátkou proti jadru respektíve s epitopomNS3/4a, (c) pridanie pevného nosiča z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) antigénu, ktorý reaguje s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s antigénom (ii), (d) detekciu komplexov vytvorených protilátkami a antigénmi, ak k ich tvorbe dochádza, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, ktorého podstata spočíva vtom, že zahŕňa nasledujúce kroky (a) zaistenie uvedeného pevného nosiča pre imunoeseje, ku ktorému sú pripojené aspoň dve protilátky proti jadru HCV, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali aspoň na dve protilátky proti jadru, respektíve epitop NS3/4a, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD, (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.

Predmetom tohto vynálezu ďalej je spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje, ku ktorému sú pripojené aspoň dve monoklonálne protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a HCV NS 3/4a konformačný epitop zahŕňajúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obr. 4A až 4D, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali aspoň na dve protilátky proti jadru respektíve konformačný epitop NS3/4a, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV, ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD, (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje, ktorý ďalej obsahuje pripojený antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich HCV antigénom a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazať sa aspoň s jednou protilátkou proti jadru, epitopom NS3/4a a antigénom vzniknutým spojením viacerých epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) prvého a druhého antigénu, ktorý reaguje s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a respektíve s antigénom vzniknutým spojením viacerých epitopov a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s antigénmi (ii), (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ dochádza k ich tvorbe, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.

Predmetom tohto vynálezu je ďalej spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje, pričom sa k nemu pripájajú aspoň dve monoklonálne protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a NS3/4a konformačný epitop zahŕňajúci sekvenciu aminokyselín znázornenú na obrázkoch 4A až 4D a antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov zahŕňajúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali aspoň na dve protilátky proti jadru, konformačný epitop NS3/4a, respektíve antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV, ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a epitopu z oblasti c22 polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD, (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.

Predmetom tohto vynálezu je tiež súprava na imunodiagnostické skúšky, ktorej podstata spočíva v tom, že obsahuje uvedený nosič pre imunoeseje alebo akékoľvek jeho výhodné uskutočnenie a pokyny na uskutočňovanie imunodiagnostickej skúšky.

Tiež je premetom tohto vynálezu spôsob prípravy pevného nosiča, pre imunoeseje, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa:

(a) zaistenie uvedeného pevného nosiča a (b) väzbu aspoň jednej protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a aspoň jedného izolovaného HCV NS3/4a konformačného epitopu.

Napokon je predmetom tohto vynálezu spôsob prípravy pevného nosiča pre imunoeseje, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa:

(a) zaistenie uvedeného pevného nosiča a (b) väzbu dvoch protilátok proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a izolovaného HCV NS3/4a konformačného epitopu.

Ďalej sa uvádzajú podrobnejšie údaje, ktoré dokresľujú a bližšie upresňujú opísanú podstatu vynálezu.

Tento vynález sa čiastočne zakladá na zistení, že protilátky sérokonverzie HCV sú zvyčajne protilátkami proti jadru a proti NS3 (helikáza). V súlade s tým tento vynález poskytuje kombinačný rozbor antigénu jadra HCV a protilátky NS3 detekujúcej antigény HCV aj protilátky prítomné vo vzorke s použitím jedného tuhého nosiča.

Preto sa v jednom svojom uskutočnení tento vynález zameriava na pevný nosič pre imunoesej obsahujúci aspoň jednu protilátku proti jadru HCV a aspoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a pripojený k tomuto nosiču. Protilátka a epitop NS3/4a môže byť ktorákoľvek z molekúl, ktoré sa tu opisujú. Navyše môže pevný nosič zahŕňať ktorýkoľvek z antigénov získaných spojením viacerých epitopov, ktoré sa tu opisujú, ako je antigén získaný spojením viacerých epitopov zahŕňajúcich aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.

V určitých uskutočneniach sú na pevný nosič pripojené aspoň dve protilátky proti jadru. Ďalej môže byť protilátkou pro ti jadru monoklonálna protilátka. Navyše môže byť epitop NS3/4a a konformačný epitop, ako je konformačný epitop NS3/4a zahŕňajúci aminokyselinovú sekvenciu zobrazenú na obrázkoch 4A až 4D.

V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na pevný nosič pre imunoesej, ku ktorému sa pripájajú aspoň dve monoklonálne protilátky proti jadru HCV a aspoň jeden konformačný epitop NS3/4a HCV s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obrázkoch 4A až 4D.

V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke. Tento spôsob zahŕňa (a) zaistenie pevného nosiča pre imunoesej, ako sa opisuje, (b) kombináciu biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok, ktoré umožnia antigénom HCV a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, väzbu na aspoň jednu protilátku proti jadru respektíve epitopu NS3/4a, (c) pridanie pevného nosiča z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru je zameraná proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) antigénu, ktorý reaguje s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s antigénom (ii) a (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, ak sú prítomné, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke. Epitop NS3/4a môže byť konformačným epitopom, ako je konformačný epitop majúci sekvenciu NS3/4a znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.

V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke. Tento spôsob zahŕňa (a) poskytnutie pevného nosiča pre imunoesej aspoň s dvoma protilátkami proti jadru HCV pripojenými na tento nosič, ako sa opisuje, (b) kombináciu biologickej vzorky s pevným nosičom za podmienok umožňujúcich antigénom HCV a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, väzbu aspoň na dve protilátky proti jadru respektíve epitop NS3/4a, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD a (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami s antigénmi, ak sú prítomné, indikujúce infekciu HCV v biologickej vzorke. Epitop NS3/4a môže byť konformačným epitopom, ako je konformačný epitop majúci sekvenciu NS3/4a znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.

V ktoromkoľvek z opísaných uskutočnení môže byť protilátka proti jadru zameraná proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako napríklad proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1, a/alebo môže byť detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV zameraná proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako sú aminokyseliny 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1. Navyše môže byť antigén reagujúci s protilátkou HCV biologickej vzorky z oblasti NS3, ako je epitop c33c oblasti HCV polyproteínu a môže byť spojený s ľudskou aminokyselinovou sekvenciou superoxid dismutázy (hSOD). V tomto uskutočnení je druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD.

V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu je spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke. Tento spôsob zahŕňa (a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje vrátane monoklonálnych protilátok proti jadru HCV a konformačného epitopu zahŕňajúceho aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D, (b) kombináciu biologickej vzorky s pevným nosičom za podmienok umožňujúcich väzbu HCV antigénu a protilátok, pokiaľ sa vyskytujú vo vzorke, aspoň s dvoma protilátkami proti jadru a konformačným epitopom NS3/4a, pridanie pevného nosiča z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s opísanou aminokyselinovou sekvenciou hSOD, a detekciu komplexov medzi protilátkami a antigénmi, ak sú prítomné, indikujúcu infekciu HCV v biologickej vzorke.

V určitých uskutočneniach sú aspoň dve protilátky proti jadru zamerané proti N-terminálnej oblasti antigénu j adra HCV, ako j e oblasť aminokyselín 10 až 5 3 HCV, číslované vzhľadom na polyproteín HCV 1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako je oblasť aminokyselín 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.

V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke. Tento spôsob zahŕňa (a) zaistenie pevného nosiča pre imunoesej zahrnujúceho antigén získaný spojením viacerých epitopov, (b) kombináciu biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich väzbu HCV antigénu a protilátok, ak sú v biologickej vzorke, aspoň s jednou protilátkou proti jadru, epitopom NS3/4a a antigénom získaným spojením viacerých epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde touto prvou detegovateľne značenou protilátkou je detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV, kde značená protilátka proti jadru je zameraná proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) prvého a druhého antigénu reagujúceho s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a a antigénom získaným spojením viacerých epitopov a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s antigénmi (ii), (d) detekciu komplexov tvorených medzi protilátkami a antigénmi, ak sú vo vzorke, indikujúce infekciu HCV biologickej vzorky.

Protilátka proti jadru sa môže zameriavať proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a prvá detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV sa môže zameriavať proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako sa opisuje. Ďalej môže prvý antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky obsahovať epitop z oblasti c33c polyproteínu HCV a môže byť spojený s aminokyselinovou sekvenciou hSOD. V tejto súvislosti je druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD. Navyše druhý antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky môže obsahovať epitop z oblasti c22 polyproteínu HCV, ako je epitop obsahujúci aminokyseliny Lysio až Ser₉₉ polyproteínu HCV s deléciou Arg47 a substitúciou Leu namiesto Trp v polohe 44, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1. Tento epitop môže byť spojený s aminokyselinovou sekvenciou hSOD. Ak je tomu tak, je druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD. Antigén získaný spojením viacerých epitopov môže obsahovať aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.

V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke, ktorý zahŕňa (a) zaistenie pevného nosiča pre imunoesej obsahujúceho dve monoklonálne protilátky proti jadru HCV, konformačný epitop HCV NS3/4a obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D a antigén získaný spojením viacerých epitopov obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F, ktoré sa k nemu pripájajú, (b) kombináciu biologickej vzorky s pevným nosičom za podmienok, ktoré umožňujú väzbu HCV antigénov a protilátok, ak sú v biologickej vzorke, aspoň s dvoma protilátkami proti jadru, s konformačným epitopom NS3/4a respektíve antigénom s viacpočetným spojením epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču v kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde sa značená protilátka proti jadru zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako posledné dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a epitopu z oblasti c22 polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s aminokyselinovými sekvenciami hSOD, (d) detekciu komplexov tvorených medzi protilátkami a antigénmi, ak sú prítomné, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.

V tomto uskutočnení sa aspoň dve protilátky proti jadru môžu zameriavať proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteín HCV1, a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV sa zameriava proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV1. Navyše môže epitop z oblasti c22 obsahovať aminokyseliny Lysi₀ až Ser₉₉ polyproteínu HCV s deléciou Arg47 a substitúciou Leu namiesto Trp v polohe 44, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV 1.

V ďalších uskutočneniach sa tento vynález zameriava na imunodiagnostické súpravy obsahujúce pevný nosič pre imunoesej e opísaný skôr a inštrukcie na uskutočňovanie imunodiagnostického testu.

V ďalších uskutočneniach sa tento vynález zameriava na spôsoby prípravy pevného nosiča pre imunoesej zahrnujúcu (a) zaistenie pevného nosiča a (b) väzbu aspoň jednej protilátky proti jadru HCV, ako je jedna, dve alebo viacej protilátok a aspoň jedného izolovaného pripojeného epitopu HCV NS3/4a a prípadne antigénu získaného spojením viacerých epitopov. Protilátky proti jadru, epitopy NS3/4a a antigény s viacpočetným spojením epitopov sú podľa uvedeného opisu.

V ďalších uskutočneniach sa tento vynález zameriava na antigén s viacpočetným spojením epitopov zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F alebo aminokyselinovú sekvenciu s aspoň 80 % sekvenčnou identitou, ako je 90 % alebo vyššia sekvenčná identita reagujúci špecificky s protilátkami proti HCV prítomnými v biologickej vzorke z jednotlivca infikovaného HCV. V určitých uskutočneniach sa antigén s viacpočetným pripojením epitopu skladá z aminokyselinovej sekvencie opísanej na obrázkoch 5A až 5F.

V ďalších uskutočneniach sa tento vynález zameriava na polynukleotid zahrnujúci kódovaciu sekvenciu pre antigén s viacpočetným spojením uvedených epitopov, rekombinantné vektory zahrnujúce polynukleotidy, hostiteľské bunky transformované rekombinantnými vektormi a spôsoby tvorby rekombinantného antigénu s viacpočetným spojením epitopov zahrnujúci: (a) zaistenie populácie hostiteľských buniek, ako sa opisuje, a (b) pestovanie populácie buniek za podmienok, pri ktorých sa exprimuje antigén obsahujúci spojenie viacerých epitopov kódovanou sekvenciou prítomnou v rekombinantnom vektore.

Tieto a ďalšie aspekty tohto vynálezu budú zrejmé pri odkaze na nasledujúci podrobný opis a pripojené výkresy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je diagram znázorňujúci HCV genóm s rôznymi oblasťami polyproteínu, od ktorých sa odvodzujú reakčné zložky eseje (proteíny a protilátky).

Obrázok 2 je schematický výkres reprezentatívnej kombinačnej eseje protilátka/antigén podľa tohto vynálezu.

Obrázok 3 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu reprezentatívneho NS3/4a konformačného antigénu na použitie v týchto esejách. Zvýraznený alanín v polohe 182 nahrádza natívny serín, ktorý sa normálne vyskytuje v tejto polohe.

Obrázky 4A až 4D znázorňujú deoxyribonukleovú kyselinu a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu ďalšieho reprezentatívneho NS3/4a konformačného antigénu na použitie v týchto esejách. Aminokyseliny v polohách 403 a 404 obrázkov 4A až 4D predstavujú substitúcie Pro namiesto Thr a íle namiesto Ser natívnej aminokyselinovej sekvencie HCV-1.

Obrázok 5 je diagram konštrukcie pd.HCVla.ns3ns4aPI.

Obrázok 6 je diagram znázorňujúci MEFA 12.

Obrázky 7A až 7F znázorňujú deoxyribonukleovú kyselinu a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu MEFA.

Obrázok 8 je schematický výkres reprezentatívnej imunoeseje podľa tohto vynálezu s použitím MEFA 12.

Nasleduje podrobný opis vynálezu.

Prax tohto vynálezu sa používa, pokiaľ sa neopisuje inak, konvenčné spôsoby chémie, biochémie, spôsoby s rekombinantnou deoxyribonukleovou kyselinou a spôsoby imunológie v rámci súčasnej znalosti odboru. Tieto spôsoby sa úplne vysvetľujú v literatúre. Pozri napríklad Fundamental Virology, 2. vydanie, diel I & II (B. B. Fields a D. M. Knipe, red.), Handbook of Experimental Immunology, diely I až IV (D. M. Weir a C.

C. Blackwell, red., Blackwell Scientific Publications), T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition), Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydanie, 1989), Methods In Enzymology (S. Colowick a N. Kaplan, red., Academic Press, Inc.).

Je potrebné poznamenať, že v tomto opise a pripojených nárokoch zahŕňajú singuláme formy odkazy na množné číslo, ak zrejme obsah neurčuje inak. Takže napríklad odkaz na „antigén“ zahŕňa zmes dvoch alebo viacerých antigénov a podobne.

V celom texte sa používajú nasledujúce skratky aminokyselín.

Alanín: Ala (A)

Asparagín: Asn (N)

Cysteín: Cys (C)

Kyselina glutámová: Glu (E) Histidín: His (H)

Leucín: Leu (L)

Metionín: Met (M)

Prolín: Pro (P)

Treonín: Thr (T)

Tyrozín: Tyr (Y)

Arginín: Arg (R)

Kyselina aspargová: Asp (D) Glutamín: Gin (Q)

Glycín: Gly (G)

Izoleucín: íle (I)

Lyzín: Lys (K)

Fenylalanín: Phe (F)

Serín: Ser (S)

Tryptofán: Trp (W)

Valín: Val (V)

I. Definície

Pri opise tohto vynálezu sa používajú nasledujúce pojmy, ktorých význam je podľa opísanej definície.

Pojmy „polypeptid“ a „proteín“ sa vzťahujú k polyméru aminokyselinových zvyškov a nie sú obmedzené minimálnou dĺžkou produktu. Peptidy, oligopeptidy, diméry, multiméry a podobne sa zahŕňajú do tejto definície. Definícia zahŕňa proteíny plnej dĺžky aj fragmenty. Tieto pojmy taktiež zahŕňajú postexpresné modifikácie polypeptidu, napríklad glykozyláciu, acetyláciu, fosforyláciu a podobne. Ďalej sa na účely tohto vynálezu pojem „polypeptid“ vzťahuje na proteín zahrnujúci modifikácie, ako sú delécia, adícia a substitúcia (všeobecne konzervatívne svojou povahou) natívnej sekvencie, ak proteín zachováva požadovanú aktivitu. Tieto modifikácie môžu byť úmyselné, ako je tomu prostredníctvom mutagenézy smerovanej na miesto, alebo môžu byť náhodné, ako je tomu prostredníctvom mutácií hostiteľa poskytujúcich proteíny, alebo chyby následkom amplifikácie PCR.

Polypeptid HCV je polypeptid, ako sa definuje, odvodený od polyproteínu HCV. Tento polypeptid nemusí byť fyzicky odvodený od HCV, ale môže byť vytvorený synteticky alebo rekombinantne. Navyše tento polypeptid môže byť odvodený od ktoréhokoľvek z kmeňov HCV, ako sú kmene 1, 2, 3 alebo 4. Je známe množstvo zachovaných a premenných oblastí medzi týmito kmeňmi a všeobecne aminokyselinové sekvencie epitopov odvodené od týchto oblastí budú mať vysoký stupeň sekvenčnej homológie, to jest homológiu aminokyselinovej sekvencie viac ako 30 %, prednostne viac ako 40 % pri zoradení sekvencii. Pojem „NS3/4“ polypeptid sa teda vzťahuje na natívny NS3/4a z ktoréhokoľvek z rôznych kmeňov HCV rovnako ako na analógy NS3/4a, muteíny a imunogénne fragmenty, ako sa definujú. Sú známe úplné genotypy mnohých z týchto kmeňov. Pozri napríklad US patent č. 6 150 087 a GenBank Accession č. AJ238800 a AJ238799.

Pojmy „analóg“ a „muteín“ sa týkajú biologicky aktívnych derivátov referenčnej molekuly alebo fragmentov týchto derivátov, ktoré zachovávajú požadovanú aktivitu, ako je imunoreaktivita v esejách, ktoré sa tu opisujú. Všeobecne sa pojem „analóg“ týka zlúčenín majúcich natívnu polypeptidovú sekvenciu a štruktúru s adíciou jednej alebo viacerých aminokyselín, substitúciami (všeobecne svojou povahou konzervatívnymi) a/alebo deléciami oproti natívnej molekule, ak tieto modifikácie neničia imunogénnu aktivitu. Pojem „muteín“ sa týka peptidov majúcich jedno alebo viac peptidových mimetík („peptoidov“), ako sa opisujú v medzinárodnej publikácii č. WO 91/04282. Prednostne má analóg alebo muteín aspoň rovnakú imunoaktivitu ako natívna molekula. Spôsoby prípravy polypeptidových analógov a muteínov sú známe v odbore a opisujú sa neskôr.

Obzvlášť preferované analógy zahŕňajú substitúcie, ktoré sú svojou povahou konzervatívne, to jest také substitúcie, ktoré nastávajú v skupine aminokyselín príbuzných vo svojich vedľajších reťazcoch. Konkrétne sa aminokyseliny delia do 4 skupín: (1) kyslé - aspartát a glutamát, (2) bázické - lyzín, arginín, histidín, (3) nepoláme - alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán a (4) poláme bez náboja - glycin, asparagín, glutamin, cysteín, serín, treonín, tyrozin. Fenylalanín, tryptofán a tyrozín sa niekedy klasifikujú ako aromatické aminokyseliny. Napríklad sa dá rozumne predvídať, že izolovaná náhrada leucínu izoleucínom alebo valínom, aspartátu glutamátom, treonínu šermom alebo podobná konzervatívna náhrada aminokyseliny štruktúrne príbuznou aminokyselinou nebude mať veľký účinok na biologickú aktivitu. Napríklad môže daný polypeptid zahŕňať až zhruba 5 až 10 konzervatívnych alebo nekonzervatívnych aminokyselinových substitúcií alebo dokonca až zhruba 15 až 25 konzervatívnych alebo nekonzervatívnych aminokyselinových substitúcií alebo akékoľvek celé Číslo medzi 5 až 25, ak pozostáva požadovaná funkcia molekuly neporušená. Ten, kto má skúsenosti v odbore, môže ľahko určiť oblasti danej molekuly, ktoré môžu tolerovať zmenu s odkazom na grafy Hopp/-Woods a Kyte-Doolittle dobre známe v odbore.

„Fragmentom“ sa rozumie polypeptid skladajúci sa iba z časti intaktnej polypeptidovej sekvencie a štruktúry plnej dĺžky. Fragment môže zahŕňať C-terminálnu deléciu a/alebo N-terminálnu deléciu natívneho polypeptidu. „Imunogénny fragment“ daného proteínu HCV bude všeobecne zahŕňať aspoň 5 až 10 súvisiacich aminokyselinových zvyškov molekuly s plnou dĺžkou, prednostne aspoň zhruba 15 až 25 súvisiacich aminokyselinových zvyškov molekuly s plnou dĺžkou a najprednostnejšie aspoň zhruba 20 až 50 alebo viac súvisiacich aminokyselinových zvyškov molekuly s plnou dĺžkou, ktoré definujú epitop, alebo akýkoľvek počet medzi 5 aminokyselinami a sekvenciu s plnou dĺžkou s podmienkou, že daný fragment zachováva imunoreaktivitu v esejách, ktoré sa tu opisujú. Preferované imunogénne fragmenty napríklad zahŕňajú, ale bez obmedzenia, fragmenty jadra HCV obsahujúce napríklad aminokyseliny 10 až 45, 10 až 53, 67 až 88 a 120 až 130 polyproteínu, epitop 5-1-1 (v oblasti NS3 vírusového genómu) rovnako tak ako epitopy odvodené od oblastí El, E2, c33c (NS3), clOO (NS4), NS3/4a a NS5 polyproteínu HCV, rovnako tak ako ktorýkoľvek z ďalších epitopov identifikovaných z polyproteínu HCV. Pozri napríklad Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89. 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993), Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, Chien,

D. Y., medzinárodná publikácia č. WO 94/01778, US patent č. 6 150 087 a 6 121 020.

Pojem „epitop“, ako sa tu používa, sa týka sekvencie aspoň zhruba 3 až 5 prednostne zhruba 5ažl0čil5a nie viac ako zhruba 1000 aminokyselín (alebo sekvencia s akýmkoľvek počtom medzi týmito hodnotami), ktorá definuje sekvenciu, ktorá je sama časťou väčšej sekvencie a viaže sa na protilátku vytvorenú na základe odpovede na túto sekvenciu. Neexistuje žiadna kritická horná medza pre dĺžku fragmentu, ktorá môže obsahovať proteínovú sekvenciu takmer plnej dĺžky alebo dokonca spojený proteín zahrnujúci dva alebo viac epitopov polyproteínu HCV. Epitop používaný v rámci tohto vynálezu sa neobmedzuje na polypeptid majúci presnú sekvenciu časti materského proteínu, z ktorého sa odvodzuje. Vírusové genómy sú skutočne v stave konštantného toku a obsahujú niekoľko premenných domén majúcich relatívne vysoké stupne variability medzi izolovanými časťami. Preto pojem epitop zahŕňa sekvencie identické s natívnou sekvenciou rovnako tak ako modifikácie natívnej sekvencie, ako sú delécia, adícia a substitúcia (všeobecne svojou povahou konzervatívne).

Oblasti daného polypeptidu zahrnujúce epitop sa dajú identifikovať s použitím množstva spôsobov mapovania epitopov dobre známych v odbore. Pozri napríklad Epitop Mapping Protocols v monografii Methods in Molecular Biology, diel 66 (Glenn E. Morris, redakcia, 1996) Human Press, Totowa, New Jersey. Napríklad lineárne epitopy sa dajú stanoviť súčasnou prípravou veľkého počtu peptidov na pevných nosičoch, kde peptidy zodpovedajú častiam molekuly proteínu, a reakciou peptidu s protilátkami, pri ktorej peptidy zostávajú pripojené na nosiče. Tieto spôsoby sú známe v odbore a opisujú sa napríklad v US patente č. 4 708 871, Geysen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002 (1984), Geysen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82. 172-182 (1985), Geysen a kol., Molec. Immunol., 23. 709-715 (1986).

S použitím týchto spôsobov sa identifikuje množstvo epitopov HCV. Pozri napríklad Chien a kol., Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 320-324 (1994) a ďalšie neskôr. Podobne sa ľahko identifikujú konformačné epitopy stanovením priestorovej konformácie aminokyselín, napríklad rôntgenovou kryštalografiou a dvoj8 rozmernou nukleárnou magnetickou rezonanciou. Pozri napríklad Epitope Mapping Protocols. Antigénne oblasti proteínov sa dajú taktiež identifikovať s použitím štandardných vynesení antigénneho pôsobenia a hydropatie, ako sú výpočty s použitím napríklad programového vybavenia Omiga verzia 1.0 od Oxford Molecular Group. Tento počítačový program používa spôsob Hopp/Woods, Hopp a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828 (1981) na stanovenie antigénneho pôsobenia a spôsob Kyte-Doolittle, Kyte a kol., J. Mol. Biol., 157, 105-132 (1982) pre vynesenie hydropatie.

Pojem „konformačný epitop“, ako sa tu používa, sa týka časti proteínu s plnou dĺžkou alebo analógu, alebo muteínu tohto proteínu majúceho štruktúrne vlastnosti natívne ako aminokyselinová sekvencia kódujúca epitop v rámci prirodzeného proteínu s plnou dĺžkou. Natívne štruktúrne vlastnosti zahŕňajú, ale bez obmedzenia, glykozyláciu a trojrozmernú štruktúru. DÍžka epitopu definujúca sekvenciu môže byť predmetom širokých zmien, pretože sa uvažuje, že tieto epitopy sa vytvárajú trojrozmerným tvarom antigénu (napríklad skladaním). Preto stačí relatívne málo aminokyselín na definíciu epitopu, ale sú široko rozptýlené pozdĺž dĺžky molekuly (alebo dokonca rôznych molekulách v prípade dimérov atď.) s tvorbou správnej konformácie epitopu skladaním. Časti antigénu medzi zvyškami definujúcimi epitop nemusia byť pre konformačnú štruktúru epitopu kritické. Napríklad delécia alebo substitúcia týchto zasahujúcich sekvencií nemusí ovplyvňovať konformačný epitop s podmienkou, že sekvencie kritické pre konformáciu epitopu sú zachované (napríklad cysteíny zúčastňujúce sa disulfidových väzieb, miesta glykozylácie atď.).

Konformačné epitopy prítomné v oblasti NS3/4a sa ľahko identifikujú s použitím diskutovaných spôsobov. Navyše prítomnosť alebo neprítomnosť konformačného epitopu v danom polypeptide sa dá ľahko stanoviť skríningom antigénu protilátkou (polyklonálnym sérom alebo monoklonálnym proti konformačnému epitopu) a porovnaním reaktivity s prípadom denaturovanej verzie antigénu, ktorá zachováva najvyššie lineárne epitopy. Pri takomto skríningu s použitím polyklonálnych protilátok môže byť výhodné absorbovať polyklonálne sérum najprv denaturovaným antigénom a pozorovať, či zadržiava protilátky proti danému antigénu. Navyše v prípade NS3/4a molekula zachovávajúca natívnu konformáciu bude mať taktiež proteázové a prípadne aj helikázové enzymatické aktivity. Tieto aktivity sa dajú detegovať s použitím enzymatických analýz, ako sa ďalej opisujú.

Prednostne sa konformačný epitop tvorí rekombinantne a exprimuje sa v bunke, z ktorej sa dá odstrániť za podmienok zachovávajúcich jeho požadované štruktúrne fúnkcie, napríklad bez denaturácie epitopu. Tieto bunky zahŕňajú baktérie, kvasinky, bunky hmyzu a cicavcov. Expresia a izolácia rekombinantných konformačných epitopov z polyproteínu HCV sa opisuje napríklad v medzinárodnej publikácii č. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Alternatívne sa dajú exprimovať antigény a ďalej denaturovať proteín po jeho získaní. Uvažuje sa, že chemická syntéza môže taktiež poskytnúť konformačné antigénové mimitopy majúce skríženú reakciu s „natívnym“ konformačným epitopom antigénu.

Pojem „viacpočetný epitopový spojený antigén“ alebo „MEFA“, ako sa tu používa, znamená polypeptid, v ktorom tvorí viac HCV antigénov časť jedného spojitého reťazca aminokyselín, ktorý sa v prírode nevyskytuje. HCV antigény sa dajú spájať priamo navzájom peptidovými väzbami alebo sa dajú oddeľovať vloženými sekvenciami aminokyselín. Spojené antigény môžu taktiež obsahovať sekvencie exogénne proti HCV polyproteínu. Navyše môžu prítomné HCV sekvencie vznikať z viacerých genotypov a/alebo izolovaných častí HCV. Príklady konkrétnych MEFA na použitie v imunoesejách podľa tohto vynálezu sa podrobne opisujú napríklad v medzinárodnej publikácii č. WO 97/44469 a ďalej sa opisujú.

Pojem „protilátka“ znamená molekulu, ktorá sa chemicky alebo fyzikálne viaže na daný polypeptid. Preto je protilátka jadra HCV molekula, ktorá sa špecificky viaže na proteín jadra HCV. Pojem „protilátka“, ako sa tu používa, zahrnuje protilátky získané z polyklonálnych aj monoklonálnych prípravkov, rovnako tak ako hybridné (chimérické) protilátkové molekuly (pozri napríklad Winter a kol., Náture, 349, 293-299 (1991) a US patent č. 4 816 567, F (ab')₂ a F(ab) fragmenty, molekuly Fv (nekovalentné heterodiméry, pozri napríklad Inbar a kol., Proc Natl Acad Sci USA, 69, 2659-2662 a Ehrich a kol., Biochem., 19, 4091-4096 (1980), molekuly Fv s jedným reťazcom (sFv) (pozri napríklad Huston a kol., Proc Natl Acad Sci 85, 5879-5883 (1988), diméme a triméme konštrukty protilátkových fragmentov, miniprotilátky (pozri napríklad Pack a kol., Biochem., 31. 1579-1584 (1992), Cumber a kol., J. Immunology, 149B, 120-126 (1992), humanizované protilátkové molekuly (pozri napríklad Riechmann a kol., Náture, 332, 323-327 (1988), Verhoeyan a kol., Science, 239, 1534-1536 (1988) a patentovú publikáciu UK, č. GB 2 276 169, publikovanú 21. septembra 1994) a akékoľvek funkčné fragmenty získané z týchto molekúl, kde tieto fragmenty zachovávajú imunologické väzbové vlastnosti materskej protilátkovej molekuly.

Pojem „monoklonálna protilátka“ sa týka protilátkového zloženia majúceho homogénnu populáciu protilátok. Tento termín sa neobmedzuje na druh alebo zdroj protilátky, ani sa neobmedzuje spôsobom, ktorým vzniká. Preto tento termín zahŕňa protilátky získané z myších hybridómov rovnako ako ľudské monoklonálne protilátky získané s použitím skôr ľudských ako myších hybridómov. Pozri napríklad Cote a kol., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, str. 77.

„Rekombinantnný“ proteín je proteín, ktorý zachováva svoju požadovanú aktivitu a ktorý bol pripravený technikami rekombinantnej deoxyribonukleovej kyseliny, ako sa tu opisuje. Všeobecne sa daný gén klonuje a potom sa exprimuje v transformovaných organizmoch, ako sa ďalej opisuje. Hostiteľský organizmus exprimuje cudzí gén za získania proteínu za podmienok expresie.

Pojem „izolovaný“ vo vzťahu k polypeptidu znamená, že je daná molekula oddelená a diskrétna oproti celému organizmu, v ktorom je táto molekula prítomná v prírode, alebo je prítomná v podstate za neprítomnosti iných biologických makromolekúl toho istého typu. Pojem „izolovaný“ v súvislosti s polynukleotidom je molekula nukleovej kyseliny zbavená ako celok alebo časť sekvencii normálne pripojených k tejto molekule v prírode alebo sekvencie, ak existuje v prírode, ale majú pripojené heterológne sekvencie, alebo molekula oddelená z chromozómu.

Pojem „ekvivalentný antigénny determinant“ znamená antigénny determinant z rôznych poddruhov, alebo kmeňov HCV, ako sú kmene 1, 2 alebo 3 HCV. Konkrétnejšie sú známe epitopy ako 5-1-1 a tieto epitopy sa menia medzi kmeňmi 1, 2 a 3. Epitop 5-1-1 z rôznych kmeňov teda predstavuje antigénne determinanty, takže kópie a dokonca ani ich sekvencie nie sú identické. Všeobecne budú mať aminokyselinové sekvencie ekvivalentných antigénnych determinantov vysoký stupeň sekvenčnej homológie, t. j. sekvenčnú homológiu viac ako 30 %, prednostne viac ako 40 %, keď sú obe sekvencie zoradené.

„Homológia“ sa týka percentuálnej podobnosti medzi dvoma polynukleotidovými alebo dvoma polypeptidovými zvyškami. Dve deoxyribonukleové kyseliny alebo dve polypeptidové sekvencie sú „podstatne homológne“ navzájom, ak sekvencie majú aspoň 50 %, prednostne aspoň 75 %, prednostnejšie aspoň 80 až 85 %, ešte prednostnej šie aspoň 90 % a najprednostnejšie aspoň 95 až 98 % sekvenčnej podobnosti na definovanej dĺžke molekúl. Pojem podstatne homológny, ako sa tu používa, sa taktiež vzťahuje na sekvencie majúce úplnú identitu so špecifickou sekvenciou deoxyribonukleovej kyseliny alebo polypeptidu.

Všeobecne sa „identita“ týka presnej korešpondencie medzi nukleotidmi alebo aminokyselinami v dvoch polynukleotidových alebo polypeptidových sekvenciách. Percento identity sa dá stanoviť priamym porovnaním sekvenčnej informácie medzi dvoma molekulami zoradením sekvencii, zistením presného počtu zodpovedajúcich zhodných dvojíc medzi dvoma zoradenými sekvenciami, delením dĺžkou kratšej sekvencie a násobením výsledku 100.

Na pomoc pri analýze podobnosti a identity sa dá použiť ľahko dostupný počítačový program, ako je ALIGN, M. O. Dayhoff, Atlas of Proteín Sequences and Structure M. O. Dayhoff, redakcia, 3, Suppl. 5, 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, ktorý prispôsobuje algoritmus lokálnej homológie Smithe a Watermana, Advances in Appl. Math., 2, 482-489 (1981) na peptidovú analýzu. Programy na stanovenie nukleotidovej sekvenčnej podobnosti a identity sú k dispozícii ako Wisconsin Sequence Analysis Package, verzia 8 (dodáva Genetics Computer Group, Madison, WI), napríklad programy BESTFIT, FASTA a GAP, ktoré sa taktiež zakladajú na algoritme Smithe a Watermana. Tieto programy sa dajú ľahko použiť s parametrami štandardného nastavenia odporúčanými výrobcom a opísanými v citovanom Wisconsin Sequence Analysis Package. Napríklad percentuálna podobnosť danej nukleotidovej sekvencie s referenčnou sekvenciou sa stanoví použitím algoritmu homológie Smithe a Watermana s tabuľkou skóre v štandardnom nastavení a s medzerou šiestich nukleotidových polôh.

Ďalší spôsob zistenia percentuálnej podobnosti v súvislosti s týmto vynálezom je použitie súboru programu MPSRCH, University of Edinburgh, autorov John F. Collinsa a Shane S. Sturroka distribuovaný spoločnosťou IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Z týchto súborov sa dá použiť Smithov-Watermanov algoritmus s použitím parametrov štandardného nastavenia zo skórovacej tabuľky [napríklad „gap open penalty 12“, „gap extension penalty 1“ a „gap 6“]. Hodnota „Match“ (zhody) vytvorená z údajov odráža „sekvenčnú podobnosť“. Ďalšie vhodné programy pre výpočet percenta identity alebo podobnosti medzi sekvenciami sú v odbore dobre známe, napríklad ďalší program BLAST použitý s parametrami štandardného nastavenia. Napríklad BLATN a BLASTP je použiteľný s nasledujúcimi parametrami so štandardným nastavením: genetický kód = štandardný, filter = žiadny, vlákno = obe, skrátenie = 60, očakávanie = 10, Matrica = = BLOSUM62, opisy = 50 sekvencii, hodnotenie = vysoké skóre, databáza = neredundantná, GenBank + + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS preklady + Swiss protein + Spupdate + PIR. Podrobnosti o týchto programoch sa dajú nájsť na nasledujúcej intemetovej adrese http:/www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternatívne sa dá homológia stanoviť hybridizáciou polynukleotidov za podmienok tvoriacich stabilné duplexy medzi homológnymi oblasťami s následným natrávením jedno vlákno vo špecifickou nukleázou a stanovením veľkosti natrávených fragmentov. Sekvencie DNA, ktoré sú v podstate homológne, sa dajú identifikovať Southemovou hybridizáciou napríklad za prísnych podmienok definovaných pre daný systém. Definícia príslušných podmienok hybridizácie spadá do oblasti skúsenosti v odbore. Pozri napríklad Sambrook a kol., DNA Cloning, Nucleic Acid hybridization.

„Kódovacia sekvencia“ alebo sekvencia, ktorá kóduje zvolený polypeptid, je molekula nukleovej kyseliny, ktorá sa prepisuje (v prípade deoxyribonukleovej kyseliny) a prekladá (v prípade mRNA) do polypeptidu in vitro alebo in vivo pri umiestnení pod kontrolu príslušných regulačných sekvencii. Medze kódovacej sekvencie sa stanovia štartovacím kodónom pri konci 5' (amino) a kodónom zastavenia translácie pri konci 3' (karboxy). Sekvencia ukončenia transkripcie sa môže pripájať v polohe 3' ku kódovacej sekvencii.

Pojem „operabilne spojený“ sa týka usporiadania elementov, v ktorých sa takto opisované zložky konfigurujú tak, aby uskutočňovali svoje požadované funkcie. Preto je daný promótor operabilne pripojený ku kódovacej sekvencii schopný uskutočňovať expresiu kódovacej sekvencie za prítomnosti vhodných transkripčných faktorov atď. Promótor nemusí byť spojený s kódovacou sekvenciou, ak je jeho funkciou smerovať jej expresiu. Preto napríklad vložené nepreložené a pritom prepísané sekvencie môžu byť medzi sekvenciou promótora a kódovacou sekvenciou, ako je to pre prepisované intróny, a sekvencia promótora sa pritom môže považovať za „operabilne pripojenú“ ku kódovacej sekvencii.

Pojem „kontrolný element“ sa týka sekvencie polynukleotidu, ktorá napomáha expresii kódovacej sekvencie, ku ktorej sa pripája. Tento pojem zahŕňa promótory, sekvencie ukončenia transkripcie, domény vzostupné regulácie, signály polyadenylácie, nepreložené oblasti, vrátane 5 '-UTR a 3 '-UTR a vo vhodných prípadoch vedúce sekvencie a enhancery, ktoré spoločne zaisťujú transkripciu a transláciu kódovacej sekvencie v bunke hostiteľa.

Pojem „promótor“, pokiaľ sa používa tu, je DNA regulačná oblasť schopná väzby RNA polymerázy v hostiteľskej bunke a začatia transkripcie zostupnej (smer 3') kódovacej sekvencie, ku ktorej je operačne pripojená. Na účely tohto vynálezu zahŕňa sekvencia promótora minimálny počet báz alebo elementov nevyhnutných na začatie transkripcie daného génu na úrovniach detegovateľných nad pozadím. V rámci sekvencie promótora je miesto začiatku transkripcie rovnako tak ako domény väzby proteínu (sekvencie konsenzu) zodpovedné za väzbu RNA polymerázy. Eukaryotické promótory často, ale nie vždy, obsahujú boxy „TATA“ a boxy „CAT“.

Kontrolná sekvencia „smeruje transkripciu“ kódovacej sekvencie v bunke, keď sa RNA polymeráza viaže na sekvenciu promótora a prepisuje kódovaciu sekvenciu do mRNA, ktorá sa potom prekladá do kódovaného polypeptidu kódovacou sekvenciou.

„Expresná kazeta“ alebo „expresný konštrukt“ sa týka súboru schopného smerovať expresiu danej sekvencie (sekvencií) alebo daného génu (génov). Expresná kazeta zahŕňa kontrolné prvky, ako sa opisujú skôr, ako je promótor, ktorý je operačne pripojený k danej sekvencii (sekvenciám) alebo danému génu (génom) a často taktiež zahŕňa sekvenciu polyadenylácie. Pri určitých uskutočneniach tohto vynálezu môže byť expresná kazeta, ktorá sa tu opisuje, obsiahnutá v rámci plazmidového konštruktu. Navyše k zložkám expresnej kazety môže plazmidový konštrukt taktiež obsahovať jeden alebo viac voliteľných markerov, ktorých signál umožňuje existenciu plazmidového konštruktu vo forme jednovláknovej deoxyribonukleovej kyseliny (napríklad pôvod M13 replikácie), aspoň v jednom mieste viacpočetného klonovania a „cicavčí“ pôvod replikácie (napríklad SV40 alebo adenovírusový pôvod replikácie).

Pojem „transformácia“, ako sa tu používa, sa týka vloženia exogénneho polynukleotidu do hostiteľskej bunky bez ohľadu na spôsob použitý pri tomto vložení: napríklad transformácia priamym zachytením, transfekciou, infekciou a podobne. Ohľadom konkrétnych spôsobov transfekcie pozri neskôr. Exogénny polynukleotid sa môže udržovať ako neintegrovaný vektor, napríklad epizóm alebo alternatívne môže byť integrovaný do hostiteľovho genómu.

„Hostiteľská bunka“ je bunka, ktorá sa transformovala alebo je schopná transformácie exogénnou sekvenciou deoxyribonukleovej kyseliny.

„Zvyčajný pevný nosič“ znamená jednotlivú tuhú matricu, ku ktorej sa polypeptidy použité v daných imunoesejách viažu kovalentne alebo nekovalentnými spôsobmi, ako je hydrofóbna adsorpcia.

Pojem „imunologický reaktívny“ znamená, že daný antigén bude reagovať špecificky s protilátkami proti HCV prítomnými v biologickej vzorke od jednotlivca infikovaného HCV.

Pojem „imunitný komplex“ znamená kombináciu vytvorenú pri väzbe protilátky na epitop antigénu.

Pojem „biologická vzorka“, ako sa tu používa, sa týka vzorky tkaniva alebo kvapaliny izolovanej zo subjektu vrátane, ale bez obmedzenia, napríklad krvi, plazmy, séra, hmoty stolice, moču, kostnej drene, žlči, spinálnej tekutiny, lymfatickej tekutiny, vzoriek kože, vonkajších sekrétov kože, respiračného intestinálneho a urogenitálneho traktu, sĺz, slín, mlieka, krviniek, orgánov, biopsií a taktiež vzoriek zložiek bunkovej kultúry in vitro vrátane, ale bez obmedzenia, upravených médií získaných z rastu buniek a tkanív v médiu, napríklad rekombinantných buniek a bunkových zložiek.

Pojmy „značka“ a „detegovateľná značka“, ako sa tu používajú, sa týkajú molekuly schopnej detekcie vrátane, ale bez obmedzenia, rádionuklidov, fluorescenčných látok, chemiluminiscenčných látok, chromofórov, enzýmov, enzýmových substrátov, enzýmových kofaktorov, enzýmových inhibítorov, chromofórov, farbív, kovových iónov, kovových solí, ligandov napríklad biotín, strepavidín alebo haptény) a podobne. Pojem „fluorescenčná látka“ sa týka látky alebo jej časti, ktorá je schopná mať fluorescenciu v detegovateľnom rozmedzí. Konkrétne vzorky značiek, ktoré sa dajú využiť v rámci tohto vynálezu, zahŕňajú, ale bez obmedzenia, chrenovú peroxidázu (HRP), fluoresceín, FITC, rodamín, dansyl, umbeliferón, dimetyl-akridíniumester (DMAE), texaskú červeň, luminol, NADPH a α-β-glaktozidázu.

II. Spôsoby uskutočnenia vynálezu

Pred podrobným opisom tohto vynálezu je potrebné si uvedomiť, že sa tento vynález neobmedzuje na konkrétne formulácie alebo že sa parametre procesu môžu samozrejme meniť. Je potrebné si taktiež uvedomiť, že terminológia, ktorá sa m používa, slúži iba na účely opisov konkrétnych uskutočnení tohto vynálezu a nie je obmedzujúca.

Aj keď počet zmesí a spôsobov podobných alebo ekvivalentných tým, ktoré sa tu opisujú, sa dá použiť v praxi tohto vynálezu, sú preferovanými látkami a spôsobmi tie, ktoré sa tu opisujú.

Ako sa poznamenáva, zakladá sa tento vynález na objave nových diagnostických spôsobov na presné stanovenie skorej infekcie HCV. Tieto spôsoby sa zakladajú na identifikácii a použití vysoko imunogénnych HCV protilátok a antigénov, ktoré sa vyskytujú v skorých fázach sérokonverzie HCV, čím sa zvyšuje správnosť detekcie a znižuje sa výskyt falošných výsledkov. Tieto spôsoby sa dajú vhodným spôsobom uskutočňovať vo formáte jednotlivej eseje.

Konkrétnejšie sa esej uskutočňuje na pevnej podložke, ku ktorej sa naviaže jedna alebo viac protilátok proti jadru HCV (smerovanej buď proti rovnakým, alebo iným epitopom jadra HCV) a epitop odvodený od oblasti NS3/4a polyproteínu HCV. Príklady konkrétnych protilátok proti jadru použiteľných v tomto vynáleze zahŕňajú, ale bez obmedzenia, protilátkové molekuly, ako sú monoklonálne protilátky zamerané proti epitopom v oblasti jadra medzi aminokyselinami 10 až 53, aminokyselinami 10 až 45, aminokyselinami 67 až 88, aminokyselinami 120 až 130 alebo protilátky zamerané proti epitopom jadra identifikovaným napríklad v Hougton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol, 8, S33-39 (1993), Chien a kol., medzinárodná publikácie č. WO 93/00365, D. Y. Chien, medzinárodná publikácia č. WO 94/01778 a US patentové prihlášky č. 08/403 590 a 08/444 818 prijaté do všeobecného vlastníctva.

Oblasť NS3/4a polyproteínu HCV sa opisuje a aminokyselinová sekvencia a celková štruktúra proteínu sa uverejňuje napríklad v Yao a kol., Structure, 7, 1353-1363 (1999), Sali a kol., Biochem., 37. 3392-3401 (1998) a R. Bartenschlager, J. Viral Hepat., 6, 165-181 (1999). Pozri tiež Dasmahapatra a kol., US patent č. 5 843 752. Imunoeseje subjektu používajú aspoň jeden konformačný epitop odvodený od oblasti NS3/4a, ktorý sa vyskytuje v konformácii nájdenej v prirodzenej častici HCV alebo v jej neúčinnom produkte, ako sa ukazuje zachovaním proteázovej a prípadne helikázovej enzymatickej aktivity normálne vykazovanej produktom génu NS3/4a a/alebo imunoreaktivitou antigénu s protilátkami v biologickej vzorke subjektu infikovaného HCV a stratou imunoreaktivity epitopu pri denaturácii antigénu. Napríklad konformačný epitop sa dá porušiť zahrievaním, zmenou pH na mimoriadne kyslé alebo bázické alebo pridaním známych organických denaturačných prostriedkov, ako je ditiotreitol (DTT) alebo príslušný detergent, pozri napríklad Proteín Purification Methods, a practical approach (E. L. V. Harris a S. Angal, red., IRL Press), a denaturovaný produkt sa porovnáva s produktom, ktorý sa nespracováva, ako sa opisuje.

Proteázová a helikázová aktivita sa dá stanoviť použitím štandardných spôsobov stanovenia enzýmov dobre známych v odbore. Napríklad proteázová aktivita sa dá stanoviť s použitím esejí dobre známych v odbore. Pozri napríklad Takeshita a kol., Anál. Biochem., 247, 242-246 (1997), Kakiuchi a kol., J. Biochem., 122, 749-755 (1997), Sali a kol., Biochemistry, 37, 3392-3401 (1998), Choo a kol., J. Virol. Meth., 72, 109-115 (1998), Cerretani a kol., Anál. Biochem., 266, 192-197 (1999), Zhang a kol., Anál. Biochem., 270. 268-275 (1999), Kakiuchi a kol., J. Virol. Meth., 80, 77-84 (1999), Fowler a kol., J. Biomol. Screen, 5, 153-158 (2000) a Kim a kol., Anál. Biochem., 284, 42-48 (2000). Obzvlášť vhodnú esej na stanovenie aktivity proteázy ukazujú opísané príklady.

Podobne sú v odbore dobre známe eseje aktivity helikázy a aktivita helikázy epitopu NS3/4a sa dá stanoviť napríklad s použitím eseje ELISA, ako sa opisuje napríklad v Hsu a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253, 594-599 (1998) a scintilačným systémom, ako opisuje Kyono a kol., Anál. Biochem., 257, 120-126 (1998) skríningovými esejami s vysokými výkonmi, ako sa opisujú napríklad v Hicham a kol., Antiviral Res., 46. 181-193 (2000) a Kwong a kol., Methods Mol. Med., 24, 97-116 (2000) rovnako tak ako inými spôsobmi esejí známymi v odbore. Pozri napríklad Khu a kol., J. Virol., 75, 205-214 (2001), Utama a kol., Virology, 273. 316-324 (2000), Paolini a kol., J. Gen. Virol., 81. 1335-1345 (2000), Preugschat a kol., Biochemistry, 39, 5174-5183 (2000), Preugschat a kol., Methods Mol. Med., 19, 353-364 (1998) a Hesson a kol., Biochemistry, 39, 2619-2625 (2000).

Dĺžka antigénu je dostatočná na udržanie imunoreaktívneho konformačného epitopu. Často má používaný polypeptid obsahujúci antigén takmer plnú dĺžku, ale tento polypeptid môže byť taktiež skrátený, napríklad na zvýšenie rozpustnosti alebo zlepšenie sekrécie. Všeobecne sa môže konformačný epitop v NS3/4a exprimovať ako rekombinantný polypeptid v bunke a tento polypeptid poskytuje epitop žiadanej formy, ako sa podrobne opisuje.

Reprezentatívne aminokyselinové sekvencie pre polypeptidy NS3/4a ukazujú obrázky 3 a obrázky 4A až 4D. Zvýraznený alanín v polohe 182 na obrázku 3 sa substituuje namiesto aktívneho serínu prítomného v tejto polohe, aby sa zabránilo autokatalýze molekuly, ktorá inak mohla nastať. Aminokyselinová sekvencia znázornená v polohách 3 až 686 obrázkov 4A až 4D zodpovedá aminokyselinovým polohám 1027 až 1711

HCV-1. Iniciačný kodón (ATG) kódujúci Met je znázornený ako poloha 1. Navyše Thr normálne prítomný v polohe 1428 HCV-1 (aminokyselinová poloha 403 obrázku 4) sa mutuje na Pro a Ser normálne prítomný v polohe 14289 HCV-1 (aminokyselina poloha 404 v obrázku 4) sa mutuje na íle. Ale natívna sekvencia s alebo bez N-terminálneho Met, znázornený analóg s alebo bez N-terminálneho Met alebo ďalšie analógy a fragmenty sa dajú použiť v esejách subjektu, pokiaľ sa epitop tvorí použitím spôsobu, ktorý zachováva alebo obnovuje natívnu konformáciu, takže sa zachováva proteázová a prípadne taktiež helikázová aktivita. Dasmahapatra a kol., US patent č. 5 843 752 a Zhang a kol., US patent č. 5 990 276 opisujú analógy NS3/4a.

NS3 proteáza NS3/4a je zhruba v polohách 1027-1207, číslované vzhľadom na HCV-1, polohy 1 až 182 obrázka 4. Štruktúra NS3 proteázy a aktívne miesto sú známe. Pozri napríklad De Francesco a kol., Antivir. Ther., 3, 99-109 (1998), Koch a kol., Biochemistry, 40, 631-640 (2001). Zmeny natívnej sekvencie, ktoré sa dajú normálne tolerovať, sú tie, ktoré sú vnútri aktívneho miesta molekuly. Konkrétne je vhodné zachovávať aminokyseliny 1- alebo 2 až 155 obrázka 4 s málo substitúciami alebo iba s konzervatívnymi substitúciami. Aminokyseliny mimo 155 budú tolerovať väčšie zmeny. Navyše, ak sa použijú fragmenty sekvencie NS3/4a znázornené na obrázku 4, budú tieto fragmenty všeobecne zahŕňať aspoň aminokyseliny 1 alebo 2 až 155, prednostne aminokyseliny 1 alebo 2 až 175 a najprednostnejšie aminokyseliny 1 alebo 2 až 182 s N-terminálnymi Met alebo bez nich. Helikázová doména je zhruba v polohách 1193 až 1657 HCV-1 (polohy 207 až 632 na obrázku 4). Preto, ak sa požaduje helikázová aktivita, bude táto časť molekuly zachovaná s málo zmenami alebo iba s konzervatívnymi zmenami. Ten, kto má skúsenosti v odbore, môže ľahko stanoviť ďalšie oblasti, ktoré budú tolerovať zmenu na základe známej štruktúry NS3/4a.

Pevný nosič môže taktiež obsahovať ďalšie antigény. Napríklad antigény tvorené spojením viacerých epitopov (zvané „MEFA“), ako sa opisujú v medzinárodnej publikácii č. WO 97/44469, sa môžu viazať na pevný nosič na použitie v esejách subjektu. Tieto MEFA obsahujú viacpočetné epitopy odvodené od dvoch alebo viacerých rôznych vírusových oblastí znázornených na obrázku 1 a v tabuľke 1. Konkrétne, ako ukazuje obrázok 1 a tabuľka 1, tvorí HCV polyproteín pri štiepení aspoň desiatich rôznych produktov v poradí NH₂-jadro-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Polypeptid jadra sa vyskytuje v polohách 1 až 191, číslované vzhľadom na HCV-1 [pozri Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88. 2451-2455 (1991) ohľadom genómu HCV-1], Tento polypeptid sa ďalej spracováva za získania HCV polypeptidu s aminokyselinami zhruba 1 až 173. Polypeptidy obálky, E1 až E2 sa vyskytujú zhruba v polohách 192 až 383 respektíve 384 až 746. Doména P7 je zhruba v polohách 747 až 809. NS2 je integrálny membránový proteín s proteolytickou aktivitou a je zhruba v polohách 810 až 1026 polyproteínu. NS2, buď samotný, alebo v kombinácii s NS3 (v polohách zhruba 1027 až 1657) štiepi väzbu NS2-NS3, ktorá tvorí koniec N NS3 a uvoľňuje veľký polyproteín zahrnujúci aktivity serín proteázy a RNA helikázy. NS3 proteáza v polohách 1027 až 1207 slúži na spracovanie zvyšného polyproteínu. Helikázová aktivita je zhruba v polohách 1193 až 1657. Dokončenie zretia polyproteínu sa začína autokatalytickým štiepením spojenia NS3-NS4a katalyzovaným NS3 serín proteázou. Nasledujúce štiepenie HCV polyproteínu sprostredkované NS3 zahŕňa rozpoznanie spojov štiepenia polyproteínu molekulou NS3 ďalšieho polypeptidu. V týchto reakciách NS3 uvoľňuje kofaktor NS3 (NS4a v polohách 1658 až 1711), dva proteíny (NS4b zhruba v polohách 1712 až 1972 a NS5a zhruba v polohách 1973 až 2420) a RNA-dependentnú RNA polymerázu (NS5b prítomnú zhruba v polohách 2421 až 3011).

Tabuľka 1

Doména	Približné rozmedzie *
C(core)	1-191
E1	192-383
E2	384-746
P7	747-809
NS2	810-1026
NS3	1027-1657
NS4a	1658-1711
NS4b	1712-1972
NS5a	1973-2420
NS5b	2421-3011

* Číslovanie vzhľadom na HCV-1. Pozri Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88. 2451-2455 (1991). Viacpočetné antigény HCV sú časťou jedného spojitého reťazca aminokyselín, ktorý sa nevyskytuje v prírode. Preto je lineárne poradie epitopov odlišné od ich lineárneho poradia v genóme, v ktorom sa vyskytujú. Lineárne poradie sekvencií MEFA na použitie v tomto vynáleze je prednostne usporiadané na dosiahnutie optimálneho antigénneho pôsobenia. V preferovaných spôsoboch pochádzajú epitopy od viacej ako jedného kmeňa HCV, čím sa zaisťuje prídavná schopnosť detegovať viacpočetné kmene HCV v jednej eseji. Preto môžu MEFA na použitie v tomto vynáleze obsahovať rôzne imunogénne oblasti odvodené od opísaného polyproteínu. Navyše proteín získaný z posunu rámca v oblasti jadra polyproteínu, ako sa opisuje v medzinárodnej publikácii

č. WO 99/63941, je použiteľný v MEFA. V prípade požiadavky sa v hybridnom proteíne môže vyskytnúť aspoň 2, 3,4, 5, 6, 7, 8,9 alebo 10, alebo viac epitopov odvodených od polyproteínu HCV.

Napríklad epitopy odvodené od hypervariabilnej oblasti E2, ako je oblasť aminokyselín 384 až 410 alebo 390 až 410, môžu byť súčasťou antigénu MEFA. Obzvlášť účinným epitopom E2 je taký, ktorý zahŕňa sekvenciu konsenzu odvodenú z tejto oblasti, ako je sekvencia konsenzu Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, ktorá predstavuje sekvenciu konsenzu pre aminokyseliny 390 až 410 genómu HCV typu 1. Reprezentatívny epitop E2 prítomný v MEFA podľa tohto vynálezu môže obsahovať hybridný epitop v rozmedzí aminokyselín 390 až 444. Tento hybridný epitop E2 môže zahŕňať sekvenciu konsenzu predstavovanú kyselinami 390 až 410 pripojenú k natívnej aminokyselinovej sekvencii pre aminokyseliny 411 až 444 HCV E2.

Navyše sa môžu antigény odvodzovať od rôznych kmeňov HCV. Sú známe viacpočetné vírusové kmene HCV a epitopy odvodené od ktoréhokoľvek z týchto kmeňov sa dajú používať v spojenom proteíne. Je dobre známe, že v akomkoľvek druhu organizmu existuje individuálna premenlivosť a ďalej, že daný organizmus, ako je vírus, môže mať množstvo rôznych kmeňov. Napríklad, ako sa opisuje, zahŕňa HCV aspoň 6 genotypov. Každý z týchto genotypov zahŕňa ekvivalentné antigénne determinanty. Konkrétnejšie zahŕňa každý kmeň množstvo antigénnych determinantov, ktoré sú prítomné vo všetkých kmeňoch vírusu, ale sú mierne rozdiely medzi jednotlivými kmeňmi vírusu. HCV napríklad zahŕňa antigénny determinant známy ako 5-1-1 (pozri obrázok 1). Tento konkrétny antigénny determinant je v troch rôznych formách na troch rôznych vírusových kmeňoch HCV. V súlade s tým sa v preferovanom uskutočnení podľa tohto vynálezu vyskytujú všetky tri formy 5-1-1 na antigéne získanom spojením viacerých epitopov použitom v imunoesejách uskutočňovaných na subjekte. Podobne môžu byť taktiež prítomné ekvivalentné antigénne determinanty z oblasti jadra rôznych kmeňov HCV. Všeobecne majú ekvivalentné antigénne determinanty vysoký stupeň homológie v zmysel aminokyselinovej sekvencie, ktorý je všeobecne 30 % alebo viac, prednostne 40 % alebo viac pri zoradení. Epitop viacpočetnej kópie podľa tohto vynálezu môže taktiež zahŕňať viac kópií, ktoré sú presnými kópiami toho istého epitopu.

Reprezentatívne MEFA na použitie v týchto analýzach sa opisuje v medzinárodnej publikácii č. WO 97/44469. Ďalšie reprezentatívne MEFA na toto použitie zahŕňajú MEFA 12, MEFA 13 a MEFA 13.1. Je potrebné si uvedomiť, že tieto MEFA sú čisto reprezentatívne a v týchto analýzach sa dajú používať ďalšie epitopy odvodené od genómu HCV a dajú sa inkorporovať do týchto alebo iných MEFA.

Sekvenciu DNA a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu MEFA 12 znázorňujú obrázky 7A až 7F. Všeobecný štruktúrny vzorec MEFA 12 znázorňuje obrázok 6 a je nasledujúci: hSOD-El (typ 1) -E2 HVR konsenzus (typ la) -E2 HVR konsenzus (typy 1 a 2) -c33c krátky (typ 1) -5-1-1 (typl) -5-1-1 (typ3) -5-1-1 (typ 2) -clOO (typ 1) -NS5 (typ 1) -NS5 (typ 1) -jadro (typy 1+2) -jadro-(typy 1+2). Tento epitop s viacpočetnými kópiami zahŕňa nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu, číslované vzhľadom na HCV-1 (opísané číslovanie aminokyselín vyplýva z určenia číslovania podľa Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991), kde aminokyselina 1 je prvý metionín kódovaný kódovacou sekvenciou oblasti jadra): aminokyseliny 1 až 69 superoxid dismutázy (SOD sa používa na zvýšenie rekombinantnej expresie proteínu), aminokyseliny 303 až 320 polyproteínu z oblasti El, aminokyseliny 390 až 410 polyproteínu predstavujúceho sekvenciu konsenzu pre hypervariabilnú oblasť HCV-la a E2, aminokyseliny 384 až 414 polyproteínu z oblasti E2, predstavujúce sekvenciu konsenzu pre hypervariabilné oblasti E2 HCV-1 a HCV-2, aminokyseliny 1211 až 1457 polyproteínu HCV-1 definujúce helikázu, tri kópie epitopu z 5-1-1, aminokyseliny 1689 až 1735, jedna z HCV-1, jedna z HCV-3 a jedna z HCV-2, kde tieto kópie sú ekvivalentné antigénnym determinantom z troch rôznych vírusových kmeňov HCV, HCV polypeptid ClOO HCV-1, aminokyseliny 1901-1936 polyproteínu, dve presné kópie epitopu z oblasti NS5 HCV-1, každá z aminokyselín 2278 až 2313 HCV polyproteínu, a dve kópie troch epitopov z oblasti jadra, dve z HCV-1 a jedna z HCV-2, ktoré sú ekvivalentné antigénnym determinantom predstavovaným aminokyselinami 9 až 53 a 64 až 88 HCV-1 a 67 až 84 HCV-2.

Tabuľka 2 ukazuje polohy aminokyselín rôznych epitopov v MEFA 12 s odkazom na obrázky 7A až 7F. Číslovanie v tabuľkách sa vzťahuje na HCV-1. Pozri Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88. 2451-2455 (1991). MEFA 13 a 13.1 taktiež zdieľajú opísaný všeobecný vzorec pre MEFA 12 s modifikáciami znázornenými v tabuľkách 3 a 4.

Tabuľka 2 - MEFA12

Mefa aa#	Koncové miesto 5'	epitop	hcv aa#	kmeň
1-69*	Ncol	hSOD
72-89	Mlul	E1	303-320	1
92-112	Hindlll	E2 HVRla konsenzus	390-410	1
113-143		E2 HVR1+2 konsenzus	384-414	1,2
146-392	Spel	C33C krátky	1211-1457	1
395-441	Sphl	5-1-1	1689-1735	1
444-490	Nrul	5-1-1	1689-1735	3
493-539	Clál	5-1-1	1689-1735	2
542-577	A val	C100	1901-1936	1
580-615	Xbal	NS5	2278-2313	1
618-653	BgÄI	NS5	2278-2313	1
654-741	Ncol	epitopy jadra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
742-829	Balí	epitopy jadra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

*Proteín SOD je skrátený tak, že detekčný konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, sa neviaže na 5 MEFA. Epitop jadra sa mutuje, aby sa predišlo väzbe protilátok proti jadru HCV použitých v detekcii s

MEFA.

Tabuľka 3 - MEFA 13

Mefa aa#	Koncové miesto 5'	epitop	hcv aa#	kmeň
1-156	Ncol	mutovaný hSOD (aa70- 72, ALA)
161-178	Mlul	E1	303-320	1
181-201	Hindlll	E2 HVRla konsenzus	390-410	1
202-232		E2 HVR1+2 konsenzus	384-414	1,2
235-451		C33C krátky	1211-1457	1
454-500	Hindlll	5-1-1 PImut*	1689-1735	1
503-549	Nrul	5-1-1 PImut*	1689-1735	3
552-598	Clal	5-1-1 PImut*	1689-1735	2
601-636	Aval	C100	1901-1936	1
639-674	Xbal	NS5	2278-2313	1
677-712	BgBl	NS5	2278-2313	1
713-800		epitopy jadra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
801-888		epitopy jadra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

*Epitopy 5-1-1-sa modifikujú elimináciou možných miest štiepenia (CS alebo CA) cielených NS3/4a rekombinantným proteínom. Namiesto CS alebo CA sa sekvencia mení na PI. Navyše sa proteín SOD mutuje takým spôsobom, že sa detekčný konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, neviaže na MEFA. Epitop jadra sa mutuje, aby sa predišlo väzbe protilátok jadra HCV použitých pri detekcii na MEFA.

SK 287694 Β6

Tabuľka 4 - MEFA 13.1

Mefa aa#	Koncové miesto 5'	epitop	hcv aa#	Kmeň
1-86	Ncol	mutovaný hSOD (aa 70-72, ALA)
89-106	Mlu\	E1	303-320	1
109-129	HindlU	E2 HVRla konsenzus	390-410	1
130-160		E2 HVR1+2 konsenzus	384-414	1, 2
163-379		C33C krátky	1211-1457	1
382-428	Hindííi	5-1-1 PImut*	1689-1735	1
431-477	Nrul	5-1-1 PImut*	1689-1735	3
480-526	Clal	5-1-1 PImut*	1689-1735	2
529-564	A val	ClOO	1901-1936	1
567-602	Xbal	NS5	2278-2313	1
605-640	BgHl	NS5	2278-2313	1
641-728		epitopy jadra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
729-816		epitopy jadra	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

*Epitopy 5-1-1 sa modifikujú elimináciou možných miest štiepenia (CS alebo CA) cielených NS3/4a rekombinantným proteínom. Namiesto CS alebo CA sa sekvencie menia na PI. Navyše sa protein SOD mutuje takým spôsobom, že sa detekčný konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, neviaže na MEFA. Epitop jadra sa mutuje, aby sa predišlo väzbe protilátok jadra HCV použitých pri detekcii na MEFA.

V jednom formáte eseje sa vzorka kombinuje s pevným nosičom, ako sa neskôr opisuje. Ak sa vzorka infikuje HCV, budú sa antigény jadra, rovnako tak ako protilátky proti týmto epitopom prítomné na pevnom nosiči, viazať na zložky pevného nosiča. Potom sa pridá detegovateľne značená protilátka proti jadru. Značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu ako protilátka proti jadru, ktorá sa viaže na pevný nosič. Táto protilátka proti jadru sa viaže na antigén jadra zachytený protilátkami proti jadru na pevnom nosiči.

Taktiež sa pridáva antigén reagujúci so zachytenou protilátkou HCV z biologickej vzorky, ktorá je reaktívna s NS3/4a epitopom. Tento antigén je prednostne epitop odvodený od oblasti NS3 polyproteínu HCV. Tento antigén viaže zachytenú protilátku HCV zo vzorky. Je známe množstvo antigénov vrátane týchto epitopov, ale bez obmedzenia, odvodených z oblastí c33c a clOO rovnako tak ako hybridných proteínov zahrnujúcich epitop NS3, ako je c25. Tieto a ďalšie epitopy NS3 sú použiteľné v týchto esejách a sú známe v odbore a opisujú ich napríklad Hougton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993). Medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, D. Y. Chien, medzinárodná publikácia č. WO 94/01778 a US patentové prihlášky prijaté do všeobecného vlastníctva č. 08/403 590 a 08/444 818.

Pridá sa druhá značená protilátka smerovaná proti opísanému antigénu. Túto protilátku je možné nasmerovať proti ktorémukoľvek epitopu obsiahnutému v antigéne. Napríklad je možné túto protilátku smerovať proti oblasti NS3 prítomnej v antigéne. Alternatívne, ak sa antigén vyššie exprimuje ako spojený protein, dá sa druhá značená protilátka smerovať proti partnerovi fúzie. Ďalšie antigény a protilátka sa dajú pridávať do eseje, najmä ak pevný nosič obsahuje MEFA. Tieto formáty eseje sa vysvetľujú neskôr.

Reprezentatívna esej podľa tohto vynálezu sa znázorňuje na obrázku 2. Ako ukazuje obrázok, zahŕňa pevný nosič dve monoklonálne protilátky proti jadru nazvané Cll-3 a Cll-7. Tieto protilátky sa smerujú proti epitopu prítomnému v N-terminálnej oblasti proteínu jadra pri aminokyselinách 10 až 53, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1. Pevný nosič taktiež zahŕňa epitop NS3/4a. K pevnému nosiču sa pridá biologická vzorka. Antigén jadra HCV, rovnako tak ako protilátky smerované proti epitopu NS3/4a taktiež prítomné vo vzorke, viažu prostriedky na zachytenie na pevnom nosiči.

Monoklonálna protilátka značená chrenovou peroxidázou c 11-14 smerovaná proti C-terminálnej oblasti jadra pri polohách aminokyselín 120 až 130, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1, sa následne pridá. Spojený protein zahrnujúci sekvenciu z ľudskej SOD (hSOD) a epitop z oblasti c33c sa pridá a je druhou protilátkou značenou chrenovou peroxidázou smerovanou proti časti SOD spojeného proteínu. Spojenie SOD-c33a sa viaže na protilátku proti NS3 a protilátka proti SOD sa viaže na spojený protein SOD-c33c. Detekcia značky indikuje prítomnosť infekcie HCV.

Ďalšia reprezentatívna esej podľa tohto vynálezu sa znázorňuje na obrázku 8. Konfiguráciou protilátkovej eseje je sendvičová esej antigén-protilátka-antigén s použitím NS3/4a a MEFA 12. Pevný nosič zahŕňa dve monoklonálne protilátky proti jadru opísané skôr, epitop NS3/4a reprezentatívnej MEFA, MEFA 12, zahrnujúci skrátenú verziu ľudskej SOD. Podobne ako pri opísanej eseji sa pridá biologická vzorka k pevnému nosiču. Antigén jadra HCV rovnako tak ako protilátky proti epitopu NS3/4a a epitopom MEFA prítomné vo vzorke sa viažu na zachytávacie prostriedky na pevnom nosiči. Pridajú sa dva antigény, jeden reaktívny s protilátkami vzorky, ktorý viaže NS3/4a (ako sa opisuje skôr) a jeden reaktívny s protilátkami vzorky, ktorý viaže MEFA 12. Na obrázku je antigén reaktívny s komplexom MEFA 12/protilátka vzorky spojením medzi molekulu SOD a c22ks delta47-L44W. Antigén c22ks je z oblasti jadra a zahŕňa aminokyseliny Lys_]0 až Ser₉₉ polyproteínu, rovnako tak ako deléciu Arg47 normálne prítomnej a substitúciu Leu namiesto Trp v polohe 44. Detekčným konjugátom protilátky je druhá monoklonálna protilátka proti SOD, značená HRP opísaná skôr.

Opísané kombinačné eseje antigén/protilátka sú obzvlášť výhodné, pretože sa dá detegovať antigén jadra HCV aj protilátky proti NS3/4a a/alebo jadru rovnakým nosičom v tej istej eseji. Navyše, ako sa opisuje, dajú sa použiť ďalšie HCV epitopy, ako je SOD pripojená k clOO, 5-1-1, NS5 antigénom rovnako tak ako proteín z posunu rámca v oblasti jadra polyproteínu, ktorý sa opisuje v medzinárodnej publikácii č. WO 99/63941, v kombinačnej zmesi na pokrytie iných neštruktúmych epitopov HCV.

Pre ďalšie pochopenie tohto vynálezu sa neskôr poskytuje podrobná diskusia ohľadom tvorby protilátok na použitie v oblasti imunoesejí, tvorby polypeptidov na použitie v imunoesejách a spôsobov uskutočňovania imunoesej í.

Tvorba protilátok na použitie v imunoesejách HCV

Ako sa opisuje, využíva esej rôzne protilátky, ktoré sa viažu na pevný nosič (napríklad jednej alebo viacerých protilátok proti jadru) a ktoré detegujú komplex antigén/protilátka tvorené pri prítomnosti infekcie HCV vo vzorke. Tieto protilátky môžu byť polyklonálnymi alebo monoklonálnymi protilátkovými prípravkami, monošpecifickými antisérami, ľudskými protilátkami alebo to môžu byť hybridné alebo chimérické protilátky, ako sú humanizované protilátky, pozmenené protilátky, fragmenty F(ab')₂', fragmenty F(ab), fragmenty Fv, jednodoménové protilátky, diméme a triméme protilátkové konštrukty fragmentov, miniprotilátky alebo ich funkčné fragmenty, ktoré sa viažu s daným antigénom.

Protilátky sa tvoria spôsobmi dobre známymi tomu, kto má skúsenosti v odbore a opisujú sa napríklad v US patentoch č. 4 011 308, 4 722 890, 4 016 043, 3 876 504, 3 770 380 a 4 372 745. Napríklad polyklonálne protilátky sa tvoria imunizáciou vhodného zvieraťa, ako je myš, krysa, králik, ovca alebo koza, daným antigénom. Na zvýšenie imunogenity sa antigén môže spájať pred imunizáciou s nosičom. Tieto nosiče sú dobre známe tomu, kto má bežnú prax v odbore. Imunizácia sa všeobecne uskutočňuje miešaním alebo emulgáciou antigénu vo fyziologickom roztoku, prednostne v adjuvantnom prostriedku, ako je Freundov úplný adjuvant a injekciou zmesi alebo emulzie parenterálne (všeobecne subkutánne alebo intramuskuláme). Zviera sa všeobecne vystaví o 2 až 6 týždňov neskôr jednej alebo viacerým posilňovacím injekciám antigénu vo fyziologickom roztoku, prednostne s použitím Freundovho neúplného adjuvantu. Protilátky sa taktiež môžu vytvárať imunizáciou in vitro spôsobmi známymi v odbore. Polyklonálne antisérum sa potom získa z imunizovaného zvieraťa. Pozri napríklad Houghton a kol., US patent č. 5 350 671 ohľadom opisu tvorby polyklonálnej protilátky proti HCV.

Monoklonálne protilátky sa všeobecne pripravia spôsobom Kohlera a Milsteina, Náture, 256, 495-497 (1975) alebo jeho modifikáciou. Zvyčajne sa myš alebo krysa imunizuje, ako sa opisuje. Ale skôr ako odobratie krvi zvieraťu na získanie séra sa vyberie slezina (a prípadne niekoľko veľkých lymfatických uzlín) a rozdelia sa na jednotlivé bunky. V prípade požiadavky sa môžu bunky sleziny rozdeliť (po odstránení nešpecifický adherujúcich buniek) aplikáciou bunkovej suspenzie na misku alebo jamku potiahnutú antigénom. Bbunky exprimujúce imunoglobulín viazaný na membránu špecifický pre antigén sa viažu na misku a nevymyjú sa so zvyškom suspenzie. Výsledné B-bunky alebo všetky disociované slezinné bunky sa potom indukujú pre spojenie s bunkami myelómu pre vytvorenie hybridómov a pestujú sa v selektívnom médiu (napríklad v hypoxantínovom, aminopterínovom, tymidínovom médiu „HAT“). Výsledné hybridómy sa prenesú na misky obmedzujúcim zriedením a analyzujú sa ohľadom tvorby protilátok, ktoré sa špecificky viažu na imunizujúci antigén (a ktoré sa neviažu na nepríbuzné antigény). Zvolené monoklonálne hybridómy vylučujúce protilátku sa potom pestujú buď in vitro (napríklad v bankách pre tkanivové kultúry alebo v reaktoroch s dutými vláknami) alebo in vivo (napríklad ako ascity pri myši).

Tvorba príbuzných monoklonálnych protilátok proti HCV sa opisuje napríklad v Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, US patentová prihláška prijatá do všeobecného vlastníctva č. 08/403 590 a 08/444 818 a Kashiwakuma a kol., US patent č. 5 871 904.

Ako sa opisuje, protilátkové fragmenty zachovávajúce schopnosť rozpoznávať daný antigén taktiež nachádzajú použitie pri imunoesejách subjektov. V odbore je známe množstvo protilátkových fragmentov, ktoré obsahujú antigénové väzbové miesta schopné mať imunologické väzbové vlastnosti intaktnej protilátkovej molekuly. Napríklad je možné vytvárať funkčné protilátkové fragmenty štiepením konštantnej oblasti nezodpovednej za väzbu antigénu z protilátkovej molekuly použitím napríklad pepsínu za získania fragmentov F(ab')₂. Tieto fragmenty obsahujú dve antigénové väzbové miesta, ale chýba im časť konštantnej oblasti od každého z ťažkých reťazcov. Podobne sa dajú taktiež v prípade požiadavky získať Fab fragmenty obsahujúce jednotlivé antigénové väzbové miesto napríklad digesciou polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok papaínom. Dajú sa taktiež získať fúnkčné fragmenty obsahujúce iba variabilnú oblasť ťažkých a ľahkých reťazcov s použitím štandardných spôsobov, ako je rekombinantná tvorba preferenčného proteolytického štiepenia imunoglobulínových molekúl. Tieto fragmenty sa opisujú ako F_v. Pozri napríklad Inbar a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 2569-2662 (1972), Hochman a kol., Biochem, 15, 2706-2710 (1976) a Ehrich a kol., Biochem., 19, 4091-4096 (1980).

Jednoreťazcový Fv („sFv“ alebo „scFv“) polypeptid je kovalentne spojený V_H-V_L heterodimér, ktorý sa exprimuje spojením génov vrátane V_H- a V_L - kódovacích génov spojených linkerom kódujúcim peptid. Huston a kol., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 85 5879-5883 (1988). Opisuje sa množstvo spôsobov na rozlíšenie a tvorbu chemických štruktúr (linkerov) pre konverziu prirodzene agregovaných ale chemicky oddelených ľahkých a ťažkých polypeptidových reťazcov z protilátkovej V oblasti do sFv molekuly, ktoré sa skladajú do trojrozmernej štruktúry v podstate podobnej štruktúre miesta väzby antigénu. Pozri napríklad US patent č. 5 091 513, 5 132 405 a 4 946 778. Molekuly sFv sa dajú vytvoriť s použitím spôsobov opísaných v odbore. Pozri napríklad Huston a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85. 5879-5883 (1988), US patent č. 5 091 513, 5 132 405 a 4 946 778. Kritériá konštrukcie zahŕňajú stanovenie príslušnej dĺžky na premostenie vzdialenosti medzi koncom C jedného reťazca a koncom N druhého reťazca, kde linker všeobecne tvorí malé hydrofílné aminokyselinové zvyšky, ktoré nejavia snahu na zvinovanie či tvorbu sekundárnych štruktúr. Takéto spôsoby sa opisujú v odbore, pozri napríklad US patent č. 5 091 513, 5132 405 a 4 946 778. Vhodné linkery všeobecne zahŕňajú polypeptidové reťazce striedavých zoskupení glycínových a serínových zvyškov a môžu zahŕňať glutámovú kyselinu a lyzínové zvyšky vložené na zvýšenie rozpustnosti.

„Miniprotilátky“ alebo „minilátky“ taktiež nachádzajú použitie v tomto vynáleze. Miniprotilátky sú sFv polypeptidové reťazce zahrnujúce domény oligomerizácie a ich konce C oddelené od sFv oblastí zavesenia. Pack a kol., Biochem., 31. 1579-1584 (1992). Doména oligomerizácie zahŕňa samoasociačné α-helixy, napríklad leucínové zippery, ktoré sa dajú ďalej stabilizovať prídavnými disulfidickými väzbami. Oligomerizačná doména sa navrhuje tak, aby bola kompatibilná s vektorovým skladaním naprieč membránou, spôsobom uvažovaným pre skladanie polypeptidu in vivo na funkčný väzbový protein. Všeobecne sa tvoria miniprotilátky s použitím rekombinantných metód dobre známych v odbore. Pozri napríklad Pack a kol., Biochem., 31, 1579-1584 (1992), Cumber a kol., J. Immunology, 149B, 120-126 (1992).

Tvorba antigénov na použitie v imunoeseji HCV

Ako sa opisuje, tvoria sa molekuly podľa tohto vynálezu všeobecne rekombinantným spôsobom. Polynukleotidy kódujúce antigén HCV na použitie v tomto vynáleze sa teda dajú pripraviť štandardnými spôsobmi molekulárnej biológie. Napríklad polynukleotidové sekvencie kódujúce opísané molekuly sa dajú získať rekombinantnými spôsobmi, ako je skríning cDNA a genómové knižnice z buniek exprimujúcich gén alebo odvodením génu z vektora, ktorý ich obsahuje. Ďalej sa dá požadovaný gén izolovať priamo z molekúl vírusovej nukleovej kyseliny spôsobmi známymi v odbore, ako opisuje Houghton a kol., US patent č. 5 350 671. Daný gén sa dá taktiež získať synteticky namiesto klonovania. Molekuly sa dajú konštruovať s príslušnými kodónmi pre danú sekvenciu. Úplná sekvencia sa potom vytvorí z prekrývajúcich sa oligonukleotidov pripravených štandardnými spôsobmi a usporiadaných do úplnej kódovacej sekvencie. Pozri napríklad Edge, Náture, 292. 756 (1981), Nambair a kol., Science 223, 1299 (1984) a Jay a kol., J. Biol. Chem., 259. 6311 (1984).

Konkrétne nukleotidové sekvencie sa dajú teda získať z vektorov nesúcich požadované sekvencie alebo sa dajú pripraviť synteticky, úplne alebo čiastočne s použitím rôznych spôsobov prípravy oligonukleotidov známych v odbore, ako je mutagenéza smerovaná na miesto a polymerázová reťazová reakcia (PCR). Pozri napríklad Sambrook. Najmä je jeden zo spôsobov získania nukleotidových sekvencii kódujúcich požadované sekvencie aneláciou komplementárnych súborov presahujúcich syntetické nukleotidy získané v konvenčnom automatickom polynukleotidovom syntetizátore s nasledujúcou ligáciou príslušnou DNA ligázou a amplifikáciou ligovanej nukleotidovej sekvencie prostredníctvom PVR. Pozri napríklad Jayaraman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 4084-4088 (1991).

Navyše sa dá v rámci tohto vynálezu použiť syntéza smerovaná na oligonukleotidy [Jones a kol., Náture, 54, 75-82 (1986)], mutagenézu vopred existujúcich nukleotidových oblastí smerovanú na oligonukleotidy [Riechmann a kol., Náture, 332, 323-327 (1988) a Verhoeyen a kol., Science, 239, 1534-1536 (1988)] a enzymatické zaplňovanie oligonukleotidov s medzerami použitím T₄DNA polymerázy [Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 10029-10033 (1989)] získaním molekúl majúcich pozmenené alebo zvýšené schopnosti väzby antigénu a/alebo zníženú imunogenicitu.

Len čo sa kódovacie sekvencie pripravia alebo izolujú, môžu sa klonovať do akéhokoľvek vhodného vektora alebo replikónu. Mnohé klonovacie vektory sú známe pre toho, kto má skúsenosti v odbore, a výber prí18 slušného klonovacieho vektora je vecou voľby. Vhodné vektory zahrnujú, ale bez obmedzenia, plazmidy, fágy, transpozóny, kozmidy, chromozómy alebo vírusy schopné replikácie pri spojení s vhodnými kontrolnými prvkami.

Kódovacie sekvencie sa potom umiestnia pod kontrolu vhodnými kontrolnými prvkami v závislosti od systému použitého na expresiu. Kódovacia sekvencia sa dá teda umiestniť pod kontrolu promótora, väzbové miesta ribozómov (pre bakteriálnu expresiu) a prípadne operátora, takže sa daná sekvencia deoxyribonukleovej kyseliny prepisuje do ribonukleovej kyseliny vhodným transformantom. Kódovacia sekvencia môže a nemusí obsahovať signálny peptid alebo vedúcu sekvenciu, ktorá môže byť neskôr odstránená hostiteľom posttranslačným spracovaním. Pozri napríklad US patent č. 4 431 739, 4 425 437, 4 338 397.

Navyše ku kontrolným sekvenciám sa môže požadovať pridanie regulačných sekvencii umožňujúcich reguláciu expresie sekvencii vzhľadom na rast hostiteľskej bunky. Regulačné sekvencie sú známe tomu, kto má skúsenosti v odbore, a príklady zahŕňajú také sekvencie, ktoré spôsobujú expresiu génu pre zapnutie alebo vypnutie ako odpoveď na chemický alebo fyzikálny podnet vrátane prítomnosti regulačnej zlúčeniny. Vo vektore môžu byť taktiež prítomné ďalšie regulačné prvky. Napríklad enhancerové prvky sa dajú použiť na zvýšenie hladín expresie konštruktov. Príklady zahŕňajú skorý génový enhancer SV40 [Dijkema a kol., EMBO J., 4, 761 (1985)], enhancer/promótor odvodený od LTR vírusu Rousovho sarkómu [Gorman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6777 (1982)] a prvky odvodené od ľudského CMV [Boshart a kol., Celí, 41, 521, (1985)] ako prvky obsiahnuté v sekvencii CMV intrónu A (US patent č. 5 688 688). Expresná kazeta môže ďalej zahŕňať pôvod replikácie pre autonómnu replikáciu vo vhodnej hostiteľskej bunke, jeden alebo viac voliteľných markerov, jedno alebo viac reštrikčných miest, možnosť vysokého počtu kópií a silný promótor.

Expresný vektor sa konštruuje tak, aby boli dané kódovacie sekvencie uložené vo vektore s príslušnými regulačnými sekvenciami, a aby umiestnenie a orientácia kódovacích sekvencii vzhľadom na kódovacie sekvencie bolo také, že sa kódovacie sekvencie prepisujú „za kontroly“ kontrolných sekvencii (t. j. RNA polymeráza, ktorá sa viaže na molekule RNA pri kontrolných sekvenciách prepisuje kódovaciu sekvenciu). Modifikácia sekvencii kódujúcich danú molekulu sa môže požadovať na tento účel. Napríklad môže byť v niektorých prípadoch nevyhnutné modifikovať sekvenciu takým spôsobom, aby sa pripájala ku kontrolným sekvenciám v príslušnej orientácii, t. j. udržovať čítací rámec. Kontrolné sekvencie a ďalšie regulačné sekvencie sa môžu pripájať ku kódovacej sekvencii pred vložením do vektora. Alternatívne sa dá kódovacia sekvencia klonovať priamo do expresného vektora, ktorý už obsahuje kontrolné sekvencie a príslušné reštrikčné miesto.

Ako sa opisuje, dá sa požadovať tvorba mutantov alebo analógov daného antigénu. To platí najmä pre NS3/4a. Spôsoby, akými sa to dá dosiahnuť, sa opisujú napríklad v Dasmahapatra a kol., US patent č. 5 846 752 a Zhang a kol., US patent č. 5 990 276. Mutanty alebo analógy tohto a ďalších HCV proteínov na použitie v esejách subjektu sa dajú pripraviť deléciou časti sekvencie kódujúcej daný polypeptid, inzerciou sekvencie a/alebo substitúciou jedného alebo viacerých nukleotidov v sekvencii. Spôsoby modifikácie nukleotidových sekvencii, ako je mutagenéza smerovaná na miesto a podobne, sú dobre známe tomu, kto má skúsenosti v odbore. Pozri napríklad Sambrook a kol., T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 448 (1985), Geisselsoder a kol., BioTechniques, 5, 786 (1987), Zoller a Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), Daíbie-McFarland a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79. 6409 (1982).

Molekuly sa dajú exprimovať širokým rozmedzím systémov vrátane hmyzích, cicavčích, bakteriálnych, vírusových a kvasinkových expresných systémov, ako sa opisujú v odbore.

Napríklad systémy expresie hmyzích buniek, ako sú bakulovírusové systémy, sú dobre známe tomu, kto má skúsenosti v odbore a opisujú sa napríklad v Summers a Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materiály a spôsoby pre systémy expresie bakulovírus/hmyzia bunka sú komerčne dostupné v súprave, okrem iných od Invitrogen, San Diego CA („MaxBac“ kit). Podobne systémy expresie bakteriálnych a cicavčích buniek sú v odbore dobre známe a opisujú sa napríklad v Sambrook a kol. Kvasinkové systémy expresií sú taktiež v odbore dobre známe a opisujú sa napríklad v Yeast Genetic Engineering (Barr a kol., redakcia, 1989) Butterworths, London.

Množstvo príslušných hostiteľských buniek na použitie s opísanými systémami je taktiež známe. Napríklad sú v odbore známe cicavčie bunkové línie a zahrnujú imortalizované bunkové línie od American Type Culture Collection (ATCC), ako sú ale bez obmedzenia, bunky vaječníka čínskeho škrečka (CHO), HeLa bunky, obličkové bunky mláďat škrečkov (BHK), opičie obličkové bunky (COS), ľudské embryonálne obličkové bunky, bunky ľudského hepatocelulámeho karcinómu (napríklad Hep G2), bunky hovädzích obličiek Madin-Darby („MDBK“) a ďalšie. Podobne bakteriálni hostitelia, ako je E. coli, Bacillus subtilis a Streptococcus spp., nájdu použitie s uvažovanými konštruktami expresie. Kvasinkový hostitelia použiteľní v tomto vynáleze zahrnujú okrem iných Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe a Yarrowia lipolytica. Hmyzie bunky na použitie s vektormi expresie bakulovírusu zahrnujú okrem iných Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda a Trichoplusia ni.

Molekuly nukleových kyselín zahrnujúce dané nukleotidové sekvencie sa môžu stabilne integrovať do genómu hostiteľskej bunky alebo udržiavať na stabilnom epizomálnom elemente vo vhodnej hostiteľskej bunke s použitím rôznych spôsobov dodávania génu dobre známych v odbore. Pozri napríklad US patent č. 5 399 346.

V závislosti od systému expresie a zvoleného hostiteľa sa tieto molekuly získajú pestovaním hostiteľských buniek transformovaných opísaným vektorom expresie za podmienok, pri ktorých sa exprimuje proteín. Exprimovaný protein sa potom izoluje z hostiteľských buniek a purifikuje. Ak systém expresie vylučuje protein do média, dá sa produkt purifikovať priamo z média. Ak sa nevylučuje, môže sa izolovať z lyzátov buniek. Voľba vhodných rastových podmienok a spôsobov získavania spadá do oblasti skúseností v odbore.

Opisuje sa rekombinantná tvorba rôznych HCV antigénov. Pozri napríklad Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993), Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, D. Y. Chien, medzinárodná patentová prihláška č. WO 94/01778.

Imunodiagnostické eseje

Pripravené protilátky proti jadru a antigény NS3/4a opísané skôr sa umiestnia na vhodný pevný nosič na použitie pri imunoeseji subjektov. Pevný nosič na účely podľa tohto vynálezu môže byť akákoľvek látka, ktorá má nerozpustnú matricu a môže mať tuhý alebo polotuhý povrch. Príklady pevných nosičov zahŕňajú, ale bez obmedzenia, substráty, ako je nitrocelulóza (napríklad v membráne vo forme mikrotitračnej jamky), polyvinylchlorid (napríklad listy alebo mikrotitračné jamky), polystyrénový latex (napríklad guľôčky alebo mikrotitračné misky), polyvinylidínfluorid, diazotovaný papier, nylonové membrány, aktivované guľôčky, magnetické guľôčky a podobne. Konkrétne nosiče zahŕňajú dosky, pelety, disky, kapiláry a duté vlákna, ihly, kolíčky, tuhé vlákna, celulózové guľôčky, guľôčky z pórovitého skla, silikagély, polystyrénové guľôčky prípadne zosietené divinylbenzénom, kopolymérové guľôčky, polyakrylamidové guľôčky, latexové guľôčky, dimetylakrylamidové guľôčky prípadne zosietené Ν,Ν'-bis-akryloyletyléndiamínom a sklenené častice potiahnuté hydrofóbnym polymérom.

V prípade požiadavky sa dajú molekuly pridávané k pevnému nosiču ľahko vybaviť funkčnými skupinami s vytvorením strénových alebo akrylátových zvyškov, čím sa umožňuje inkorporácia molekúl do polystyrénu, polyakrylátu alebo ďalších polymérov, ako je polyimid, polyakrylamid, polyetylén, polyvinyl, polydiacetylén, polyfenylén-vinylén, polypeptid, polysacharid, polysulfón, polypyrol, polyimidazol, polytiofén, polyéter, epoxidové polyméry, kremičité sklo, silikagél, siloxán, polyfosfát, hydrogél, agaróza, celulóza a podobne.

V jednom z prípadov sa pevný nosič nechá najprv reagovať s protilátkami proti jadru HCV a epitopom NS3/4a (tu spoločne nazývané „komponenty pevnej fázy“) a prípadne s jednou alebo viacerými MEFA za vhodných podmienok väzby tak, aby sa molekuly dostatočne imobilizovali na nosiči. Niekedy sa dá imobilizácia nosiča zvýšiť najprv pripojením antigénu a/alebo protilátky k proteínu s lepšími väzbovými vlastnosťami proti tuhej fáze. Vhodné spojovacie proteíny zahŕňajú, ale bez obmedzenia, molekuly, ako sú sérumalbumíny vrátane bovinného sérumalbumínu (BSA), keyhole limpet hemocyanínu, molekúl imunoglobulínu, tyroglobulínu, ovalbumínu a ďalších proteínov dobre známych v odbore. Dajú sa použiť ďalšie prostriedky pre väzbu molekúl na nosič vrátane polysacharidov, polymliečnych kyselín, polyglykolových kyselín, polymémych aminokyselín, aminokyselinových kopolymérov a podobne. Tieto molekuly a spôsoby pripájania týchto molekúl k antigénom poznajú dobre tí, ktorí majú skúsenosti v odbore. Pozri napríklad M. A. Brinkley, Bioconjugate Chem., 3 2-13 (1992), Hashida a kol., J. Appl. Biochem., ťg 56-63 (1984) a Anjaneyulu a Staros, International J. of Peptide and Protein Res., 30. 117-124 (1987).

Po reakcii tuhého nosiča so zložkami tuhej fázy sa akékoľvek neimobilizované komponenty tuhej fázy odstránia z nosiča premytím a komponenty naviazané na nosič sa potom privedú do styku s biologickou vzorkou s podozrením na protilátky a antigény HCV (tu spoločne nazývané „molekuly ligandov“) pri vhodných väzbových podmienkach. Po premytí na odstránenie nenaviazaných molekúl ligandu sa za vhodných podmienok väzby pridá druhá protilátka proti jadru zameraná proti inému epitopu ako protilátka proti jadru naviazaná na nosič. Pridaná protilátka proti jadru obsahuje detegovateľnú značku, ako sa opisuje a pôsobí v zmysle väzby akéhokoľvek antigénu jadra, ktorý môže byť prítomný vo vzorke, ktorý reagoval s protilátkou proti jadru naviazanou na nosič. Taktiež sa pridá jeden alebo viac antigénov, ktoré môžu reagovať s protilátkami prítomnými vo vzorke, a ktoré reagovali s epitopom NS3/4a. Ako sa opisuje, zvyčajne sa antigén odvodzuje od oblasti NS3 polyproteínu HCV a najmä od oblasti c33c HCV. Pozri Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 10011-10015 (1989), medzinárodná prihláška č. WO 93/00365 US patentová prihláška prijatá do všeobecného vlastníctva č. 08/403 590 a 08/444 818 ohľadom opisu tejto oblasti a epitopov, ktoré sa od nej odvodzujú. Pridá sa taktiež značená protilátka zameraná proti tomuto antigénu. Táto protilátka bude teda viazať antigén, ktorý reagoval s protilátkami proti NS3 prítomnými vo vzorke. Na tento účel sa dá zaistiť výhodne epitop c33c ako spojenie medzi c33c a ľudskou superoxid dismutázou (hSOD) získanou rekombinantne, napríklad spôsobmi opísanými v Houghton a kol., US patent č 5 350 671. Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie pre ľudskú SOD sú známe a opisujú sa v Hal20 lewell a kol. US patent č. 5 710 033. Značená protilátka zameraná proti ľudskej SOD sa teda dá použiť na detekciu prítomnosti komplexov tvorených medzi epitopom NS3/4a, akýmikoľvek protilátkami vo vzorke reagujúcimi s týmto epitopom a polypeptidmi HCV, ktoré sa viažu na protilátku vo vzorke.

V prípade prítomnosti MEFA na pevnom nosiči sa dá k eseji taktiež pridať jeden alebo viac ďalších antigénov reaktívnych s protilátkami z biologickej vzorky, ktoré sú viazané na antigény prítomné na MEFA. Obzvlášť užitočný je v tejto súvislosti antigén odvodený od oblasti jadra HCV a najmä od c22 antigénu, ktorý zahŕňa 119 N terminálne aminokyseliny jadra HCV polyproteínu. Jeden konkrétny antigén odvodený od c22 je c22ks delta47-L44W, ktorý obsahuje aminokyseliny Lysio až Ser₉₉ polyproteínu, rovnako tak ako deléciu Arg47 normálne prítomného a substitúciu Leu namiesto Trp v polohe 44. Podobne ako opísaný epitop c33c sa dá tento antigén získať ako spojenie s hSOD a rovnakou značenou protilátkou zameranou proti ľudskej SOD a dá sa použiť na detekciu prítomnosti komplexov tvorených medzi protilátkami prítomnými vo vzorke a epitopom NS3/4a a/alebo MEFA, ktorého komplexy sú taktiež viazané s antigénmi HCV (napríklad c33c a c22).

Konkrétnejšie sa dá použiť metóda ELISA, kde sú jamky mikrotitračnej dosky potiahnuté komponentmi pevnej fázy. Biologická vzorka obsahujúca molekuly ligandu alebo vzorka, pri ktorej je podozrenie na obsah týchto molekúl, sa potom pridá do týchto potiahnutých jamiek. Po dobe inkubácie dostatočnej na umožnenie väzby molekuly ligandu s imobilizovaňou zložkou pevnej fázy sa miska (misky) premyje (premyjú) na odstránenie neviazaných zvyškov a pridá sa detegovateľne značená molekula sekundárnej väzby (značená protilátka proti jadru), molekula obsahujúca NS3 epitop a protilátka zameraná proti molekule obsahujúcej NS3 epitop. Tieto molekuly sa nechajú reagovať s akýmkoľvek zachyteným antigénom a protilátkou vo vzorke, miska sa premyje a prítomnosť značených protilátok sa deteguje spôsobmi dobre známymi v odbore.

Opísané reakčné prostriedky pre esej vrátane pevného nosiča imunoeseje s naviazanými protilátkami a antigénmi, rovnako tak ako s protilátkami a antigénmi, ktoré majú reagovať so zachytenou vzorkou, sa dajú získať v súpravách s vhodnými pokynmi a ďalšími nevyhnutnými reakčnými prostriedkami na uskutočnenie imunoesej! podľa opisu. Táto súprava môže taktiež obsahovať, v závislosti od konkrétnej imunoeseje, vhodné značky a ďalšie balené chemikálie a látky (napríklad premývacie pufŕy a podobne). Štandardné imunoeseje, ako sú tie, ktoré sa opisujú, sa môžu uskutočniť s použitím týchto súprav.

III. Experimentálna časť

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujú príklady špecifických uskutočnení tohto vynálezu. Tieto príklady slúžia iba na ilustratívne účely a žiadnym spôsobom sa neuvažujú ako obmedzenie obsahu tohto vynálezu.

Je snahou zaistiť správnosť ohľadom použitých hodnôt (napríklad množstvo, teplota atď.), ale je potrebné pripustiť určitú experimentálnu chybu a odchýlku.

Príklad 1

Kombinačná imunoesej HCV antigén/protilátka

Kombinačná imunoesej HCV antigén/protilátka, ktorá sa tu opisuje, sa porovnáva s inými esejami HCV na testovanie detekčných medzí sérokonverzie a porovnanie týchto medzí s medzami získanými v iných komerčne dostupných esejách nasledujúcim spôsobom.

A. Materiály a spôsoby uskutočnenia

Vzorky krvi

Používajú sa komerčne dostupné súbory vzoriek ľudskej krvi. Tieto súbory sa dajú získať napríklad od Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater MA (BBI), Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP) a North American Biologics, Inc., BocoRatan, FL (NABI). Dni v tabuľkách 5 a 6 sú dni, v ktorých boli vzorky krvi odobraté od osôb.

Monoklonálne protilátky

Monoklonálne protilátky cll-3, cll-7 a cl 1-14 sa získajú od Ortho Clinical Dagnostics, Raritan, New Jersey. Protilátky cll-3 a cll-7 sú zamerané proti N-terminálnej časti jadra (aminokyseliny 10 až 53, číslované vzhľadom na polyproteín HCV1). Monoklonálna protilátka cl 1-14 je zameraná proti C-terminálnej časti jadra (aminokyseliny 120 až 130, číslované vzhľadom na HCV1 polyproteín). Protilátka cl 1-14 sa konjuguje s chrenovou peroxidázou (HRP) štandardnými spôsobmi.

Monoklonálna protilátka 5A-3 je protilátka proti SOD, zameraná proti aminokyselinám 1 až 65 SOD a pripravuje sa štandardnými spôsobmi. Táto protilátka sa konjuguje s HRP, ako sa opisuje skôr.

B. Antigény

Antigén c33c (266 aminokyselín, aminokyseliny 1192 až 1457 HCV1 polyproteínu) sa exprimuje ako vnútorný SOD spojený polypeptid v E. coli spôsobmi opísanými na prípravu antigénu 5-1-1 (Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989). Rekombinantný antigén sa purifikuje podľa opisu v Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci, 89, 10011-10015 (1989). Pozri Houghton a kol., US patent č. 5 350 671 ohľadom spôsobov prípravy SOD-c33c.

Epitop NS3/4a použitý v eseji je konformačný epitop majúci sekvenciu znázornenú na obrázku 3.

C. Spôsoby usporiadania imunoeseje

Esej Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) je komerčne dostupná a je to detekčná esej založená na protilátke. Táto esej sa uskutočňuje podľa inštrukcií výrobcu.

ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System (nazývaná Ortho 3.0 esej v tomto patente, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) je detekčná esej založená na protilátke. Analýza sa uskutočňuje podľa inštrukcií výrobcu.

Súprava Roche Amplicor (Roche, Pleasant, CA) je komerčne dostupná súprava založená na PCR. Esej sa uskutočňuje podľa inštrukcií výrobcu.

Súprava Gen-Probe TMA (San Diego, CA) je komerčne dostupná transkripčne sprostredkovaná amplifikačná súprava. Esej sa uskutočňuje podľa inštrukcií výrobcu.

Súprava pre antigénovú esej Ortho (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) je detekčná súprava založená na antigéne. Esej sa uskutočňuje podľa návodu výrobcu.

Kombinačná imunoesej HCV antigén subjektu/protilátka sa uskutočňuje nasledujúcim spôsobom. 4 mg/ml každej z purifikovaných monoklonálnych protilátok Cll-7 aCll-3 v lx fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS), pH 7,4 sa kombinuje a dobre premieša. K tomu istému poťahovaciemu pufŕu sa pridá 90 ng rekombinantného antigénu NS3/4a. Roztok sa mieša pred potiahnutím počas 30 min. 200 μΐ opísaného roztoku sa pridá na jamku v 96-jamkových mikrotitračných miskách s médiom Costar (Corning, Inc.). Misky sa inkubujú pri teplote 15 až 30 °C počas 16 až 24 h. Premyjú sa dvakrát dH₂O, potom 300 μΐ na jamku pufŕa po potiahnutí (1 % bovinné sérumalbumín, BSA, 1 x PBS) počas Íha stabilizačným pufrom 300 μΐ na jamku (lx PBS, 1 % BSA, manitol, polyetylénglykol, želatína) v priebehu 1 h. Roztoky sa ašpirujú a usušia pri teplote 4 °C v lyofilizačnom zariadení počas 24 h. Misky sa naplnia desikačným prostriedkom

Na uskutočnenie kombinačnej imunoeseje antigén/protilátka sa do misky pridá 100 μΐ obohateného pufŕa na cytolýzu [1 % N-laurylsarkozínu, 0,65 M chlorid sodný, 50 mg/ml IgG čistoty na technické použitie (Sigma, St. Louis, MO), 1 % BSA s modifikovanými tioskupinami (Bayer), 0,1 % kazeínu]. Potom sa pridá 100 μΐ vzorky. Tá sa inkubuje na trepacom zariadení pri teplote 40 °C počas lh. Misky sa premyjú šesťkrát 1 x PBS, 0,1 % Tween-20 na zariadení Ortho Plate Washer. 200 μΐ roztoku konjugátu [zriedenie 1 : 75 cll14 HRP s 250 ng/esej SOD-c33c antigénu plus zriedenie 1 : 5 000 myšej protilátky proti SOD-HRP v HCV 3.0 zrieďovacom prostriedku pre vzorky (od ORTHO HCV verzia 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) bez SOD extraktu, všetko sa pripraví 30 min. pred pridaním]. Roztok sa inkubuje 45 min. počas trepania pri teplote 40 °C. Premyje sa šesťkrát ako skôr a pridá sa 200 μΐ roztoku substrátu (1 tableta OPD/10 ml). Tableta OPD obsahuje dihydrochlorid o-fenyléndiamínu a peroxid vodíka pre tvorbu zafarbenia chrenovou peroxidázou a získa sa od Sigma, St. Louis, MO. Zmes sa inkubuje počas 30 minút pri teplote 15 až 30 °C v tme. Reakcia sa zastaví prídavkom 50 ml 4N roztoku kyseliny sírovej a misky sa odpočítajú pri vlnovej dĺžke 492 nm vzhľadom na absorbanciu pri 690 nm ako kontrole.

D. Výsledky

Výsledky rôznych esejí ukazujú tabuľky 5 a 6 znázorňujúce samostatné experimenty uskutočnené na vzorkách krvi exponovaných infekcii HCV. Šrafované plochy ukazujú detekciu vírusu. Ako sa ukazuje, kombinačná esej antigén/protilátka deteguje sérokonverziu vo všetkých vzorkách, zatiaľ čo všetky ostatné eseje založené na protilátke a antigéne aspoň v jednom zo vzoriek nedegekujú sérokonverziu. Konkrétne žiadna z esejí založených na protilátke nedegekuje prítomnosť HCV infekcie v deň 22. Navyše esej založená na antigéne Ortho nie je schopná detegovať sérokonverziu od dní 85 ďalej.

Preto je na základe opísaných výsledkov zrejmé, že nová kombinačná esej protilátka/antigén znižuje počet falošne negatívnych výsledkov získaných s použitím iných konvenčných esejí založených na protilátke a antigéne.

Tabuľka 5 - Sérokonverzia HCV

Dni	Abbott PRISM	Ortho 3.0	Roche Amplicor	Gen-Probe TMA	Ortho AG	Chiron Ag/Ab
0	0.1	0.0	•AxlO'	9,25	18,6	2,8
4	0.1	0.0	>5x10^{5 :}	9,29	19.0	3.1
7	0.1	0.0	>5x10^s	9.52	22,3	1,5
13	0.3	0.1	>5xl0⁵	9,59	26,2	1.7
18	1,3	0.4	>5xl0⁵	9,70	15.9	1.2
21	2,2	1.0	>5xl0⁵	9.39	11.3	1.5
164	4,2	43	4x10⁴	’ 9,28	0.11	2,5

Tabuľka 6 - Sérokonverzia HCV

Dni	Abbott PRISM	Ortho 3.0	Roche Amplicor	Gen-Probe TMA	Ortho AG	Chiron Ag/Ab
0	0,1	0,0	BLD		0,11	0,5
13	0,1	0,0	5x10’		44.0	3,0
20	0,1	0,0	>5xl0^s		24.2	1.3
22	0.3	0.0	>5x10’		29,2	'1,6··:/
85	.......M ......	4,7	BQR		0,06	1,1
131	4,3	4,7	BQR		0,09	1,0
135	4,6	4,7	3x10¹		0,09	1,2
138	5,5	4,7	BLD		0,08	1,2
146	5,9	.4,7	BLD		0,11	2,1
152	5.2	4,7	BQR		0,07	Ι.Χ

Príklad 2

Tvorba konformačného epitopu NS3/4a zo substitúciami Thr na Pro a Ser na íle

Konformačný epitop NS3/4a sa získa nasledujúcim spôsobom. Tento epitop má sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D a líši sa od natívnej sekvencie by poskytlo klonovacie miesto 5' HindlII nasledované sekvenciou ACAAACAAA, iniciátor ATG a kodóny HCV la počínajúc aminokyselinou 1027 s pokračovaním k miestu BglI aminokyseliny 1046, (b) reštrikčný fragment 683 bp Bgll-Clal (kódovacie aminokyseliny 1046 až 1274) z pAcHLTns3ns4aPI a (c) vektor pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL č. X65332, ktorý bol spracovaný HindlII a Clal, defosforylovaný a podrobený gélovej purifikácii. Plazmid pAcHLTns3ns4aPI sa odvodzuje od pAcHLT, vektoru bakulovírusovej expresie komerčne dostupného od BD Pharmingen (San Diego, CA). Konkrétne sa pripraví vektor pAcHLT EcoRI-PstI a nasledujúce fragmenty: EcoRI-Alwnl, 935 bp zodpovedajúci aminokyselinám 1027 až 1336 genómu HCV-1, Alwnl-SacII, 247bp zodpovedajúci aminokyselinám 1336 až 1419 genómu HSV-1, Hinfl-BglI, 175 bp zodpovedajúci aminokyselinám 1449 až 1509 genómu HSC-1, BglI-PstI, 619 bp zodpovedajúci aminokyselinám 1510až 1711 genómuHCV-1 plus transkripčný terminačný kodón. SacII-Hinfl odvodený fragment 91 bp zodpovedajúci aminokyselinám 1420 až 1448 genómu HCV-1 a obsahujúci mutácie PI (Thr-1428 mutovaný na Pro, Ser-1429 mutovaný na íle) sa liguje s fragmentom 175 bp Hinfl-BglI a fragmentom 619 bp BglI-PstI opísaným skôr a subklonuje do vektora pGEM-5Zf(+) spracovaného SacII a Pstl. pGEM-5Zf(+) je komerčne dostupný vektor E. coli (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Accession Number X65308). Po transformácii kompetentných buniek HB101 sa uskutočňuje miniskríning jednotlivých klonov a verifikácia sekvencie, fragment 885 bp SacII-PstI z pGEM5. PI klonu 2 sa čistí gélovou purifikáciou. Tento fragment sa liguje s EcoRI-Alwnl 935 bp fragmentom, Alwnl SacII 247 bp fragmentom a pAcHLT EcoRI-PstI opísaným vektorom. Výsledný konštrukt sa nazýva pAcHLTns3ns4aPI.

Ligačná zmes opísaná skôr sa transformuje do HB101 kompetentných buniek a nanesie na agarové dosky Luria obsahujúce 100 pg/ml ampicilínu. Analýzy miniprep jednotlivých klonov vedú k identifikácii predpokladaných pozitívnych vzoriek, z ktorých sa dva amplifikujú. Plazmid DNA pre pSP72 laHC, klony 1 a 2, sa pripravia s použitím súpravy Qiagen Maxiprep a sekvencuje.

Potom sa spolu ligujú nasledujúce fragmenty (a) 761 bp HindlII-Clal z pSP721aHC 1 [pSP72.1aHC sa tvoria ligáciou spolu s nasledujúcimi: pSP72 spracovaný HindlII a Clal, syntetické oligonukleotidy poskytujúce klonovacie miesto 5' HindlII, nasledované sekvenciou ACAAACAAA, iniciačný kodón ATG a kodóny HCVla, počínajúc aminokyselinou 1027 s pokračovaním k miestu BglII pri aminokyseline 1046 a 683 bp BglII-Clal reštrikčný fragment (kódovacie aminokyseliny 1046 až 1274) z pAcHLTns3ns4aPI], (b) 1353 bp BamHI-HindlII fragment pre kvasinkový hybridný promótor ADH2/GAPDH, (c) 1320 bp Clal-Sall fragment (kódujúci HCVla aminokyseliny 1046 až 1711 s Thr 1428 mutovaným na Pro a Ser 1429 mutovaným na íle) z pAcHLTns3ns4aPI a (d) pBS24.1 kvasinkový expresný vektor, ktorý je spracovaný BamHI a Sali, defosforylovaný a čistený gélovou purifikáciou. Ligačná zmes sa transformuje na kompetentnú HV101 a nanáša na agarové dosky Luria obsahujúce 100 pg/ml ampicilínu. Analýzy miniprep jednotlivých kolónií vedú k identifikácii klonov s očakávanou vloženou časťou 3446 bp BamHl-Sall, ktorá obsahuje ADH2/GAPDH promótor, iniciačný kodón ATG a HCVla NS3/4a z aminokyselín 1027 až 1711 (znázornené ako aminokyseliny 1 až 686 na obrázkoch 4A až 4D) s Thr 1428 (poloha aminokyseliny 403 na obrázkoch 4A až 4D) mutovaným na Pro a Ser 1429 (poloha aminokyseliny 404 na obrázkoch 4A až 4D) mutovaným na íle. Konštrukt sa nazýva pd.HCVla. ns3ns4aPI (pozri obrázok 5).

S. cerevisiae, kmeň AD3, sa transformuje pd.HCVla.ns3ns4aPI a jednotlivé transformanty sa overia ohľadom expresie po vyčerpaní glukózy v médiu. Rekombinantný proteín sa exprimuje pri vysokých hladinách v kvasinkách, ako sa deteguje farbením modrou Coomassie a overí imunoblotovacou analýzou s použitím polyklonálnej protilátky proti helikázovej doméne NS3.

Príklad 3

Purifikácia konformačného epitopu

Konformačný epitop NS3/4a sa purifikuje nasledujúcim spôsobom Bunky S. cerevisiae opísané skôr exprimujúce epitop NS3/4a sa zbierajú, ako sa opisuje. Bunky sa suspendujú v pufre pre cytolýzu (50 mM Trip pH 8,0, 150 mM chloridu sodného, 1 mM EDTA, 1 mM PMSD, 0,1 μΜ pepstatínu, 1 pM leupeptínu) a podrobia sa cytolýze v zariadení Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Švajčiarsko) alebo ekvivalentnej aparatúre s použitím sklenených guľôčok v pomere 1:1:1 bunky : pufor : sklenené guľôčky 0,5 mm. Lyzát sa centrifuguje pri 30 100 g počas 30 min. pri teplote 4 °C a peleta obsahujúca nerozpustnú proteínovú frakciu sa pridá k premývaciemu pufru (6 ml/g východiskovej hmotnosti pelety buniek) a zmes sa pomaly mieša nakláňaním pri teplote miestnosti počas 15 min. Premývaci pufor obsahuje koncentrácie 50 mM fosforečnanu sodného, pH 8,0, 0,3 M chloridu sodného, 5 mM β-merkaptoetanolu, 10 % glycerolu, 0,05 % oktylgukozidu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 pM pepstatínu, 1 pM leupeptínu. Zvyšky z rozpadnutých buniek sa odstránia centrifugáciou pri 30 100 g v priebehu 30 min. pri teplote 4 °C. Supematant sa odstráni do odpadu a peleta sa zachová.

Z pelety sa extrahuje proteín nasledujúcim spôsobom. Pridá sa 6 mg/g extrakčného pufra a zmes sa nakláňa pri teplote miestnosti počas 15 min. Extrakčný pufor obsahuje koncentráciu 50 mM Tris, pH 8,0, 1 M chloridu sodného, 5 mM β-merkaptoetanolu, 10 % glycerolu, 1 mM EDTA, 1 mM PSMF, 0,1 pM pepstatínu, 1 pM leupeptínu. Táto zmes sa centrifuguje pri 30 100 g počas 30 min. pri teplote 4 °C. Supematant sa zachová a pridá sa síran amónny do koncentrácie 17,5 % s použitím nasledujúceho vzorca: objem supematantu (ml) násobený x % síranu amónneho / (1-x % síranu amónneho) = ml 4,1 M nasýteného síranu amónneho na pridanie k supematantu. Síran amónny sa pridáva po kvapkách pri miešaní na ľade a roztok sa mieša na ľade počas 10 min. Roztok sa centrifuguje pri 17 700 g počas 30 min. pri teplote 4 °C a peleta sa zachová a ukladá pri teplote 2 až 8 °C počas až 48 h.

Peleta sa resuspenduje a aplikuje na kolónu Poly U (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) pri teplote 4 °C nasledujúcim spôsobom. Peleta sa resuspenduje v 6 ml Poly U ekvilibračného pufra na gram hmotnosti pelety. Ekvilibračný pufor obsahuje 25 mM HEPES, pH 8,0, 200 mM chloridu sodného, 5 mM DTT (pridáva sa čerstvý), 10 % glycerolu, 1,2 % oktylglukozidu. Roztok sa mieša nakláňaním pri teplote 4 °C počas 15 min. a centrifuguje pri 31 000 g počas 30 min. pri teplote 4 °C.

Pripraví sa stĺpec Poly U (1 ml živice na gram východiskovej hmotnosti pelety). Lineárny prietok je 60 cm/h a prietok náplne 133 % z 60 cm/h. Stĺpec sa upraví ekvilibračným pufrom a supematant resuspendovanej amónium-sulfátovej pelety sa nanesie na ekvilibrovanú kolónu. Kolóna sa premyje na východiskovú hodnotu ekvilibračným pufrom a proteín sa eluuje stupňovou elúciou v nasledujúcom elučnom pufre Poly U: 25 mM HEPES pH 8,0, IM chloridu sodného, 5 mM DTT (pridáva sa čerstvý), 10 % glycerolu, 1,2 % oktylglukozidu. Eluát z kolóny sa nanesie na SDS-PAGE (farbený Coomassie) a alikvóty sa zamrazia a uložia pri teplote -80 °C. Prítomnosť epitopu NS3/4a sa overí Westemovým blotovaním s použitím polyklonálnej protilátky zameranej proti NS3 proteázovej doméne a monoklonálnej protilátky proti 5-1-1 epitopu (HCV 4a).

Navyše sa monitoruje proteázová enzymatická aktivita v priebehu purifikácie nasledujúcim spôsobom. Peptid NS4A (KKGSWTVGRIVLSGKPAIIPKK) a vzorka obsahujúca konformačný epitop NS3/4a sa zriedi v 90 pl reakčného pufra (25 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M chloridu sodného, 0,5 mM EDTA, 10 % glycerolu, 0,05 % n-dodecyl B-D-maltozidu, 5 mM DTT) a nechá sa miešať počas 30 min. pri teplote miestnosti. 90 pl zmesi sa pridá do mikrotitračnej misky (Costar, Inc., Corning, NY) a pridá sa 10 pl HCV substrátu (AnaSpec, Inc., San Jose CA). Miska sa mieša a odpočíta sa čítacím zariadením Fluostar. Výsledky sa vyjadrujú ako relatívne fluorescenčné jednotky (RFU) za minútu.

Pri použití týchto spôsobov obsahuje produkt extrakcie 1 M roztokom chloridu sodného aktivitu 3,7 RFU/min., zrazenina síranu amónneho má aktivitu 7,5 RFU/min. a produkt purifikácie Poly U má aktivitu 18,5 RFU/min.

Príklad 4

Kompetičné štúdie

Nasledujúce kompetičné štúdie sa uskutočňujú na vyhodnotenie, či konformačný epitop NS3/4a deteguje rôzne protilátky alebo rôzne antigény HCV. Konkrétne sa porovnáva antigén NS3/4a s antigénom c200 nasledujúcim spôsobom.

0,5 pg a 1,0 pg NS3/4a získaného, ako sa opisuje skôr alebo c200 (Hepatology, 15, 19-25 (1992) od ORTHO HCV, Version 3.0 ELISA Test System, OrthoClinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) sa zmieša s 20 pl vzorky PHV914-5 (skorý sérokonverzný odber krvi získaný z krvi infikovaného jednotlivca) v celkovom objeme 220 pl (1 x PBS). Zmes sa inkubuje počas 1 h v mikrojamkách pri teplote 37 °C. Zmes sa prenesie na misky potiahnuté NS3/4a a inkubuje sa počas lh pri teplote 37 °C. Misky sa premývajú a analyzujú nasledujúcim spôsobom.

pg antigénu c200 sa pridá k 10 pl vzorky PHV914-5 v celkovom objeme zhruba 220 pl. Zmes sa inkubuje počas 1 h v mikrojamke pri teplote 37 °C a 200 pl sa prenesie na misku potiahnutú NS3/4a (100 ng/esej) a inkubuje sa počas 1 h pri teplote 37 °C. Misky sa premyjú päťkrát 1 x PBS, 0,1 % Tween-20. 200 pl roztoku konjugátu (podľa opisu) sa pridá a misky sa inkubujú a analyzujú. Kontroly obsahujúce PHV914-5 a 1 x PBS (bez antigénu) sa taktiež spracujú, ako sa opisuje.

Výsledky ukazuje tabuľka 7. Výsledky percenta inhibície v stĺpci 4 sa vypočítavajú ako hodnoty stĺpca 3 mínus (stĺpec 2 delený stĺpcom 3 krát 100). Ako je viditeľné, údaje ukazujú, že NS34a sa neutralizuje protilátkami skorej sérokonverzie a c200 v žiadnom prípade. Silný signál sa získa pri reakcii protilátok v člene súboru skorej sérokonverzie PHV914-5 c33c s poťahom NS34a na miske. Antigén c200 sa neneutralizuje týmito protilátkami. To je viditeľné vo vrchnej časti tabuľky 7. Keď sa NS34a zmieša so vzorkou PHV914-5, neutralizuje sa a preto nie sú vo vzorke prítomné žiadne protilátky, ktoré by reagovali s NS34a naneseným na mikromiske. Údaje ukazujú, že NS34a môže detegovať inú skupinu protilátok ako c200.

Tabuľka 7 - Kompetičné štúdie ukazujú detekciu rôznych protilátok v súbore skorej sérokonverzie c33c antigénom NS34a v porovnaní s antigénom c200

	1	2	3	4
			kontrola
C200	+	PHV914-5	lxPBS	% inhibície
		S	s
1 Hg		1,450	1,645	12
1 gg		1,545	1,687	8
0,5 pg		1,557	1,913	19
0,5 pg		1,719	1,804	5

NS3/4a	+	PHV914-5
		S	S
1 gg		0,054	1,599	97
1 gg		0,037	1,677	98
0,5 pg		0,066	1,672	96
0,5 pg		NA	1,524	NA

Príklad 5

Štúdie stability konformačného epitopu NS3/4a

Na vyhodnotenie úlohy stability epitopu NS3/4a pri uskutočnení eseje sa uskutočňuje nasledujúca štúdia zisťujúca imunoreaktivitu NS3/4a proti času pri teplote miestnosti. Malé alikvóty zásobného roztoku NS3/4a sa ponechajú v pokoji pri teplote miestnosti a potom sa zamrazia v časových intervaloch udaných v tabuľke 8. Všetky fľaštičky sa súčasne potiahnu a testujú proti dvom NS3 sérokonverzným súborom.

Ako ukazuje tabuľka 8, zásobná NS3/4a nie je stabilná a imunoreaktivita s časom klesá. Navyše je pre imunoreaktivitu nevyhnutné udržať konformáciu NS3/4a.

Ďalšie stabilitné štúdie sa uskutočňujú nasledujúcim spôsobom. Dve konformačné monoklonálne protilátky pripravené proti NS3/4a štandardnými spôsobmi sa substituujú pre skoré sérokonverzné súbory proti HCV. Zásobné fľaštičky NS3/4a sa uchovávajú pri teplote miestnosti v časových intervaloch 3, 6 a 24 h. NS3/4a zo zamrazených fľaštičiek sa poťahuje pri 90 ng/ml a podrobí analýze opísaným spôsobom. Výsledky ukazujú, že tieto dve monoklonálne látky sú skutočne konformačné a ich reaktivita je citlivá na zachádzanie so zásobným antigénom NS3/4a pri teplote miestnosti. Reaktivita pozitívnej kontroly monoklonálnej protilátky sa nemení.

Tabuľka 8

Čas (h)	0	6	21.4	29	35,5	46	52	Kontrola
	A	D	G	H	I	K	N	Referenčná
	s/co	s/co	s/co	s/co	s/co	s/co	s/co	s/co
PHV 904-1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 904-2	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 904-3	1,5	0.3	0,1	0,0	0,0	0,0	0,0	1,8
PHV 904-4	• iÄ/	1,0	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	4,4
PHV 904-5	4,8	2,0	0,7	0,6	0.3	0,2	0,3	5,5
PHV 904-6		2,8	1,1	1,0	0.6	0,5	0,6	5,8
PHV 904-7	5,1	3,4	1,5: :	1,0	1,1	0,5	0,7	5,4

PHV 914-1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 914-2	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 914-3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 914-4	0,5	0,1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,7
PHV 914-5	2.1	0,4	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	3,0
PHV 914-6	./ 2,3,..	0,4	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	3,4
PHV 914-7	2,8	0,5	0,1	0,1	0,0	0,0	0,0	4,9
PHV 914-8	2,9	0,7	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	4.9

Enzým
RFU/min.	8,75	4,14	3,08	1,88	1,75	1,75	0,75

Príklad 6

Imunoreaktivita konformačného epitopu NS3/4a v porovnaní s denaturovaným NS3/4a 5 Imunoreaktivita konformačného epitopu NS3/4a získaného podľa opisu sa porovnáva s NS3/4a denaturovaným prídavkom SDS do prípravku konformačného epitopu NS3/4a do konečnej koncentrácie 2 %. Denaturovaný NS3/4a a konformačný NS3/4a sa nanáša na mikrotitračné misky, ako sa opisuje. Na mikrotitračné misky sa taktiež nanáša antigén c200 [Hepatology, 15. 19-25 (1992) ORTHO, HCV Version 3,0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Dagnostics, Raritan, New Jersey], Antigén c200 sa používa na porovnanie a predpo10 kladá sa, že je nekonformačný vzhľadom na prítomnosť redukujúceho činidla (DTT) a detergentu (SDS).

Imunoreaktivita sa testuje proti dvom súborom skorej HCV sérokonverzie, PHV 904 a PHV 914 (komerčne dostupné vzorky ľudskej krvi od Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Výsledky ukazuje tabuľka 9. Údaje ukazujú, že denaturovaná alebo linearizovaná forma NS3/4a (rovnako tak ako c200) nedeteguje skoré sérokonverzné súbory tak skoro ako konformačný epitop NS3/4a.

Tabuľka 9

	NS3/4a proti denat. NS3/4a
	*NS3/4a + 2 % SDS
		NS3/4a	dNS3/4a*	c200	NS3/4a	dNS3/4a*	c200
		OD	OD	OD	s/co	s/co	s/co
HCV	PHV 904-1	0,012	0,012	0,009	0,02	0,02	0,01
Sérokonverzia	PHV 904-2	0,011	0,009	0,008	0,02	0,01	0,01
	PHV 904-3	1,124	0,071	0,045	1,80	0.11	0,07
	PHV 904-4	2,401	0,273	0,129	3,85	0.44	0,21
	PHV 904-5	3,022	0,793	0,347	4,85	1,28	0,57

	PHV 904-6	2,711	1,472	0,774	4,35	2,37	1,28
	PHV 904-7	3,294	1,860	0,943	5,28	2,99	1,55

	PHV 914-1	0,006	0,004	0,001	0,01	0,01	0,00
	PHV 914-2	0,005	0,004	0,002	0,01	0,01	0,00
	PHV 914-3	0,098	0,003	0,001	0,16	0,00	0,00
	PHV 914-4	1,118	0,006	0,004	1,79	0,01	0,01
	PHV 914-5	2,035	0,044	0,022	3,26	0,07	0,04
	PHV 914-6	2,092	0,074	0,025	3,35	0,12	0,04
	PHV 914-7	2,519	0,281	0,132	4,04	0,45	0,22
	PHV 914-8	2,746	0,907	0,500	4.40	1.46	0,82
	PHV 914-9	3,084	1,730	0,931	4.94	2,78	1,53

HCV 3.0	Neg. kont.	0,023	0,024	0,008
Kontroly	Neg. kont.	0,027	0,024	0,007
	Neg. kont.	0,021	0,017	0,005
	priemer	0,024	0,022	0,007
	odrezanie	0,624	0,622	0,607

	Poz. kont.	1,239	0,903	0,575	1,99	1,45	0,95
	Poz. kont.	1,445	0,916	0,614	2,32	1,47	1,01

Imunoreaktivita konformačného epitopu sa taktiež testuje s použitím monoklonálnych protilátok proti NS3/4a štandardnými spôsobmi. Tieto monoklonálne protilátky sa potom testujú v usporiadam ELISA proti NS3/4a a denaturovanému NS3/4a a antigénu c200. Údaje ukazujú, že monoklonálne protilátky proti NS3/4a reagujú s NS3/4a a denaturovaným NS3/4a podobným spôsobom ako so sérokonverznými súbormi, ako ukazuje tabuľka 10. Tento výsledok taktiež poskytuje ďalší dôkaz toho, že NS3/4a je svojou povahou konformačný, ako sa môžu stať monoklonálne protilátky, ktoré sú svojou reaktivitou podobné skorým sérokonverzným súborom c33c.

Tabuľka 10

Miska NS3/4a dNS3/4a c200
Monoklonálny		OD	OD	OD
4B9/E3	1:100	1,820	0,616	0,369
	1:1000	1,397	0,380	0,246
	1:10000	0,864	0,173	0,070
	1:20000	0,607	0,116	0,085
5B7/D7	1:100	2,885	0,898	0,436
	1:1000	2,866	0,541	0,267
	1:10000	1,672	0,215	0,086
	1:20000	1,053	0,124	0,059
1A8/H2	1:100	1,020	0,169	0,080
	1:1000	0,921	0,101	0,043
	1:10000	0,653	0,037	0,013
	1:20000	0,337	0,027	0,011

Opisujú sa nové eseje na detekciu HCV. Z opisuje potrebné si uvedomiť, že špecifické uskutočnenia tohto vynálezu tu slúžia iba na účely ilustrácie. Dajú sa uskutočniť rôzne modifikácie bez odchýlky od myšlien15 ky a obsahu vynálezu, ktorý sa tu opisuje.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Pevný nosič pre imunoeseje, vyznačujúci sa tým, že sa k nemu pripája aspoň jedna protilátka proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a aspoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a.
2. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa k nemu pripájajú aspoň dve protilátky proti jadru HCV.
3. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
4. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadra je zameraná proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
5. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že aspoň jednou protilátkou proti jadru je monoklonálna protilátka.
6. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že epitop NS3/4a je konformačný epitop a obsahuje sekvenciu aminokyselín znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
7. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje pripojený antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov.
8. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.
9. Pevný nosič pre imunoeseje, vyznačujúci sa tým, že sa k nemu pripájajú dve monoklonálne protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a HCV NS3/4a konformačný epitop zahŕňajúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
10. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sú tieto dve protilátky proti jadru zamerané proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
11. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sú tieto dve protilátky proti jadru zamerané proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
12. Pevný nosič pre imunoeseje, vyznačujúci sa tým, že sa k nemu pripájajú dve monoklonálne protilátky proti jadru vírusu C (HCV), HCV NS3/4a konformačný epitop zahŕňajúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D a antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.
13. Spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 1, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich HCV antigénom a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazať sa aspoň s jednou protilátkou proti jadru respektíve s epitopom NS3/4a, (c) pridanie pevného nosiča z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) antigénu, ktorý reaguje s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s antigénom (ii), (d) detekciu komplexov vytvorených protilátkami a antigénmi, ak k ich tvorbe dochádza, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
16. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky obsahuje epitop z oblasti c33c polyproteínu HCV.
17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že sa epitop c33c spája s aminokyselinovou sekvenciou ľudskej superoxid dismutázy (hSOD) a druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s touto aminokyselinovou sekvenciou hSOD.
18. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že epitop NS3/4a je konformačný epitop a zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
19. Spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 2, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali na aspoň dve protilátky proti jadru, respektíve epitop NS3/4a, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD, (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že epitop NS3/4a je konformačný epitop a obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
21. Spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 9, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali na aspoň dve protilátky proti jadru respektíve konformačný epitop NS3/4a, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV, ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD, (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že tieto aspoň dve protilátky proti jadru sú zamerané proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že aspoň dve protilátky proti jadru sú zamerané proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
24. Spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 7, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich HCV antigénom a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazať sa aspoň s jednou protilátkou proti jadru, epitopom NS3/4a a antigénom vzniknutým spojením viacerých epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) prvého a druhého antigénu, ktorý reaguje s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a respektíve s antigénom vzniknutým spojením viacerých epitopov a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s antigénmi (ii), (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ dochádza k ich tvorbe, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že táto aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a prvá detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV 1.
27. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že tento prvý antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky obsahuje epitop z oblasti c33c polyproteínu HCV.
28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že tento epitop c33c je spojený s aminokyselinovou sekvenciou ľudskej superoxid dismutázy (hSOD) a druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s touto aminokyselinovou sekvenciou hSOD.
29. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že tento druhý antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky obsahuje epitop z oblasti c22 polyproteínu HCV.
30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že epitop z oblasti c22 obsahuje aminokyseliny Lysio až Ser₉₉ polyproteínu HCV s deléciou Arg47 a substitúciou Leu namiesto Trp v polohe 44, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1, kde sa tento epitop spája s aminokyselinovou sekvenciou ľudskej superoxid dismutázy (hSOD) a druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s touto aminokyselinovou sekvenciou hSOD.
31. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že tento antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.
32. Spôsob detekcie infekcie vírusom C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 12, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali na aspoň dve protilátky proti jadru, konformačný epitop NS3/4a, respektíve antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV, ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a epitopu z oblasti c22 polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD, (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že tieto aspoň dve protilátky proti jadru sa zameriavajú proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a prvá detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV sa zameriava proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že aspoň dve protilátky proti jadru sú zamerané proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
35. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že epitop z oblasti c22 zahŕňa aminokyseliny Lysioaž Ser₉₉ polyproteínu HCV s deléciou Arg47 a substitúciou Leu namiesto Trp v polohe 44, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
36. Súprava na imunodiagnostické skúšky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje pevný nosič pre imunoeseje podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, a pokyny na uskutočňovanie imunodiagnostickej skúšky.
37. Spôsob prípravy pevného nosiča, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

(a) zaistenie pevného nosiča a (b) väzbu aspoň jednej protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a aspoň jedného izolovaného HCV NS3/4a konformačného epitopu.
38. Spôsob prípravy pevného nosiča pre imunoeseje, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

(a) zaistenie pevného nosiča a (b) väzbu dvoch protilátok proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a izolovaného HCV NS3/4a konformačného epitopu.
39. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 37 alebo 38, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa väzbu aspoň jedného antigénu vzniknutého spojením viacerých epitopov s pevným nosičom.