NO332275B1

NO332275B1 - Fast underlag for immunoanalyse, fremgangsmate for fremstilling derav, fremgangsmater for pavising av hepatitt C virus (HCV) infeksjon i en prove samt immunodiagnostisk testkit.

Info

Publication number: NO332275B1
Application number: NO20025878A
Authority: NO
Inventors: David Y Chien; Phillip Arcangel; Laura Tandeske; Carlos George-Nasciemento; Doris Coit; Angelica Medina-Selby
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2002-12-06
Publication date: 2012-08-13
Also published as: AU2001272945A1; JP2011125350A; CN1214244C; BRPI0111731C1; JP2004506878A; BRPI0111731B8; EP1350105A2; DE60125240T2; BR0111731A; CN1660913A; BRPI0111731B1; US6797809B2; US20020146685A1; WO2001096875A2; PL213363B1; US20040063092A1; US7241879B2; SK17772002A3; EP1354204A2; CZ304185B6

Abstract

Et HCV-kjerneantigen og NS3/4a-antistoff kombinasjonsanalyse som kan påvise både HCV- antigener og antistoffer som er tilstede i en prøve ved anvendelse av en enkelt fast matriks er tilveiebragt, så vel som fast underlag for immunoanalyse til anvendelse i analysen.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generalt viral diagnostikk. Nærmere bestemt vedrø-rer oppfinnelsen et fast underlag for immunoanalyse, en fremgangsmåte for fremstilling av dette, fremgangsmåter for påvisning av av hepatitt C virus (HCV) infeksjon i en biologisk prøve samt et immunodiagnostisk testkit.

Bakgrunn

Hepatitt C Virus (HCV) er hovedårsaken til paranteral ikke-A, ikke-B hepatitt (NANABH) som i stor grad overføres ved blodoverføring og seksuell kontakt. Viruset er til stede hos 0.4 til 2.0 % av blodgiverne. Kronisk hepatitt utvikles i omring 50 % av infeksjonene og av disse utvikler tilnærmet 20 % av de infiserte individene levercirrho-se som av og til fører til hepatocellulært karsinom. Følgelig er studie og kontroll av sykdommen av medisinsk betydning.

HCV ble først påvist ogkarakterisertsom en årsak til NANABH av Houghten et al. Den virale genomsekvensen til HCV er kjent, som også fremgangsmåter til oppnåelse av sekvensen. Se f. eks. internasjonal publikasjon WO 89/04669, WO 90/11089 og WO 90/14436. HCV har et 9.5 kb positiv-sens, enkelttrådet RNA-genom og er medlem av Flaviridae virusfamilien. Minst 6 distinkte, men beslektede genotyper av HCV, basert på fylogenetisk analyser, er påvist (Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74: 2391-2399). Virusene koder for et enkelt polyprotein som har flere enn 3000 aminosyreresidier (Choo et al, Science (1989) 244:359-362, Choo et al., Proe. Nati. Acad Sei. USA

(1991) 88: 2451-2455, Han et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1991) 88: 1711-1715). Polyproteinet prosesseres ko- og post-translasjonelt til både strukturelle og ikke-strukturelle (NS, "non-structural") proteiner.

Spesielt, slik som vist i figur 1, kodes flere proteiner av HCV-genomet. Rekkefølgen og nomenklaturen til spaltingsproduktene av HCV-polyproteinet er følgende: NH2-C-EI-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Intiell spalting av polyproteinet katalyseres av vertsproteaser som frigir tre strukturelle proteiner, det N-terminale nukleo-kapsidproteinet (betegnes "kjerne") og to kappe-glykoproteiner, "El" (som også er kjent som E) og "E2" (som også er kjent som E2/NS1) så vel som ikke-strukturelle proteiner som inneholder de virale enzymene. NS-områdene betegnes NS2, NS3, NS4 og NS5. NS2 er et integralt membranprotein med proteolytisk aktivitet. NS2, enten alene eller i kombinasjon med NS3, spalter NS2-NS3 "sissle"-bindingen som deretter genererer NS3 N-terminalen og frigir et stort polyprotein som omfatter både serinprotease og RNA helikase-aktiviteter. NS3-proteasen hjelper å prosessere det resterende polypeptidet. Fullføring av polyproteinmodning initieres av autokatalytisk spalting i NS3-NS4a koblingen som katalyseres av NS3 serinproteasen. Påfølgende NS3-medierte spaltninger av HCV polyproteinet synes å omfatte gjenkjenning av polyproteinspaltningskoblingen av et NS3 molekyl fra et annet polypeptid. I disse reaksjonene frigir NS3 en NS3-kofaktor (NS4a), to proteiner (NS4b og NS5a) og en RNA-avhengig RNA-polymerase (NS5b).

Et uttall av generelle og spesifikke polypeptider som er nyttige som immunologiske og diagnostiske reagenser for HCV, avledet fra HCV-polyproteinet er beskrevet. Se f. eks. Houghton et al, Europeisk publikasjon 318 216 og 388 232, Choo et al, Science (1989) 244: 359-362, Kuo et al, Science (1989) 244: 362-364, Houghton et al, Hepatology

(1991) 14: 381-388, Chien et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1992) 89: 10011-10015, Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39, Chien et al., Internasjonal publikasjon WO 93/00365, Chien, D. Y., Internasjonal publikasjon WO 94/01778. Disse publi-kasjonene sørger for en utstrakt bakgrunn om HCV generelt, så vel som fremstillingen og anvendelsene av HCV-polypeptid immunologiske reagenser.

Sensitive, spesifikke fremgangsmåter for screening og påvisning av bærere av HCV og HCV-kontaminert blod eller blodprodukter, vil være et viktig medisinsk fremskritt. Posttransfusjons hepatitt (PTH) oppstår i tilnærmet 10 % av de transfuserte pasientene og HCV har utgjort opp til 90 % av disse tilfellene. Pasientpleie, så vel som forebyg-gingen og overføringen av HCV med blod og blodprodukter eller ved nær personlig kontakt, krever pålitelig diagnostisk og prognostisk verktøy. Følgelig er flere analyser til serodiagnostisering av HCV-infeksjon utviklet. Se f. eks. Choo et al., Science (1989) 244: 359-362, Kuo et al, Science (1989) 244: 362-364, Choo et al, Br. Med. Bull.

(1990) 46: 423-441, Ebeling et al, Lancet (1990) 335: 982-983, van der Poel et al, Lancet (1990) 335: 558-560, van der Poel et al, Lancet (1991) 337: 317-319, Chien D. Y., internasjonal publikasjon WO 97/44469 og Kashiwakuma et al., US patent 5 871 904.

WO 0007023 Al og EP1020727 Al beskriver et assay for deteksjon av HCV i en biologisk prøve ved anvendelse av et fast underlag (mikrotiterplate) omfattende HCV kjerneantigen og HCV kjerne antistoff. Antigenet CEPM, er et fusjonspeptid bestående av flere deler av HCV genomet.

Et betydelig problem som man støter på med noen serumbaserte analyser, er at det er en betydelig avstand mellom infeksjon og påvisning av viruset, ofte mer enn 80 dager. Denne avstanden i analysen kan skape en stor risiko for blodoverførings resipienter. For å overvinne dette problemet, er det utviklet nukleinsyrebaserte tester (NAT) som påviser viralt RNA direkte og HCV kjerne-antigentester som analyserer virale antigener i stedet for antistoff-respons. Se f. eks. Kashiwakuma et al., US patent 5 871 904, Beid et al, Transfusion (2000) 40: 575-579.

Det gjenstår imidlertid et behov for sensitiv, nøyaktig diagnostisk og prognostisk verk-tøy for å sørge for adekvat pasientpleie, så vel som for å forebygge overføring av HCV med blod og blodprodukter eller ved nær personlig kontakt.

O ppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter fast underlag for immunoanalyse kjenntegnet ved

at det omfatter minst et hepatitt C virus (HCV) anti-kjerne antistoff og minst en isolert HCV NS3/4a-epitop bundet dertil hvori nevnte NS3/4a-epitop er et konformasjonsepitop og omfatter aminosyresekvensen vist i figurene 4 A-4D.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte til påvisning av hepatitt C virus (HCV)-infeksjon i en biologisk prøve kjenntegnet ved at nevnte fremgangsmåte omfatter å

(a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 1,

(b) kombinere en biologisk prøve med nevnte faste underlag under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er til stede i den biologiske prøven, å binde til henholdsvis nevnte minst ene anti-kjerne antistoff og nevnte NS3/4a epitop, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i)

et første detekterbart merket antistoff, hvori nevnte første detekterbart merkede antistoff er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori nevnte merkede anti-kjerne antistoff er rettet mot et annet HCV kjerne-epitop enn det minst ene anti-kjerne antistoffet som er bundet til det faste underlaget, (ii) et antigen som reagerer med et HCV-antistoff fra den biologiske prøven reaktivt med nevnte NS3/4a-epitop og (iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori nevnte andre detekterbare merkede antistoff er reaktivt med antigenet i (ii),

(d) påvisning av komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom

noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

Omfattet av oppfinnelsen er også fremgangsmåte til påvisning av hepatitt C virus (HCV)-infeksjon i en biologisk prøve kjennetegnet ved at nevnte fremgangsmåte omfatter å

(a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 2,

(b) kombinere en biologisk prøve med nevnte faste underlag under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er til stede i den biologiske prøven, å binde til henholdsvis nevnte minst to anti-kjerne antistoffer og nevnte NS3/4a konformasjonsepitop, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i)

et første detekterbart merket antistoff, hvori nevnte første detekterbart merkede antistoff er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori nevnte merkede anti-kjerne antistoff er rettet mot en annen HCV kjerne-epitop enn de i det minste to anti-kjerne antistoffene som er bundet til det faste underlaget, (ii) en epitop fra c33c-området i HCV polyproteinet som er fusert til en hSOD-aminosyresekvens og (iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori nevnte andre detekterbare merkede antistoff er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvens,

noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte til påvisning av hepatitt C virus (HCV)-infeksjon i en biologisk prøve kjennetegnet ved at nevnte fremgangsmåte omfatter å

(a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 6,

(b) kombinere en biologisk prøve med nevnte faste underlag under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er til stede i den biologiske prøven, å binde til nevnte minst ett anti-kjerne antistoff, nevnte NS3/4a konformasjonsepitop og

nevnte multiple epitop fusjonsantigen,

(c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i)

et første detekterbart merket antistoff, hvori nevnte første detekterbart merkede antistoff er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori nevnte merkede anti-kjerne antistoff er rettet mot en annen HCV kjerne-epitop enn det i det minste ene anti-kjerne antistoffene som er bundet til det faste underlaget, (ii) første og andre antigener som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven reaktiv med henholdsvis nevnte NS3/4a epitop og nevnte multiple epitop fusjonantigen (iii) et andre detekterbart antistoff hvori nevnte detekterbare antistoff er reaktivt med antigenene i (ii),

noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte til påvisning av hepatitt C virus (HCV)-infeksjon i en biologisk prøve kjennetegnet ved at nevnte fremgangsmåte omfatter å

(a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 8,

(b) kombinere en biologisk prøve med nevnte faste underlag under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er til stede i den biologiske prøven, å binde til henholdsvis nevnte minst to anti-kjerne antistoffer, nevnte NS3/4a konformasjonsepitop og nevnte multiple epitopfusjonsantigen, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i)

et første detekterbart merket antistoff, hvori nevnte første detekterbart merkede antistoff er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori nevnte merkede anti-kjerne antistoff er rettet mot en annen HCV kjerne-epitop enn de minst to anti-kjerne antistoffer bundet til det faste underlaget, (ii) en epitop fra c33c regionen til HCV polyproteinet fusert til en hSOD aminosyresekvens og en epitop fra c22 regionen til HCV polyproteinet fusert til en hSOD aminosyresekvens og iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori nevnte andre detekterbare merkede antistoff er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvenser,

noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

Omfattet av oppfinnelsen er også immunodiagnostisk testkit kjennetegnet ved at det omfatter det faste underlaget for immunoanalyse ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 og bruksanvisning for utførelse av immunodiagnostikk-testen.

Foreliggende oppfinnelse er delvis basert på funnet av at HCV-serokonversjons antistoffer er typisk anti-kjerne og anti-NS3 (helikase). Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen en HCV kjerneantigen og NS3 antistoff-kombinasjonsanalyse som kan påvise både HCV-antigener og antistoffer som er tilstede i en prøve ved anvendelse av en eneste fast matriks.

Derfor er foreliggende oppfinnelse, i en utførelsesform, rettet mot et fast underlag for immunoanalyse som omfatter minst et HCV anti-kjerne antistoff og minst en isolert HCV NS3/4a epitop bundet til det. Antistoffet og NS3/4a-epitopen kan være hvilket som helst av molekylene som er beskrevet heri. I tillegg kan det faste underlaget omfatte hvilke som helst av de multiple epitop-fusjonsantigenene som er beskrevet heri, slik at det multiple epitopfusjonsantigenet omfatter aminosyresekvensen som er vist i figurene 7A - 7F.

I visse utførelsesformer omfatter det fast underlaget minst to HCV anti-kjerneantistoffer bundet dertil. Anti-kjerneantistoffet kan dessuten være et monoklonalt antistoff. I tillegg kan NS3/4a-epitopen være en konformasjonsepitop, slik som en konformasjons NS3/4a-epitop som omfatter aminosyresekvensen som er vist i figurene 4A - 4D.

I en annen utførelsesform er oppfinnelsen rettet mot et fast underlag for immunologisk analyse som omfatter minst to HCV anti-kjerne monoklonale antistoffer og minst en HCV NS3/4a konformasjonell epitop som omfatter aminosyresekvensen som er vist i figurene 4A - 4D bundet dertil.

Fremgangsmåte for påvisning av HCV-infeksjon i en biologisk prøve kan utføres som følger. Fremgangsmåten omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse slik som beskrevet over, (b) kombinere en biologisk prøve med det fast underlaget under betingelser som tillater HCV-antigener og antistoffer, når de er tilstede i den biologiske prøven, å binde til henholdsvis minst et anti-kjerne antistoff og NS3/4a-epitopen, (c) tilsette det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart merket antistoff, hvori det første detekterbart merkede antistoffet er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori det merkede anti-kjerne antistoffet er rettet mot en annen HCV kjerne-epitop enn det minst ene anti-kjerne antistoffet som er bundet til det faste underlaget, (ii) et antigen som reagerer med et HCV-antistoff fra den biologiske prøven som er reaktiv med NS3/4a-epitopen og (iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori det andre detekterbart merkede antistoffet er reaktivt med antigenet fra (ii) og (d) påvise komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven. NS3/4a-epitopen kan være en konformasjonsepitop, slik som en konformasjonsepitop som har sekvensen til NS3/4a, som vist i figurene 4A - 4D.

En annen mulig måte er en en fremgangsmåte for påvisning av HCV-infeksjon i en biologisk prøve. Fremgangsmåten omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag for en immunoanalyse med minst to HCV antikjerne antistoffer bundet dertil slik som beskrevet over, (b) kombinere en biologisk prøve med det faste underlaget under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er tilstede i den biologiske prøven, å binde til de henholdsvis minst to antikjerne antistoffene og NS3/4a-epitopen, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart antistoff, hvori det første merkede anti-kjerne antistoffet er rettet mot en forskjellig HCV-kjerneepitop enn anti-kjerne antistoffene som er bundet til det faste underlaget, (ii) en epitop fra c33c regionen i HCV polyproteinet som er fusert med en hSOD aminosyresekvens og (iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori det andre detekterbart merkede antistoffet er reaktivt med hSOD aminosyresekvensen og (d) påvise komplek ser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven. NS3/4a-epitopen kan være en konformasjonsepitop, slik som en konformasjonsepitop som har NS3/4a-sekvensen slik som angitt i figurene 4A - 4D.

I hvilket som helst av de ovennevnte utførelsesformene kan anti-kjerne antistoffet være rettet mot et N-terminalt område i HCV kjerne-antigenet, slik som mot aminosyrene 10-53 i HCV, som er nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen og/eller det detekterbart merkede HCV antikjerne antistoffet kan være rettet mot et C-terminalt område i HCV kjerneantigenet, slik som aminosyrer 120-130 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen. Dessuten kan antigenet som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven være fra NS3 regionen, slik som en epitop fra c33c regionen i HCV polyproteinet og kan være fusert med en human superoksid dismutase (hSOD) aminosyresekvens. I denne utførelsesformen er det andre detekterbart merkede antistoffet reaktivt med hSOD aminosyresekvensen.

En fremgangsmåte til påvisning av HCV-infeksjon i en biologisk prøve kan også gjøre som følger: Fremgangsmåten omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse som inkluderer to HCV anti-kjerne monoklonale antistoffer og en konformasjonsepitop som omfatter aminosyresekvensen som er angitt i figurene 4A - 4D, (b) kombinere en biologisk prøve med det faste underlaget under betingelser som tillater HCV-antigener og antistoffer, når de er tilstede i den biologiske prøven, å binde minst til henholdsvis to anti-kjerne antistoffer og NS3/4a konformasjonsepitopen, tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart merket antistoff, hvori det første detekterbart merkede antistoffet er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori det merkede anti-kjerne antistoffet er rettet mot en annen HCV kjerne-epitop enn de minst to anti-kjerne antistoffene som er bundet til det faste underlaget, (ii) en epitop fra c33c regionen i HCV polyproteinet fusert til en hSOD aminosyresekvens og (iii) et andre detekterbart merket antistoff hvori det andre detekterbart merkede antistoffet er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvens, påvise komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

I visse utførelsesformer er minst de to anti-kjerne antistoffene rettet mot et N-terminalt område i HCV kjerneantigenet, slik som mot aminosyrene 10 - 53 i HCV, nummerert i forhold til HCV polyproteinet og det detekterbart merkede HCV anti-kjerne antistoffet er rettet mot et C-terminalt område i HCV kjerne antigenet slik som mot aminosyrer 120 - 130 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen.

Også følgende fremgangsmåte til påvisning av HCV-infeksjon i en biologisk prøve er

mulig. Fremgangsmåten omfatter (a) å tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse som omfatter et multippelt epitopfusjonsantigen, (b) kombinere en biologisk prøve med det faste underlaget under betingelser som tillater HCV-antigener og antistoff, når de er tilstede i den biologiske prøven, å binde til det i det minste ene kjerne antistoffet, NS3/4a epitopen og det multiple epitopfusjonsantignet, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart merket antistoff, hvori det første detekterbart merkede antistoffet er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori det merkete anti-kjerne antistoffet er rettet mot en forskjellig HCV kjerne-epitop enn det i det minste ene anti-kjerne antistoffet som er bundet til det faste underlaget, (ii) henholdsvis første og andre antigener som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven som er reaktiv med NS3/4a epitopen og det multiple epitopfusjonsantigenet og (iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori det andre detekterbart merkede antistoffet er reaktivt med antigenene i (ii), (d) påvise komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

Anti-kjerne antistoffet kan være rettet mot et N-terminalt område i HCV kjerneantigenet og nevnte første detekterbart merkede HCV anti-kjerne antistoff kan være rettet mot et C-terminalt område i HCV kjerneantigenet slik som beskrevet over. Dessuten kan det første antigenet som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven omfatte en epitop fra c33c-området i HCV polyproteinet og kan være fusert med en hSOD aminosyresekvens. I denne sammenhengen er det andre detekterbart merkede antistoffet reaktivt med hSOD aminosyresekvensen. I tillegg kan det andre antigenet som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven omfatte en epitop fra c22-området i HCV polyproteinet, slik som en epitop som omfatter aminosyrene Lysiotil Ser99i HCV polyproteinet med en delesjon av Arg47 og en substitusjon av Trp med Leu i posisjon 44, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen. Epitopen kan være fusert med en hSOD aminosyresekvens. Dersom det er tilfellet, er det andre detekterbart merkede antistoffet reaktivt med aminosyresekvensen til hSOD. Det multiple fusjonsantigenet kan omfatte aminosyresekvensen som er angitt i figurene 7A - 7F.

En annen fremgangsmåte til påvisning av HCV-infeksjon i en biologisk prøve kan være, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter (a) å tilveiebringe et fast underlag for immunoana lyse som omfatter to HCV anti-kjerne monoklonale antistoffer, en HCV NS3/4a konformasjonsepitop som omfatter aminosyresekvensen som er angitt i figurene 4 A - 4D og et multippelt epitopfusjonsantigen som omfatter aminosyresekvensen som er angitt i figurene 7A - 7F bundet dertil, (b) kombinere en biologisk prøve med det faste underlaget under betingelser som muliggjør at HCV antigener og antistoffer, når de er tilstede i samme biologisk prøve, binder henholdsvis til de minst to anti-kjerne antistoffene, NS3/4a konformasjonsepitopen og det multiple epitopfusjonsantigenet, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart merket antistoff, hvori det første detekterbart merkede antistoffet er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori det merkede anti-kjerne antistoffet er rettet mot en annen HCV kjerne epitop enn de minst to anti-kjerne antistoffene som er bundet til det fast underlaget, (ii) en epitop fra c33c-området i HCV polyproteinet som er fusert til en hSOD aminosyresekvens og en epitop fra c22-området i HCV polyproteinet som er fusert til en hSOD aminosyresekvens og (iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori nevnte andre detekterbart merkete antistoff er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvens, (d) påvise komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologisk prøven.

I denne utførelsesformen kan de minst to anti-kjerne antistoffene være rettet mot et N-terminalt område i HCV kjerneantigenet, slik som mot aminosyrene 10 - 53 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinet og det detekterbart merkede HCV anti-kjerne antistoffet er rettet mot et C-terminalt område i HCV kjerneantigenet, slik som mot aminosyrene 120 - 130 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen. Dessuten kan epitopen fra c22 området omfatte aminosyrer Lysiotil Ser99i HCV polyproteinet med en delesjon av Arg47 og en substitusjon av Trp med Leu i posisjon 44, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen.

I andre utførelsesformer er oppfinnelsen rettet mot immunodiagnostiske testkit som omfatter det faste underlaget for immunoanalyse slik som beskrevet over, og instruksjoner for utføringen av den immunodiagnostiske testen.

I enda en ytterligere utførelsesform, er oppfinnelsen rettet mot fremgangsmåter for fremstilling av et fast underlag for immunoanalyse som omfatter (a) å tilveiebringe et fast underlag og (b) binde minst et HCV anti-kjerne antistoff og minst en isolert HCV NS3/4a konformasjonsepitop dertil som har aminosyresekvensen vist i figurene 4A-4D dertil.

I nok en utførelsesform omfatter fremgangsmåten til fremstilling av et fast underlag for immunoanalyse (a) å tilveiebringe et fast underlag og (b) binde minst to hepatitt C virus (HCV) anti-kjerne antistoffer og en isolert HCV NS3/4a konformasjonsepitop som har aminosyresekvensen vist i figurene 4A-4D dertil.

Anti-kjerne antistoffene, NS3/4a epitopene og multiple epitopfusjonsantigener er slik som beskrevet over.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 er en skjematisk presentasjon av HCV-genomet, som angir de ulike områdene i polyproteinet hvorfra de foreliggende analysereagenser (proteiner og antistoffer) er avledet. Figur 2 er en skjematisk tegning av en representativ antistoff/antigen kombinasjonsanalyse ifølge oppfinnelsen. Figur 3 angir aminosyresekvensen til et representativ NS3/4a konformasjonsantigen til anvendelse i de foreliggende analysene. Den native serin som normalt er til stede i posisjon 182 er substituert med den uthevde alanin. Figurene 4A til D angir DNA og korresponderende aminosyresekvens til et annet re-presentativt NS3/4a konformasjonsantigen til anvendelse i de foreliggende analysene. Aminosyrene i posisjonene 403 og 404 i figurene 4A til 4D representerer substitusjoner av Thr med Pro og Ser med Ile i den native aminosyresekvensen til HCV-1.

Figur 5 er et diagram av konstruksjonen av pd.HCVla.ns3ns4aPI.

Figur 6 er en skjematisk presentasjon av MEFA 12.

Figurene 7A - 7F angir DNA og korresponderende aminosyresekvens til MEFA 12. Figur 8 er en skjematisk tegning av en representativ immunoanalyse ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av MEFA 12.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Utførelsen av oppfinnelsen vil benytte, dersom ikke annet er angitt, konvensjonelle kjemiske, biokjemiske, rekombinante DNA-teknikker og immunologiske fremgangsmåter som er innenfor kunnskapen til fagmannen på området. Slike teknikker er fullstendig forklart i litteraturen. Se f. eks. Fundamental Virology, 2<nd>Edition, vol I & II (B. N. Fields og D. M. Knipe, eds.), Handbook of Experimental Immunology, vols. I - IV (D. M. Weir og C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications), T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), A. L. Lehninger, Biochemsitry (Worth Publishers, Inc., current addition), Sambrook et. al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (andre utgave, 1989) Methods In Enzymolo-gy (S. Colowick og N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Det må bemerkes at i foreliggende beskrivelse og de vedlagte kravene, omfatter de ube-stemte og bestemte entallsformene også flertallsformene dersom innholdet ikke lydelig tilsier annet. Derfor omfatter for eksempel referanse til "et antigen" en blanding av to eller flere antigener og liknende.

Følgende aminosyreforkortelser er anvendt gjennom hele teksten:

I. Definisjoner

Ved beskrivelse av foreliggende oppfinnelse, vil de følgende betegnelser bli benyttet, og er ment å defineres slik som angitt nedenfor.

Betegnelsen "polypeptid" og "protein" refererer til en polymer av aminosyreresidier og er ikke begrenset til en minimumslengde av produktet. Derfor er peptider, oligopeptider, dimerer, multimerer og liknende inkludert i definisjonen. Både fullengde proteiner og fragmenter derav er omfattet av definisjonen. Betegnelsen inkluderer også postekspresjons modifiseringer av polypeptidet, for eksempel glykosylering, acetyle-ring, fosforylering og liknende. Dessuten med hensyn til foreliggende oppfinnelse, refererer et "polypeptid" til et protein som inkluderer modifiseringer, slik som delesjoner, addisjoner og substitusjoner (stort sett konservative av natur), av den native sekvensen så lenge proteinet opprettholder den ønskede aktiviteten. Disse modifiseringene kan være tilsiktede som gjennom seterettet mutagenese eller kan være tilfeldige slik som ved mutasjoner av verter som produserer proteinene eller feil på grunn av PCR-amplifisering.

Et HCV-polypeptid er et polypeptid slik som definert over, som er avledet fra HCV polyproteinet. Polypeptidet trenger ikke være fysisk avledet fra HCV, men kan være syntetisk eller rekombinant fremstilt. Dessuten kan polypeptidet være avledet fra hvilke som helst av de ulike HCV-stammene, slik som fra stamme 1, 2, 3 eller 4 av HCV. Et antall konserverte og variable områder er kjent mellom disse stammene og stort sett vil aminosyresekvensene til epitoper som er avledet fra disse områdene ha en høy grad sekvenshomologi, f. eks. aminosyresekvenshomologi på mer enn 30 %, fortrinnsvis mer enn 40 % når de to sekvensene stilles opp. Derfor refererer for eksempel betegnelsen "NS3/4a" polypeptid til nativt NS3/4a fra hvilken som helst av de ulike HCV-stammene så vel som NS3/4a-analoger, muteiner og immunogene fragmenter slik som definert lenger nede. De fullstendige genotypene til mange av disse stammene er kjente. Se f. eks. US patent 6 150 087 og GenBank aksesjonsnummer AJ238800 og AJ238799.

Betegnelsen "analog" og "mutein" refererer til biologisk aktive derivater av referanse-molekylet eller fragmenter av slike derivater som beholder ønsket aktivitet, slik som immunoreaktivitet i analysen som er beskrevet heri. Stort sett refererer betegnelsen "analog" til forbindelser som har en nativ polypeptidsekvens og struktur med en eller flere aminosyreaddisjoner, substitusjoner (stort sett konservative av natur) og/eller delesjoner, relativt til det native molekylet, så lenge modifiseringene ikke ødelegger immu-nogen aktivitet. Betegnelsen "mutein" refererer til peptider som har en eller flere pep-tidetterlignere ("peptoider"), slik som de som er beskrevet i internasjonal publikasjon WO 91/04282. Fortrinnsvis har analogen eller muteinet minst samme immunoaktivitet som det native molekylet. Fremgangsmåter til laging av polypeptidanaloger og muteiner er kjent innen fagområdet og er beskrevet lenger nede.

Spesielt viktige analoger omfatter substitusjoner som er konservative av natur, dvs. de substitusjonene som foregår innen en aminosyrefamilie som har beslektede sidekjeder. Spesifikt er aminosyrer stort sett delt i fire familier: (1) sure - aspartat og glutamat, (2) basiske - lysin, arginin, histidin, (3) ikke-polare - alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin, tryptofan og (4) uladete polare - glycin, asparagin, glutamin, cy-stein, serin, treonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan og tyrosin klassifiseres noen ganger som aromatiske aminosyrer. For eksempel er det rimelig forutsigbart at en isolert erstatning av leucin med isoleucin eller valin, en aspartat med en glutamat, en treonin med en serin eller en liknende konservativ erstatning av en aminosyre med strukturelt beslektet aminosyre, ikke vil ha større effekt på den biologiske aktiviteten. For eksempel kan polypeptidet av interesse inkludere opp til omkring 5-10 konservative eller ikke-konservative aminosyresubstitusjoner eller til og med opp til omkring 15-25 konservati ve eller ikke-konservative aminosyresubstitusjoner eller et hvilket som helst helt tall mellom 5-25, så lenge molekylets ønskede funksjonen forblir intakt. En fagmann på området kan enkelt bestemme områder i molekylet av interesse som kan tolerere endring, med referanse til Hopp/Woods og Kyte-Doolittle plott som er velkjent innen fagområdet.

Med "fragment" er ment et polypeptid som kun delvis består av den intakte fullengde polypeptidsekvensen og struktur. Fragmentet kan omfatte en C-terminal delesjon og/eller en N-terminal delesjon av det native polypeptidet. Et "immunogent fragment" av et spesielt HCV-protein vil stort sett inkludere minst omkring 5-10 sammenhengende aminosyreresidier fra fullengde molekylet og mer foretrukket minst omkring 15-25 sammenhengende aminosyreresidier fra fullengde molekylet og mest foretrukket minst omkring 20-50 eller flere sammenhengende aminosyreresidier fra fullengde molekylet som definerer en epitop, eller et helt tall mellom 5 aminosyrer og fullengdesekvensen, forutsatt at det aktuelle fragmentet bevarer immunoreaktivitet i analysene som er beskrevet heri. For eksempel omfatter foretrukne immunogene fragmenter, men er ikke begrenset til, fragmenter med HCV-kjerne som omfatter f. eks. aminosyrer 10-45,10-53, 67-88 og 120-130 i polyproteinet, epitop 5-1-1 (i NS3 området fra det virale genomet) så vel som definerte epitoper som er avledet fra El, E2, c33c (NS3), cl00 (NS4), NS3/4a og NS5 områder i HCV-polyproteinet så vel som hvilken som helst av de andre ulike epitopene som er påvist fra HCV polyproteinet. Se f. eks. Chien et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1992) 89: 10011-10015, Chien et al, J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39, Chien et al., Internasjonal publikasjon WO 93/00365, Chien, D. Y., Internasjonal publikasjon WO 94/01778, US patent 6 150 087 og 6 121 020.

Betegnelsen "epitop" slik som anvendt heri refererer til en sekvens på minst omkring 3 til 5, fortrinnsvis omkring 5 til 10 eller 15 og ikke mer enn omkring 1000 aminosyrer (eller hvilket som helst helt tall derimellom) som angir en sekvens som i seg selv, eller som en del av en større sekvens, binder til et antistoff som er generert i respons på slik sekvens. Det finnes ingen kritisk øvre grense for fragmentets lengde, som kan omfatte nesten fullengden av proteinsekvensen eller til og med et fusjonsprotein som omfatter to eller flere epitoper fra HCV polyproteinet. En epitop til anvendelse i foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til et polypeptid som har den eksakte sekvensen til delen av foreldre proteinet som det er avledet fra. Faktisk er virale genomer i en tilstand av konstant flux og inneholder flere variable domener som gir relativt høye grader av variasjon mellom isolater. Derfor omfatter betegnelsen "epitop" sekvenser som er identisk med den native sekvensen, så vel som modifiseringer i den native sekvensen, slik som delesjoner, addisjoner og substitusjoner (stort sett konservative av natur).

Områder i et gitt polypeptid som omfatter en epitop kan identifiseres ved anvendelse av hvilket som helst av uttallige epitop-kartleggings teknikker som er velkjent innen fagområdet. Se f. eks. Epitop Mapping Protocols i Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. For eksempel kan lineære epitoper bestemmes ved f. eks. samtidig å syntetisere store antall peptider på faste underlag, hvor peptidene korresponderer til deler av proteinmolekylet og reagere peptidene med antistoffer mens peptidene fremdeles er festet til underlagene. Slike teknikker er kjent innen fagområdet og beskrevet i f. eks. US patent 4 708 871, Geysen et al. (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 3998-4002, Geysen et al. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 178-182, Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. Ved anvendelse av slike teknikker har mange HCV-epitoper blitt påvist. Se f. eks. Chien et al. Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) s. 320-324 og videre nedenfor. På liknende måte påvises konformasjonsepitoper enkelt ved bestemmelse av romlig konformasjon av aminosyrer slik som f. eks. røntgenkrystallografi og todimensjonal kjernemagnetisk resonnans. Se f. eks. Epitop Mapping Protocols, over. Antigene områder i proteiner kan også identifiseres ved anvendelse av standard antigenisitet og hydropati plott, slik som de som er beregnet ved anvendelse av f. eks. Omiga versjon 1.0 software program som er tilgjengelig fra Oxford Molecular Group. Dette dataprogrammet benytter Hopp/Woods metoden, Hopp et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1981) 78:3824-3828 til bestemmelse av antigenisitetsprofiler og Kyte-Doolittle teknikken, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 for hydropati plott.

Som anvendt heri refererer betegnelse "konformasjonsepitop" til en del av et fullengde protein eller en analog eller mutein derav, som har strukturelle kjennetegn som er native for aminosyresekvensen som koder for epitopen innen det fullengde naturlige proteinet. Native strukturelle kjennetegn inkluderer, men er ikke begrenset til glykosylering og tredimensjonal struktur. Lengden av den epitop bestemmende sekvensen kan utsettes for store variasjoner da disse epitopene er antatt å dannes av den tredimensjonale formen til antigenet (f. eks. folding). Derfor kan aminosyrer som bestemmer epitopen være relativ få i antall, men meget spredt langs lengden av molekylet (eller til og med ulike molekyler i tilfellet med dimerer etc.) som bringes i riktig epitopkonformasjon via folding. De-lene til antigenet mellom residiene som bestemmer epitopen kan ikke være kritiske for konformasjonsstrukturen til epitopen. For eksempel kan delesjon eller substitusjon av disse intervenerende sekvensene ikke påvirke konformasjonsepitopen, forutsatt at sek venser som er kritiske for epitop konformasjon opprettholdes (f. eks. cysteiner som er involvert i disulfidbinding, glykosyleringssteder etc.).

Konformasjonsepitoper som er tilstede i NS3/4a området identifiseres enkelt ved anvendelse av fremgangsmåtene som er diskutert over. Dessuten kan tilstedeværelsen eller fraværet av en konformasjonsepitop i et gitt polypeptid enkelt bestemmes ved screening av antigenet av interesse med et antistoff (polyklonalt serum eller monoklonalt for konformasjonsepitopen) og sammenligne dets reaktivitet med den for en denaturert utgave av antigenet som kun beholder lineære epitoper (dersom noen). I slike screening som anvender polyklonale antistoffer, kan det være fordelaktig å absorbere det polyklonale serumet først med det denaturerte antigenet og se om det beholder antistoffer mot antigenet av interesse. I tillegg, i tilfellet med NS3/4a, vil et molekyl som bevarer den native konformasjonen, også ha protease og valgfritt helikase-enzymatiske aktiviteter. Slike aktiviteter kan påvises ved anvendelse av enzymatiske analyser slik som beskrevet lenger nede.

Fortrinnsvis fremstilles en konformasjonsepitop rekombinant og uttrykkes i en celle som den kan ekstraheres fra, under betingelser som bevarer dets ønskede strukturelle kjennetegn, f. eks. uten denaturering av epitopen. Slike celler omfatter bakterier, gjær, insekter og pattedyrceller. Ekspresjon og isolering av rekombinante konformasjonsepitoper fra HCV-polyproteinet er f. eks. beskrevet i internasjonal publikasjon WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Alternativt er det mulig å ut-trykke antigenene og renaturere proteinet ytterligere etter gjenvinning. Det skal også forstås at kjemisk syntese også kan tilveiebringe konformasjonsantigen mimitoper ("mimitopes") som kryssreagerer med det "native" antigenets konformasjonsepitop.

Med betegnelsen "multippelt epitopfusjonsantigenet" eller "MEFA" slik som den anvendes heri menes et polypeptid hvori multiple HCV antigener er del av en enkel, sammenhengende kjede av aminosyrer, hvis kjede ikke forekommer i naturen. HCV antigenene kan være forbundet direkte med hverandre eller med peptidbindinger eller kan være adskilt av intervenerede aminosyresekvenser. Fusjonsantigenene kan også inneholde sekvenser som er eksogene for HCV polyproteinet. Dessuten kan HCV-sekvensene som er tilstede være fra multiple genotyper og/eller isolater av HCV. Eksempler på spesielle MEFAer til anvendelse i foreliggende immunoanalyser er detaljert angitt i f. eks. internasjonal publikasjon WO 97/44469 og er ytterligere beskrevet nedenfor.

Med et "antistoff menes et molekyl som gjennom kjemiske eller fysiske hjelpemidler spesifikt binder til et polypeptid av interesse. Derfor er et HCV kjerne-antistoff et molekyl som spesifikt binder til HCV kjerne-proteinet. Betegnelsen "antistoff slik som det er anvendt heri omfatter antistoffer som er oppnådd fra både polyklonale og monoklonale fremstillinger, så vel som de følgende: hybride (kimære) antistoff-molekyler (se for eksempel Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299 og US patent 4 816 567, F(ab')2og F(ab) fragmenter, Fv molekyler (ikke-kovalente heterodimerer, se for eksempel Inbar et al. (1972) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69: 2659-2662 og Ehrlich et al. (1980) Biochem. 19: 4091-4096), enkeltkjede Fv molekyler (sFv)(se for eksempel Huston et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883), dimere og trimere antistoffragment konstrukter, ministoffer ("minibodies")(se f. eks. Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584, Cumer et al. (1992) J Immunology 149B: 120-126), humaniserte antistoffmolekyler (se for eksempel Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327, Verhoeyan et al.

(1988) Science 239:1534-1536 og U. K. Patent GB 2 276 169, publisert 21. september 1994) og ethvert funksjonelt fragment som er oppnådd fra slike molekyler, hvori slike fragmenter beholder de immunologiske bindingsegenskaper til foreldre antistoffmolekylet.

Betegnelsen "monoklonalt antistoff slik som det anvendes heri refererer til en anti-stoffsammensetning som har en homogen antistoff-populasjon. Betegnelsen er ikke begrenset med hensyn til artene eller kilden til antistoffet, det er heller ikke ment å være begrenset til måten det er laget på. Derfor omfatter betegnelsen antistoffer som er oppnådd fra murine hydridomer, så vel som humane monoklonale antistoffer som er oppnådd ved anvendelse av humane fremfor murine hybridomer. Se f. eks. Cote et al. Mo-noclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, s. 77.

Et "rekombinant" protein er et protein som beholder den ønskede aktiviteten og som er fremstilt ved rekombinante DNA-teknikker slik som beskrevet heri. Stort sett klones genet av interesse og så uttrykkes i transformerte organismer, slik som beskrevet lenger nede. Vertsorganismen uttrykker det fremmede genet for å produsere proteinet under ekspresj onsbetingelser.

Med "isolert" menes, når det refereres til et polypeptid, at det angitte molekylet er sepa-rert og adskilt fra hele organismen som molekylet finnes i naturen eller er til stede i det vesentlige i fraværet av andre biologiske makromolekyler av samme typen. Betegnelsen "isolert" med hensyn til et polynukleotid, er et nukleinsyremolekyl som er fritt, helt eller delvis, for sekvenser som normalt assosieres med det i naturen, eller en sekvens, slik som den eksisterer i, i naturen, men som har heterologe sekvenser i forbindelse med den eller et molekyl som er disassosiert fra kromosomet.

Med "ekvivalent antigen determinant" menes en antigen determinant fra ulike sub-arter eller stammer av HCV, slik som fra stammer 1, 2 eller 3 av HCV. Mer spesifikt er epitoper kjent, slik som 5-1-1 og slike epitoper varierer mellom stammene 1, 2 og 3. Derfor er epitopen 5-1-1 fra de tre ulike stammene ekvivalente antigene determinanter og er derfor "kopier" selv om deres sekvenser ikke er identiske. Stort sett vil aminosyresekvensene til ekvivalente antigene determinanter ha en høy grad av sekvenshomologi, f. eks. aminosyresekvenshomologi på mer enn 30 %, fortrinnsvis mer enn 40 % når de to sekvensene settes opp.

"Homologi" refererer til prosent likhet mellom to polynukleotid eller to polypeptid enheter. To DNA eller to polypeptidsekvenser er "vesentlig homologe" med hverandre når sekvensen viser minst omkring 50 %, fortrinnsvis minst omkring 75 % mer foretrukket minst omkring 80 % - 85 %, fortrinnsvis minst omkring 90 % og mest foretrukket minst omkring 95 % - 98 % sekvenslikhet over en bestemt lengde av molekylene. Slik som anvendt heri refererer vesentlig homolog også til sekvenser som viser full identitet med den spesifiserte DNA eller polypeptidsekvensen.

Stort sett refererer "identitet" til et eksakt nukleotid-til-nukleotid eller aminosyre-til - aminosyre korrespondering av henholdsvis to polynukleotider eller polypeptidsekvenser. Prosent identitet kan bestemmes ved en direkte sammenligning av sekvensin-formasjonen mellom to molekyler ved å stille opp sekvensene, telle det eksakte antall matcher mellom de to oppstilte sekvensene, dividere med lengden til den korteste sekvensen og multiplisere resultatet med 100.

Lett tilgjengelige dataprogram kan anvendes som hjelp i analysene av likhet og identitet, slik som ALIGN, Dayhoff, M. O. I Atlas og Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washing-ton, DC, som tilpasser den lokale homologialgoritmen til Smith og Waterman Advances in Appl. Math. 2: 482-489, 1981 til peptidanalyse. Programmer til bestemmelse av nukleotidsekvenslikhet og identitet er tilgjengelig i Wisconsin Sequence Analysis Package, versjon 8 (tilgjengelig fra Genetics Computer Group, Madison, WI) for eksempel BESTFIT, FASTA og GAP programmer som også bygger på Smith og Waterman algoritmen. Disse programmene er enkle å benytte med standard parametre som er anbefalt av fabrikanten og beskrevet i Wisconsin Sequence Analysis Package, som er referert over. For eksempel kan en bestemt nukleotidsekvens' prosent likhet med en referanse-sekvens bestemmes ved anvendelse av homologi-algoritmen til Smith og Waterman med en standardscoringstabell og en "gap penalty" på 6 nukleotidposisjoner.

En annen fremgangsmåte til fastsetting av prosentvis likhet i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, er å anvende MPSRCH-programpakken som Universitetet i Edin-burgh har copyright på og som er utviklet av John F. Collins og Shane S. Sturrok og distribueres av IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Fra dette pakkesettet kan Smith-Waterman algoritmen benyttes, hvor standard parametre anvendes i scoringsta-bellen (for eksempel "gap open penalty" på 12, "gap extension penalty" på 1 og et gap på 6). Fra data som er generert, reflekterer "Match"-verdi "sekvenslikhet". Andre egnede programmer til beregning av prosentidentiteten eller likheten mellom sekvenser, er stort sett kjent innen fagområdet, for eksempel er et annet oppstillingsprogram BLAST, anvendt med standardparametre. For eksempel kan BLASTN og BLASTP anvendes ved anvendelse av følgende standardparametre: genetisk kode = standard, filter = ingen, tråd = begge, cutoff = 60, forventning =10, Matriks = BLOSUM62, beskrivelser = 50 sekvenser, sorteres etter = HIGH SCORE, databaser = ikke-redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translasjoner + Swiss protein + Spupdate + PIR. De-taljer for disse dataprogrammene finnes på følgende internettadresse: http:// www. ncbi. nlm. gov/ cgi- bin/ BLAST.

Alternativt kan homologi bestemmes ved hybridisering av polynukleotider under betingelser som danner stabile duplekser mellom homologe områder, etterfulgt av fordøy-ing med enkelttrådspesifikk nuklease(r) og størrelsesbestemmelse av de fordøyde fragmentene. DNA-sekvenser som er vesentlig homologe kan påvises i et Southern hybridi-seringsforsøk under for eksempel stringente betingelser, som er angitt for det spesielle systemet. Fastsettelse av hensiktsmessige hybridiseringsbetingelser er innefor kunnskapen til en fagmann på området. Se f. eks. Sambrook et al, over: DNA Cloning, over, Nucleic Acid Hybridization, over.

En "kodende sekvens" eller en sekvens som "koder for" et selektert polypeptid er et nukleinsyremolekyl som transkriberes (i tilfellet med DNA) og translateres (i tilfellet med mRNA) til et polypeptid in vitro eller in vivo når det plasseres under kontroll av hensiktsmessige regulatoriske sekvenser. Grensene til den kodende sekvensen er bestemt av et start-kodon i 5' (amino) terminalen og et translasjonsstoppkodon ved 3'

(karboksi) terminalen. En transkripsjonstermineringssekvens kan finnes 3' for den kodende sekvensen.

"Operabelt bundet" refererer til et arrangement av elementer hvori komponentene som er beskrevet på denne måten, er konfigurert slik at de utfører sin ønskede funksjon. Derfor er en gitt promoter som er operabelt bundet til en kodende sekvens, i stand til å for-årsake ekspresjonen av den kodende sekvensen når de riktige transkripsjonsfaktorene etc. er tilstede. Promoteren trenger ikke henge sammen med den kodende sekvensen så lenge den dirigerer ekspresjonen derav. Derfor kan for eksempel intervenerende, utranslaterte, allikevel transkriberte sekvenser være tilstede mellom promotersekvensen og den kodende sekvensen, slik som også transkriberte introner kan, og promotersekvensen anses fremdeles å være "operabelt bundet" til den kodende sekvensen.

Et "kontrollelement" refererer til en polynukleotidsekvens som hjelper til i ekspresjonen av en kodende sekvens som den er bundet til. Betegnelsen omfatter promoterer, transkripsjonstermineringssekvenser, oppstrøms regulerende domener, polyadenyle-ringssignaler, utranslaterte områder, inkludert 5'-UTRer og 3'-UTRer og dersom hensiktsmessig, ledersekvenser og enhancere som kollektivt sørger for transkripsjon og translasjon av en kodende sekvens i en vertscelle.

En "promoter" slik som anvendt heri er et regulatorisk område av DNA som er i stand til å binde RNA polymerase i en vertscelle og initiere transkripsjon av en nedstrøms (3' retning) kodende sekvens som er operabelt bundet til den. I foreliggende oppfinnelse inkluderer en promotersekvens minimum antall baser eller elementer som er nødvendig for å initiere transkripsjon av et gen av interesse på nivåer som er detekterbare over bakgrunnen. Innen promotersekvensen er det et transkripsjonsinitieringssete, så vel som proteinbindingsdomer (konsensussekvenser) som er ansvarlige for bindingen av RNA polymerase. Eukaryote promoterer vil ofte, men ikke alltid inneholde "TATA" bokser og "CAT" bokser.

En kontrollsekvens "dirigerer transkripsjonen" av en kodende sekvens i en celle når RNA polymerase vil binde promotersekvensen og transkribere den kodende sekvensen til mRNA, som da translateres til polypeptidet som kodes av den kodende sekvensen.

"Ekspresjonskassett" eller "ekspresjonskonstrukt" refererer til en samling som er i stand til å dirigerer ekspresjonen av sekvensen(e) eller genet(ene) av interesse. Ekspresjons-kassettene omfatter kontrollelementer slik som beskrevet over, slik som en promoter som er operabelt bundet til (for å dirigere transkripsjon av) sekvensen(e) eller ge-nettene) av interesse og omfatter ofte også en polyadenyleringssekvens. Innen visse utførelsesformer av oppfinnelsen kan ekspresjonskassetten som er beskrevet her, finnes

i et plasmidkonstrukt. I tillegg til komponentene i ekspresjonskassetten, kan plasmid-konstruktet også omfatte en eller flere selekterbare markører, et signal som tillater plasmidet å eksistere som en enkelttrådet DNA (f. eks. et Ml3 replikasjonsorigo), minst et multippelt kloningssete og et "mammalsk" replikasjonsorigo (f. eks. et SV40 eller adenovirus replikasjonsorigo).

"Transformasjon" slik som anvendt heri refererer til insersjon av et eksogent polynukleotid i en vertscelle, uten hensyn til fremgangsmåten som anvendes til insersjonen: for eksempel transformasjon ved direkte opptak, transfeksjon, infeksjon og liknende. Se nedenfor for spesielle fremgangsmåter til transfeksjon. Eksogent polynukleotid kan opprettholdes som en ikke-integrert vektor for eksempel et episom, eller kan alternativt integreres i vertsgenomet.

En "vertscelle" er en celle som er transformert eller er i stand til transformasjon med en eksogen DNA-sekvens.

Med "vanlig fast underlag" menes en enkelt fast matriks som HCV polypeptidene som anvendes i de foreliggende immunoanalysene, er kovalent bundet til, eller ikke-kovalent slik som hydrofob adsorpsjon.

"Immunologisk reaktiv" betyr at det aktuelle antigenet vil reagere spesifikt med anti-HCV antistoffer som er tilstede i en biologisk prøve fra et HCV-infisert individ.

Med "immunkompleks" menes kombinasjonen som dannes når et antistoff binder til en epitop på et antigen.

En "biologisk prøve" slik som den anvendes heri, refererer til en prøve av vev eller væske som er isolert fra et individ, inkludert men ikke begrenset til for eksempel blod, plasma, serum, avføring, urin, benmarg, galle, spinalvæske, lymfevæske, hudprøver, eksterne sekresjoner fra huden, respiratorisk, tarm og urogenitalkanaler, tårer, spytt, melk, blodceller, organer, biopsier og også prøver av in vitro cellekulturbestanddeler som inkluderer, men ikke er begrenset til kondisjonert media som resulterer fra veksten av celler og vev i kulturmedium f. eks. rekombinante celler og cellekomponenter.

Betegnelsen "merket" og "detekterbart merket" refererer til et molekyl som er i stand til å påvise, inkludert, men ikke begrenset til radioaktive isotoper, fluorescerer, kjemolu-minescenser, kromoforer, enzymer, enzymsubstrater, enzym kofaktorer, enzyminhibito- rer, kromoforer, fargestoffer, metallioner, metallsol, ligander (f. eks. biotin, streptavidin eller haptener) og liknende. Betegnelsen "fluorescerer" refererer til en substans eller en del derav som er i stand til å viser fluorescens i det detekterbare området. Spesielle eksempler på merker som kan anvendes under oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til pepperrotperoksidase (HRP), fluorescein, FITC, rhodamin, dansyl, umbellife-ron, dimetyl akridinester (DMAE), Texas rødt, luminol, NADPH og a-|J-galaktosidase.

II. Måter for utførelse av oppfinnelsen

Før foreliggende oppfinnelse beskrives i detalj, må det forstås at denne oppfinnelsen ikke er begrenset til bestemte formuleringer eller prosessparametre som sådan selvsagt kan variere. Det skal også forstås at terminologien som anvendes heri kun er med hen-sikt å beskrive spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen, og er ikke ment å være begrensende.

Selv om flere sammensetninger og fremgangsmåter som er liknende eller ekvivalente med de som er beskrevet heri, kan anvendes i utførelsen av foreliggende oppfinnelse, er de foretrukne materialene og fremgangsmåtene beskrevet heri.

Som bemerket over, er foreliggende oppfinnelse basert på oppdagelsen av nye diagnostiske fremgangsmåter til nøyaktig påvisning av tidlig HCV-infeksjon. Fremgangsmåtene er avhengige av påvisningen og anvendelsen av svært immunogene HCV-antistoffer og antigener som er til stede i de tidlige trinnene av HCV serokonversjon, og derved økes påvisningsnøyaktighet og redusere forekomsten av feilaktige resultater. Fremgangsmåtene kan hensiktsmessig utføres i ett enkelt analyseformat.

Mer spesielt gjennomføres analysen på et fast underlag til hvilke det er bundet et eller flere HCV anti-kjerne antistoffer (rettet mot enten samme eller forskjellige HCV-kjerneepitoper) og en epitop som er avledet fra NS3/4a området i HCV polyproteinet. Eksempler på spesielle anti-kjerne antistoffer som er nyttige i foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til antistoffmolekyler slik som monoklonale antistoffer som er rettet mot epitoper i kjerneområdet som finnes mellom aminosyrer 10-53, aminosyrer 10-45, aminosyrer 67-88, aminosyrer 120-130 eller antistoffer som er rettet mot hvilken som helst av kjerneepitopene som er identifisert i f. eks. Houghton et al., US patent 5 350 671, Chien et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1992) 89:10011-10015, Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39, Chien et al., internasjonal publikasjon WO 94/01778 og offentlig eid, godkjent US patent søknad serienummer 08/403 590 og 08/444 818.

NS3/4a området i HCV polyproteinet er beskrevet og aminosyresekvensen og total-strukturen til proteinet er beskrevet i f. eks. Yao et al., Structure (november 1999) 7: 1353-1363, Sali et al, Biochem. (19989 37:3392-3401 og Bartenschlager, R., J. Viral Hepat. (1999) 6:165-181. Se også Dasmahapatra et al, US patent 5 843 752. De aktuelle immunoanalysene benytter minst en konformasjonsepitop som er avledet fra NS3/4a området som finnes i konformasjonen slik den finnes i den naturlig forekommende HCV-partikkelen eller dets infektive produkt slik som bevist ved bevaringen av protease og valgfritt helikase enzymatiske aktiviteter, som normalt vises av NS3/4a genproduktet og/eller immunoreaktiviteten til antigenet med antistoffer i en biologisk prøve fra et HCV-infisert individ og et tap av epitopens immunoreaktivitet ved denaturering av antigenet. For eksempel kan konformasjonsepitopen ødelegges av oppvarming, endring av pH til ekstremt sur eller basisk eller ved tilsetting av kjente organiske denatureringsmid-ler slik som ditiotreitol (DTT) eller en passende detergent. Se f. eks. Protein Purification Methods, a practical approach (E. L. V. Harris og S. Angal eds., IRL Press) og det denaturerte produktet sammenlignet med produktet som ikke er behandlet slik som over.

Protease- og helikaseaktivitet kan bestemmes ved anvendelse av standard enzymanaly-ser som er velkjente innen fagområdet. For eksempel kan proteaseaktivitet bestemmes ved anvendelse av analyser som er velkjent innen fagområdet. Se f. eks. Takeshita et al, Anal. Biochem. (1997) 247:242-246, Kakiuchi et al, J. Biochem. (1997) 122:749-755, Sali et al, Biochemistry (1998) 37:3392-3401, Cho et al, J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115, Cerretani et al, Anal. Biochem. (1999) 266:192-197, Zhang et al, Anal. Biochem.

(1999) 270:268-275, Kakiuchi et al, J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84, Fowler et al, J. Biomol. Screen. (2000) 5:153-158 og Kim et al, Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. En spesielt passende analyse til testing av proteaseaktivitet er vist i eksemplene nedenfor.

På tilsvarende måte er helikaseaktivitetsanalyser velkjente innen fagområdet og helikaseaktivitet til et NS3/4a epitop kan bestemmes ved anvendelse av f. eks. en ELISA-analyse slik som beskrevet i f. eks. Hsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599, et scintillasjons nærhetsanalysesystem slik som beskrevet i Kyono et al., Anal. Biochem. (1998) 257:120-126, høy gjennomstrømningsanalyser er beskrevet i f. eks. Hicham et al., Antiviral Res. (2000) 46: 181-193 og Kwong et al, Methods Mol. Med. (2000) 24: 97-116 så vel som ved andre analysefremgangsmåter som er velkjent innen fagområdet. Se f. eks. Khu et al, J. Virol. (2001) 75:205-214, Utama et al, Virology (2000) 273:316-324, Paolini et al, J. Gen.Virol. (2000) 81:1335-1345, Preugschat et al, Biochemistry (2000) 39:5174-5183, Preugschat et al, Methods Mol. Med. (1998) 19:353-364 og Hesson et al., Biochemistry (2000) 39:2619-2625.

Lengden av antigenet er tilstrekkelig til å opprettholde en immunoreaktiv konformasjonsepitop. Ofte vil polypeptidet som inneholder antigenet som anvendes, ha nesten fullengde, polypeptidet kan imidlertid også være trunkert for f. eks. å øke løseligheten eller for å forbedre sekresjon. Stort sett ekspresseres konformasjonsepitopen som finnes i NS3/4a, som et rekombinant polypeptid i en celle og dette polypeptidet tilveiebringer epitopen i en ønsket form slik som beskrevet detaljert nedenfor.

Representative aminosyresekvenser for NS3/4a polypeptider er vist i figur 3 og figurene 4A til 4D. Den uthevete alanin som forekommer i posisjon 182 i figur 3 er substituert for det native serin som finnes i denne posisjon, for å forebygge autokatalyse av molekylet som ellers kan forekomme. Aminosyresekvensen som er vist i posisjonene 2-686 i figurene 4A til 4D korresponderer til aminosyreposisjoner 1027-1711 i HCV. Et initia-torkodon (ATG) som koder for Met er vist i posisjon 1.1 tillegg er Thr som normalt forekommer i posisjon 1428 i HCV-1 (aminosyreposisjon 403 i figur 4) mutert til Pro, og Ser som normalt forekommer i posisjon 1429 i HCV-1 (aminosyreposisjon 404 i figur 4) er mutert til Ile. Imidlertid kan enten den native sekvensen med eller uten en N-terminal Met, den avbildete analogen med eller uten den N-terminale Met, eller andre analoger og fragmenter, anvendes i de foreliggende analysene så lenge epitopen fremstilles ved anvendelse av en fremgangsmåte som bevarer eller gjeninnsetter dets native konformasjon slik at proteaseaktiviteten og valgfritt, helikaseaktiviteten beholdes. Dasmahapatra et al, US patent 5 843 752 og Zhang et al, US patent 5 990 276 beskriver begge analoger av NS3/4a.

NS3-proteasen til NS3/4a finnes omkring posisjoner 1027-1207, nummerert relativt til HCV-1, posisjoner 2-182 i figur 4. Strukturen til NS3-proteasen og det aktive setet er kjent. Se f. eks. De Francesco et al, Antivir. Ther. (1998) 3:99-109, Koch et al, Biochemistry (2001) 40:631-640. Endringer i den native sekvensen som normalt vil tolere-res, vil være de som er utenfor det aktive setet til molekylet. Spesielt er det ønskelig å opprettholde aminosyrene 1- eller 2-155 i figur 4, med få eller kun konservative substitusjoner. Aminosyrer som forekommer etter 155, vil tolerere større endringer. I tillegg, dersom fragmenter i NS3/4a sekvensen som finnes i figur 4 anvendes, vil disse fragmentene stort sett inkludere minst aminosyrene 1- eller 2-155, fortrinnsvis aminosyrer 1- eller 2-175 og mest foretrukket aminosyrer 1- eller 2-182 med eller uten den N-terminale Met. Helikasedomenet finnes omkring posisjoner 1193-1657 i HCV-1 (posi sjoner 207-632 i figur 4). Derfor, dersom helikaseaktivitet er ønskelig, vil denne delen av molekylet opprettholdes med få eller kun konservative endringer. En fagmann på området kan enkelt bestemme områdene som tolerere endringer, basert på den kjente strukturen til NS3/4a.

Det faste underlaget kan også omfatte andre antigener. For eksempel kan multiple epitopfusjonsantigener (betegnet "MEFAer") slik som beskrevet i internasjonal publikasjon WO 97/44469, være bundet til det faste underlaget for anvendelse i de foreliggende analysene. Slike MEFAer omfatter multiple epitoper som er avledet fra to eller flere av de ulike virale områdene som er vist i figur 1 og tabell 1. Spesielt, slik som vist i figur 1 og tabell 1, produserer et HCV polyprotein minst 10 distinkte produkter ved spalting i rekkefølgen NH2-kjerne-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Kjerne-polypeptidet forekommer i posisjoner 1-191, nummerert relativt til HCV-1 (se Choo et al. (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:2451-2455 for HCV-1 genomet). Dette polypeptidet prosesseres ytterligere for å produsere et HCV polypeptid med tilnærmet aminosyrer 1-173. Kappepolypeptidene El og E2 forekommer i omkring posisjoner 192-383 og 384-746. p7-domenet finnes i posisjoner 747-809. NS2 er et integralt membranprotein med proteolytisk aktivitet og finnes omkring posisjoner 810-1026 i polyproteinet. NS2, enten alene eller i kombinasjon med NS3 (finnes omkring posisjoner 1027-1657), spalter NS2-NS3 sissle-bindingen som så genererer NS3 N-terminalen og frigir et stort polyprotein som inkluderer både serinprotease- og RNA-helikaseaktiviteter. NS3-proteasen som finnes i posisjoner 1027-1207, prosesserer det resterende polyproteinet. Helikaseaktiviteten finnes omkring posisjoner 1193-1657. Fullføring av polyproteinmodning initieres av autokatalytisk spalting i NS3/4a-forgreiningen som katalyseres av NS3 serinproteasen. Påfølgende NS3-medierte spaltninger av HCV polyproteinet synes å involvere gjenkjenning av polyproteinspaltningsforgreninger av et NS3 molekyl fra et annet polypeptid. I disse reaksjonene frigir NS3 en NS3 kofaktor (NS4a som finnes i posisjoner 1658-1711), to proteiner (NS4a som finnes omkring posisjoner 1712-1972 og NS5a som finnes omkring posisjoner 1973-2420) og en RNA-avhengig RNA-polymerase (NS5b som finnes omkring posisjoner 2421-3011).

De multiple HCV-antigenene er del av en enkel, sammenhengende kjede av aminosyrer, hvor kjede ikke forekommer i naturen. Derfor er den lineære rekkefølgen av epitopene forskjellig fra deres lineære rekkefølge i genomet som de forekommer i. Den lineære rekkefølgen av sekvensene av MEFAene til anvendelse heri er fortrinnsvis arrangert for optimal antigenisitet. Fortrinnsvis er epitopene fra mer enn en HCV-stamme og sørger derved for den tilførte evnen til å påvise multiple HCV-stammer i en enkelt analyse. Derfor kan MEFAene til anvendelse heri omfatte ulike immunogene områder som er avledet fra polyproteinet som er beskrevet over. Dessuten kan et protein som resulterer fra et frameshift i kjerneområdet av polyproteinet, slik som beskrevet i internasjonal publikasjon WO 99/63941, anvendes i MEFAene. Dersom ønskelig kan minst 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 eller flere av en eller flere epitoper som er avledet fra HCV-polyproteinet forekomme i fusjonsproteinet.

For eksempel kan epitoper som er avledet fra f. eks. det hypervariable området i E2, slik som et område som strekker seg til aminosyrene 384-410 eller 390-410, inkluderes i MEFA-antigenet. En spesielt effektiv E2 epitop er en som omfatter en konsensussekvens som er avledet fra dette området, slik som konsensussekvensen Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn som representerer en konsensussekvens for aminosyrene 390-410 i HCV type 1 genomet. En representativ E2-epitop som er til stede i en MEFA ifølge oppfinnelsen, kan omfatte en hybridepitop som strekker seg over aminosyrer 390-444. En slik hybrid E2-epitop kan omfatte en konsensussekvens som representerer aminosyrene 390-410 som er fusert med den native aminosyresekvensen til aminosyrene 411-444 i HCV E2.

I tillegg kan antigenene avledes fra ulike HCV-stammer. Multiple virale HCV-stammer er kjente og epitoper som er avledet fra hvilken som helst av disse stammene kan anvendes i et fusjonsprotein. Det er velkjent at enhver organismeart varierer fra en indivi- duell organisme til en annen og videre at en gitt organisme slik som et virus, kan ha uttallige ulike stammer. For eksempel, slik som forklart over, omfatter HCV minst 6 genotyper. Hver av disse genotypene omfatter ekvivalente antigene determinanter. Mer spesifikt inkluderer hver stamme uttallige antigene determinanter som er til stede på alle stammene av viruset, men er litt forskjellig fra en viral stamme til en annen. For eksempel omfatter HCV den antigene determinanten som er kjent som 5-1-1 (se figur 1). Denne spesielle antigendeterminanten forekommer i tre ulike former på de tre forskjellige virale HCV-stammene. Som en følge av dette forekommer, i en foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen, alle tre formene av 5-1-1 på det multiple epitopfusjonsantigenet som er anvendt i de aktuelle immunoanalysene. På liknende måte kan også ekvivalente antigene determinanter i kjerneområdet fra ulike HCV-stammer være tilstede. Stort sett har ekvivalente antigene determinanter en høy grad av homologi i form av aminosyresekvens, hvis homologigrad stort sett er 30 % eller mer, fortrinnsvis 40 % eller mer, når de sammenlignes. Den multiple kopiepitopen ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte multiple kopier som er eksakte kopier av den samme epitopen.

Representative MEFAer til anvendelse i foreliggende analyser er beskrevet i internasjonal publikasjon WO 97/44469. Ytterligere representative MEFAer til anvendelse heri, omfatter de som er betegnet MEFA 12, MEFA 13 og MEFA 13.1. Det skal forstås at disse MEFAene kun er representative, og andre epitoper som er avledet fra HCV-genomet vil også finne anvendelse i de foreliggende analysene og kan inkorporeres i disse eller andre MEFAer.

DNA-sekvensen og den korresponderende aminosyresekvens til MEFA 12 er vist i figurene 7A til 7F. Den generelle strukturformel for MEFA 12 er vist i figur 6 og er som følger: hSOD-El (type 1)-E2 HVR konsensus (type la)-E2 HVR konsensus (typer 1 og 2)-c33c kort (type l)-5-l-l (type l)-5-l-l(type 3)-5-l-l(type 2)-cl00(type l)-NS5(type l)-NS5(type l)-kjerne(typer l+2)-kjerne(typer 1+2). Denne multiple kopieepitopen omfatter følgende aminosyresekvens, nummerert relativt til HCV-1 (nummereringen av aminosyrene som er vist nedenfor følger nummereringsangivelsen som er tilveiebragt i Choo et al. (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:2451-2455, hvori aminosyre #1 er det første metioninet som er kodet av den kodende sekvensen i kjerneområdet): aminosyrer 1-69 til superoksiddismutase (SOD, anvendt for å forsterke rekombinant ekspresjon av proteinet), aminosyrer 303 til 320 i polyproteinet fra El området, aminosyrer 390 til 410 i polyproteinet som representerer en konsensussekvens for det hypervariable området til HCV-la E2, aminosyrer 1211-1457 i HCV-1 polyproteinet som angir helikasen, 3 kopier av en epitop fra 5-1-1, aminosyrer 1689-1735, en fra HCV-1, en fra HCV-3 og en fra HCV-2, hvis kopier er ekvivalente antigendeterminanter fra de 3 ulike virale HCV-stammene, HCV-polypeptid C100 fra HCV-1, aminosyrer 1901-1936 fra polyproteinet, to eksakte kopier av en epitop fra NS5 området i HCV-1, hver med aminosyrer 2278 til 2313 fra HCV-polyproteinet og 2 kopier av 3 epitoper fra kjerneområdet, 2 fra HCV-1 og 1 fra HCV-2, hvor kopier er ekvivalente antigendeterminanter som er representert av aminosyrer 9 til 53 og 64-88 i HCV-1 og 67-84 i HCV-2.

Tabell 2 viser aminosyreposisjonen til de ulike epitopene i MEFA 12 med referanse til figurene 7A til 7F heri. Nummereringen i tabellene er relativt til HCV-1. Se Choo et al.

(1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88: 2451-2455. MEFA 13 og 13.1 deler også den generelle formelen som er angitt over for MEFA 12, med modifiseringer slik som angitt i henholdsvis tabell 3 og 4.

<*>SOD proteinet er trunkert slik at påvisningskonjugatet, et HPR-merket anti-SOD antistoff ikke binder til MEFA. Kjerneepitopen er mutert for å forhindre antistoffene mot HCV-kjerne som anvendes i påvisning, i å binde til MEFA. <*>5-1-1 epitopene er modifisert ved eliminering av mulige spaltingsseter (CS eller CA) som målsøkes av det rekombinante NS3/4a proteinet. I stedet for CS eller CA er sekvensen endret til PI. I tillegg er SOD proteinet mutert slik at deteksjonskonjugatet, et HRP-merket anti-SOD antistoff ikke binder MEFA. Kjerneepitopen er mutert for å forhindre at antistoffene mot HCV-kjerne som anvendes i påvisning, binder til MEFA.

<*>5-1-1 epitopene er modifisert ved eliminering av mulige spaltingsseter (CS eller CA) som målsøkes av det rekombinante NS3/4a proteinet. I stedet for CS eller CA er sekvensen endret til PI. I tillegg er SOD proteinet mutert slik at deteksjonskonjugatet, et HRP-merket anti-SOD antistoff ikke binder MEFA. Kjerneepitopen er mutert for å forhindre at antistoffene mot HCV-kjerne som anvendes i påvisning, binder til MEFA.

I et analyseformat kombineres prøven med det faste underlaget slik som beskrevet nedenfor. Dersom prøven er infisert med HCV, vil kjerneantigener så vel som HCV-antistoffer mot de epitopene som er tilstede på det faste underlaget, binde til komponentene i det faste underlaget. Et detekterbart merket anti-kjerne antistoff tilsettes så. Det merkede anti-kjerne antistoffet er rettet mot en annen epitop enn anti-kjerne antistoffet som er bundet til det faste underlaget. Dette anti-kjerne antistoffet binder til kjerneantigenet som er bundet ("captured") av anti-kjerne antistoffene på det fast underlaget.

Et antigen som reagerer med det bundne HCV antistoffet fra den biologiske prøven, hvor det bundne HCV-antistoffet fra prøven er reaktivt med NS3/4a epitopen, tilsettes også. Dette antigenet er fortrinnsvis en epitop som er avledet fra NS3 området i HCV-polyproteinet. Dette antigenet binder det bundne HCV-antistoffet fra prøven. Et uttall antigener som inkluderer slike epitoper er kjent, inkludert men ikke begrenset til antigener som er avledet fra c33c og clOO områdene, så vel som fusjonsproteiner som omfatter en NS epitop slik som c25. Disse og andre NS3 epitoper er nyttige i de foreliggende analysene og er kjent innen fagområdet og beskrevet i f. eks. Houghton et al, US patent 5 350 671, Chien et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1992) 89: 10011-10015, Chien et al, J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39, Chien et al. internasjonal publikasjon WO 93/00365, Chien, D. Y., internasjonal publikasjon WO 94/01778 og godkjent US pa-tentsøknad serienummer 08/403 590 og 08/444 818.

Et andre merket antistoff som er rettet mot antigenet som er beskrevet over, tilsettes. Dette antistoffet kan være rettet mot hvilken som helst epitop som er inkludert i antigenet. For eksempel kan antistoffet være rettet mot NS3 området som er tilstede i antigenet. Alternativt, dersom antigenet over ekspresseres som et fusjonsprotein, kan det andre merkede antistoffet være rettet mot fusjonspartneren. Ytterligere antigener og antistoffer kan settes til analysen, spesielt dersom det faste underlaget omfatter en MEFA. Disse analyseformatene forklares nærmere nedenfor.

En representativ analyse ifølge oppfinnelsen er vist i figur 2. Som vist i figuren omfatter det fast underlaget to anti-kjerne monoklonale antistoffer som er betegnet cll-3ogcll-7. Disse antistoffene er rettet mot en epitop som finnes i det N-terminale området av kjerneproteinet i aminosyrer 10-53, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen. Det faste underlaget omfatter også en epitop mot NS3/4a. Den biologiske prøven settes til det faste underlaget. HCV kjerneantigen, så vel som antistoffer som er rettet mot NS3/4a epitopen, som begge er til stede i prøven, vil binde til de bundne reagensene på det faste underlaget.

Pepperrotperoksidase (HRP)-merket anti-kjerne monoklonalt antistoff cl 1-14 som er rettet mot et C-terminalt område av kjernen som finnes i aminosyreposisjoner 120-130, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen, tilsettes så. Et fusjonsprotein som omfatter en sekvens fra human SOD (hSOD) og en epitop fra c33c området tilsettes, og også et andre HRP-merket antistoff som er rettet mot SOD-delen av fusjonsproteinet. SOD-c33c fusjonen vil binde til anti-NS3 antistoffet og anti-SOD antistoffet vil deretter binde til SOD-c33c fusjonsproteinet. Deteksjon av merkelappen indikerer tilstedeværelsen av HCV-infeksjon.

En annen representativ analyse ifølge oppfinnelsen er vist i figur 8. Antistoffanalyse-konfigurasjonen er en antigen-antistoff sandwich capture-analyse som anvender både NS3/4a og MEFA 12. Det faste underlaget omfatter de to anti-kjerne monoklonale antistoffene som er beskrevet over, en epitop til NS3/4a så vel som en representativ MEFA, MEFA 12 som omfatter en trunkert utgave av humant SOD. Som med analysene over, settes den biologiske prøven til det faste underlaget. HCV kjerneantigen, så vel som antistoffer som er rettet mot NS3/4a-epitopen og epitoper fra MEFAer som er til stede i prøven, vil binde til reagensene som er bundet på det faste underlaget. To antigener, et som er reaktivt med antistoffer fra prøven som binder NS3/4a (slik som beskrevet over) og et som er reaktivt med antistoffer fra prøven som binder MEFA 12, tilsettes. I figur 8 er antigenet som reagerer med MEFA 12/prøve antistoffkompleks en fusjon mellom et SOD-molekyl og c22ksA47-L44W. c22ks antigenet er fira kjerneområdet og omfatter aminosyrer Lysiotil Ser^ i polyproteinet, så vel som en delesjon av Arg47 som normalt er til stede og en substitusjon av Trp med Leu i posisjon 44. Antistoffdeteksjonskonju-gatet er det andre HRP-merkede monoklonale anti-SOD antistoffet som er beskrevet over.

Den ovenfor beskrevne antigen/antistoff-kombinasjonsanalysen er spesielt fordelaktig da både HCV kjerneantigenet og antistoffene mot NS3/4a og/eller kjernen kan påvises med samme underlaget i samme analysen. Dessuten, slik som beskrevet over, kan ekstra hev epitoper, slik som SOD fusert med clOO, 5-1-1, NS5 antigener så vel som et protein som resulterer fra et rammeskifte i kjerneområdet i polyproteinet, slik som beskrevet i internasjonal publikasjon WO 99/63941, anvendes i kombinasjonscocktailen for å dek-ke andre ikke-strukturelle epitoper av HCV.

For ytterligere å forstå oppfinnelsen, gis en mer detaljert diskusjon nedenfor som angår fremstilling av antistoffer til anvendelse i de aktuelle immunoanalysene, fremstilling av polypeptider til anvendelse i immunoanalysene og fremgangsmåter til gjennomføring av immunoanalysene.

Fremstilling av antistoffer til anvendelse i HCV- immunoanalvsene

Som forklart over, benytter analysene ulike antistoffer som er bundet til et fast underlag (f. eks. et eller flere anti-kjerne antistoffer) og som detekterer antigen/antistoff komplekser som dannes når HCV-infeksjon er til stede i prøven. Disse antistoffene kan være polyklonale eller monklonale antistoff-preparater, monospesifikke antisera, humane antistoffer eller kan være hybride eller kimære antistoffer slik som humaniserte antistoffer, endrede antistoffer, F(ab')2 fragmenter, F(ab) fragmenter, Fv fragmenter, enkelt-domene antistoffer, dimere eller trimere antistoff-fragmentkonstruksjoner, ministoffer eller funksjonelle fragmenter derav som binder til det aktuelle antigenet.

Antistoffer fremstilles ved anvendelse av teknikker som er velkjent for en fagmann på området og er for eksempel beskrevet i US patent 4 011 308, 4 722 890, 4 016 043, 3 876 504,3 770 380 og 4 372 745. For eksempel genereres polyklonale antistoffer ved immunisering av et egnet dyr, slik som en mus, rotte, kanin, sau eller geit med det aktuelle antigenet. For å forsterke immunogenisitet kan antigenet bindes til en bærer før immunisering. Slike bærere er velkjente for en fagmann på området. Immunisering utfø-res stort sett ved å blande eller emulgere antigenet i saltløsning, fortrinnsvis i en adjuvans slik som Freunds komplett adjuvans og injisere blandingen eller emulsjonen paren-teralt (stort sett subkutant eller intramuskulært). Dyret boostes stort sett 2-6 uker senere med en eller flere injeksjoner av antigenet i saltløsning, fortrinnsvis ved anvendelse av Freunds ufullstendige adjuvans. Antistoffer kan også genereres ved in vitro immunisering ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen fagområdet. Polyklonalt antiserum oppnås fra det immuniserte dyret. Se f. eks. Houghton et al., US patent 5 350 671 for en beskrivelse av fremstillingen av HCV-polyklonale antistoffer.

Monoklonale antistoffer fremstilles stort sett ved anvendelse av fremgangsmåten til Kohler og Milstein (1975) Nature 256: 495-497 eller en modifisering derav. Typisk immuniseres en mus eller rotte slik som beskrevet over. Heller enn å la dyret blø for å ekstrahere serum, fjernes milten (og valgfritt flere store lymfeknuter) og dissossieres til enkeltceller. Dersom ønskelig kan milten screenes (etter fjerning av ikke-spesifikt ved-heftede celler) ved å påføre en cellesuspensjon på en plate eller brønn som er coated med antigenet. B-celler som ekspresserer membranbundne immunoglobuliner som er spesifikke for antigenet, vil binde til platen og vaskes ikke bort med resten av suspen-sjonen. Resulterende B-celler eller alle dissosierte miltceller induseres så til å fusere med myelomaceller for å danne hybridomer og dyrkes i et seleksjonsmedium (f. eks. hypoxantin, aminopterin, tymidin medium, "HAT"). De resulterende hydridomene plates ut med begrensende fortynning og analyseres med hensyn til produksjon av antistof fer som binder spesifikt til det immuniserende antigenet (og som ikke binder til ikke-beslektede antigener). De selekterte monoklonale antistoff-sekreterende hybridomene dyrkes deretter enten in vitro (f. eks. i vevskulturflasker eller hule fiberreaktorer) eller in vivo (f. eks. som asciter i mus).

Produksjonen av ulike anti-HCV monklonale antistoffer er beskrevet i f. eks. Houghton et al, US patent 5 350 671, Chien et al., internasjonal publikasjon WO 93/00365, godkjent US patentsøknad med serienummer 08/403 590 og 08/444 818 og Kashiwakuma et al, US patent 5 871 904.

Som forklart over vil antistoff-fragmenter som har beholdt evnen til å gjenkjenne det aktuelle antigenet også finne anvendelse i de foreliggende immunoanalysene. Et antall antistoff-fragmenter som omfatter antigenbindingsseter som er i stand til å utøve de immunologiske bindingsegenskapene til et intakt antistoff molekyl, er kjent innen fagområdet. For eksempel kan funksjonelle antistoff-fragmenter fremstilles ved spalting av et konstant område som ikke er ansvarlig for binding av antigen, fra antistoffmolekylet ved anvendelse av f. eks. pepsin, for å fremstille F(ab')2-fragmenter. Disse fragmentene vil inneholde to antigenbindingsseter, men mangler en del av det konstante området fra hver av de tunge kjedene. På tilsvarende måte kan, dersom ønskelig, Fab-fragmenter som omfatter et enkelt antigenbindingssete fremstilles f. eks. ved fordøying av polyklonale eller monoklonale antistoffer med papain. Funksjonelle fragmenter, inkludert kun de variable områdene i de tunge og lette kjedene kan også fremstilles ved anvendelse av standard teknikker slik som rekombinant fremstilling eller preferanseproteolytisk spalting av immunoglobulinmolekyler. Disse fragmentene er kjent som Fv. Se f. eks. Inbar et al. (1972) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69: 2659-2662, Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710 og Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096.

Et enkeltkjede Fv ("sFv" eller "scFv") polypeptid er en kovalent bundet Vh-Vl heterodimer som ekspresseres fra en genfusjon som omfatter Vn-VL-kodende gener som er bundet sammen med en peptidkodende linker. Huston et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883. Et stort antall fremgangsmåter er beskrevet for å skille og ut-vikle kjemiske strukturer (linkere) til konvertering av de naturlig aggregerte, men kjemisk separerte lette og tunge polypeptidkjedene fra et antistoff V-område til et cFv molekyl som vil foldes til en tredimensjonal struktur som er vesentlig lik strukturen til et antigenbindende sete. Se f. eks. US patent 5 091 513, 5 132 405 og 4 946 778. sFv-molekylene kan fremstilles ved anvendelse av fremgangsmåter som er beskrevet innen fagområdet. Se f. eks. Huston et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883, US patent 5 091 513, 5 132 405 og 4 946 778. Designkriterier omfatter bestemmelse av den riktige lengde for å spenne over avstanden mellom den C-terminale enden i en kjede og den N-terminale enden i den andre, hvori linkeren stort sett dannes av små hydrofile aminosyreresidier som ikke har en tilbøyelighet til å rulle seg sammen eller å danne sekundærstrukturer. Slike fremgangsmåter er beskrevet innen fagområdet. Se for eksempel US patenter 5 091 513, 5 132 405 og 4 946 778. Egnede linkere omfatter stort sett polypeptidkjeder med alternerende sett av glycin og serinresidier og kan omfatte glutaminsyre og lysinresidier som er innsatt for å forsterke løseligheten.

"Mini-antistoffer" eller "ministoffer" vil også finne anvendelse i foreliggende oppfinnelse. Ministoffer er sFv polypeptidkjeder som omfatter oligomeriseringsdomener i deres C-terminale ender, adskilt fra sFv med et leddområde. Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584. Oligomeriseirngsdomenet omfatter selv-assosierende a-helikser, f. eks. leucin glidelåser som ytterligere kan stabiliseres av ekstra disulfidbindinger. Oligomeri-seringsdomenet er designet for å være kompatibelt med den vektorielle foldingen over en membran, en fremgangsmåte som er tenkt å lette in vivo folding av polypeptidet til et funksjonelt bindingsprotein. Stort sett fremstilles ministoffer ved anvendelse av rekombinante fremgangsmåter som er velkjent innen fagområdet. Se f. eks. Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584, Cumber et al. (1992) J. Immunology 149B: 120-126.

Fremstilling av antigener til anvendelse i HCV- immunoanalysene

Som forklart over fremstilles molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse stort sett rekombinant. Derfor kan polynukleotidene som koder for HCV-antigener til anvendelse i foreliggende oppfinnelse lages ved anvendelse av standard molekylærbiologiske teknikker. For eksempel kan polynukleotidsekvenser som koder for de ovenfor beskrevne molekylene oppnås ved anvendelse av rekombinante fremgangsmåter slik som ved screening av cDNA og genomiske bibliotek fra celler som uttrykker genet eller ved å avlede genet fra en vektor som er kjent å inneholde den. Dessuten kan det ønskede genet isoleres direkte fra virale nukleinsyremolekyler ved anvendelse av teknikker som er beskrevet innen fagområdet, slik som i Houghton et al., US patent 5 350 671. Genet av interesse kan også fremstilles syntetisk fremfor å klones. Molekylene kan lages med hensiktsmessige kodoner for den spesielle sekvensen. Den fullstendige sekvensen settes så sammen av overlappende oligonukleotider som er fremstilt ved standard fremgangsmåter og satt sammen til en kodende sekvens. Se f. eks. Edge (1981) Nature 292: 756, Nambair et al. (1984) Science 223: 1299 og Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311. Derfor kan spesielle nukleotidsekvenser oppnås fra vektorer som rommer de ønskede sekvensene eller syntetiseres fullstendig eller delvis ved anvendelse av ulike oligo-nukleotid synteseteknikker som er kjent innen fagområdet, slik som seterettet mutagenese og polymerase kjedereaksjons (PCR) teknikker der hvor det er hensiktsmessig. Se f. eks. Sambrook, supra. Spesielt er en fremgangsmåte for å oppnå nukleotidsekvenser som koder for de ønskede sekvensene, å anneale komplementære sett overlappende syntetiske oligonukleotider som er fremstilt på en konvensjonell, automatisert polynukleotid syntesemaskin, etterfulgt av ligering med en hensiktsmessig DNA-ligase og amplifisere av de ligerte nukleotidsekvensene via PVR. Se f. eks. Jayaraman et al.

(1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88: 4084-4088.

I tillegg kan oligonukleotidrettet syntese (Jones et al. (1986) Nature 54: 75-82), oligonukleotidrettet mutagenese av pre-eksisterende nukleotidområder (Riechmann et al.

(1988) Nature 332:323-327 og Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536) og enzymatisk innfylling av oligonukleotider med gap ved anvendelse av T4DNA-polymerase (Queen et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033) anvendes i oppfinnelsen for å tilveiebringe molekyler med endret eller forsterkede antigen-bindings evner og/eller redusert immunogenisitet.

Straks kodende sekvenser er fremstilt eller isolert kan slike sekvenser klones inn i en hvilken som helst egnet vektor eller replikon. Uttallige kloningsvektorer er kjent for en fagmann på området og seleksjonen av en hensiktsmessig klonings vektor dreier seg om valg. Egnede vektorer omfatter, men er ikke begrenset til plasmider, fager, transposoner, cosmider, kromosomer eller virus som er i stand til å replikere når de er forbundet med de riktige kontrollelementene.

Den kodende sekvensen settes da under kontroll av egnede kontrollelementer, avhengig av systemet som anvendes til ekspresjon. Derfor kan den kodende sekvensen settes under kontrollen av en promoter, ribosombindingssete (for bakteriell ekspresjon) og valgfritt en operator slik at DNA-sekvensen av interesse transkriberes til RNA av en egnet transformant. Den kodende sekvensen kan eller kan ikke inneholde et enkelt peptid eller ledersekvens som senere kan fjernes av verten i post-translasjonell prosessering. Se f. eks. US patent 4 431 739,4 425 437, 4 338 397.

I tillegg til kontrollsekvenser kan det være ønskelig å tilsette regulatoriske sekvenser som tillater regulering av ekspresjonen av sekvensen relativt til veksten av vertscellen. Regulatoriske sekvenser er kjent for en fagmann på området og eksempler omfatter de som forårsaker ekspresjonen av et gen som kan slås på eller av i respons på en kjemisk eller fysisk stimulans, inkludert tilstedeværelsen av en regulatorisk forbindelse. Andre typer regulatoriske elementer kan også være tilstede i vektoren. For eksempel kan en-hancer-elementer anvendes heri for å øke ekspresjonsnivåer av konstruksjonene. Eksempler omfatter SV40 tidlig genenhancer (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), en-hancer/promoteren som er avledet fra det lange terminale repeatet (LTR) fra Rous Sar-coma Virus (Gorman et al. (1982) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79: 6777) og elementer som er avledet fra humant CMV (Boshart et al. (1985) Cell 41:521) slik som elementer som er omfattet av CMV intron A sekvensen (US patent 5 688 688). Ekspresjonskassetten kan ytterligere omfatte et replikajonsorigo for autonom replikasjon i en egnet vertscelle, en eller flere selekterbare markører, et eller flere restriksjonsseter, et potensiale for høyt kopitall og en sterk promoter.

En ekspresjonsvektor konstrueres slik at en bestemt kodende sekvens er lokalisert i vektoren med de hensiktsmessige regulatoriske sekvensene, posisjonering og orientering av den kodende sekvensen med hensyn til kontrollsekvensen slik at den kodende sekvensen transkriberes under "kontroll" av kontrollsekvenser (dvs. RNA polymerase som binder til DNA-molekylet i kontrollsekvensene som transkriberer den kodende sekvensen). Modifisering av sekvensen som koder for molekylet av interesse kan være ønskelig for å oppnå denne enden. For eksempel kan det i noen tilfeller være nødvendig å modifisere sekvensen slik at den kan festes til kontrollsekvensene i hensiktsmessig orientering, dvs. for å opprettholde leserammen. Kontrollsekvensene og andre regulatoriske sekvenser kan ligeres til den kodende sekvensen før innsettingen i en vektor. Alternativt kan den kodende sekvensen klones direkte inn i en ekspresjonsvektor som allerede inneholder kontrollsekvenser og et hensiktsmessig restriksjonssete.

Som forklart over kan det også være ønskelig å fremstille mutanter eller analoger av antigenet av interesse. Dette er spesielt riktig for NS3/4a. Fremgangsmåter for å gjøre slik er beskrevet i f. eks. Dasmahapatra et al, US patent 5 843 752 og Zhang et al., US patent 5 990 276. Mutanter eller analoger av disse eller andre HCV-proteiner til anvendelse i foreliggende analyser kan fremstilles ved delesjonen av en del av sekvensen som koder for polypeptidet av interesse ved innsetting av en sekvens og/eller ved substitusjon av en eller flere nukleotidsekvenser, slik som seterettet mutagenese og liknende er velkjent for en fagmann på området. Se f. eks. Sambrook et al, supra, Kunkel, T. A.

(1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1985) 82: 448, Geisselsoder et al. (1987) BioTechniques 5: 786, Zoller og Smith (1983) Methods Enzymol. 100: 468, Dalbie-McFarland et al. (1982) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:6409. Molekylene kan ekspresseres i mange ulike systemer, inkludert insekter, pattedyr, bakterielle, virale og gjærekspresjonssystemer som alle er velkjente innen fagområdet.

For eksempel er insektscelle-ekspresjonssytemer slik som baculovirussystemer kjent for en fagmann på området f. eks. beskrevet i Summers og Smith, Texas Agricultural Expe-riment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materialer og fremgangsmåter for baculovi-rus/insektscelle-ekspresjonssystemer er kommersielt tilgjengelige i kit-form fra blant annet Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit). På liknende måte er bakterielle og pattedyr celleekspresjonssystemer velkjent innen fagområdet og beskrevet i f. eks. Sambrook et al., supra. Gjærekspresjonssystemer er også kjent innen fagområdet og beskrevet i f. eks. Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London.

Et antall hensiktsmessige vertsceller til anvendelse med de ovennevnte systemene er også kjent. For eksempel er mammalske cellelinjer kjent innen fagområdet og omfatter udødelige cellelinjer som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection (ATCC) slik som, men ikke begrenset til kinesisk hamster ovarieceller (CHO), HeLa-celler, babyhamster nyreceller (BHK), apenyreceller (COS), humane embryonyreceller, humane hepatocellulære karsinomceller (f. eks. Hep G2), Madin-Darby bovin nyreceller ("MDBK") så vel som andre. På liknende måte vil bakterieverter slik som E. coli, Bacil-lus subtilis og Streptococcus spp. finne anvendelse med foreliggende ekspresjonskonst-ruksjoner. Gjærverter som er nyttige i foreliggende oppfinnelse omfatter blant annet Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe og Yarrowia lipolytica. Insektceller til anvendelse med baculovirusekspresjonsvektorer omfatter blant annet Åedes aegypti, Autographa cali-fornica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda og Trichoplu-sia ni.

Nukleinsyremolekyler som omfatter nukleotidsekvenser av interesse kan stabilt integreres i et vertscellegenom eller opprettholdes på et stabilt episomalt element i en egnet vertscelle ved anvendelse av ulike genleveringsteknikker som er velkjent innen fagområdet. Se f. eks. US patent 5 399 346.

Avhengig av ekspresjonssystem og vert som velges, fremstilles molekylene ved dyrking av vertsceller som er transformert med en ekspresjonsvektor som er beskrevet over, under betingelser hvorved proteinet ekspresseres. Det ekspresserte proteinet isoleres deretter fra vertscellen og renses. Dersom ekspresjonssystemet sekreterer proteinet i dyrkningsmediumet, kan produktet renses direkte fra mediumet. Dersom det ikke sekre-teres, kan det isoleres fra cellelysater. Seleksjonen av hensiktsmessige dyrkningsbeting-elser og fremgangsmåter for gjenvinning er innenfor kunnskapen til en fagmann på området.

Den rekombinante fremstillingen av ulike HCV-antigener er beskrevet. Se f. eks. Houghton et al, US patent 5 350 671, Chien et al, J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39, Chien et al, internasjonal publikasjon WO 93/00365, Chien, D. Y., internasjonal publikasjon WO 94/01778.

Immunodiagnostiske analyser

Straks de er produsert, plasseres de ovenfornevnte anti-kjerne antistoffene og NS3/4a antigenene på et passende fast underlag for anvendelse i de aktuelle immunoanalysene. Et fast underlag i forbindelse med foreliggende oppfinnelse kan være et hvilket som helst materiale som er en uløselig matriks og kan ha en stiv eller halvstiv overflate. Eksempler på faste underlag omfatter, men er ikke begrenset til substrater slik som nitro-cellulose (f. eks. i membran eller mikrotiterbrønn form), polyvinylklorid (f. eks. ark eller mikrotiterbrønner), polystyren lateks (f. eks. kuler eller mikrotiterplater), polyviny-lidin fluorid, diazotisert papir, nylonmembraner, aktiverte kuler, magnetisk mottagelige kuler og liknende. Spesielle underlag omfatter plater, pelleter, skiver, kapillærrør, hule fibre, nåler, pinner, faste fibre, cellulosekuler, poreglasskuler, silikageler, polystyrenku-ler valgfritt kryssbundet med divinylbenzen, transplanterte ko-polykuler, polyakryla-midkuler, latekskuler, dimetylakrylamidkuler valgfritt kryssbundet med N-N'-bis-akryloyletylendiamin og glasspartikler som er belagt med en hydrofob polymer.

Dersom ønskelig kan molekylene som skal settes til det faste underlaget enkelt gjøres mer funksjonelle for å danne styren eller akrylat enheter, som derved muliggjør inkor-poreringen av molekylene i polystyren, polyakrylat eller andre polymerer slik som po-lyimid, polyakrylamid, polyetylen, polyvinyl, polydiacetylen, polyfenylen-vinylen, polypeptid, polysakkarid, polysulfon, polypyrrol, polyimidazol, polytiofen, polyeter, epoksier, silikaglass, silikagel, siloksan, polyfosfat, hydrogel, agarose, cellulose og liknende.

I en sammenheng reagerer først et fast underlag med HCV anti-kjerne antistoffer og NS3/4a epitop (kollektivt omtalt som "fastfase komponentene" heri) og valgfritt et eller flere MEFA under egnede bindingsbetingelser, slik at molekylene immobiliseres til strekkelig på underlaget. Noen ganger kan immobiliseringen på underlaget forsterkes ved først å koble antigenet og/eller antistoff til et protein med bedre fastfase-bindings egenskaper. Egnede koblingsproteiner omfatter, men er ikke begrenset til makromolekyler slik som serumalbuminer inkludert bovint serumalbumin (BSA), "keyhole limpet" hemocyanin, immunoglobulin molekyler, thyroglobulin, ovalbumin og andre proteiner som er velkjent for en fagmann på området. Andre reagenser som kan anvendes for å binde molekyler til underlaget inkludert polysakkarider, polymelkesyrer, polyglykolsy-rer, polymere aminosyrer, aminosyre kopolymerer og liknende. Slike molekyler og fremgangsmåter for kobling av disse molekylene til antigener er velkjent for en fagmann på området. Se f. eks. Brinkley, M. A. (1992) Bioconjugate Chem. 3:2-13, Hashida et al. (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63 og Anjaneyulu og Staros (1987) Inter-national J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124.

Etter at det faste underlaget har reagert med fast-fase komponentene, fjernes alle ikke-immobiliserte fast-fase komponenter fra underlaget ved vasking og komponentene som er bundet til underlaget kontaktes deretter med en biologisk prøve som det mistenkes at inneholder HCV-antistoffer og antigener (kollektivt betegnet "ligand molekyler" heri) under egnede betingelser. Etter vask for å fjerne alle ubundne ligandmolekyler, tilsettes et andre anti-kjerne antistoff som er rettet mot en annen epitop enn anti-kjerne antistoffet som er bundet til underlaget, under egnede betingelser. Det tilsatte anti-kjerne antistoffet omfatter et detekterbart merke slik som beskrevet over og virker for å binde alle kjerne-antigener som kan være tilstede i prøven som har reagert med anti-kjerne antistoffet som er bundet til underlaget. Det tilsettes også et eller flere antigener som kan reagere med antistoffer som er tilstede i prøven som i tur har reagert med NS3/4a-epitopen. Som forklart over, er antigenet typisk avledet fra NS3-området i HCV-polyproteinet og spesielt fra c33c-området i HCV. Se Houghton et al, US patent 5 350 671, Chien et la., Proe. Nati. Acad. Sei. (1989) 89: 10011-10015, internasjonal publikasjon WO 93/00365 og godkjent US patentsøknad med serienummer 08/403 590 og 08/444 818, for en beskrivelse av dette området og epitoper som er avledet derfra. Et merket antistoff rettet mot dette antigenet tilsettes også. Antistoffet vil derfor binde antigenet som har reagert med anti-NS3 antistoffer som er tilstede i prøven. Til dette formålet kan c33c-epitopen beleilig tilveiebringes som en fusjon mellom c33c og human superoksiddismutase (hSOD), rekombinant fremstilt ved f. eks. ved fremgangsmåter som er beskrevet i Houghton et al., US patent 5 350 671. Nukleotid og aminosyresekvensene til humant SOD er kjente og oppgitt i Hallewell et al, US patent 5 710 033. Et merket antistoff som er rettet mot humant SOD kan derfor anvendes for å påvise tilstedeværelsen av komplekser som er dannet mellom NS3/4a-epitopen, hvilket som helst antistoffer i prøven som reagerer med denne epitopen og HCV polypeptider som deretter binder antistoffet i prøven.

Dersom et MEFA er tilstede på det fast underlaget, kan et eller flere ekstra antigener som er reaktive med antistoffer fra den biologiske prøven som er bundet til antigener som er tilstede på MEFA, også settes til analysen. Spesielt nyttig i denne sammenheng er et antigen som er avledet fra kjerneområdet i HCV og mer spesielt fra c22 antigenet som omfatter 119 N-terminal kjerneaminosyrer fra HCV polyproteinet. Et bestemt antigen som er avledet fra c22 er c22ksA47-L44W som inkluderer aminosyrer Lysiotil Ser99fra polyproteinet, så vel som en delesjon av Arg47 som normalt er tilstede og en substitusjon av Trp med Leu i posisjon 44. Som for c33c-epitopen som er beskrevet over, kan dette antigenet tilveiebringes som en fusjon med hSOD og det samme merkede antistoffet som er rettet mot humant SOD, kan anvendes for å påvise tilstedeværelsen av komplekser som er dannet mellom antistoffer som er tilstede i prøven og NS3/4a-epitopen og/eller MEFA, hvilke komplekser også er bundet med HCV-antigenene (f. eks. c33c og c22).

Mer spesielt kan en ELISA-fremgangsmåte anvendes, hvori brønnene på en mikrotiterplate er coatet med fastfase-komponentene. En biologisk prøve som inneholder eller som er mistenkt at inneholder ligand-molekyler, settes så til de coatede brønnene. Etter en inkuberingsperiode som er tilstrekkelig til å tillate at ligandmolekyler binder til de immobiliserte fastfase-komponentene, kan platen(e) vaskes for å fjerne ubundne deler, tilsettes et detekterbart merket sekundært bindingsmolekyl (merket anti-kjerne antistoff), et NS3-epitopinneholdende molekyl og et antistoff som er rettet mot det NS3-epitopinneholdende molekylet. Disse molekylene tillates å reagere med hvilket som helst "captured" antigen og antistoff i prøve, platene vaskes og tilstedeværelsen av de merkede antistoffene påvises ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjent innen fagområdet.

De ovenfor beskrevne analyse-reagensene, inkludert immunoanalysens faste underlag med bundne antistoffer og antigener, så vel som antistoffer og antigener som skal reagere med den "captured" prøven, kan fåes i kits med hensiktsmessige bruksanvisninger og andre reagenser som er nødvendige for å gjennomføre immunoanalyser slik som beskrevet over. Kittet kan også inneholde, avhengig av den bestemte immunoanalysen som anvendes, egnede markører og andre pakkede reagenser og materialer (dvs. vaske-buffere og liknende). Standard immunoanalyser, slik som de som er beskrevet over, kan utføres ved anvendelse av disse kittene.

III. Forsøk

Nedenfor er eksempler på spesifikke utførelsesformer til utføring av foreliggende oppfinnelse. Eksemplene er kun ment å illustrere, og er ikke ment å begrense omfanget av foreliggende oppfinnelse på noen måte.

Det er forsøkt å sikre nøyaktighet med hensyn til tall som er anvendt (f. eks. mengder, temperaturer etc.), men noen forsøksfeil og avvik må allikevel regnes med.

EKSEMPEL 1

HCV- antigen/ antistoff- kombinasjons immunoanalyse

Foreliggende HCV-antigen/antisoff-kombinasjons immunoanalyse ble sammenlignet med andre HCV-analyser for å teste serokonversjons deteksjonsgrenser og sammenligne disse grensene med de som er oppnådd i andre kommersielt tilgjengelige analyser, som følger.

A. Materialer og fremgangsmåter

Blodprøver: Paneler av kommersielt tilgjengelige blodprøver ble anvendt. Slike paneler er f. eks. tilgjengelige fra Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI), Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP) og North American Biologics, Inc., BocoRa-tan, FL (NABI). Dagene som er indikert i tabell 5 og 6 er dager som blodprøver ble tatt fra individene.

Monoklonale antistoffer: monoklonale antistoffer cl 1-3, cl 1-7 og cl 1-14 ble oppnådd fra Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey, cl 1-3 og cl 1-7 antistoffer er rettet mot en N-terminal del av kjernen (aminosyrer 10-53, nummerert relativt til HCV-polyproteinet). Monoklonalt antistoff cl 1-14 er rettet mot en C-terminal del av kjernen (aminosyrer 120-130, nummerert relativt til HCV 1-polyproteinet). cl 1-14 antistoffet ble konjugert til pepperrot peroksidase (HRP) ved anvendelse av standard fremgangsmåter.

Monoklonalt antistoff 5A-3 er et anti-SOD antistoff som er rettet mot aminosyrer 1 til 65 i SOD og ble laget ved anvendelse av standard teknikker. Antistoffet ble konjugert til HRP slik som beskrevet over.

B. Antigener:

c33c-antigenet (266 aminosyrer, aminosyrer 1192 til 1457 i HCV 1-polyproteinet) ble ekspressert som et indre SOD-fusjonspolypeptid i E. coli ved fremgangsmåter som er beskrevet for syntesen av 5-1-1 antigenet (Choo et al., Science (1989) 244:359-362).

Det rekombinante antigenet ble renset slik som beskrevet i Chien et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (19889) 89:10011-10015. Se også Houghton et al, US patent 5 350 671 for fremstillingsprotokoller av SOD-c33c.

NS3/4a-epitopen som er anvendt i analysen er en konformasjonsepitop som har sekvensen som er beskrevet i figur 3.

C. Immunoanalyseformat:

Abbott PPJSM analysen (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) er kommersielt tilgjengelig og er en antistoff-basert påvisningsanalyse. Analysen utføres ved anvendelse av fabrikantens instruksjoner.

ORTHO HCV Versjon 3.0 ELISA testsystem (betegnet Ortho 3.0 analyse heri, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) er en antistoff-basert påvisningsanalyse. Analysen utføres ved anvendelse av fabrikantens anvisninger.

Roche Amplicor analyse (Roche, Pleasant, CA) er en kommersielt tilgjengelig PCR-basert analyse. Analysen utføres ved anvendelse av fabrikantens anvisninger.

Gen-Probe TMA analysen (San Diego, CA) er en kommersielt tilgjengelig transkrip-sjonsmediert amplifiseringsanalyse. Analysen utføres ved anvendelse av fabrikantens anvisninger.

Ortho antigenanalysen (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) er en antigen-basert analyse. Analysen utføres ved anvendelse av fabrikantens anvisninger.

Den aktuelle HCV antigen/antistoff kombinasjonsimmunoanalysen utføres på følgende måte. 4 mg/ml hver av rensete monoklonale antistoffer Cll-7ogCll-3ilx fosfatbuf-ret saltløsning (PBS), pH 7.4 blandes godt sammen. 90 ng av det rekombinante

<**>NS3/4a antigenet settes til samme coatingbuffer. Løsningen blandes i 30 minutter før coating. 200 ml av ovennevnte løsning settes til hver brønn på en 96-brønners Costar mediumbindings mikrotiterplater (Corning, Inc.). Plater inkuberes ved 15-30°C i 16-24 timer. Plater vaskes to ganger med dH20, etterfulgt av 300 ul/brønn postcoat buffer (1% bovint serumalbumin (BSA), 1 x PBS) i 1 time og 300 (il/brønn stabiliseringsbuffer (lx PBS, 1 % BSA, mannitol, polyetylenglykol (PEG), gelatin) i 1 time. Plater aspireres og tørkes ved 4°C i en lyofilisator i 24 timer. Plater puttes i en lomme med tørkemidler.

For å utføre antigen/antistoff-kombinasjons immunoanalysen tilsettes 100 (il forsterket lyseringsbuffer (1% N-laurylsarcosin, 0.65 M NaCl, 50 mg/ml muse IgG teknisk kvali-tet (Sigma, St. Louis, MO), 1 % BSA sulfhydryl-modifisert (Bayer), 0.1 % Casein) til platen. 100 ml prøve tilsettes deretter. Dette inkuberes på en shaker ved 40°C i 1 time. Platene vaskes 6 ganger med 1 x PBS, 0.1 % Tween-20 på en Ortho Plate Washer. 200 ml konjugeringsløsning (1 : 75 fortynning cl 1-14-HRP med 250 ng/analyse SOD-c33c antigen pluss 1:5000 fortynning muse anti-SOD-HRP i HCV 3.0 prøve fortynningsmid-del (fra ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) uten SOD ekstrakt, alt fremstilt 30 minutter før tilsetting). Løs-ningen inkuberes 45 minutter med risting ved 40°C. Dette vaskes 6 ganger slik som over, og 200 ml substratløsning (1 OPD tablett/10 ml) tilsettes. OPD-tabletten inneholder o-fenylendiamin dihydroklorid og hydrogenperoksid for pepperrotperoksidase reak-sjon fargeutvikling og er tilgjengelig fra Sigma, St. Louis, MO. Dette inkuberes 30 minutter ved 15-30°C i mørket. Reaksjonen stoppes ved å tilsette 50 ml 4N H2SO4og platene avleses ved 493 nm relativt til absorbansen ved 690 nm som kontroll.

D. Resultater:

Resultatene av de ulike analysene er vist i tabell 5 og 6, som viser to adskilte forsøk som er utført på blodprøver som er eksponert for HCV-infeksjon slik som indikert. Skyggelagte områder indikerer påvisning av virus. Som vist nedenfor påviste Chiron's kombinasjon-antigen/antistoff analysen serokonversjon i alle prøver, mens alle andre antistoff- og antigen-baserte analyser ikke påviste serokonversjon i minst 1 prøve. Spesielt påviste ingen av de antistoff-baserte analysene serokonversjon inntil minst dag 18 (tabell 5). Tabell 6 viser at ingen av de antistoff-baserte analysene detekterte tilstedeværelsen av HCV-infeksjon på dag 22. Dessuten påviste ikke den Ortho antigen-baserte analysen serokonversjon fra dag 85 og videre.

Derfor, basert på resultatene ovenfor er det klart at den nye kombinasjons antistoff/antigen-analysen reduserer antallet falske negativer som oppnås ved anvendelse av andre konvensjonelle antistoff- og antigen-baserte analyser.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av en NS3/ 4a konformasjonsepitop med Thr til Pro og Ser til Ile substitusjoner

En konformasjonsepitop av NS3/4a ble oppnådd på følgende måte. Denne epitopen har sekvensen som er oppgitt i figurene 4A til 4D og er forskjellig fra den native sekvensen i posisjon 403 (aminosyre 1428 i HCV-1 fullengdesekvensen) og 404 (aminosyre 1429 i HCV-1 fullengdesekvensen). Spesielt er Thr som normalt forekommer i posisjon 1428 i den native sekvensen, mutert til Pro og Ser som forekommer i posisjon 1429 i den native sekvensen, er mutert til Ile.

Særlig ble gjærekspresjonsvektoren pBS24.1 anvendt som beskrevet over. Plasmid pd.hcvla.ns3ns4aPI som koder for en representativ NS3/4a epitop som anvendes i de foreliggende immunoanalysene, ble fremstilt på følgende måte. En to-trinns fremgangsmåte ble anvendt. Først ble de følgende DNA-bitene ligert sammen: (a) syntetiske oligonukleotider som vil tilveiebringe et 5 'Hindlll-kloningssete etterfulgt av sekvensen ACAAAACAAA, initiatoren ATG og kodoner for HCV la som starter med aminosyre 1027 og fortsetter til et Bgll-sete i aminosyre 1046, (b) et 683 bp BgH-Clal restriksjonsfragment (som koder for aminosyrer 1046-1274) fra pAcHLTns3ns4aPI og (c) en pSP72 vektor (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL aksesjonsnummer X65332) som er fordøyd med Hindlll og Clal, defosforylert og renset på gel. Plasmid pAcHLTns3ns4aPI ble avledet fra pAcHLT, en baculovirusekspresjonsvektor som er kommersielt tilgjengelig fra BD Pharmingen (San Diego, CA). Spesielt ble en pAcHLT EcoRI-Pstl vektor fremstilt så vel som følgende fragmenter: EcoRI-Alwnl, 935 bp, som korresponderer til aminosyrer 1027-1336 i HCV-1 genomet, AlwI-SacII, 247 bp, som korresponderer til aminosyrer 1336-1419 i HCV-1 genomet, Hinfl-Bgll, 175 bp, som korresponderer til aminosyrer 1449-1509 i HCV-1 genomet, BgH-Pstl, 619 bp, som korresponderer til aminosyrer 1510-171H HCV-1 genomet pluss transkripsjonstermi-neringskodon. Et SacII-Hinfl syntetisk generert fragment på 91 bp som korresponderer til aminosyrer 1420-1448 i HCV-1 genomet og som inneholder PI-mutasjonene (Thr-1428 som er mutert til Pro, Ser-1429 som er mutert til Ile), ble ligert til 175 bp Hinfl-Bgll fragmentet og 619 bp BgH-Pstl fragmentet som er beskrevet over og subklonet inn i en pGEM-5Zf(+) vektor som er fordøyd med SacII og Pstl. pGEM-5Zf(+) er en kommersielt tilgjengelig E. coli-vektor (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL aksesjonsnummer X65308). Etter transformasjon av kompetente HB101 celler, miniscreen analyse av individuelle kloner og sekvensverifisering, ble et 885 bp SacII-Pstl fragment fra pGEM5.PI klon 2 renset på gel. Dette fragmentet ble ligert til EcoRI-Alwnl 935 bp fragmentet, Alwnl-SacII 247 bp fragmentet og pAcHLT EcoRI-Pstl vektoren som er beskrevet over. Det resulterende konstruktet ble gitt navnet pAcHLTns3ns4aPI.

Ligeringsblandingen over ble transformert inn i HB101-kompetente celler og platet ut på Luria-agarplater som inneholdt 100 ug/ml ampicillin. Miniprepanalyser av individuelle kloner førte til identifiseringen av antatt positiver, hvorav 2 ble amplifisert. Plasmid DNA fra pSP72 laHC, kloner #1 og #2 ble fremstilt med et Qiagen Maxiprep kit og sekvensert.

Deretter ble følgende fragmenter ligert sammen: (a) et 761 bp Hindlll-Clal fragment fra pSP721aHC #l(pSP72.1aHC ble generert ved å ligere sammen følgende: pSP72 som var fordøyd med Hindlll og Clal, syntetiske oligonukleotider som vil gi et 5' Hindlll kloningssete etterfulgt av sekvensen ACAAAACAAA, initieringskodon ATG og kodoner for HCVla som starter med aminosyre 1027 og fortsetter til et Bglll sete i aminosyre 1046 og et 683 bp Bglll-Clal restriksjonsfragment (som koder for aminosyrer 1046-1274) frapAcHLTns3ns4aPI), (b) et 1353 bp BamHI-Hindlll fragment for gjærhybrid-promoteren ADH2/GAPDH, (c) et 1320 bp Clal-Sall fragment (som koder for HCVla aminosyrer 1046-1711 med Thr 1428 mutert til Pro og Ser 1429 mutert til Ile) fra pAcHLTns3ns4aPI og (d) pBS24.1 gjærekspresjonsvektor som er fordøyd med BamHI og SacI, defosforylert og renset på gel. HB 101 kompetente celler transformeres med ligeringsblandingen og plates på Luria-agarplater som inneholder 100 jxg/ml ampicillin. Miniprepanalyser av individuelle kolonier førte til identifiseringen av kloner med det forventede 3446 bp BamHI-Sall innskuddet som omfattet ADH2/GAPDH promoteren, initieringskodonet ATG og HCVla NS3/4a fra aminosyrer 1027-1711 (vist som aminosyrer 1-686 i figurene 4A-4D) med Thr 1428 (aminosyreposisjon 403 i figurene 4A-4D) mutert til Pro og Ser 1429 (aminosyreposisjon 404 i figurene 4A-4D) mutert til Ile. Konstruktet ble gitt navnet pd.HCVla.ns3ns4aPI (se figur 5).

S. cerevisiae stamme AD3 ble transformert med pd.HCVla.ns3ns4aPI og enkle trans-formanter ble sjekket for ekspresjon etter uttømming av glukose fra mediumet. Rekom-binantproteinet ble uttrykt med høye nivåer i gjær slik som påvist med Coomassieblå farging og bekreftet i immunoblot analyse ved anvendelse av et polyklonalt antistoff mot helikasedomenet i NS3.

EKSEMPEL 3

Rensing av NS3/ 4a konformasjonsepitop

NS3/4a konformasjonsepitopen ble renset på følgende måte. S. cerevisiae celler fra over som ekspresserer NS3/4a-epitopen ble høstet slik som beskrevet over. Cellene ble sus-pendert i lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 8.0,150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1 uM pepstatin, 1 uM leupeptin) og lysert i en Dyno-Mill (Wab WillyA. Ba-chofon, Basel, Sveits) eller ekvivalent apparatur ved anvendelse av glasskuler i et forhold på 1:1:1 celler:buffer:0.5 mm glasskuler. Lysatet ble sentrifugert ved 30100 x g i 30 minutter ved 4°C og pelleten som inneholder den uløselige proteinfraksjonen ble satt til vaskebuffer (6 ml/g startcelle pelletvekt) og vippet ved romtemperatur i 15 minutter. Vaskebufferen bestod av 50 mM NaP04pH 8.0, 0.3 M NaCl, 5 mM (}-merkaptoetanol, 10 % glycerol, 0.05 % oktyl glukosid, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1 uM pepstatin, 1 uM leupeptin. Celledebris ble fjernet ved sentrifugering ved 30100 x g i 30 minutter ved 4°C. Supernatanten ble kastet og pelleten beholdt.

Protein ble ekstrahert fra pelleten på følgende måte. 6 ml/g ekstraksjonsbuffer ble tilsatt og vippet ved romtemperatur i 15 minutter. Ekstraksjonsbufferen består av 50 mM Tris pH 8.0,1 M NaCl, 5 mM (5-merkaptoetanol, 10 % glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1 uM pepstatin, 1 uM leupeptin. Dette ble sentrifugert ved 30100 x g i 30 minutter ved 4°C. Supernatanten ble beholdt og ammoniumsulfat ble tilsatt til 17.5 % ved anvendelse av følgende formel: volum av supernatant (ml) multiplisert med x % ammoniumsulfat/ (1 - x % ammoniumsulfat) = ml av 4.1 M mettet ammoniumsulfat til å tilsette supernatanten. Ammoniumsulfaten ble tilsatt dråpevis under røring på is og løsningen ble rørt på is i 10 minutter. Løsningen ble sentrifugert ved 17700 x g i 30 minutter ved 4°C og pelleten beholdt og oppbevart ved 2-8°C i opptil 48 timer.

Pelleten ble resuspendert og kjørt på en Poly U kolonne (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) ved 4°C på følgende måte. Pelleten resuspenderes i 6 ml Poly U ekvilibreringsbuffer pr. gram pelletvekt. Ekvilibreringsbufferen bestod av 25 mM HEPES pH 8.0,200 mM NaCl, 5 mM DTT (tilsatt fersk), 10 % glycerol, 1.2 oktylglu-kosid. Løsningen ble vippet ved 4°C i 15 minutter og sentrifugert ved 30100 x g i 30 minutter ved 4°C.

En Poly U kolonne (1 ml resin pr. gram startpelletvekt) ble klargjort. Lineær flythastig-het var 60 cm/time og pakkeflythastighet var 133 % med 60 cm/time. Kolonnen var ekvilibrert med ekvilibreringsbuffer og supernatanten til den resuspenderte ammonium-sulfatpelleten ble satt på den ekvilibrerte kolonnen. Kolonnen ble vasket til grunnlinjen med ekvilibreringsbufferen og protein eluert med en trinneluering i følgende Poly U elueringsbuffer : 25 mM HEPES pH 8.0, 0.1 M NaCl, 5 mM DTT (fersk tilsatt), 10 % glycerol, 1.2 oktyl glukosid. Kolonneeluat ble kjørt på SDS-PAGE (Coomassie farget) og aliquoter ble frøset og oppbevart ved -80°C. Tilstedeværelsen av NS3/4a epitopen ble bekreftet med Westernblot ved anvendelse av et polyklonalt antistoff rettet mot NS3 proteasedomenet og et monoklonalt antistoff mot 5-1-1 epitopen (HCV 4a).

I tillegg ble protease-enzymaktivitet registrert iløpet av rensingen på følgende måte. Et NS4A-peptid (KKGSVVIVGPJVLSGKPAIIPKK) og prøven som inneholdt NS3/4a konformasjonsepitopen ble fortynnet i 90 (il reaksjonsbuffer (25 mM Tris, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 % glycerol, 0.05 n-Dodecyl B-D-Maltosid, 5 mM DTT) og tillatt å blande seg i 30 minutter ved romtemperatur. 90 (il av blandingen ble satt til en mikrotiterplate (Costar, Inc., Corning, NY) og 10 (il HCV substrat (AnaSpec, Inc., San Jose CA) ble tilsatt. Platen ble blandet og avlest i en Fluostar plateleser. Resultater ble uttrykt som relative fluorescensenheter (RFU) pr. minutter.

Ved anvendelse av disse fremgangsmåtene inneholdt produktet av 1 M NaCl ekstrak-sjon 3.7 RFU/min aktivitet, arnmoniumsulfatpresipitatet hadde en aktivitet på 7.5 RFU/min og produktet av Poly U-rensingen hadde en aktivitet på 18.5 RFU/min.

EKSEMPEL 4

Competition- studier

Følgende competition-studie ble gjennomført for å fastsette hvorvidt NS3/4a konformasjonsepitopen detekterte forskjellige antistoffer enn andre HCV-antigener. Spesielt ble NS3/4a antigenet sammenlignet med c200 antigenet på følgende måte.

0.5 (ig og 1.0 (ig NS3/4a fremstilt slik som beskrevet over, eller c200 (Hepatology

(1992) 15:19-25, tilgjengelig i ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) ble blandet med 20 (il prøve PHV914-5 (en tidlig serokonversjonsblødning oppnådd fra et infisert individ) i et totalt volum på 220 (il (1 x PBS). Blandingen ble inkubert i 1 time i mikrobrønner ved 37°C. Blandingen ble deretter overført til NS3/4a-coatede plater og inkubert i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket og vurdert på følgende måte. 1 (ig c200 antigen ble satt til 10 (il prøve av PHV914-5 i et totalvolum på omkring 220 (il. Blandingen ble inkubert i 1 time i en mikrobrønn ved 37°C og 200 (il ble overført til en NS3/4a-coatet plate (100 ng/analyse) og inkubert i 1 time ved 37°C. Plater ble vasket 5 ganger med 1 x PBS, 0.1 % Tween-20. 200 (il konjugert løsning (beskrevet over) ble tilsatt og platene inkubert og analysert. Kontroller som bestod av PHV914-5 og 1 x PBS (uten antigen) ble også behandlet slik som over.

Resultater er vist i tabell 7. Prosent inhiberingsresultater som er vist i kolonne 4 er beregnet som kolonne 3 minus (kolonne 2 dividert med kolonne 3 multiplisert med 100). Som det fremgår viser data at NS3/4a nøytraliseres av tidlige serokonversjons antistoffer og at c200 ikke gjør det. Et sterkt signal ble oppnådd når antistoffer i PHV914-5 c33c tidlig serokonversjon panelmedlem reagerte med NS3/4a som platen var coatet med. c200 antigenet ble ikke nøytralisert av disse antistoffene. Dette er vist i det øverste panelet i tabell 7. Når NS3/4a blandes med PHV914-5-prøven, ble det nøytralisert og derfor var det ingen antistoffer tilstede i prøven til å reagere med NS3/4a som var coatet på mikrotiterplaten. Data indikerte at NS3/4a muligens kan påvise en annen klasse antistoffer enn de som påvises med c200.

EKSEMPEL 5

Stabilitetsstudier av NS3/ 4a konformasjonsepitop

For å vurdere rollen av stabiliteten til NS3/4a-epitopen for å vurdere ytelse, ble følgende studie utført for å bestemme NS3/4a immunoreaktivitet versus tid ved romtemperatur. Små aliquoter av stamløsning NS3/4a fikk stå i romtemperatur og deretter fryst i inter-valler slik som vist i tabell 8. Alle beholdere ble coatet simultant og testet mot to tidlige NS3 serokonversjonspaneler.

Som det fremgår av tabell 8, er NS3/4a stamløsning ikke stabil og immunoreaktivitet avtar med tiden. I tillegg er det nødvendig å opprettholde NS3/4a konformasjon for immunoreaktivitet.

Ytterligere stabilitetsstudier ble utført på følgende måte. 2 konformasjons monoklonale antistoffer som var lagd mot NS3/4a ved anvendelse av standard fremgangsmåter, ble substituert for anti-HCV tidlig serokonversjonspaneler. Stamløsning NS3/4a beholdere ble oppbevart ved romtemperatur i tidsintervaller på 3, 6, og 24 timer. NS3/4a fra de frosne beholderne ble coatet med 90 ng/ml og analysert ved anvendelse av fremgangsmåten som er beskrevet over. Resultater tyder på at de to monoklonalene virkelig var konformasjonelle og at deres reaktivitet var følsom for behandlingen av NS3/4a-antigen stamløsning ved romtemperatur. Reaktiviteten til et monoklonalt antistoff som positiv kontroll endret seg ikke.

EKSEMPEL 6

Immunoreaktivitet til NS3/ 4a konformasjonsepitop versus denaturert NS3/ 4a Immunoreaktiviteten til NS3/4a konformasjonsepitopen som er fremstilt slik som beskrevet over, ble sammenlignet med NS3/4a som var denaturert ved tilsetting av SDS til NS3/4a konformasjonsepitop-preparatet til en endelig konsentrasjon på 2 %. Den denaturerte NS3/4a og konformasjons NS3/4a ble coatet på mikrotiterplater slik som beskrevet over. c200-antigenet (Hepatology (1992) 15:19-25, tilgjengelig i ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) ble også coatet på mikrotiterplater. c200-antigenet ble anvendt som en sammenligning, det antas å være en ikke-konformasjon på grunn av tilstedeværelsen av reduseren-de middel (DTT) og detergent (SDS) i dets formulering.

Immunoreaktiviteten ble testet mot to tidlige serokonversjonspaneler, PHV 904 og PHV 914 (kommersielt tilgjengelige humane blodprøver fra Boston Biomedica, Inc., West Brigdewater, MA). Resultatene er vist i tabell 9. Dataene tyder på at den denaturerte eller lineariserte formen av NS3/4a (så vel som c200) ikke detekterer tidlige serokonversjonspaneler like tidlig som NS3/4a-konformasjonsepitopen.

Immunoreaktivitet til konformasjonsepitopen ble også testet ved anvendelse av monoklonale antistoffer mot NS3/4a, fremstilt ved standard fremgangsmåter. Disse monklonale antistoffene ble deretter testet i ELISA-formatet mot NS3/4a og denaturert NS3/4a og c200 antigen. Dataen viser at anti-NS3/4a monoklonaler reagerer med NS3/4a og denaturert NS3/4a på en liknende måte som serokonversjonspaneler som er vist i tabell 10. Dette resultatet tilveiebringer også ytterligere bevis for at NS3/4a er konformasjonell i naturen, da monklonale antistoffer kan lages som er liknende i reaktivitet med de tidlige c33c serokonversjonspaneler.

Følgelig er nye HCV-påvisningsanalyser beskrevet. Fra det foregående skal det forstås at selv om spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen er beskrevet heri med det formål å illustrere, kan ulike modifiseringer gjøres uten å fravike ånden og omfanget av beskri-velsen heri.

Claims

1. Fast underlag for immunoanalysekarakterisert vedat det omfatter minst et hepatitt C virus (HCV) anti-kjerne antistoff og minst en isolert HCV NS3/4a-epitop bundet dertil hvori nevnte NS3/4a-epitop er en konformasjonsepitop og omfatter aminosyresekvensen vist i figurene 4 A-4D.

2. Fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 1,karakterisertv e d at det omfatter minst to HCV anti-kjerne antistoffer bundet dertil.

3. Fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 1,karakterisertv e d at nevnte minst ene anti-kjerne antistoff er rettet mot et N-terminalt område i HCV kjerneantigenet.

4. Fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 3,karakterisertv e d at nevnte minst ene anti-kjerne antistoff er rettet mot aminosyrer 10-53 i HCV, nummerert relativt til HCV 1-polyproteinsekvensen.

5. Fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 1,karakterisertv e d at nevnte minst ene anti-kjerne antistoff er et monoklonalt antistoff.

6. Fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 1,karakterisertv e d at det ytterligere omfatter et multippelt epitopfusjonsantigen som er bundet dertil.

7. Fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 6,karakterisertv e d at nevnte multiple epitopfusjonsantigen omfatter aminosyresekvensen som er angitt i figurene 7A-7F.

8. Fast underlag for immunoanalyse ,karakterisert vedat det omfatter to hepatitt C virus (HCV) anti-kjerne monoklonale antistoffer og en HCV NS3/4a konformasjonsepitop som omfatter aminosyresekvensen som er angitt i figurene 4A-4D og et multippelt epitopfusjonsantigen som omfatter aminosyresekvensen som er angitt i figurene 7A-7F, bundet dertil.

9. Fremgangsmåte til påvisning av hepatitt C virus (HCV)-infeksjon i en biologisk prøve,karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 1, (b) kombinere en biologisk prøve med nevnte faste underlag under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er tilstede i den biologiske prøven, å binde til henholdsvis nevnte minst ene anti-kjerne antistoff og nevnte NS3/4a epitop, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart merket antistoff, hvori nevnte første detekterbart merkede antistoff er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori nevnte merkede anti-kjerne antistoff er rettet mot en annet HCV kjerne-epitop enn det minst ene anti-kjerne antistoffet som er bundet til det faste underlaget, (ii) et antigen som reagerer med et HCV-antistoff fra den biologiske prøven reaktivt med nevnte NS3/4a-epitop og (iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori nevnte andre detekterbare merkede antistoff er reaktivt med antigenet i (ii), (d) påvisning av komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9,karakterisert vedat nevnte minst ene anti-kjerne antistoff er rettet mot et N-terminalt område i HCV kjerne-antigenet og nevnte detekterbart merkede HCV anti-kjerne antistoff er rettet mot et C-terminalt område i HCV kjerneantigenet.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10,karakterisertv e d at nevnte minst ene anti-kjerne antistoff er rettet mot aminosyrer 10-53 i HCV, nummerert relativt til HCV 1-polyproteinsekvensen og nevnte detekterbart merkede HCV anti-kjerne antistoff er rettet mot aminosyrer 120-130 i HCV, nummerert relativt til HCV 1-polyproteinsekvensen.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 9,karakterisert vedat nevnte antigen som reagerer med et HCV antistoff fra den biologisk prøven som omfatter en epitop fra c33c-området i HCV-polyproteinet.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12,karakterisertv e d at c33c-epitopen er fusert med en human superoksiddismutase (hSOD) aminosyresekvens og det andre detekterbare merkede antistoffet er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvens.

14. Fremgangsmåte til påvisning av hepatitt C virus (HCV)-infeksjon i en biologisk prøve,karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 2, (b) kombinere en biologisk prøve med nevnte faste underlag under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er tilstede i den biologiske prøven, å binde til henholdsvis nevnte minst to anti-kjerne antistoffer og nevnte NS3/4a konformasjonsepitop, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart merket antistoff, hvori nevnte første detekterbart merkede antistoff er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori nevnte merkede anti-kjerne antistoff er rettet mot en annen HCV kjerne-epitop enn de i det minste to anti-kjerne antistoffene som er bundet til det faste underlaget, (ii) en epitop fira c33c-området i HCV polyproteinet som er fusert til en hSOD-aminosyresekvens og (iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori nevnte andre detekterbare merkede antistoff er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvens, (d) påvisning av komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14,karakterisertv e d at nevnte minst to anti-kjerne antistoff er rettet mot en N-terminal region til HCV kjerneantigenet og nevnte detekterbare merkede HCV anti-kjerne antistoff er rettet mot en C-terminal region hos HCV kjerneantigenet.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15,karakterisertved at nevnte minst to anti-kjerne antistoffer er rettet mot aminosyrer 10-53 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen og nevnte detekterbare merkede HCV anti-kjerne antistoff er rettet mot aminosyrer 120-130 i HCV, nummerert relativt tuk HPC1 polyprotein sekvens.

17. Fremgangsmåte til påvisning av hepatitt C virus (HCV)-infeksjon i en biologisk prøve,karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 6, (b) kombinere en biologisk prøve med nevnte faste underlag under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er til stede i den biologiske prøven, å binde til nevnte minst ett anti-kjerne antistoffer, nevnte NS3/4a konformasjonsepitop og nevnte multiple epitop fusjonsantigen, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart merket antistoff, hvori nevnte første detekterbart merkede antistoff er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori nevnte merkede anti-kjerne antistoff er rettet mot en annen HCV kjerne-epitop enn det i det minste ene anti-kjerne antistoffene som er bundet til det faste underlaget, (ii) første og andre antigener som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven reaktiv med henholdsvis nevnte NS3/4a epitop og nevnte multiple epitop fusjonantigen (iii) et andre detekterbart antistoff hvori nevnte detekterbare antistoff er reaktivt med antigenene i (ii), (d) påvisning av komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 17,karakterisertv e d at nevnte i det minst ene anti-kjerne antistoffet er rettet mot et N-terminalt område av HCV kjerneantigenet og nevnte første detekterbart merkede HCV anti-kjerne antistoff er rettet mot et C-terminalt område av HCV kjerneantigenet.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 18,karakterisertv e d at nevnte minst to anti-kjerne antistoffer er rettet mot aminosyrer 10-53 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen og nevnte detekterbart mer kede HCV anti-kjerne antistoff er rettet mot aminosyrer 120-130 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 17,karakterisertv e d at nevnte første antigen som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven omfatter en epitop fra c33c-området i HCV-polyproteinet.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 20,karakterisertv e d at c33c-epitopen er fusert med en human superoksiddismutase (hSOD) aminosyresekvens og det andre detekterbart merkede antistoffet er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvens.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 17,karakterisertv e d at nevnte andre antigen som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven omfatter en epitop fra c22-området i HCV-polyproteinet.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 22,karakterisertv e d at epitopen fra c22-området omfatter aminosyrer Lysiotil Ser99i HCV polyproteinet med en delesjon av Arg47 og en substitusjon av Leu med Trp i posisjon 44, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen, hvori nevnte epitop er fusert med en human superoksid dismutase (hSOD) aminosyresekvens og det andre detekterbart merkede antistoffet er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvens.

24. Fremgangsmåten som angitt i krav 17,karakterisertv e d at nevnte multiple epitopfusjonsantigen omfatter aminosyresekvensen som er vist i figurene 7A-7F.

25. Fremgangsmåte til påvisning av hepatitt C virus (HCV)-infeksjon i en biologisk prøve,karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag for immunoanalyse ifølge krav 8, (b) kombinere en biologisk prøve med nevnte faste underlag under betingelser som tillater HCV antigener og antistoffer, når de er tilstede i den biologiske prøven, å binde til henholdsvis nevnte minst to anti-kjerne antistoffer, nevnte NS3/4a konformasjonsepitop og nevnte multiple epitopfusjonsantigen, (c) tilsette til det faste underlaget fra trinn (b) under kompleksdannende betingelser (i) et første detekterbart merket antistoff, hvori nevnte første detekterbart merkede antistoff er et detekterbart merket HCV anti-kjerne antistoff, hvori nevnte merkede anti-kjerne antistoff er rettet mot en annen HCV kjerne-epitop enn de minst to anti-kjerne antistoffer bundet til det faste underlaget, (ii) en epitop fra c33c regionen til HCV polyproteinet fusert til en hSOD aminosyresekvens og en epitop fra c22 regionen til HCV polyproteinet fusert til en hSOD aminosyresekvens og iii) et andre detekterbart merket antistoff, hvori nevnte andre detekterbare merkede antistoff er reaktivt med nevnte hSOD aminosyresekvenser, (d) påvisning av komplekser som er dannet mellom antistoffene og antigenene, dersom noen, som en indikasjon på HCV-infeksjon i den biologiske prøven.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 25,karakterisertv e d at nevnte minst to anti-kjerne antistoffer er rettet mot et N-terminalt område i HCV kjerneantigenet og nevnte første detekterbart merkede HCV anti-kjerne antistoff er rettet mot et C-terminalt område av HCV kjerneantigenet.

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 26,karakterisertv e d at nevnte minst to anti-kjerne antistoff er rettet mot aminosyrer 10-53 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen og nevnte detekterbart merkede HCV anti-kjerne antistoff er rettet mot aminosyrer 120-130 i HCV, nummerert relativt til HCV1 polyproteinsekvensen.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 24,karakterisertv e d at nevnte første antigen som reagerer med et HCV antistoff fra den biologiske prøven omfatter en epitop fra c33c-området i HCV-polyproteinet.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 25,karakterisertv e d at epitopen fra c22-området omfatter aminosyrer Lysiotil Ser99i HCV po lyproteinet med en delesjon av Arg47 og en substitusjon av Trp med Leu i posisjon 44, nummerert relativt til HCV 1-polyproteinsekvensen.

30. Immunodiagnostisk testkit,karakterisert vedat det omfatter det faste underlaget for immunoanalyse ifølge hvilket som helst av kravene 1-8 og bruksanvisning for utførelse av immunodiagnostikk-testen.

31. Fremgangsmåten til fremstilling av et fast underlag til immunoanalyse,karakterisert vedat den omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag og (b) binde minst et hepatitt C virus (HCV) anti-kjerne antistoff og minst en isolert HCV NS3/4a konformasjonsepitop som har aminosyresekvensen vist i figurene 4A-4D dertil.

32. Fremgangsmåte til fremstilling av et fast underlag for immunoanalyse,karakterisert vedat den omfatter å (a) tilveiebringe et fast underlag og (b) binde minst to hepatitt C virus (HCV) anti-kjerne antistoffer og en isolert HCV NS3/4a konformasjonsepitop som har aminosyresekvensen vist i figurene 4A-4D dertil.

33. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 30 eller 31,karakterisert vedat den ytterligere omfatter å binde minst et multippelt epitopfusjonsantigen til det faste underlaget.