CN102140538A - 丙型肝炎病毒检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测其待检血样是否带有丙型肝炎病毒的试剂盒，该试剂盒中有四条特异性引物。本发明的试剂盒使用方法是以从被检试样中提取的RNA为模板，在其中加入特异性引物、聚合酶、缓冲液及水后进行LAMP反应，反应产物或者加入溴化乙锭后在紫外灯下观察，根据反应产物有在紫外光下是否产生荧光确定被检样品是否带有丙型肝炎病毒；或者将反应产物进行琼脂凝胶电泳，根据反应产物是否在特定泳道出现条带确定被检样品是否带有丙型肝炎病毒。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒检测试剂盒，特别是一种从血液中检测其是否带有丙型肝炎病毒的试剂盒。更确切讲，本发明是利用利用环介导等温扩增技术(LAMP)而研发的从人血液中进行检测丙型肝炎病毒(HCV)的检测试剂盒。
背景技术
丙型肝炎(hepatitis C，HC)是上世纪70年代中期发现的一种新型肝炎，当时被命名为输血后非甲非乙型(NANB)肝炎。其病原体丙型肝炎病毒(HCV)直一到1989年才通过分子克隆技术被发现，也是至今唯一在未分离到病原体之前通过分子克隆技术发现的人类病毒。丙型肝炎是人类特有的一种复杂的肝脏疾病，全球约有1.7亿丙型肝炎病毒(HCV)感染者，每年因HCV感染而死亡人数高达28万人，其致病因子是丙型肝炎病毒(HCV)。HCV是一种有包膜的RNA病毒，含有一条长约9600个核苷酸的单股正链RNA分子。HCV基因组的特征与黄病毒科中的黄病毒属和瘟病毒属十分相似，因此，HCV被纳入黄病毒科，单独分为丙型肝炎病毒属。HCV基因组的5′和3′端非翻译区的核苷酸序列高度保守，含有顺式作用元件，主要负责调控病毒蛋白的翻译及病毒基因组的复制。相反，HCV基因组的开放阅读框(open reading frame，ORF)序列在不同的病毒株中高度变异。根据核苷酸序列的变异程度，HCV被进一步分为HCV1-HCV7七个主要基因型和多个亚型。该病在全世界范围内流行，并且只感染人，主要是通过被感染的血液和血液制品而被感染人的。
丙型肝炎病毒(HCV)感染最显著的临床特征通常无明显症状，大多数感染者转为慢性病毒携带者，大约有10％-30％感染者能成功地清除掉病毒感染，但是大约70％的感染患者持续出现并发症，并可能最终演变成肝硬化及原发性肝细胞癌。
HCV的病毒基因组包括5′端非翻译区、一个编码3010～3040个氨基酸多肽的开放阅读框(open reading frame，ORF)和长度可变的3′端非翻译区。HCV蛋白首先被翻译成一条蛋白多肽，然后经细胞和病毒蛋白酶切割而成10个不同的病毒结构蛋白和非结构蛋白，依次为C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B，另外一种由核心蛋白编码区经核糖体移码翻译而成的新蛋白，被命名为F或ARFP蛋白，其生物学特性和功能仍不清楚。HCV结构蛋白包括核心蛋白(C)、包膜蛋白E1和E2，另外p7是一个大约7KDa的疏水性小蛋白，是否存在于病毒颗粒中仍不清楚。HCV非结构蛋白包括NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它们在病毒细胞感染周期中主要负责病毒蛋白质的切割和RNA的复制。NS2编码23kDa的疏水性的Ⅲ型跨膜蛋白，其功能是负责在NS2与NS3蛋白之间的顺式切割；NS3编码大约70kDa的蛋白，具有多种酶活性，与NS3下游区域所有蛋白的切割和HCV的慢性感染有关；NS4A是NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，同时可协助病毒RNA复制体的膜附着；NS4B是27kDa大小的疏水性跨膜蛋白；NS5A是一种磷酸化蛋白，主要以分子量56kDa和58kDa形式存在。
丙型肝炎病毒的实验室诊断技术包括检测抗-HCV抗体的ELISA或放射免疫诊断(RIA)技术和检测丙型肝炎病毒核酸的PT-PCR、实时定量PCR和转录介导扩增(TMA)技术。ELISA或放射免疫诊断(RIA)技术检测血清中抗HCV抗体，不宜作为急性丙型肝炎的常规实验室诊断方法，因为它们检测的既不是中和抗体，也不是lgM抗体，而是lgG抗体，同时它们具有不够灵敏和非特异性的特点，一些自身免疫性慢性肝病患者可出现假阳性，需要其他技术辅助诊断。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，用于检测人血液中HCV的试剂盒，同时提供这种试剂盒的使用方法。
本发明的丙型肝炎病毒快速检测试剂盒中有四条特异性引物，这四条特异引物为：外侧引物：
上游F：5-GGTGAGTACACCGGAATTGC-3，
下游B：5-(CACGGTCTACGAGACCTCC-3；
内测引物：
FIP：5-GGCACGCCCAAATCTCCAGGTTTTAGGACGACCGGGTCCTT-3，
BIP：5-GCGAGACTGCTAGCCGAGTTTTTCCCTAT CAGGCAGTACCACA-3。
本发明的人丙型肝炎病毒快速检测试剂盒的使用方法是以从被检试样中撮的RNA为模板，在其中加入特异性引物、聚合酶、缓冲液及水后进行LAMP反应，反应产物用溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，根据反应产物有在紫外光下是否产生荧光确定被检样品是否带有丙型肝炎病毒。
或者，本发明的人丙型肝炎病毒快速检测试剂盒的使用方法是以从被检试样中撮的RNA为模板，在其中加入特异性引物、聚合酶、缓冲液及水后进行LAMP反应，将反应产物进行琼脂凝胶电泳，根据反应产物是否在特定泳道出现条带确定被检样品是否带有丙型肝炎病毒。
在本发明的人丙型肝炎病毒快速检测试剂盒的具体使用方法是在50μL反应体系中加入：被检RNA 2μL，10μmol/L的外侧上下游引物各1μL，1μmol/L的内侧上下游引物各1μL，2.5mmol/L的dNTP 2μL，Bst聚合酶8U，10x缓冲液5μL，加大的H2O至50μL。本发明所使用的特异性引物如表1所示。LAMP反应条件为：64℃60min。然后80℃5min终止反应进行检测。
表1丙型肝炎病毒LAMP快速检测试剂盒所使用的四条特异性引物
本发明实际上是利用环介导等温扩增技术，从人血液中提取核酸，利用所涉及的引物进行扩增反应，检测反应产物是否含有特异性的梯状条带，以确定人是否感染丙型肝炎的快速检测技术。
本发明的HCV的LAMP检测方法是：以被检测人的血液中的RNA为模板，根据HCV基因组序列，设计两对针对HCV的5′非编码区基因的特异性引物进行等温扩增反应。
进一步，本发明所述的HCV的LAMP方法中，引入了阳性对照，阳性对照为与pMD18-载体T连接的HCV的5′非编码区基因的重组载体。所使用的检测方法为2％的琼脂糖电泳检测。
环介导等温扩增技术(LAMP)最早是由Notomi发明的一种替代传统PCR的快速、简便、灵敏、准确和经济的核酸识别技术。LAMP技术用于HCV的检测具有以下特点：
1.对靶基因的6个部位设计4种引物，利用链置换反应在恒温条件下，靶基因进行高效扩增，由于其反应由4个引物共同启动的，所以比现有的PCR更特异。
2.尽管LAMP技术和PCR灵敏度几乎相同，但本发明仅需一台63℃-65℃的水浴锅或热源，因此可以极大地降低试验成本。
3.LAMP技术比PCR更加节省时间，仅需1小时即可以完成实验。
相关的实验表明本发明具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，且其检测灵敏度优于现有技术，具有良好的应用前景。本发明即可以作为丙型肝炎的早期诊断和献血员筛查指标，也可作为丙型肝炎预后的一个指标。
附图说明
图1为丙型肝炎的LAMP和PCR检测方法的敏感性比较图。A图，从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000；1-5泳道：2fg、0.4fg、0.08fg、0.016fg和0.0032fg；B图，从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000；1-6泳道：250fg、50fg、10fg、2fg、0.4fg和0.08fg；
图2为紫外灯下丙型肝炎的LAMP敏感性试验，从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000；1-5泳道：2fg、0.4fg、0.08fg、0.016fg和0.0032fg；
图3为丙型肝炎的LAMP与其余病毒的交叉性检测电泳结果。从左至右依次为：从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000；1泳道，HCV的RNA，2泳道，HAV的RNA，3泳道，HBV的DNA，4泳道，HEV的泳道；5泳道，阴性。
具体实施方式
本发明实施例分成两部分完成，即实施例一：本发明的检测方法(以下称为“丙型肝炎LAMP检测试剂盒的使用方法”或者简称为”LAMP”方法)；实施例二：丙型肝炎LAMP方法的特异性和敏感性试验，下面实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例<一>丙型肝炎LAMP检测试剂盒的使用方法
1丙型肝炎的核酸提取
无菌采集感染丙型肝炎的人的外周血液，加入适量的抗凝剂，样品按照宝生物工程(大连)有限公司提供的病毒RNA/DNA提取试剂盒提取病毒5′非编码区RNA。
2HCV的LAMP反应
本试剂盒参照Genbank登录的HCV的5′非编码区基因的序列，设计并合成两对引物。引物序列如下：
外侧引物：
上游F：5′-GGTGAGTACACCGGAATTGC-3′
下游B：5′-CACGGTCTACGAGACCTCC-3′
内测引物：
FIP：5′-GGCACGCCCAAATCTCCAGGTTTTAGGACGACCGGGTCCTT-3′
BIP：5′-GCGAGACTGCTAGCCGAGTTTTTCCCTAT
CAGGCAGTACCACA-3′
以提取的HCV的RNA为模板，在50μL反应体系中加入HCV的RNA 2μL，10μmol/L的外侧上下游引物各1μL，1μmol/L的内侧上下游引物各1μL，2.5mmol/L的dNTP 2μL，Bst聚合酶8U，10x缓冲液5μL，加H2O至50μL。LAMP反应程序如下：64℃60min，然后80℃5min。
实施例<二>丙型肝炎LAMP方法的特异性和敏感性试验
1丙型肝炎LAMP的敏感性试验
1.1丙型肝炎病毒的定量及不同稀释度模板的确定
按照HCV 5′非编码区基因组的大小和提取的病毒RNA的浓度测算，用于LAMP的检测模板浓度按照每管2fg、0.4fg、0.08fg、0.016fg和0.0032fg分别进行稀释。用于PCR的检测模板浓度按照每管250fg，50fg，10fg，2fg，0.4fgand 0.08fg分别进行稀释
1.2丙型肝炎病毒的LAMP方法检出限与PCR方法的对比
HCV的LAMP反应组成及反应程序按照实施例<一>，HCV的PCR反应组成如下：在50μL反应体系中加入HCV的RNA 2μL，1μmol/L的内侧上下游引物各1μL，1.5mmol/L的dNTP 2μL，5U Taq聚合酶(Nippon Gene)，10×缓冲液5μL，加大的H2O至50μL。PCR反应程序如下：94℃，2min，然后是循环程序94℃变性30s，72延伸50s，36个循环。最后72延伸10min。PCR反应在BIOMRTRA扩增仪中进行。
1.3结果检测
PCR产物和LAMP反应产物分别进行琼脂糖凝胶电泳。然后用溴化乙锭染色，BIO-RAD凝胶成像仪中照相并分析，电泳结果见图1(A和B)，从图中可以看出HCV的LAMP方法的检出限位0.0016fg，而PCR反应产物的检出限为0.04fg，LAMP的反应比PCR反应的敏感性高25倍。同时每管LAMP反应产物紫外灯下检测结果见图2。
2.丙型肝炎LAMP的特异性试验
2.1HAV、HBV和HEV病毒的提取和LAMP反应
分别用经过PCR或RT-PCR鉴定过的HAV和HEV中提取的DNA和HBV中提取的DNA作为HCV的LAMP反应模板，以健康人的血液提取的RNA作为阴性对照模板。然后程序按照实施例<一>中的HCV的LAMP体系和条件进行反应，反应产物用琼脂凝胶电泳检测。
2.2特异性结果分析
HAV、HBV、HEV和HCV的LAMP方法交叉反应结果见图3。图中1-5道分别是HCV、HAV、HBV、HEV的核酸和健康人血清的RNA。从图中可以看见上述三种病毒与HCV的LAMP方法无交叉反应。健康人血液中提取的RNA的LAMP方法反应结果也为阴性。上述结果表明本实验所建立的HCV的LAMP方法与上述三种在临床症状表现相似的病毒无交叉反应。
3HCV的LAMP的临床样品检测
3.1临床样品的准备
共包括116份临床样品，其中包括10份健康人的血清和106份被荧光定量PCR和ELISA共同诊断为HCV阳性的血清样品。
3.2LAMP检测结果
对上述106个HCV阳性的临床样品用所建立的LAMP方法检测，检测结果见表2，从表中可以看出，LAMP方法对106个HCV阳性的临床样品的检出率为95％，总体上比PCR的检出率高。
4结论
上述试验证明所建立的HCV的LAMP方法具有敏感性高、特异性强、快速、实验设备简单和操作容易等特点，适合于实验室和临床对HCV的快速诊断。本发明的检测方法与现有的PCR检测方法比较见表2.
表2为丙型肝炎的LAMP和PCR检测方法的敏感性比较图。
Claims (4)
1.一种人丙型肝炎病毒快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒中有四条特异性引物，这四条特异引物为：外侧引物：
上游F：5-GGTGAGTACACCGGAATTGC-3，
下游B：5-CACGGTCTACGAGACCTCC-3；
内测引物：
FIP：5-GGCACGCCCAAATCTCCAGGTTTTAGGACGACCGGGTCCTT-3，
BIP：5-GCGAGACTGCTAGCCGAGTTTTTCCCTAT CAGGCAGTACCACA-3。
2.权利要求1所述的人丙型肝炎病毒快速检测试剂盒的使用方法，其特征是以从被检试样中提取的RNA为模板，在其中加入特异性引物、聚合酶、缓冲液及水后进行LAMP反应，反应产物加入溴化乙锭后在紫外灯下观察，根据反应产物有在紫外光下是否产生荧光确定被检样品是否带有丙型肝炎病毒。
3.权利要求1所述的人丙型肝炎病毒快速检测试剂盒的使用方法，其特征是以从被检试样中撮的RNA为模板，在其中加入特异性引物、聚合酶、缓冲液及水后进行LAMP反应，将反应产物进行琼脂凝胶电泳，根据反应产物是否在特定泳道出现条带确定被检样品是否带有丙型肝炎病毒。
4.权利要求2或3所述的人丙型肝炎病毒快速检测试剂盒的使用方法，其特征是在50μL反应体系中加入：被检RNA 2μL，10μmol/L的外侧上下游引物各1μL，1μmol/L的内侧上下游引物各1μL，2.5mmol/L的dNTP 2μL，Bst聚合酶8U，10x缓冲液5μL，加大的H2O至50μL。LAMP反应程序如下：64℃60min，然后80℃5min。
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| US10072309B1 (en) * | 2015-05-08 | 2018-09-11 | Dougbeh-Chris Nyan | Methods for real-time multiplex isothermal detection and identification of bacterial, viral, and protozoan nucleic acids |
| CN109097494A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-28 | 昆明医科大学第附属医院 | 基于环介导恒温扩增的丙型肝炎病毒基因分型方法 |
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