CN102776294B

CN102776294B - C型口蹄疫病毒快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN102776294B
Application number: CN2012102216849A
Authority: CN
Inventors: 刘永生; 张�杰; 丁耀忠; 周建华; 陈豪泰; 马丽娜
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-06-30
Filing date: 2012-06-30
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2032-06-30
Also published as: CN102776294A

Abstract

本发明涉及一种用于检测牛或猪或羊以及相关牛或猪或羊的产品是否感染C型口蹄疫病毒的试剂盒。本发明的C型口蹄疫病毒快速检测试剂盒中包括有两对LAMP引物，这两对引物分别是SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4。用本发明的试剂盒进行检测，具有方便、及时、快捷的优点，并且有较高的检测灵敏度，同时在具体的检测过程中只需用普通的水浴锅或热源即可。

Description

C型口蹄疫病毒快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，确切讲是一种用于检测牛或猪或羊以及相关牛或猪或羊的产品是否感染C型口蹄疫病毒的试剂盒。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是一种由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV)引起的危害牛、猪、羊等偶蹄动物的严重的急性热性高度接触性传染病。由于其传播速度快，不易控制和消灭，严重危害世界动物贸易，被世界卫生组织列为必须上报传染病之一。

口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科（picornaviridas）中的口蹄疫病毒属（aphthavirus）。共包括A、C、O、Asia I、SAT I、SAT II及SAT III型7个血清型，各血清型之间无交叉保护力。FMDV的病毒粒子直径20-25nm，为正二十面体结构，近似圆形；基因组为全长8,500（nt）的正链RNA，包括一个开放阅读框（open reading frame，ORF），5’-非编码区（5’-Untraslated Region，5’-UTR）和3’-非编码区（3’-Untraslated Region，3’-UTR）；ORF编码病毒多聚蛋白，依赖于自身编码的蛋白酶（L、2A、3C）及少数的宿主因子，在经过3级裂解后，形成4种病毒结构蛋白（VP4、 VP2、VP3和VP1）和9 种非结构蛋白（Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）；四种结构蛋白各60分子构成病毒颗粒， VP1靠近由五个原粒组成病毒表面的小洞，VP2和VP3位于远端，VP4则完全位于衣壳里面。

尽管目前国内外对口蹄疫的病原学、血清分型、诊断做了大量的研究，但口蹄疫病毒几乎遍及世界各地，口蹄疫对偶蹄类经济动物的威胁众所周知，它的发病率和造成的经济至今仍为各类传染病之首。为了确定口蹄疫是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全可靠，还必须通过通过病原学检测以确诊病原的存在。一般检测方法为生物学实验、血清型诊断技术和分子生物学技术等诊断技术，但是这些方法有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率较低，即使病毒分离技术被认为是检测口蹄疫的金标准，但其确认结果至少需要7天，检测周期太长，并且这些技术普遍费用太高，存在二次散毒的隐患，一般基层很难开展此项工作。C型口蹄疫在我国周边亚洲地区具有流行史，对我国威胁较大。因此我们实验室利用在60年代从前苏联引进的C型口蹄疫毒株建立了一种快速诊断C型口蹄疫的诊断技术，完成对C型口蹄疫病毒的诊断和监控，对于防止其传入我国具有重要的战略意义。

中国发明专利200810034124.6公开一种用于检测O型口蹄疫病毒的LAMP试剂盒，该试剂盒由包含有六条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系构成。由于该专利的试剂盒中有六条引物，因此其制造成本与使用成本相对较大。其次，该专利使用中需要定时定量仪器，这使其应用受到很大限制。第三，使用该专利检测时只能得到两条电泳条带，这影响其检测灵敏度，并易造成检测结果识别的困难。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，能进行快速、简便检测，具有较高灵敏度和更好经济性能的可检测出被检测牛或猪或羊，或牛或猪或羊的产品是否感染C型口蹄疫病毒的试剂盒。

本发明的C型口蹄疫病毒快速检测试剂盒中包括有两对LAMP引物，这两对引物分别是SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4，即：

表1 本发明的试剂盒中的引物

采用本发明的检测试剂盒，是从待检动物的器官拭子或OP液或血液或动物死体组织中提取其全基因组RNA，再以RNA为模板，以试剂盒中的特异性C型口蹄疫的引物进行多重RT-PCR，再对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检动物是否感染有C型口蹄疫病毒。

本发明在应用中先应先将从待检动物的器官拭子或OP液或血液或病死动物的组织用生理盐水稀释或研磨成1:5的乳悬液，全基因组RNA提取的方法采用RNA/DNA试剂盒提取法，然后再进行后续处理。

本发明是利用环介导等温扩增技术，从疑似样品中提取核酸，利用所涉及的引物进行扩增反应，检测反应产物是否含有特异性的梯状条带，以确定动物是否感染C型口蹄疫的快速检测技术。

环介导等温扩增技术（LAMP）最早是由Notomi发明的一种替代传统PCR的快速、简便、灵敏、准确和经济的核酸识别技术。采用本发明的试剂盒进行检测较经典的病毒分离、单RT-PCR和血清型分型方法快捷。

用本发明的试剂盒进行检测，可以相当方便地一次性鉴定C型口蹄疫病毒的感染，可以及时快捷的对疫病情况及区域、环境做出及时快捷的反应，以最短的时间做出正确的处理办法，这对及时扑灭或阻断传染病的传播具有积极的意义。

本发明的试剂盒用于C型口蹄疫病毒的检测还具有以下优点：

1．本发明根据靶基因的6个部位设计了4条引物，利用链置换反应在恒温条件下，靶基因进行高效扩增，由于其反应由4个引物共同启动的，所以比PCR更特异，具有更好的灵敏度。相对现有技术其制造成本与使用成本均将低于六条引物的现有检测试剂盒。

2．尽管LAMP技术和PCR灵敏度几乎相同，但本发明的试剂盒在实际的使用中仅需一台56℃～65℃的水浴锅或热源，因此可大大方便其实际应用，并可以极大地降低检测成本。

3．采用本发明的试剂盒进行LAMP检测比PCR更加节省时间，仅需1小时即可以完成检测作业。

4. 采用本发明的试剂盒进行检测可以得到5条特异条带，使其检测灵敏度大大高于现有技术。

附图说明

图1 为C型口蹄疫的LAMP和PCR检测方法的敏感性比较图。a图为使用本发明试剂盒的RT-LAMP检测结果，图中：从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000；1-5泳道：2fg、0.4fg、0.08fg、0.016fg和0.0032fg；b图为RT-PCR检测结果，图中：从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000；1-6泳道：250fg、50fg、10fg、2fg、0.4fg和0.08fg；

图2为C型口蹄疫的LAMP与其余病毒的交叉性检测电泳结果。从左至右依次为：从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000；1泳道，C型口蹄疫病毒的RNA，2泳道， A型口蹄疫病毒的RNA，3泳道，Asia 1型口蹄疫病毒的RNA，4泳道，O口蹄疫病毒的RNA；5泳道，PRRSV的RNA；6泳道，SVDV的RNA；7泳道，阴性。

具体实施方式

本发明实施例分成两部分完成，即第一部分为试剂盒的制备及C型口蹄疫LAMP反应；第二部分为采用本发明的检测试剂盒进行具体的检测，即C型口蹄疫LAMP方法的特异性和敏感性试验，下面实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例

一、C型口蹄疫LAMP检测试剂盒制备及使用方法

1．检测试剂盒的制备

参照Genbank登录的C型口蹄疫病毒的VP1基因的序列，设计并合成两对引物。外侧引物序列如下：

上游F:5- ACACTGGGAAGCTGACGT-3（SEQ1）

下游B: 5-GTTGACCCAGGTCTCCTCT-3（SEQ2）

内侧引物：

FIP： 5- CGGGTCAGCGGTCTCTTGTG-GCACCGGTTTCTGCACTT -3（SEQ3）

BIP：5- CTCTCCCATACACCGCACCAC-CGGGTAGTGGCGTAAGTTG -3（SEQ4）

在本发明的检测试剂盒中还可以有dNTP，Bst聚合酶，AMV反转录酶，2x缓冲液（Tris-HCL，KCL，MgSO₄，(NH₄)₂SO₄，Tween-20，Betains，dNTPs等，这样可以更加方便其使用。

1.2. C型口蹄疫的核酸提取

无菌采集感染C型口蹄疫样品,按照宝生物工程(大连)有限公司提供的病毒RNA/DNA提取试剂盒提取病毒VP1编码区RNA。

3. 应用本发明的检测试剂盒进行检测的方法

1.3. C型口蹄疫病毒的LAMP反应

以提取的C型口蹄疫病毒的RNA为模板，在50μL反应体系中加入C型口蹄疫病毒的RNA 2μL，10μmol/L的外侧上下游引物各1μL，1μmol/L的内侧上下游引物各1μL，Bst聚合酶8U，AMV反转录酶5U，2x缓冲液10μL，加双蒸水至50μL。LAMP反应程序如下：64℃ 60min，然后80℃ 5 min。

二、C型口蹄疫LAMP方法的特异性和敏感性试验

2 . C型口蹄疫LAMP的敏感性试验

2.1 C型口蹄疫病毒的定量及不同稀释度模板的确定

按照C型口蹄疫病毒VP1编码区基因组的大小和提取的病毒RNA的浓度测算，用于LAMP的检测模板浓度按照每管2fg、0.4fg、0.08fg、0.016fg和0.0032fg分别进行稀释。用于PCR的检测模板浓度按照每管250fg, 50fg, 10fg, 2fg, 0.4fg and 0.08fg分别进行稀释。

2.2 C型口蹄疫病毒的LAMP方法检出限与PCR方法的对比

C型口蹄疫病毒的LAMP反应组成及反应程序均为实施例第一部分的内容，C型口蹄疫病毒的PCR反应组成按照TAKAR一步法反转录试剂盒推荐说明书进行，反应终体积为50μL，反应在0.2mLPCR管中进行。PCR反应程序如下：94℃，2 分钟，然后是循环程序94℃ 变性30秒，72℃延伸50秒，36个循环。最后72℃延伸10分钟。PCR反应在BIOMRTRA扩增仪中进行。

2.3 结果检测

PCR产物和LAMP反应产物分别进行琼脂糖凝胶电泳。然后用溴化乙锭染色，BIO-RAD凝胶成像仪中照相并分析，电泳结果见图1（a图和b图），从图1a图中可以看出，本发明的扩增产物可出现5个特异条带，由此得到的C型口蹄疫病毒的LAMP方法的检出限位0.0016 fg，而PCR反应产物的检出限为0.04fg，LAMP的反应比PCR反应的敏感性高25倍。

2.4. C型口蹄疫LAMP的特异性试验

2.4.1 A、Asia 1和O型口蹄疫病毒以及SVDV、PRRSV的提取和LAMP反应

分别用经过PCR或RT-PCR鉴定过的A、Asia 1和O型口蹄疫病毒以及SVDV、PRRSVRNA作为C型口蹄疫病毒的LAMP反应模板，以健康猪的血液提取的RNA作为阴性对照模板。然后程序按照实施例第一部分中的C型口蹄疫病毒的LAMP体系和条件进行反应，反应产物用琼脂凝胶电泳检测。

2.4.2 特异性结果分析

A、Asia 1、O型口蹄疫病毒以及SVDV、PRRSV和C型口蹄疫病毒的LAMP方法交叉反应结果见图2。图中1-7道分别是C型口蹄疫病毒、A、Asia 1、O型口蹄疫病毒、PRRSV、SVDV和健康猪血清的RNA。从图中可以看见上述5种病毒与C型口蹄疫病毒的LAMP方法无交叉反应。健康动物血液中提取的RNA的LAMP方法反应结果也为阴性。上述结果表明本实验所建立的C型口蹄疫病毒的LAMP方法与上述5种口蹄疫病毒无交叉反应。

3 C型口蹄疫病毒的LAMP的临床样品检测

3.1 临床样品的准备

共包括110份临床样品，其中包括28份O型口蹄疫病毒、20份A型口蹄疫病毒、16份Asia 1口蹄疫病毒、30份C型口蹄疫病毒、8份猪水泡病病毒（SVDV）和10猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)。

3.2 LAMP检测结果

对上述110份阳性的临床样品用所建立的C型口蹄疫病毒RT-LAMP方法进行检测，检测结果见表2，

表2 C型口蹄疫的LAMP和PCR检测方法对临床样品的检测结果

从表中可以看出，LAMP方法对30个C型口蹄疫病毒阳性的临床样品的检出率为100%，检测其他病毒全部为阴性结果。

上述试验证明本发明所建立的C型口蹄疫病毒的LAMP方法具有敏感性高、特异性强、快速、实验设备简单和操作容易等特点，适合于实验室和临床对C型口蹄疫病毒的快速诊断。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> C型口蹄疫病毒快速检测试剂盒

<160> 4

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（内引物上游引物F）

<400>

acactgggaa gctgacgt 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（内引物下游引物B）

<400>

gttgacccag gtctcctct 19

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（外引物上游引物FIP）

<400>

cgggtcagcg gtctcttgtg gcaccggttt ctgcactt 38

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（内引物下游引物BIP）

<400>

ctctcccata caccgcacca ccgggtagtg gcgtaagttg 40

Claims

1.C型口蹄疫病毒快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有两对LAMP引物，这两对引物分别是：外侧引物序列如下：

上游F:5- ACACTGGGAAGCTGACGT-3

下游B: 5-GTTGACCCAGGTCTCCTCT-3

内侧引物：

FIP： 5- CGGGTCAGCGGTCTCTTGTG-GCACCGGTTTCTGCACTT -3

BIP：5- CTCTCCCATACACCGCACCAC-CGGGTAGTGGCGTAAGTTG -3。