CN105441593A - 一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列 - Google Patents

一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列 Download PDF

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江杰元
李文良
毛立
郝飞
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张纹纹
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Abstract

本发明涉及一种检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列，属于动物病原微生物检测技术领域。引物对包括：由序列为GCTTGGCTTCTTTGAAATGG的上游引物CPIVTF和序列为GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC的下游引物CPIVTR组成的引物对；探针CPIVTM序列为CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA。该套引物和探针序列根据GenBank上山羊副流感病毒3型全基因组序列KT215610设计，具有较高的灵敏度和特异性。

Description

一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列
技术领域
本发明属于动物病原微生物检测技术领域。具体涉及一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸的引物和探针序列。
背景技术
副流感病毒3型(PIV3)属于副粘病毒科呼吸道病毒属成员，是有囊膜的单股负链RNA病毒。该属成员还包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1、HPIV3)、仙台病毒和牛副流感病毒3型(BPIV3)。副流感病毒3型宿主范围广泛，在自然和实验室条件下均可感染人和多种动物，包括小鼠、豚鼠、牛、马、鹿、犬、猫、猪、绵羊和山羊等。人副流感病毒1型和3型是导致婴幼儿上下呼吸道感染的重要病原；仙台病毒是实验小鼠的重要呼吸道病原体，常造成实验室幼鼠的大量死亡；牛副流感病毒3型可引起牛的“运输热”，当呼吸道有致病性细菌或支原体继发感染时，会引起犊牛大批死亡，给养牛业带来重大的经济损失。
牛的呼吸道疾病综合征又称为“运输热”，临床上以发热、咳嗽、食欲减退、眼睛鼻部分泌物增多，并伴有腹泻为特征。1959年，美国科学家首次证实该病与牛副流感病毒3型有关，并成功分离到病原体。目前，牛副流感病毒3型已在全球范围内流行，尤其以亚洲和美洲发病率最高。我国于2008年之后陆续有牛副流感病毒3型感染的报道，并证实存在BPIV3a和BPIV3c两个基因型。
目前关于羊群中山羊副流感病毒3型感染的报道较少，本研究室自2013年起在江苏、安徽等地的山羊养殖场羊群中检测到副流感病毒3型，发病羊群临诊表现以呼吸道症状为主。经过RT-PCR检测、病毒分离鉴定、血凝试验和测序分析，证实该病毒与人副流感病毒3型和牛副流感病毒3型均存在较大差异，在进化上处于独立的分支，命名为山羊副流感病毒3型JS2013(李文良,等.山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定.畜牧兽医学报.2015)。
然而，对山羊副流感病毒3型在国内的流行情况尚无详实数据，对于该病原的诊断方法主要以病毒的分离鉴定和中和试验为主，这两种方法耗时长，不适合疾病的快速诊断，荧光定量PCR敏感性高、特异性强、检测时间短、无需进行核酸电泳即可以进行定量分析，是传统方法无法比拟的。
因此，基于以上的研究和当前的需要，申请人根据山羊副流感病毒3型全基因组序列(GenBank登录号：KT215610)，设计了用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针，建立荧光定量PCR方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列。
技术方案
本发明采用以下技术方案：
1、一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物对，其特征在于所述的引物对为：由序列为GCTTGGCTTCTTTGAAATGG的上游引物CPIVTF和序列为GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC的下游引物CPIVTR组成的引物对。
2、一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的探针，其特征在于所述的探针CPIVTM序列为CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA。
所述引物对和探针序列用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法，包括：
1)待测模板的制备：取100μl血清；或取100mg肺组织，加入500μlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl。加入400μlTRIzol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，RNA沉淀于管底，加入500μl75％乙醇(DEPC处理的水配置)，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；
2)使用TaKaRa公司OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit配制反应体系：
将加好样品的PCR管置于荧光定量PCR仪中进行扩增，反应程序如下：42℃，5分钟，反转录；95℃，10秒预变性；95℃，5秒，60℃34秒，40个循环。试验结果可以实时监测。
3)山羊副流感病毒3型实时荧光定量PCR的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有山羊副流感病毒3型核苷酸则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达10个拷贝/ml；若待检样品中不含有山羊副流感病毒3型核苷酸则无扩增信号。
所述引物对和探针序列可以在制备用于检测山羊副流感病毒3型的试剂盒产品中得到应用。
有益效果
本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(TAMRA)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异性结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。所述引物对和探针序列可以在制备用于检测山羊副流感病毒3型的试剂盒产品中得到应用。
本发明的优点：
1、本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达10个拷贝/ml，说明其具有非常良好的灵敏度；
2、本发明提供的引物和探针对于不含有山羊副流感病毒3型的检测样品均无扩增信号，说明其具有良好的特异性；
3、本发明对山羊副流感病毒3型基因序列进行分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。
4、本发明采用荧光定量PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了普通PCR检测常出现假阳性结果的现象。由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。
附图说明
图1：荧光定量PCR扩增曲线，利用引物对CPIVTF/CPIVTR和探针CPIVTM检测山羊副流感病毒3型10倍稀释(10-3-10-8)的标准质粒。
图2：荧光定量PCR标准曲线，利用引物对CPIVTF/CPIVTR和探针CPIVTM检测山羊副流感病毒3型10倍稀释(10-3-10-8)的标准质粒。
图3：荧光定量PCR特异性曲线，利用引物对CPIVTF/CPIVTR和探针CPIVTM检测山羊副流感病毒3型阳性质粒和蓝舌病(BTV)(毛立,等.江苏省部分地区牛羊蓝舌病血清学调查及监控.西南农业学报.2015)、小反刍兽疫(PPR)(购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)、边界病(BDV)(MaoL,etal.Characterizationofonesheepborderdiseasevirusinchina.JVirol.2012)毒株的cDNA。
图4：荧光定量PCR敏感性，利用引物对CPIVTF/CPIVTR和探针CPIVTM检测山羊副流感病毒3型阳性质粒(10拷贝/ml)。
图5：临床样品检测，利用引物对CPIVTF/CPIVTR和探针CPIVTM检测5份疑视山羊副流感病毒3型感染样品。
具体实施方式
1、引物和探针设计：通过对山羊副流感病毒3型基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为18-24个碱基左右，探针长度一般为15-45个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：
上游引物CPIVTF：GCTTGGCTTCTTTGAAATGG
下游引物CPIVTR：GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC
探针CPIVTM：CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA
2、反应体系的建立和优化：从山羊副流感病毒3型分离株JS2013(李文良,等.山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定.畜牧兽医学报.2015)的细胞毒中提取病毒RNA，利用引物对CPIVTF/CPIVTR进行目的基因PCR扩增，对目的片段克隆测序后，提取阳性质粒T-MPIV作为标准品，将标准品10倍梯度稀释，储存于-20℃备用。
2.1引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1μmol/L至2.0μmol/L做连续倍比稀释，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.2μmol/L。
2.2探针浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L作连续倍比稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.4μmol/L。
2.3循环条件的优化：通过比较荧光定量PCR的三温循环和双温循环进行筛选，同时将退火温度从55℃递增到65℃，对退火温度进行筛选。
利用上述引物、探针和循环条件的建立，最后确定采用的山羊副流感病毒3型实时荧光定量PCR反应体系为20μl，所需各组分及相应浓度见表1。
表1.山羊副流感病毒3型实时荧光定量PCR反应体系中的各组分情况：
备注：以上试剂均购买自TaKaRa公司。
3.仪器检测通道的选择：在进行荧光定量PCR反应时，应对所使用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针两端所标记的荧光报告基团相一致。本发明所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(TAMRA)的寡核苷酸，具体设置方法参照仪器使用说明书。
4.PCR反应程序选择如下：42℃，5分钟，反转录；95℃，10秒，预变性；95℃，5秒，60℃，34秒，40个循环。
5.检测步骤：
5.1选取引物和探针；
5.2制备待测模板，采用常规提取RNA方法提取各种来源样品中山羊副流感病毒3型的核酸；
5.3反应体系的建立：表1。
5.4选择仪器的检测通道；
5.5上机检测。
6.标准曲线的建立：取10倍梯度稀释的标准品T-MPIV(10-3-10-8)为模板，用优化后的反应体系和程序进行荧光定量PCR扩增(图1)。以循环数阈值为纵轴，以质粒拷贝数的常用对数(lgC)为横轴，绘制标准曲线(图2)。
7.特异性试验：蓝舌病(BTV)(毛立,等.江苏省部分地区牛羊蓝舌病血清学调查及监控.西南农业学报.2015)、小反刍兽疫(PPR)(购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司)、边界病(BDV)(MaoL,etal.Characterizationofonesheepborderdiseasevirusinchina.JVirol.2012)毒株的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，以10-3倍稀释的标准品为阳性对照，检测该方法的特异性(图3)。
8.敏感性试验：以浓度为10拷贝/ml和1拷贝/ml的标准品T-MPIV为模板进行荧光定量PCR扩增，检测该方法的灵敏性(图4)。
实施例
1)待测模板的制备：对5头疑似CPIV3发病羊进行检测，取100μl待测样品血清；或取100mg肺组织，加入500μlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl。加入400μlTRIzol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，RNA沉淀于管底，加入500μl75％乙醇(DEPC处理的水配置)，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；
2)山羊副流感病毒3型实时荧光定量PCR反应的扩增条件：根据表1加样，将加好样品的PCR管放置荧光定量PCR仪(ABIStepOnePlusTM)中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：42℃，5分钟，反转录；95℃，10秒，预变性；95℃，5秒，60℃34秒，40个循环。
试验结果可以实时监测。仪器检测通道的选择：在进行荧光定量PCR反应时，应对所使用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，与探针两端所标记的荧光报告基团相一致。本发明所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(TAMRA)的寡核苷酸，参照荧光PCR仪(ABIStepOnePlusTM)使用说明书具体设置选择的荧光检测参数。
3)山羊副流感病毒3型实时荧光定量PCR的检测结果：经检测，待检样品中4份含有山羊副流感病毒3型，显示阳性扩增曲线；1份不含有山羊副流感病毒3型，无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度和特异性(图5)，对于不含有山羊副流感病毒3型的检测样品无扩增信号。
SEQUENCELISTING
<110>江苏省农业科学院
<120>一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探针序列
<130>0
<160>3
<170>PatentInversion3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>上游引物CPIVTF
<222>(1)..(20)
<223>
<400>1
gcttggcttctttgaaatgg20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<221>下游引物CPIVTR
<222>(1)..(20)
<223>
<400>2
gcctgcagaagttccttgtc20
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>
<220>
<221>探针CPIVTM
<222>(1)..(27)
<223>
<400>3
caatcggactagccaagtatggtggga27

Claims (5)

1.一种用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物对和探针序列，其特征在于，所述的引物对为：由序列为GCTTGGCTTCTTTGAAATGG的上游引物CPIVTF和序列为GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC的下游引物CPIVTR组成的引物对；探针CPIVTM序列为CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA。
2.根据权利要求1所述引物对和探针序列,其特征在于,所述引物对和探针序列用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法，包括：
1）待测模板的制备：取100μl血清或取100mg组织样品，加入500μlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl;
加入400μlTRIzol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，RNA沉淀于管底，加入500μl75%乙醇（DEPC处理的水配置），温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；
2）使用TaKaRa公司OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit配制反应体系：
试剂用量/终浓度
2×OneStepRT-PCRBufferⅢ10μl/1×
TaKaRaExTaqHS(5U/μl)0.4μl
PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.4μl
PCRForwardPrimer(10μM)0.4μl/0.2μM
PCRReversePrimer(10μM)0.4μl/0.2μM
TaqManProbe(10μM)0.8μl/0.4μM
ROXReferenceDyeⅠ(50×)0.4μl/1×
TotalRNA2μl
RNaseFreedH2O5.2μl
将加好样品的PCR管置于荧光定量PCR仪中进行扩增，反应程序如下：42℃，5分钟，反转录；95℃，10秒，预变性；95℃，5秒，60℃34秒，40个循环;
山羊副流感病毒3型实时荧光定量PCR的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有山羊副流感病毒3型核苷酸则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达10个拷贝/ml；若待检样品中不含有山羊副流感病毒3型核苷酸则无扩增信号。
3.根据权利要求2所述引物对和探针序列,其特征在于,所述引物对和探针序列用于检测山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法中其检测灵敏度达10个拷贝/ml。
4.含有权利要求1所述引物对和探针序列的试剂盒。
5.权利要求1所述引物对和探针序列在制备用于检测山羊副流感病毒3型的试剂盒产品中的应用。
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