CN109097494A - 基于环介导恒温扩增的丙型肝炎病毒基因分型方法 - Google Patents

基于环介导恒温扩增的丙型肝炎病毒基因分型方法 Download PDF

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CN109097494A CN201810917403.0A CN201810917403A CN109097494A CN 109097494 A CN109097494 A CN 109097494A CN 201810917403 A CN201810917403 A CN 201810917403A CN 109097494 A CN109097494 A CN 109097494A
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Abstract

本发明涉及公开一种基于环介导恒温扩增的丙型肝炎病毒基因分型方法，涉及分子生物技术领域。所述丙型肝炎病毒基因分型方法，基于LAMP方法，针对丙型肝炎病毒5’UTR‑Core区中各亚型特异的基因序列，设计不同亚型的LAMP引物，包括两条外引物、两条内引物和环引物，在65℃，60min条件下采用NEB试剂进行检测；具有高特异性、高灵敏度、低成本的特性，可实现标本高通量的自动化检测、可污染的风险，并且较低的设备要求可以有助于推广LAMP方法在临床的应用；具有较好的临床应用前景，同时可开发相应试剂有利于进一步推动本方法在临床的应用。

Description

基于环介导恒温扩增的丙型肝炎病毒基因分型方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体的涉及一种基于环介导恒温 扩增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)的丙型肝炎病毒基 因分型方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是单股正链RNA病毒，属 黄病毒科丙型肝炎属。全球约有1.7亿人感染丙型肝炎病毒，中国HCV 的感染率占总人口的3.2％，约4200万。HCV感染发展隐匿，具有较 高的慢性化比例，感染后80％以上会转变成慢性肝炎，如未经合理 治疗，其中10％～30％经l0～20年后会发展成肝硬化，l％～3％发 展成原发性肝癌[3-5]。HCV基因组呈现高度异质性。根据Simmonds命 名系统HCV可分为11个型，70个亚型。常见的基因亚型有5种，即 1a、1b、2a、2b、3a型等。HCV病毒基因型分布有明显地区差异， 可能与HCV的来源、传播方式及人群遗传背景不同有关。研究表明 中国大陆的HCV主要有1b和2a型，南方城市1b型占75％～90％以 上，北方城市1a型占46％～70％，而人口流动较少的少数民族地区 如广西、甘肃、新疆、云南等分布呈现基因型多样性。云南因为民族 多样性可能对不同亚型的HCV病毒易感性有差异，主要以1型、3型 和6型为主，其中6u/6v亚型为全球首次发现。
不同型别的丙型肝炎病毒对疾病预防、临床治疗和预后均有重要 意义。首先，不同基因型HCV感染者的临床表现程度不一。目前认 为1b丙型肝炎病毒感染与肝硬化失代偿期、原发性肝癌和肝移植术 后复发明显相关。其次，HCV基因型能预测疾病的发展与转归。约 92％1b型急性感染患者进展为慢性，而其他类型仅35％-50％。再次，HCV的亚型分布与感染来源相关。3a型和1a型在静注毒品中多见， 1b型多见于HCV血制品传播中，因此基因分型对追踪HCV流行来源 与疾病预防有重要意义。最后，HCV不同基因型对于抗病毒药物治疗时间和剂量以及预后分析有重要指导作用。长效干扰素对1b、4、5、 6型患者的治疗效果明显不如1a、2和3型。因此，HCV基因分型的 检测在临床工作中具有重要的作用。
目前HCV基因进行分型常用技术包括基因测序法、型特异性引 物扩增法、探针杂交法、限制性片段长度多态性分析(RELP)、系统 进化树方法，实时荧光定量PCR法等。HCV全基因组测序是最准确的 方法，但操作复杂，灵敏度较低，设备要求高。传统PCR方法的型特异性引物扩增法等受引物的影响也存在容易扩增失败的缺点。RELP 方法在检测过程中需开盖操作，因此具有较高的实验室污染风险。因 此，这些方法在临床应用中均存在一定不足。
环介导等温扩增技术(LAMP)是近些年来新发展起来的技术， 此方法具有快速，反应温度恒定和特异的优点。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种丙型肝炎病毒 基因分型方法，基于LAMP方法检测过程中温度恒定的特点，设计了 一种简单方便、高效快捷、敏感度高的丙型肝炎病毒基因分型方法， 具有高特异性、高灵敏度、低成本的特性，可以有助于推广LAMP方 法在临床的应用。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技 术方案实现：
一种丙型肝炎病毒基因分型方法，基于LAMP方法，针对丙型肝 炎病毒5’UTR-Core区中各亚型特异的基因序列，设计不同亚型的 LAMP引物，包括两条外引物、两条内引物和环引物，在65℃、60min 条件下采用NEB试剂进行检测；
所述反应体系为：12.5μL 2×MasterMix、2.5μL引物混合液、1 μL cDNA模板和9μLRnase free水在基因扩增仪下反应；
所述引物混合液两条外引物各5pmol、两条内引物各40pmol和 环引物20pmol；
所述反应体系从红色变为黄色时结果判断为阳性。
进一步的，所述丙型肝炎病毒1b，2a，3和6a基因分型方法， 包括以下步骤：
1)基于LAMP方法，设计丙型肝炎病毒1b，2a，3和6a对应的 两条外引物、两条内引物和环引物
HCV1b
外引物1b-F3：caaacgtaacaccaaccgc、1b-B3：ggcgagccttggggata
内引物1b-FIP：cggcaacaggtaaactccaccacgcccacaggacgtcaag
1b-BIP：taagtgtgcgcgcgactatgtcgccttccacgagg
环引物1b-LF：ggaagacttccgagcggt
HCV2a
外引物2a-F3：tgcggaaccggtgagt、2a-B3：cacggtctacgagacctcc
内引物2a-FIP：ggccgggcatagagtgggtcaccggaattgccgggaag
2a-BIP：ccgcaagactgctagccgagcrccctatcaggcagtacca
环引物2a-LB：tagcgttgggttgcgaaag
HCV3
外引物3-F3：ctcccgggagagccatag、3-B3cacggtctacgagacctcc
内引物
3-FIP：agcgggttgttccaagaaaggagtctgcggaaccggtgag
3-BIP：ccgcgagatcactagccgagtccctatcaggcagtaccaca
环引物3-LF：ccggcgattccggtgta
HCV6a
外引物6a-F3：gcaagactgctagccgag、6a-B3ctccgccaacgatctgac
内引物6a-FIP：tacgagacctcccggggcactagcgttgggttgcgaaag
6a-BIP：tgagcacwcttccaaaaccccacgccacccgggaactt
环引物6a-LB：tcaggcagtaccacaaggc
2)在65℃，60min条件下采用NEB试剂进行检测，在反应体系 为：12.5μL 2×MasterMix、2.5μL引物混合液、1μL cDNA模板和9 μL Rnase free水在基因扩增仪下反应；
所述引物混合液两条外引物各5pmol、两条内引物各40pmol和 环引物20pmol；
所述反应体系从红色变为黄色时结果判断为阳性。
进一步的，所述丙型肝炎病毒基因分型方法最低检测限可以达到 103IU/mL。
本发明的另一目的在于，公开一种丙型肝炎病毒1b，2a，3和 6a基因分型方法的验证，以上述四种HCV亚型的血清各一例，分别 进行稀释，将稀释后的每个不同浓度的样本平均分为10份后同时提 取RNA，用LAMP与RT-PCR两种方法同时检测；分别选取20例 HCV-1b,2a,3和6a型的血清，同时用LAMP方法与RT-PCR同时进行 检测比较两种方法的一致性。
一种丙型肝炎病毒基因分型方法在丙型肝炎病毒基因分型试剂 盒试剂盒中的应用。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种丙型肝炎病毒基因分型 方法，基于LAMP方法检测过程中温度恒定的特点，设计了一种简单 方便、高效快捷、敏感度高的丙型肝炎病毒基因分型方法，能准确区 分HCV-1b，2a，3和6a型，相应的LAMP引物能与对应的模板特异 性发生反应，且各亚型间无交叉反应；LAMP法检测HCV-1b,3和6a 型的最低检测限为1.5×103IU/mL.，HCV-2b的最低检测限为1.0×103 IU/mL，与RT-PCR方法的灵敏度基本一致；HAV，HIV，HBV对本研究 建立的方法无干扰；同时本发明具有高特异性、高灵敏度、低成本的特性，可实现标本高通量的自动化检测、可污染的风险，并且较低的 设备要求可以有助于推广LAMP方法在临床的应用；具有较好的临床 应用前景，同时可开发相应试剂有利于进一步推动本方法在临床的应 用。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的 所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描 述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图 仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例所述HCV1b,2a,3和6a型LAMP引物特异性 评价(A为LAMP法检测HCV-RNA分型结果的电泳图；B为LAMP法 检测HCV各亚型；C为LAMP方法检测HCV亚型的特异性)；
图2为本发明实施例所述LAMP法检测HCV-1b,2a,3和6a最低检 测限评价(A为LAMP法检测HCV-1b,2a,3和6a反应图；B为HCV-1b,3 和6a型的LAMP反应产物电泳图；C为LAMP法检测HCV-2a型产物 电泳图；D为LAMP法检测HCV-1b,3,6a型反应图；E为LAMP法HCV-2a 型的反应图)；
图3为本发明实施例所述Realtime PCR检测HCV-1b,2a,3和6a的 最低检测限分析(A,B,C,D分别表示不同浓度HCV 1b,2a,3和6a的扩 增曲线，NC为阴性对照)；
图4为本发明实施例所述LAMP方法检测HCV的抗干扰能力(A 为LAMP反应产物的电泳图；B为LAMP法检测抗干扰性的反应图)；
图5位本发明实施例所述LAMP法检测HCV反应产物的电泳图和 反应图(A为LAMP法检测HCV-1b,2a型反应产物的电泳图；B为1-3 分别表示LAMP法检测HCV-1b在40min,50min,60min时间点的反应 图，4-6分别表示LAMP法检测HCV-2a在40min,50min,60min时间点 的反应图，；C为LAMP法检测HCV-3,6a型反应产物的电泳图；D为 1-3分别表示LAMP法检测HCV-3型在40min,50min,60min时间点的 反应图，4-6分别表示LAMP法检测HCV-6a在40min,50min,60min时 间点的反应图)
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例， 都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种丙型肝炎病毒基因分型方法，基于LAMP方法，从GeneBank 中下载HCV各亚型序列(CHINA HCV 1b:L02836.1，HQ912959.1， HQ912956.1，GU451224.1，HCV 2a:HQ639945.1，KC844043.1， HQ639944.1，HQ639938.1，KF676352.1，HCV 3:AP008209.2，HQ912953.1，KC844041.1，KC844044.1，HCV 6a:DQ480524.1， HQ912955.1，HQ912954.1，KC844037.1，DQ480516.1)，采用 Geneious10.2.3软件对各亚型的序列进行比对，选取5’UTR-Core区 中各亚型特异又保守的序列段，并用primer explorer V.5 (http://primerexplorer.jp/e/)软件设计各型LAMP反应引物，其中包 括两条外引物(F3，B3)和两条内引物(FIP，BIP)以及环引物(LF 或LB)；引物由生工生物工程股份有限公司合成(上海，中国)。
反应体系包括：12.5μL 2×MasterMix(6mM的MgSO4，1.4mM 的dNTP Mix，320U的Bst3.0DNA Polymerase)，2.5μL引物混合液 (FIP、BIP各40pmol，B3和F3为5pmol，LB为20pmol)，1μL cDNA 模板，9μL Rnase free水。LAMP反应温度为65℃，扩增的时间为60min，LAMP反应采用基因扩增仪(天隆Genesy 96T，西安，中国) 进行检测，当反应体系从红色变为黄色时结果判断为阳性。
实施例2
一种丙型肝炎病毒1b，2a，3和6a基因分型方法，包括：
血清样本：收集2017年8月至12月昆明医科大学第一附属医院 (云南，中国)和昆明市传染病医院(云南，中国)完成临床检测后 的血清样本共108例。其中80例标本通过基因测序方法确定了HCV 的亚型，且甲型肝炎，乙型肝炎，艾滋病毒和巨细胞病毒标志物为阴性，用于评价方法特异性；乙型肝炎病毒血清10例，HIV病毒血清 10例，甲型肝炎病毒8例，且丙型肝炎标志物阴性，用于验证RT-LAMP 方法的抗干扰性。
核酸提取：血清样本采用DNA/RNA磁珠法核酸提取试剂盒(天 隆科技有限公司，西安，中国)提取，核酸提取方法参照厂家说明书 操作。提取好的核酸放置-80℃备用。
引物设计：从GeneBank中下载HCV各亚型序列(CHINA HCV 1b:L02836.1，HQ912959.1，HQ912956.1，GU451224.1，HCV 2a:HQ639945.1，KC844043.1，HQ639944.1，HQ639938.1，KF676352.1， HCV 3:AP008209.2，HQ912953.1，KC844041.1，KC844044.1，HCV6a:DQ480524.1，HQ912955.1，HQ912954.1，KC844037.1，DQ480516.1)。 采用Geneious10.2.3软件对各亚型的序列进行比对，选取5’UTR-Core 区中各亚型特异又保守的序列段，并用primer explorer V.5 (http://primerexplorer.jp/e/)软件设计各型LAMP反应引物，其中包 括两条外引物(F3，B3)和两条内引物(FIP，BIP)以及环引物(LF 或LB)，各亚型引物序列见表1。引物由生工生物工程股份有限公司 合成(上海，中国)。
表1各亚型LAMP反应引物
RT-LAMP：LAMP检测试剂购自NEB公司(Ipswich，美国)，反 应体系包括：12.5μL 2×MasterMix(6mM的MgSO4，1.4mM的 dNTP Mix，320U的Bst3.0DNA Polymerase)，2.5μL引物混合液(FIP、 BIP各40pmol，B3和F3为5pmol，LB为20pmol)，1μL cDNA模 板，9μL Rnasefree水。LAMP反应温度为65℃，扩增的时间为60 min，LAMP反应采用基因扩增仪(天隆Genesy 96T，西安，中国)进 行检测，当反应体系从红色变为黄色时结果判断为阳性。
Real time PCR：采用PCR-荧光探针法的HCV基因分型检测试剂盒 进行检测(TIB，厦门，中国)，PCR反应采用SLAN 96P荧光PCR仪 进检测(宏石，上海，中国)，依据厂家说明书进行操作。
特异性评价：将经基因测序确认的HCV1b,2a,3,6a型各20例标本 用于特异性评价，每份标本用1b,2a,3,6a四种引物分别进行LAMP检 测，以去离子水为模板作为阴性对照，各亚型引物阳性且不与其它亚 型模板发生反应即认为特异性符合要求。
HCV1b,2a,3和6a型LAMP引物特异性评价
如图1所示(A，LAMP法检测HCV-RNA分型结果的电泳图，1-4 分别表示HCV1b,2a,3和6a，NC为阴性对照，M为分子量标准。B， LAMP法检测HCV各亚型，1-4分别表示HCV-1b,2a,3和6a。C，LAMP 方法检测HCV亚型的特异性。每行表示1b,2a,3,6a对应的引物，每列 表示不同型的HCV模板，1-5分别表示HCV1b,2a,3a,3b和6a，NC为 阴性对照)
HCV-1b,2a,3和6a型LAMP引物均可与对应模板发生反应，且无 交叉反应(图1C)，产物经琼脂糖凝胶电泳后呈特异的阶梯型条带(图 1A)。HCV-3型引物可同时识别HCV-3a和3b模板(图1C)。因此， 本发明中设计的LAMP引物对HCV各型有较好的特异性。
实施例3
基于实施例2的丙型肝炎病毒基因分型方法
最低检测限评价：将HCV1b,2a,3,6a型的RNA(浓度约为1.0× 106IU/mL)标本用HCV阴性血清按10倍梯度稀释得到一系列样本(1.0 ×106,1.0×105,1.0×104,1.5×103,1.0×103,1.0×102IU/mL)，再 将各浓度样本分成10份后分别提取核酸，上述样本均同时采用LAMP 和Real-time PCR两种方法进行检测，10个样本全部阳性的最低浓度 视为该亚型的最低检测限。
LAMP方法和Real-time PCR检测HCV-1b,2a 3和6a的最低检测 限。
如图2所示(图2：LAMP法检测HCV-1b,2a,3和6a最低检测限 评价。A:LAMP法检测HCV-1b,2a,3和6a反应图，1-10表示同一个亚 型的10个重复反应孔，1b,2a,3和6a型分别用临界检测限的两种浓 度对比检测，HCV-1b,3,6a型在1.5×103IU/mL浓度下10个复孔全部为阳性，在1.0×103IU/mL浓度下不全为阳性，HCV-2a在1.0× 103IU/mL浓度下10个复孔全为阳性，在1.5×103IU/mL下不全为阳 性。B：HCV-1b,3和6a型的LAMP反应产物电泳图，泳道1-3分别表 示HVC-1b,3,6a型浓度为1.5×103IU/mL，在此浓度下可以看到特异的 阶梯条带，泳道4-6表HCV-1b,3,6a型浓度为1.0×103IU/mL。C， LAMP法检测HCV-2a型产物电泳图，1-6分别对应浓度为1.0× 106IU/mL，1.0×105IU/mL，1.0×104IU/mL，1.5×103IU/mL，1.0× 103IU/mL，1.0×102IU/mL，M为分子量标准，在1.0×106IU/mL至 1.0×103IU/mL浓度下都可以看到特异的阶梯状条带。D：LAMP法检 测HCV-1b,3,6a型反应图，1-3分别表示HVC-1b,3,6a型浓度为1.5× 103IU/mL，4-6表示HCV-1b,3,6a型浓度为1.0×103IU/mL。E:LAMP法HCV-2a型的反应图，1-6表示对应浓度为1.0×106IU/mL，1.0× 105IU/mL，1.0×104IU/mL，1.5×103IU/mL，1.0×103IU/mL，1.0× 102IU/mL的反应图。)
如图3所示(Realtime PCR检测HCV-1b,2a,3和6a的最低检测限 分析，A,B,C,D分别表示不同浓度HCV 1b,2a,3和6a的扩增曲线，NC 为阴性对照)
HCV-1b,3,6a样本浓度为1.5×103IU/mL的10个样本均阳性，因 此HCV-1b,3,6a的最低检测限为1.5×103IU/mL(图3A and B)，HCV-2a 的最低检测限为1.0×103IU/mL(图3Aand C)。表明，RT-PCR的最 低检测限达到1.0×103IU/mL。
抗干扰能力：分别以甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，HIV病毒阳 性血清样本为样本进行检测，以相应亚型HCV-RNA基因作为阳性对 照，以去离子水当模板为阴性对照，加入各亚型的引物，用LAMP方 法进行检测，分析所建立的HCV LAMP分型方法的抗干扰能力。
LAMP法抗干扰能力的评价
如图4所示(LAMP方法检测HCV的抗干扰能力。A，LAMP反应 产物的电泳图，HIV-1,2分别表示HIV-1型和2型，HBV-1,2分别表示 HBV-A型，B型，M为分子量标准。B，LAMP法检测抗干扰性的反应 图，1-9分别表示HAV，HIV-1型，HIV-2型，HBV-A型，HBV-B型， HCV-1b，HCV-2a，HCV-3和HCV-6a型)
HAV,HIV和HBV与HCV1b,2a,3和6a的LAMP反应体系均无应
LAMP和RT-PCR一致性的评估：用LAMP方法和RT-PCR方法分 别检测80个已测序明确亚型的HCV阳性标本评估两种方法的一致性 和临床适用性。
LAMP方法和RT-PCR方法的一致性评价。
为了评价LAMP方法与实时荧光定量检测方法的一致性，选择80 例经测序确认的HCV标本进行用LAMP和RT-PCR两种方法同时进行检 测。LAMP方法检测出75个阳性，RT-PCR方法检测出74个阳性，两 者一致检测出70个阳性。28个HCV阴性的样本依然检测为阴性。卡方检测P值为0.330，差异无统计学意义，两种方法检测具有一致性 如下表2所示。
表2
time-point检测：在LAMP反应的过程中，我们把四型1b,2a,3,6a (浓度为1.5×103IU/ml)在不同的时间点(40min,50min,60min)进 行检测以寻找最佳反应时间。
如图5所示
图5中:A为LAMP法检测HCV-1b,2a型反应产物的电泳图，泳道 1-3表示HCV-1b在40min,50min,60min产物的电泳，泳道4-6表示 HCV-2a在40min,50min,60min产物的电泳，NC为阴性对照。B为1-3 分别表示LAMP法检测HCV-1b在40min,50min,60min时间点的反应图，4-6分别表示LAMP法检测HCV-2a在40min,50min,60min时间点 的反应图，HCV-1b,2a在40,50,60min三个时间点都有阳性产物。C为 LAMP法检测HCV-3,6a型反应产物的电泳图，泳道1-3表示HCV-3型 在40min,50min,60min产物的电泳，泳道4-6表示HCV-6a在 40min,50min,60min产物的电泳，NC为阴性对照。D为1-3分别表示 LAMP法检测HCV-3型在40min,50min,60min时间点的反应图，4-6 分别表示LAMP法检测HCV-6a在40min,50min,60min时间点的反应 图，HCV-3,6a在50,60min有阳性产物。
LAMP的优势在于快速反应，为了评估HCV-RNA恒温扩增法的最 早反应时间，在探索最佳反应时间的同时评估不用时间点 (40min,50min,60min)的反应性，结果表明1b,2a在40min变为阳 性，呈现弱阳性(图5-A)，3,6a在50min变为阳性(图5-B)，四种 型均发生阳性反应的时间都在60min之内，在60min时已经可以观察 到稳定而明显的阳性结果，所以我们在后续实验中都是以60min为最 佳时间点。
通常来说，检测LAMP产物的方法有目视检测浑浊，肉眼观察颜 色变化，实时浊度法和荧光检测法，目视检查浑浊是利用LAMP反应 产生的焦磷酸镁沉淀物进行判断，但是沉淀量较低时难以直接观察结 果，相比之下，我们的实验中肉眼对颜色的判断是利用染色法对产物 进行阴、阳结果的直接判读，可以大大提高肉眼识别率。实时浊度法 和荧光检测法特异、精准，但是需要扩增后特定的仪器检测，成本较 高。
一种丙型肝炎病毒基因分型方法在丙型肝炎病毒基因分型试剂 盒试剂盒中的应用。
本发明提供的一种丙型肝炎病毒基因分型方法，基于LAMP方法 检测过程中温度恒定的特点，设计了一种简单方便、高效快捷、敏感 度高的丙型肝炎病毒基因分型方法，能准确区分HCV-1b，2a，3和 6a型，相应的LAMP引物能与对应的模板特异性发生反应，且各亚型 间无交叉反应；LAMP法检测HCV-1b,3和6a型的最低检测限为1.5 ×103IU/mL.，HCV-2b的最低检测限为1.0×103IU/mL，与RT-PCR方 法的灵敏度基本一致；HAV，HIV，HBV对本研究建立的方法无干扰； 同时本发明具有高特异性、高灵敏度、低成本的特性，可实现标本高通量的自动化检测、可污染的风险，并且较低的设备要求可以有助于 推广LAMP方法在临床的应用；具有较好的临床应用前景，同时可开 发相应试剂有利于进一步推动本方法在临床的应用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具 体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、 材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书 中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而 且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个 实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实 施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实 施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说 明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和 实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发 明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (4)

1.一种丙型肝炎病毒基因分型方法，其特征在于：基于LAMP方法，针对丙型肝炎病毒5’UTR-Core区中各亚型特异的基因序列，设计不同亚型的LAMP引物，包括两条外引物、两条内引物和环引物，在65℃，60min条件下采用NEB试剂进行检测；
所述反应体系为：12.5μL2×MasterMix、2.5μL引物混合液、1μLcDNA模板和9μLRnasefree水在基因扩增仪下反应；
所述引物混合液两条外引物各5pmol、两条内引物各40pmol和环引物20pmol；
所述反应体系从红色变为黄色时结果判断为阳性。
2.如权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因分型方法，其特征在于：所述丙型肝炎病毒1b，2a，3和6a基因分型方法，包括以下步骤：
1)基于LAMP方法，设计丙型肝炎病毒1b，2a，3和6a对应的两条外引物、两条内引物和环引物
HCV1b
外引物1b-F3：caaacgtaacaccaaccgc、1b-B3：ggcgagccttggggata
内引物1b-FIP：cggcaacaggtaaactccaccacgcccacaggacgtcaag
1b-BIP：taagtgtgcgcgcgactatgtcgccttccacgagg
环引物1b-LF：ggaagacttccgagcggt
HCV2a
外引物2a-F3：tgcggaaccggtgagt、2a-B3：cacggtctacgagacctcc
内引物2a-FIP：ggccgggcatagagtgggtcaccggaattgccgggaag
2a-BIP：ccgcaagactgctagccgagcrccctatcaggcagtacca
环引物2a-LB：tagcgttgggttgcgaaag
HCV3
外引物3-F3：ctcccgggagagccatag、3-B3cacggtctacgagacctcc
内引物
3-FIP：agcgggttgttccaagaaaggagtctgcggaaccggtgag
3-BIP：ccgcgagatcactagccgagtccctatcaggcagtaccaca
环引物3-LF：ccggcgattccggtgta
HCV6a
外引物6a-F3：gcaagactgctagccgag、6a-B3ctccgccaacgatctgac
内引物6a-FIP：tacgagacctcccggggcactagcgttgggttgcgaaag
6a-BIP：tgagcacwcttccaaaaccccacgccacccgggaactt
环引物6a-LB：tcaggcagtaccacaaggc
2)在65℃，60min条件下采用NEB试剂进行检测，在反应体系为：12.5μL2×MasterMix、2.5μL引物混合液、1μLcDNA模板和9μLRnasefree水在基因扩增仪下反应；
所述引物混合液两条外引物各5pmol、两条内引物各40pmol和环引物20pmol；
所述反应体系从红色变为黄色时结果判断为阳性。
3.如权利要求1或2任意一项所述的丙型肝炎病毒基因分型方法，其特征在于：所述丙型肝炎病毒基因分型方法最低检测限可以达到103IU/mL。
4.一种丙型肝炎病毒基因分型方法在丙型肝炎病毒基因分型试剂盒试剂盒中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501355A (zh) * 2020-12-15 2021-03-16 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 鸭丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102140538A (zh) * 2011-02-06 2011-08-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 丙型肝炎病毒检测试剂盒
CN102534045A (zh) * 2010-12-30 2012-07-04 上海复星医学科技发展有限公司 一种丙型肝炎病毒基因分型荧光pcr检测试剂盒
CN103060472A (zh) * 2013-01-08 2013-04-24 成都市学忠农业发展有限公司 一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒
CN103773897A (zh) * 2014-01-16 2014-05-07 江苏硕世生物科技有限公司 一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光pcr检测试剂盒及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102534045A (zh) * 2010-12-30 2012-07-04 上海复星医学科技发展有限公司 一种丙型肝炎病毒基因分型荧光pcr检测试剂盒
CN102140538A (zh) * 2011-02-06 2011-08-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 丙型肝炎病毒检测试剂盒
CN103060472A (zh) * 2013-01-08 2013-04-24 成都市学忠农业发展有限公司 一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒
CN103773897A (zh) * 2014-01-16 2014-05-07 江苏硕世生物科技有限公司 一种用于丙型肝炎病毒核酸检测和基因分型的多重荧光pcr检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOHAMMAD KARGAR ET AL.: "Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Hepatitis C virus", 《INDIAN J. VIROL.》 *
赵娜 等: "反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒1b和2a基因型检测", 《病毒学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501355A (zh) * 2020-12-15 2021-03-16 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 鸭丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒

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