CN102534045A

CN102534045A - 一种丙型肝炎病毒基因分型荧光pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN102534045A
Application number: CN 201010621904
Authority: CN
Inventors: 陈硕; 吴大治; 夏懿
Original assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明提供了一种丙型肝炎病毒(HCV)基因分型荧光PCR检测试剂盒，试剂盒包括RT-PCR反应液、RT-PCR混合酶、引物探针、阴性对照、1型阳性对照、2型阳性对照。本发明通过提取HCV RNA，通过一步法RT-PCR，检测样本中HCV RNA的基因类型。本发明的试剂盒一步法扩增方法简单、程序简短、操作简便，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰，可用于血清或血浆中丙型肝炎病毒的基因分型检测，非常适合临床及科研单位使用。

Description

一种丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于检测丙型肝炎病毒基因型的检测试剂盒。

背景技术

丙型病毒性肝炎是由多种丙型肝炎病毒(HCV)引起的，以肝脏损害的一组全身性传染病。丙型肝炎主要是通过输血或血制品、血透析、单采血浆还输血球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。丙型病毒性肝炎分布较广，容易演变为慢性、肝硬化和肝癌。基因分型在HCV感染、传播、诊断、诊疗、预防等方面均有重要意义。

目前临床上常用的HCV基因分型的检测方法主要有：

1.测序法：采用特异性PCR引物扩增部分病毒基因组区域，联合多部位的测序结果进而描绘系统进化树。直接测序法的优点是可提供被测区域的全部信息，包括病毒基因组内部的多态性，并可以发现新的基因变异形式，缺点是操作繁琐，成本较高，对混合感染不易确定。

2.型特异性RT-PCR方法：通过对套式RT-PCR引物设计的优化，使扩增片断大小不同，达到分型目的。改良后的方法可将6个基因型完全分开，并可以区分混合感染。该方法的优点是成本较低，不需要特殊设备，缺点是有时会出现较弱的扩增条带，难以判断。

3.型特异性探针杂交法：通过将生物素或荧光素标记型特异性探针固相化在膜或芯片上，与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交后，经扫描判读出HCV基因型，代表性试剂为Inno-LiPA II。该方法准确性和灵敏性较高，在国外报道的HCV基因分型研究中常用。

4.基因芯片法：近来开发的新方法，与测序法的符合率在90％以上，适用于大量样本的检测，需要专用检测分析设备。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有HCV基因分型检测存在的问题，利用PCR-荧光探针法，使丙型病毒性肝炎的基因分型有更为科学、便捷的检测诊断手段，可为医院、病人普遍接受。

为了达到上述发明目的，本发明的技术方案为：提供一种丙型肝炎病毒基因分型检测方法及试剂盒，采用一步荧光RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短。本发明方法操作简便、敏感度高、结果明晰。

本发明提供的试剂盒包括：RT-PCR反应液、RT-PCR混合酶、引物探针、阴性对照、HCV 1型阳性对照、HCV 2型阳性对照。其中所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl(pH8.3)20mM、KCl 100mM、明胶0.2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.4mM、MgCl₂6mM的混合液；所述的RT-PCR混合酶为逆转录酶和Taq酶的混合物；所述的引物探针为HCV特异性引物、HCV 1型特异性探针及HCV 2型特异性探针的混合液；所述的阴性对照为无HCV RNA的人血清；所述的HCV 1型阳性对照为含有HCV 1型基因片段的非传染性体外转录RNA的人血清；所述的HCV 2型阳性对照为含有HCV 2型基因片段的非传染性体外转录RNA的人血清。

检测用的HCV片段特异性引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列<SEQ ID No.3>为：5’-TGAGTACACCGGAATTGCC-3’

下游引物序列<SEQ ID No.4>为：5’-CTACTCGGCTAGCAGTCT-3’

HCV 1型特异性探针序列<SEQ ID No.5>为：

5’-CAACCCGCTCAATGCCTGGAG-3’。

HCV 2型特异性探针序列<SEQ ID No.6>为：

5’-AAACCCACTCTRTGCCCGGTC-3’

本发明提供的试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立HCV 1型阳性对照、HCV 2型阳性对照和阴性对照。

扩增检测：

a、按反应样本数(反应样本数＝待检样品数+对照品3个+1)n配制反应液：取RT-PCR反应液n×12.5μl、引物探针n×2μl、RT-PCR混合酶n×0.5μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按15μl/管分装到反应管中。

b、取样本提取物、阴性对照提取物、HCV 1型阳性对照提取物和HCV 2型阳性对照各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上。

c、50℃反应15min，然后95℃保温2min，再按94℃10s→60℃45s，循环45次，60℃采集FAM、HEX荧光通道的信号。

d、仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。分析软件自动计算各样品提取物的阴阳性结果。

本发明方法原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，以病毒RNA为模板，采用病毒基因组特异性引物探针，辅以逆转录酶和Taq酶，经一步法荧光RT-PCR实验，可快速、准确对丙型肝炎病毒RNA模板进行分析；从逆转录到荧光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰，可用于血清或血浆中丙型肝炎病毒的基因分型检测。非常适合医院检验科室、传染病防治中心以及各级丙型肝炎检测单位使用。

具体实施方式

实施例1一种丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒

1.丙型肝炎病毒核酸RNA的提取。

使用硅胶柱离心法进行提取。

2.逆转录及实时荧光PCR扩增(每人份25ul体系)

a、一步基因分型RT-PCR反应液的配制：

RT-PCR反应液 12.5ul

RT-PCR混合酶(Taq酶1.5U/ul，逆转录酶0.5U/ul) 0.5ul

引物探针 2ul

反应液体积： 15ul

b、基因分型一步法RT-PCR反应程序：

[1]50℃ 15min

[2]95℃ 2min

[3]94℃ 10s

[4]60℃ 45s

[5]Go to[3]，45cycles

在第五步采集荧光。

[6]End

3.检测：

本发明使用ABI Prism 7500实时基因分型PCR仪进行检测。

4.结果判断

仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。分析软件自动计算各样品提取物的阴阳性。

实施例2临床检测

用上述方法对200例HCV阳性临床样品进行检测，其中HCV 1型患者168例，HCV 2型患者32例，准确率100％，能对丙型肝炎病毒进行准确基因分型分析，远远优于酶联免疫。本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、可重复度高，可对丙型肝炎病毒进行快速定性检测，并可替代一直沿用的传统测序方法。同时，利用一步法荧光RT-PCR技术。在核酸提取结束后直接加入到反应体系中，cDNA的合成和PCR反应在一管，无需增加额外步骤。该操作既确保了扩增结果的准确性，灵敏度，又缩短了时间、减少了污染，提高了基因分型PCR检测方法的简便性，不仅可用于HCV基因分型，也可作为临床实验室对HCV感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段。

Claims

1.一种丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：本发明通过考察人体丙型肝炎病毒各个亚型序列之间特异位点的差异，设计出一对HCV特异性引物、一条HCV 1型特异性荧光探针和一条HCV 2型特异性荧光探针，采用实时PCR方法扩增目的基因。

2.一种丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：本发明采用一步RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行基因分型检测。在核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短。该方法操作简便、敏感度高、结果明晰，非常适合血清或血浆中丙型肝炎病毒的基因分型检测。

3.如权利要求2中所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应液的配制和扩增程序如下：

a、一步基因分型RT-PCR反应液的配制：

将RT-PCR反应液、RT-PCR混合酶(Taq酶1.5U/ul，逆转录酶0.5U/ul)、引物探针按照12.5∶0.5∶2的比例混合，反应液体积为15ul。

b、一步基因分型RT-PCR反应程序：

[1]50℃ 15min

[2]95℃ 2min

[3]94℃ 10s

[4]60℃ 45s

[5]Go to[3]，45cycles

在第四步采集荧光。

[6]End

4.如权利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、RT-PCR混合酶、引物探针、阴性对照、HCV 1型阳性对照、HCV 2型阳性对照。

5.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl(pH8.3)20mM、KCl 100mM、明胶0.2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.4mM、MgCl₂6mM的混合液；所述的RT-PCR混合酶为逆转录酶和Taq酶的混合物；所述的引物探针为一对HCV特异性引物、HCV 1型特异性探针及HCV 2型特异性探针的混合液；所述的阴性对照为无HCV RNA的人血清；所述的1型阳性对照为含有HCV 1型基因片段的非传染性体外转录RNA的人血清；所述的2型阳性对照为含有HCV 2型基因片段的非传染性体外转录RNA的人血清。

6.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：丙型肝炎病毒特异性PCR扩增的基因序列为<SEQ ID No.1>：5’

-TGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTG

GTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTT

TCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAG

ACTGCTAGCCGAGTAG-3’(HCV 1型)

和<SEQ ID No.2>：

5’

-TGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTG

GTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTT

TCTTGGATAAACCCACTCTRTGCCCGGTCATTTGGGCGTGCCCCCGCGAG

ACTGCTAGCCGAGTAG-3’(HCV 2型)。

丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒扩增序列全长165bp，属5’非编码区，为单拷贝序列。

7.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，一对HCV特异性引物序列中一条序列与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的部分序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的部分序列互补；HCV 1型特异性探针与SEQ ID No.1中所示的部分序列相同或互补；HCV 2型特异性探针与SEQ ID No.2中所示的部分序列相同或互补。

8.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的一对HCV特异性引物，其序列可以选自SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4

<SEQ ID No.3>为：5’TGAGTACACCGGAATTGCC 3’

<SEQ ID No.4>为：5’CTACTCGGCTAGCAGTCT 3’

一对HCV特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

9.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的HCV 1型特异性探针，可以选自SEQ ID No.5的序列，

<SEQ ID No.5>为：5’-CAACCCGCTCAATGCCTGGAG-3’。

其中探针5’端标记FAM荧光基团，探针3’端标记淬灭基团。HCV 1型特异特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。

10.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的HCV 2型特异性探针，可以选自SEQ ID No.6的序列，

<SEQ ID No.6>为：5’-AAACCCACTCTRTGCCCGGTC-3’。

其中探针5’端标记HEX荧光基团，探针3’端标记淬灭基团。HCV 2型特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10～20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85％以上。