CN102507925B - 一种改良的人血中抗体的检测方法 - Google Patents

一种改良的人血中抗体的检测方法 Download PDF

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一种改良的人血中抗体的检测方法，属于检测技术领域，由以下步骤完成，特异多肽抗原及内参多肽抗原的设计与合成，本发明提供一种与人类蛋白组无免疫交叉反应的羊多肽序列为内参多肽抗原；特异和内参多肽抗原的溶解和包被；血清或血浆中抗体的孵育；酶标抗体的孵育；显色，获得特异结合指数SBI。本发明有效提高了人血抗体检测方法的准确度和可重复性和特异性。

Description

一种改良的人血中抗体的检测方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，涉及抗体的检测方法。
背景技术
目前流行的基于表位多肽抗原的血液中IgA、IgG及IgM抗体的检测方法：
1、抗原的溶解与包被：溶解可溶性抗原，根据不同抗原确定不同稀释倍数，稀释后酶标板每孔加入50-100ul抗原包被液，4℃静置过夜。稀释液：碳酸盐缓冲液，pH 9.6或PBS缓冲液，pH 7.4。
2、 封闭：弃去包被液，洗板机或手动洗涤3-6次。洗涤液：PBST（PBS缓冲液包含0.05% Tween 20）。每孔100-200ul封闭缓冲液封闭过量的结合部位。
3、 血清或血浆中抗体的孵育：弃去封闭缓冲液，洗板机或手动洗涤3-6次，每孔加入100μl 封闭缓冲液稀释的血清或血浆 (1:100-500)，37℃或室温孵育1-4小时。
4、酶标抗体的孵育：弃去孵育的血清或血浆，洗板机或手动洗涤3-6次，根据检测抗体类型选择酶标抗体，常用辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体，每孔加入100-200μl，1/10000-30000封闭缓冲液稀释的酶标抗体，37℃或室温孵育1-4小时。
5 、显色：弃去酶标抗体，洗板机或手动洗涤3-6次，每孔加TMB显色液100μl， 显色15-30min，加终止液每孔50μl，以450nm为测试波长，630nm为参考波长，测定酶标板每孔OD值。
世界卫生组织专家组提出对ELISA的评价认为：“ELISA作为蛋白定量检测是一个好办法，但要做好它不容易。”虽然ELISA在国内外已使用得非常广泛，但对该法在应用中的评价尚不一致，过去在ELISA开始建立时有全面肯定的趋势，而在广泛研究和实践中发现了一些缺点，特别对ELISA的非特异性评价的资料不够完善，因此对出现一些非特异性反应的时候，往往不易解释，遇到了一些困难，如存在重演性问题，特异性问题以及能否考核疗效问题等等。因此，还需进一步研究改进，加以完善。
发明内容
本发明要解决的技术问题是公开一种改良的人血中抗体的检测方法，从而提高了人血中抗体检测的准确度、灵敏度。
本发明提供一种改良的基于表位多肽抗原的血液中IgA、IgG及IgM抗体的检测方法，由以下步骤完成：
1、多肽抗原的设计与合成：
 ① 特异多肽抗原的合成：根据所选蛋白的核心表位，设计并合成特异多肽抗原；
②  内参多肽抗原的合成：本发明提供一种与人类蛋白组无免疫交叉反应的羊多肽序列： H-VFQKLKDLKDYGGVSLPEWVCIAFHTSG-OH，为内参多肽抗原；
2、特异和内参多肽抗原的溶解：将中性及碱性多肽抗原溶解于 67%乙酸中，浓度5mg/ml，作为储备液，分装后置于-20℃冰箱保存；
3、特异和内参多肽抗原的包被：
① 特异多肽抗原包被：包被液稀释特异多肽抗原至所需浓度，每孔加100μl多肽抗原包被液，3复孔重复，覆封板膜，4℃静置过夜；
② 内参多肽抗原包被：包被液将内参多肽抗原稀释至10-20μg/ml浓度，每孔加100μl，对应特异多肽抗原3复孔重复；
其中特异多肽抗原包被浓度应以质控血样（Quality control，QC）的特异结合指数（specific binding index，SBI）为参照标准，质控血样的特异结合指数参照标准范围在1-1.4之间；
所述的 质控血样（Quality control，QC）的制备为100-1000健康人血清或血浆的混合样本，分装20μl/管，-20℃保存。长期保存应置于-80℃冰箱中；
所述的包被液配方为：叠氮钠NaN3  0.1g，加PBS缓冲液至100ml；
包被液
NaN3                               0.1g
PBS  缓冲液                     up to 100ml   4℃保存
举例说明酶标板多肽抗原包被设计：
                            
  hAg1 hAg1 hAg1 hAg2 hAg2 hAg2 hAg3 hAg3 hAg3 gAg gAg gAg
A NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC
B S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
C S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
D S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
E C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
F C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
G C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3
H QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC
                         
注：hAg:  人特异多肽抗原包被孔（ Human antigen-coated wells）
gAg:  内参多肽抗原包被孔（Blck1 antigen-coated wells）
NC：阴性对照孔（Negtive control）
C:   对照样本（Control samples）
S:   病例样本（Case samples）
    QC：质控血样本 （Quality control）
4、血清或血浆中抗体的孵育：弃去包被液，洗板机或手动洗涤3-6次，每孔加入100μl  1:100-500倍分析液稀释的血清或血浆，37℃或室温孵育1-4小时，其中分析液配方为：牛血清白蛋白（BSA）1.0g，加PBS缓冲液至100ml；
Figure 387615DEST_PATH_IMAGE002
5、 酶标抗体的孵育：弃去孵育的血清或血浆，洗板机或手动洗涤3-6次，每孔加入100-200μl，1/10000-30000分析液稀释的酶标抗体，37℃或室温孵育1-4小时，其中分析液是步骤4采用的分析液；
6、 显色：与目前方法一致，以450nm为测试波长，630nm为参考波长，测定酶标板每孔OD值，得到特异多肽抗原OD值、对应特异多肽抗原阴性对照OD值 、内参多肽抗原OD值和对应内参多肽抗原阴性对照OD值；
7、 特异结合指数SBI的计算公式如下：
SBI=特异多肽抗原OD值 – 对应特异多肽抗原阴性对照OD值 / 内参多肽抗原OD值 - 对应内参多肽抗原阴性对照OD值。
本发明从降低ELISA的非特异性结合，提高其准确度、灵敏度及可重复性入手，设计了质控系统和内参照系统，与目前流行检测方法相比具以下明显优势：
1、质控血样本QC 系统：本发明首次提出并制备了足量QC样本，每次独立试验均以QC样本SBI作为质控标准，以其批内变异CV <10%和批间变异CV <20%为标准，有效提高了人血抗体检测方法的准确度和可重复性。
2、 内参多肽抗原和特异结合指数SBI分析系统：本发明首次提出并设计合成了内参多肽抗原，且以羊多肽抗原检测的信号为内参背景信号，通过计算SBI值来衡量所检测特异抗体的表达量，从而有效地提高了人血抗体检测方法的特异性。
具体实施方式
例1、
检测方法由以下步骤完成：
（1）多肽抗原的设计与合成：
① 特异多肽抗原的合成：根据所选蛋白的核心表位，设计并合成特异多肽抗原；
②内参多肽抗原的合成：本发明提供一种与人类蛋白组无免疫交叉反应的羊多肽序列： H-VFQKLKDLKDYGGVSLPEWVCIAFHTSG-OH，为内参多肽抗原；       
（2）特异和内参多肽抗原的溶解：将中性及碱性多肽抗原溶解于 67%乙酸中，浓度5mg/ml，作为储备液，分装后置于-20℃冰箱保存；
（3）特异和内参多肽抗原的包被：
① 特异多肽抗原包被：包被液稀释特异多肽抗原至所需浓度，每孔加100μl多肽抗原包被液，3复孔重复，覆封板膜，4℃静置过夜；
② 内参多肽抗原包被：包被液将内参多肽抗原稀释至10μg/ml浓度，每孔加100μl，对应特异多肽抗原3复孔重复；
其中特异多肽抗原包被浓度应以质控血样（Quality control，QC）的特异结合指数（specific binding index，SBI）为参照标准，质控血样的特异结合指数参照标准范围为1；
所述的 质控血样本（Quality control，QC）的制备为100健康人血清或血浆的混合样本，分装20μl/管，-20℃保存。长期保存应置于-80℃冰箱中；
所述的包被液配方为：叠氮钠NaN3  0.1g，加PBS缓冲液至100ml；
举例说明酶标板多肽抗原包被设计：
                            
  hAg1 hAg1 hAg1 hAg2 hAg2 hAg2 hAg3 hAg3 hAg3 gAg gAg gAg
A NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC
B S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
C S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
D S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
E C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
F C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
G C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3
H QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC
                         
注：hAg:  人特异多肽抗原包被孔（ Human antigen-coated wells）
gAg:  内参多肽抗原包被孔（Blck1 antigen-coated wells）
NC：阴性对照孔（Negtive control）
C:   对照样本（Control samples）
S:   病例样本（Case samples）
    QC：质控血样本 （Quality control）
（4） 血清或血浆中抗体的孵育：弃去包被液，洗板机或手动洗涤3次，每孔加入100μl  1:100倍分析液稀释的血清或血浆，37℃孵育1小时，其中分析液配方为：牛血清白蛋白（BSA）1.0g，加PBS缓冲液至100ml；
（5） 酶标抗体的孵育：弃去孵育的血清或血浆，洗板机或手动洗涤3次，每孔加入100μl，1/10000分析液稀释的酶标抗体，37℃孵育1小时，其中分析液是步骤4采用的分析液；
（6） 显色：与目前方法一致，以450nm为测试波长，630nm为参考波长，测定酶标板每孔OD值，得到特异多肽抗原OD值、对应特异多肽抗原阴性对照OD值 、内参多肽抗原OD值和对应内参多肽抗原阴性对照OD值；
（7） 特异结合指数SBI的计算公式如下：
SBI=特异多肽抗原OD值 – 对应特异多肽抗原阴性对照OD值 / 内参多肽抗原OD值 - 对应内参多肽抗原阴性对照OD值。
例2、
检测方法由以下步骤完成：
（1）多肽抗原的设计与合成：
 ① 特异多肽抗原的合成：根据所选蛋白的核心表位，设计并合成特异多肽抗原；
②内参多肽抗原的合成：本发明提供一种与人类蛋白组无免疫交叉反应的羊多肽序列： H-VFQKLKDLKDYGGVSLPEWVCIAFHTSG-OH，为内参多肽抗原；
（2）特异和内参多肽抗原的溶解：将中性及碱性多肽抗原溶解于 67%乙酸中，浓度5mg/ml，作为储备液，分装后置于-20℃冰箱保存；
（3）特异和内参多肽抗原的包被：
① 特异多肽抗原包被：包被液稀释特异多肽抗原至所需浓度，每孔加100μl多肽抗原包被液，3复孔重复，覆封板膜，4℃静置过夜；
② 内参多肽抗原包被：包被液将内参多肽抗原稀释至20μg/ml浓度，每孔加100μl，对应特异多肽抗原3复孔重复；
其中特异多肽抗原包被浓度应以质控血样（Quality control，QC）的特异结合指数（specific binding index，SBI）为参照标准，质控血样的特异结合指数参照标准范围为1.4；
所述的 质控血样本（Quality control，QC）的制备为1000健康人血清或血浆的混合样本，分装20μl/管，-20℃保存。长期保存应置于-80℃冰箱中；
所述的包被液配方为：叠氮钠NaN3  0.1g，加PBS缓冲液至100ml；
举例说明酶标板多肽抗原包被设计：
                            
  hAg1 hAg1 hAg1 hAg2 hAg2 hAg2 hAg3 hAg3 hAg3 gAg gAg gAg
A NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC
B S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S1
C S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S2
D S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3 S3
E C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1
F C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C2
G C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3 C3
H QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC QC
                         
注：hAg:  人特异多肽抗原包被孔（ Human antigen-coated wells）
gAg:  内参多肽抗原包被孔（Blck1 antigen-coated wells）
NC：阴性对照孔（Negtive control）
C:   对照样本（Control samples）
S:   病例样本（Case samples）
    QC：质控血样本 （Quality control）
（4） 血清或血浆中抗体的孵育：弃去包被液，洗板机或手动洗涤3次，每孔加入100μl  1:500倍分析液稀释的血清或血浆，室温孵育4小时，其中分析液配方为：牛血清白蛋白（BSA）1.0g，加PBS缓冲液至100ml；
（5） 酶标抗体的孵育：弃去孵育的血清或血浆，洗板机或手动洗涤3次，每孔加入200μl，1/30000分析液稀释的酶标抗体，室温孵育4小时，其中分析液是步骤4采用的分析液；
（6） 显色：与目前方法一致，以450nm为测试波长，630nm为参考波长，测定酶标板每孔OD值，得到特异多肽抗原OD值、对应特异多肽抗原阴性对照OD值 、内参多肽抗原OD值和对应内参多肽抗原阴性对照OD值；
（7） 特异结合指数SBI的计算公式如下：
SBI=特异多肽抗原OD值 – 对应特异多肽抗原阴性对照OD值 / 内参多肽抗原OD值 - 对应内参多肽抗原阴性对照OD值。
Figure IDA0000114124940000011

Claims (2)

1.一种改良的人血中抗体的检测方法，其特征是由以下步骤完成：
（1）多肽抗原的设计与合成：
 ① 特异多肽抗原的合成：根据所选蛋白的核心表位，设计并合成特异多肽抗原；
②  内参多肽抗原的合成：本发明提供一种与人类蛋白组无免疫交叉反应的羊多肽序列： H-VFQKLKDLKDYGGVSLPEWVCIAFHTSG-OH，为内参多肽抗原；
（2）特异和内参多肽抗原的溶解：将中性及碱性多肽抗原溶解于 67%乙酸中，浓度5mg/mL，作为储备液，分装后置于-20℃冰箱保存；
（3）特异和内参多肽抗原的包被：
① 特异多肽抗原包被：包被液稀释特异多肽抗原至所需浓度，每孔加100μL多肽抗原包被液，3复孔重复，覆封板膜，4℃静置过夜；
② 内参多肽抗原包被：包被液将内参多肽抗原稀释至10-20μg/mL浓度，每孔加100μL，对应特异多肽抗原3复孔重复；
其中特异多肽抗原包被浓度应以质控血样的特异结合指数为参照标准，质控血样的特异结合指数参照标准范围在1-1.4之间；
所述的包被液配方为：叠氮钠NaN3  0.1g，加PBS缓冲液至100mL；
（4）血清或血浆中抗体的孵育：弃去包被液，洗板机或手动洗涤3-6次，每孔加入100μL  1:100-500倍分析液稀释的血清或血浆，37℃或室温孵育1-4小时，其中分析液配方为：牛血清白蛋白（BSA）1.0g，加PBS缓冲液至100mL；
（5） 酶标抗体的孵育：弃去孵育的血清或血浆，洗板机或手动洗涤3-6次，每孔加入100-200μL，1/10000-30000分析液稀释的酶标抗体，37℃或室温孵育1-4小时，其中分析液是步骤（4）采用的分析液；
（6） 显色：与目前方法一致，以450nm为测试波长，630nm为参考波长，测定酶标板每孔OD值，得到特异多肽抗原OD值、对应特异多肽抗原阴性对照OD值 、内参多肽抗原OD值和对应内参多肽抗原阴性对照OD值；
（7） 特异结合指数SBI的计算公式如下：
SBI=[特异多肽抗原OD值–对应特异多肽抗原阴性对照OD值 ]/ [内参多肽抗原OD值–对应内参多肽抗原阴性对照OD值]。
2.根据权利要求1所述的改良的人血中抗体的检测方法，基特征在于：质控血样的制备为100-1000健康人血清或血浆的混合样本。
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