CN101596307B

CN101596307B - 重组fn肝素结合域多肽在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用

Info

Publication number: CN101596307B
Application number: CN 200810071172
Authority: CN
Inventors: 陈元仲; 黄涛; 邹起练; 陈显凌
Original assignee: Union Medical College Hospital of Fujian Medical University
Current assignee: Union Medical College Hospital of Fujian Medical University
Priority date: 2008-06-05
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2028-06-05
Also published as: CN101596307A

Abstract

本发明公开了一种重组FN肝素结合域多肽在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用，由FN分子中N端的五个I型同源结构组成，含有从Ser46-Gly282的237个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从403bp到1113bp，长711bp，PCR扩增片断长741bp，双酶切后片断长729bp；由酵母表达的多肽分子量为28.52kDa。由FN分子中的III-12、III-13、III-14三个III型同源结构组成，含有从Tyr1720-Tyr1991的272个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从5428bp到6244bp，长816bp，PCR扩增片断长835bp，双酶切后片断长828bp，由酵母表达的多肽分子量为36.09kDa。经试验证明本发明能在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中得到应用。

Description

重组FN肝素结合域多肽在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用

技术领域：

本发明涉及医药领域，尤其属于重组纤维连接蛋白N端及C端肝素结合域多肽在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用。

背景技术：

纤维连接蛋白，fibronectin，以下简称FN；侵袭转移是恶性肿瘤的生物学特征。肿瘤的侵袭转移中，肿瘤细胞与肿瘤细胞、肿瘤细胞与血管内皮细胞及细胞外基质之间的粘附和解离在转移扩散中起重要作用。近年来肿瘤中细胞外基质成分如何影响肿瘤细胞粘附、迁移，从而影响肿瘤侵袭、转移，已成为研究热点。FN是细胞外基质(ECM)的重要成份，为一种具有多种功能的糖蛋白大分子，能与肝素、胶原、纤维蛋白以及整合素家族的细胞表面受体结合，它与细胞表面的受体结合可改变细胞的粘附性能，在肿瘤的侵袭和转移事件中起重要作用。大量研究表明FN具有抗肿瘤侵袭转移的作用，但从血浆分离FN存在着血浆资源不足和可能传播血源性传染病的问题，同时由于FN分子量大，全分子表达又存在技术上的难题。因此利用基因工程技术表达FN的功能区多肽并研究其功能，以代替FN的抗肿瘤侵袭转移作用不失为一种可行的方法。FN分子结构中有二个与肝素结合的结构域，一个位于FN的N端，由五个I型的同源结构组成，该结构域的分子量为29kDa，由237个氨基酸组成。另一个位于FN的C端，由第12，13，14三个III型的同源结构组成，该结构域的分子量为36kDa，由272个氨基酸组成。重组FN N端及C端肝素结合域两种多肽对恶性肿瘤的侵袭、转移能力的影响的研究不曾报道。因此，在前期成功制备重组FN的N端及C端肝素结合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)(制备方法与申请号为200710009192.2所公开方法相同)基础上，以下本发明将研究rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽对恶性肿瘤(以B16细胞)粘附能力及恶性肿瘤(以B16细胞为例)相关粘附基因mRNA表达的影响，继而以恶性肿瘤(以B16细胞为例)在C57小鼠体内建立移植瘤和转移瘤动物模型，研究rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽对小鼠黑色素瘤B16细胞侵袭转移能力的影响，并探讨此两种多肽抑制肿瘤侵袭转移能力的分子机制。

发明内容：

本发明的目的在于提出一种重组纤维连接蛋白N端及C端肝素结合域多肽在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用。

本发明所采用的技术方案是：所述的二种重组纤维连接蛋白N和C端肝素结合域多肽，其一的特征在于是由FN分子中N端的五个I型同源结构组成，含有从Ser46-Gly282的237个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从403bp到1113bp，长711bp，PCR扩增片断长741bp，双酶切后片断长729bp；由酵母表达的多肽分子量为28.52kDa，纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽(简称rhFNHN-29)。所述的另一种重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽，其特征在于是由FN分子中的III-12、III-13、III-14三个III型同源结构组成，含有从Tyr1720-Tyr1991的272个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从5428bp到6244bp，长816bp，PCR扩增片断长835bp，双酶切后片断长828bp，由酵母表达的多肽分子量为36.09kDa，纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽(简称rhFNHC-36)。

本发明的重组FN N端肝素结合域和重组FN C端肝素结合域多肽酵母表达载体的构建及多肽的制备：

根据FNcDNA序列及与FN分子结构中的氨基酸序列进行比对，确定纤维连接蛋白N端或C端肝素结合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)克隆位置，结合酵母表达载体的酶切特点，设计rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆的PCR扩增引物和酶切位点。利用所设计和合成的PCR引物，以FNcDNA为模板，PCR合成rhFNHN-29和rhFNHC-36基因。将rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆至pGEM-T载体上。将重组的pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)载体转染DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的选择，挑取阳性克隆的单菌斑，进行DNA序列测定。正确的克隆进一步扩增，提取重组pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒。以双酶切和连接的方法将rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因连接到pAo815SM载体中。将重组的pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)载体转染DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的选择，挑取阳性克隆的单菌斑，DNA序列测定和双酶切鉴定，提取阳性克隆的重组pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒。以双酶切和连接的方法将rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因连接到pPIC9K整合型酵母表达载体上。重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)载体转染DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的选择，挑取阳性克隆的单菌斑，进行DNA序列测定和双酶切鉴定。正确的克隆进一步扩增，提取重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒。用Bgl II酶切重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒，使其线性化。将线性化的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)载体转染GS115酵母细胞，进行筛选，挑选阳性克隆进行小规模诱导培养、鉴定rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的表达量，挑选高水平表达的菌株进行大规模的表达。发酵液先用80％硫酸胺沉淀，沉淀物溶解后上S-100柱和SP柱纯化rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽。对纯化的rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽进行SDS-PAGE分析，并经凝胶图像分析系统扫描计算其分子量。通过斑点杂交和Western blot方法，检测多肽结合肝素能力和FN的抗原性。

本发明成功构建了重组rhFNHN-29和rhFNHC-36酵母表达载体，并在酵母细胞中表达及制备了rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽。制备的rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽经SDS-PAGE电泳分离，在凝胶图象分析系统中测定分子量，rhFNHC-36多肽分子量为36.09kDa，rhFNHN-29多肽分子量为28.52kDa。斑点杂交实验证明两多肽均能与肝素结合，但都不能与FN抗体结合。说明所合成的多肽在体外具有结合肝素的能力而没有FN的抗原性。说明利用酵母表达系统表达FN肝素结合域多肽是可行的。

本发明所述的重组纤维连接蛋白N端及C端肝素结合域多肽，经试验证明能在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中得到应用。

本发明具有如下优点：本发明是利用基因工程技术表达FN的功能区多肽并研究其功能，以代替FN的抗肿瘤侵袭转移作用。FN N端和C端的两个肝素域是目前深受研究人员关注的区域。

1)本发明的重组FN的肝素结合域具有下述多种生物学功能：1.是血管内皮生长因子的结合区域，增强了血管内皮生长因子的活性，促进血管的生成；同时通过与血管内皮细胞表面的肝素硫酸蛋白聚糖结合促进了血管内皮细胞表达更多有活性的血管内皮生长因子；2.增强了FN细胞结合域介导的细胞黏附与增殖；3.通过下调MMP-9和α5β3的表达抑制肝癌的生长和转移；4.通过抑制p53和c-myc基因调节细胞的凋亡；5.能够与细菌表面的蛋白结合，从而发挥其抗微生物活性；6.参与调节造血干细胞的增殖与分化。7.具有刺激组织纤溶酶原激活剂激活纤溶酶的活性；8.与淋巴细胞表面的CD44结合，参与免疫的调节；9.能诱导NO的产生和金属蛋白酶的合成。

2)本发明的重组纤维连接蛋白N端及C端肝素结合域两种多肽进行对以小鼠黑色素瘤为例的肿瘤的侵袭、转移能力的影响的实验研究。本发明通过不同的细胞粘附实验研究重组FN多肽对B16细胞与基底膜及B16细胞相互间的粘附力的影响，结果显示：B16细胞与重组FN多肽的粘附力和天然全长纤维连接蛋白基本一致；在各时相内，经过重组FN多肽干预的B16细胞与人工基质基底膜的粘附力明显增高，经过重组FN多肽干预的B16细胞之间的粘附力明显增高，经0.02％乙二胺四乙酸处理后，重组FN多肽干预组脱落的B16细胞数目明显减少，与对照组相比，差别均有统计学意义(P＜0.01)。提示重组FN多肽可以增强B16细胞与基底膜及B16细胞之间的粘附能力，减弱B16细胞从基底膜及周围细胞脱落的能力。本发明的重组FN多肽通过增加细胞表面FN表达，继而增强FN和细胞表面整合素受体的结合力，从而增强细胞间及细胞与基底膜的粘附力。

3)整合素是细胞表面的一种重要的粘附分子，主要介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质之间的相互粘附，并介导细胞与细胞外基质之间的双向信号传导，调控细胞粘附、增殖、转移、凋亡，其中整合素av β3是整合素家族中的一种重要分子，与肿瘤的侵袭转移有关。整合素av β3是血液中肿瘤细胞和血管内皮细胞结合，进而侵入内皮下基质的关键因子。而血液中的纤维蛋白原是整合素av β3的天然配体之一，可以促进肿瘤细胞和血管内皮细胞的粘附，然后肿瘤细胞通过av β3和内皮下基质结合，开始侵袭组织。同时，纤维蛋白原在整合素中只结合av β3，并能促进肿瘤细胞与av β3的其他配体结合，进而增强侵袭能力。本发明通过RT-PCR检测重组FN多肽处理后B16细胞整合素av、β3基因的mRNA表达，结果显示：B16细胞经重组FN多肽作用后，整合素av、β3基因的mRNA表达明显降低。同时通过细胞粘附实验检测重组FN多肽对B16细胞与纤维蛋白原粘附力的影响，结果显示：经过重组FN多肽处理后，B16细胞与纤维蛋白原的结合能力明显减弱。肿瘤细胞和纤维蛋白原的结合能力减弱，可使具有高活性的av β3细胞减少。提示重组FN多肽不仅干扰整合素av、β3基因的表达，而且抑制整合素av β3和其他配体的结合，进而抑制肿瘤的侵袭转移。这是重组FN多肽抗B16肿瘤细胞血行转移的分子机制之一。

4)细胞与ECM粘附可诱导一些重要的功能基因的表达，目前对于粘附诱导基因表达的机理还不清楚，推测可能通过整合素相关的信号转导来实现，这一信号转导的一个重要中间分子是粘附斑激酶(FAK)。FAK是一非受体型蛋白酪氨酸激酶，是介导细胞间、细胞与胞外基质信号转导的胞内重要分子，参与多条信号转导通路，在胞内与FN-整合素-细胞骨架跨膜信息系统相结合，调节AP-1、PI-3K等多种信号通路，参与细胞增殖、转化等多种生物学过程。细胞ECM粘附可诱导整合素分子聚集，并激活FAK，磷酸化细胞骨架蛋白，引起细胞骨架重建，且可通过RAS-MAPK通路影响基因表达。通过上述作用，粘附不仅可影响MMP基因表达及侵袭性质，而且还可调节多种细胞功能，如锚定依赖性生长性质和分化。本发明通过RT-PCR检测重组FN多肽处理后B16细胞FAK基因的mRNA表达，结果显示：B16细胞经重组FN多肽作用后，FAK基因的mRNA表达显著降低。重组FN多肽可明显抑制FAK基因的mRNA表达，提示重组FN多肽可以阻止FN-整合素-细胞骨架跨膜信息系统的信号转导，抑制肿瘤的侵袭转移能力。

5)肿瘤侵袭是指恶性肿瘤细胞离开原发生长部位，突破基底膜和细胞外基质构成的屏障，侵犯毗邻的正常组织。侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤，如能早期预防和抑制侵袭将可减少或预防转移的发生。本发明通过皮下接种B16黑色素瘤细胞建立皮下肿瘤侵袭转移模型，结果显示：B16瘤细胞在小鼠皮下生长迅速，70％的小鼠皮下肿瘤发生腹腔侵袭，20％的小鼠皮下肿瘤发生肺脏转移。经过重组FN多肽干预后，小鼠皮下肿瘤的生长受到明显的限制，rhFNHN-29多肽干预组只有10％的小鼠皮下肿瘤发生腹腔侵袭，未见肺脏转移；而rhFNHC-36多肽干预组只有20％的小鼠皮下肿瘤发生腹腔侵袭，未见肺脏转移，两种多肽与对照组的差别均具有统计学意义(P＜0.01)。提示重组FN多肽不仅可以明显抑制皮下肿瘤的生长，还可以减弱皮下肿瘤向腹腔侵袭及向肺脏转移的能力。在转移过程的早期步骤中，粘附可以使细胞不易脱离瘤体，实际上降低了转移率。因此重组FN多肽能通过增强B16细胞与基底膜及细胞之间的粘附能力，减弱B16细胞从基底膜及周围细胞脱落的能力，从而使皮下肿瘤局限生长，最终减少了肿瘤的侵袭和转移。

6)腹腔接种瘤细胞后形成肿瘤结节依据大小可分为大结节(≥1mm)和小结节(＜1mm)。本发明研究发现，结节形成初期，都是小结节，随着肿瘤组织的生长，大结节的数量逐渐增加，而小结节的数量却逐渐停止增加，这可能与大肿瘤组织分泌肿瘤血管生长抑制因子有关。腹腔内微小肿瘤结节具有更强的侵袭转移能力，而较大的肿瘤结节一般局限生长。本发明通过腹腔接种B16黑色素瘤细胞建立腹腔侵袭模型，结果显示：B16瘤细胞在腹腔内形成大量的微小肿瘤结节(＜1mm)，分布于肠系膜静脉网及腹腔大血管周围，具有很强的侵袭转移能力。经过重组FN多肽干预后，B16瘤细胞在腹腔内局限生长，腹腔内微小肿瘤结节明显减少，其中，rhFNHN-29多肽对腹腔肿瘤结节的抑制率为62.7％，而rhFNHC-36多肽对腹腔肿瘤结节的抑制率为54.5％；重组FN多肽干预组与对照组相比，差别具有统计学意义(P＜0.01)。提示重组FN多肽对微小肿瘤结节的增加具有较强的抑制作用，可抑制小鼠黑色素瘤在腹腔的侵袭生长。

7)肿瘤转移指恶性肿瘤细胞借助血管、淋巴管等途径，在远离肿瘤原发生长部位的器官内形成继发瘤的过程。人工血行转移模型集中体现了肿瘤细胞进入血液循环以后癌转移的几个步骤。因此，本发明通过尾静脉接种B16黑色素瘤细胞建立黑色素瘤人工血行转移模型，结果显示：B16瘤细胞通过尾静脉进入小鼠血液循环后，最终100％小鼠发生黑色素瘤肺脏转移。经过重组FN多肽干预后，rhFNHN-29多肽干预组只有50％小鼠发生黑色素瘤肺脏转移，而rhFNHC-36多肽干预组只有40％小鼠发生黑色素瘤肺脏转移，与对照组相比，差别均有统计学意义(P＜0.05)。提示重组FN多肽能明显减少荷瘤小鼠肺脏转移。由于重组FN多肽和肿瘤细胞表面的整合素受体具有很强的粘附力，故我们认为，重组FN多肽可和血管内皮细胞“竞争”肿瘤细胞表面的整合素受体，使肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的粘附性减弱，肿瘤局限在血流中，不易突破基底膜侵入其他器官，从而减少肺脏及其他部位转移灶的产生。人工血行转移模型是通过尾静脉注射瘤细胞建立，大量肿瘤细胞通过血行而到达相应器官形成转移癌，重组FN多肽有一定效果。

综上所述，本发明重组FN多肽通过影响整合素av β3的功能，进而干扰B16细胞与细胞外基质粘附能力，并减弱粘附斑激酶的激活，从而起到抑制肿瘤侵袭转移的作用。因此本发明的重组FN肝素结合域多肽能在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用，从小鼠黑色素瘤细胞B16细胞注射到小鼠的动物实验数据可知本发明的重组FN肝素结合域多肽具有抑制恶性肿瘤侵袭转移的作用，能作为药物；而且制备方法简单，能替代从血浆分离FN，克服存在着血浆资源不足和可能传播血源性传染病的问题。

附图说明：

图1-1为本发明的rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重组载体上的PCR鉴定图。

图中：1、pUC8；2、rhFNHC-36；3、rhFNHN-29

图1-2为本发明的重组pAo815SM-FNHN-29载体EcoR I和BamH双酶切鉴定图。

图中：1、pUC18；2、pAo815SM-FNHN-29载体；3、空载体对照

图1-3为本发明的bacmid-FNHC-36重组载体上rhFNHC-36基因的PCR和双酶切鉴定图。

图中：1、PCR鉴定；2、双酶切鉴定；3、pUC8

图1-4为本发明的rhFNHN-29基因的正向测序图。

图1-5为本发明的rhFNHN-29基因的反向测序图。

图1-6为本发明的rhFNHC-36基因的正向测序图。

图1-7为本发明的rhFNHC-36基因的反向测序图。

图1-8为本发明的FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析图。

图1-9为本发明的纯化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析图。

图中：1、纯化的FNHC-36多肽；2、M

图1-10为本发明的rhFNHC-36多肽的分子量测定图。

图1-11为本发明的rhFNHN-29多肽分子量测定图。

图1-12为本发明的多肽结合肝素斑点杂交放射显影图。

图中：左右箭头为rhFNHC-36多肽，中间箭头为rhFNHN-29多肽

图1-13为本发明的多肽结合肝素斑点杂交酶联反应显色图。

图中：左右箭头为rhFNHC-36多肽，中间箭头为rhFNHN-29多肽

图2为本发明的C57BL/6小鼠皮下肿瘤腹腔侵袭模型图(接种后第30天)。

图中：a：对照组；b：rhFNHC-36多肽组；c：rhFNHN-29多肽组

图3为本发明的C57BL/6小鼠皮下肿瘤照片(接种后第30天)。

图中：上：对照组；中：rhFNHC-36多肽组；下：rhFNHN-29多肽组。

图4为本发明的C57BL/6小鼠腹腔肿瘤移植侵袭模型图(接种后第7天)。

图中：a：对照组；b：rhFNHC-36多肽组；c：rhFNHN-29多肽组

图5为本发明的C57BL/6小鼠接种瘤细胞后第30天全肺照片图(每组显示3只小鼠全肺)。

图中：a：对照组；b：rhFNHC-36多肽组；c：rhFNHN-29多肽组

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述：

下面以小鼠黑色素瘤细胞B16细胞注射到小鼠为例说明重组FN肝素结合域多肽能在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用。

(一)材料与试剂

1.主要试剂

天然全长纤维连接蛋白(FN)：采用明胶亲和层析法从正常人血浆纯化。

重组FN多肽：重组FN N端肝素结合域多肽(rhFNHN-29)、重组FN C端肝素结合域多肽(rhFNHC-36)：本发明构建FN N端和C端两个肝素结合域多肽的酵母表达载体pPIC9K-rhFNHN-29、pPIC9K-rhFNHC-36，并筛选出高表达的酵母表达菌株，表达、纯化出rhFNHN-29多肽及rhFNHC-36多肽。

RPMI-1640培养液购自GIBCOL公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司，引物、Trizol均购自Invitrogen公司，AMV逆转录试剂盒购自Promega公司(编号：A3500)，PCR试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)公司，DNA Marker购自北京天为时代公司，MatrigelMatrix购自BD公司，纤维蛋白原、四甲基偶氮唑蓝购自Sigma公司，96孔、6孔细胞培养板购自Costar公司。

2.细胞株：

小鼠黑色素瘤细胞B16细胞：由福建医科大学药学院惠赠，置于含10％小牛血清的RPMI1640培养液，37℃、5％CO2混合气体培养箱中常规传代培养，0.25％胰蛋白酶消化传代。

3.动物：

C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重(19±0.6)g，雄性，由中国医学科学院上海实验动物繁育中心提供[为清洁级动物，合格证SCXX(沪)-2003-003]，在SPF层流柜中饲养。

4.主要仪器：

台式低温离心机为Beckman公司产品(型号：J2-21)，紫外分光光度仪为Beckman公司产品(型号：DU-640)，酶标仪为Stat公司产品(型号：Fax-2100)，PCR扩增仪为美国AB公司产品(型号：AB2720)，凝胶成像系统为美国BIO-RAD公司产品(型号：GelDOC1000)，细胞培养箱为HEAL FORCE公司产品，超净工作台为AIR TECH公司产品，微量加样器为Eppendorf公司产品，水平电泳槽为北京东方仪器厂产品，电子天平为Ohaus公司产品，光学显微镜为0lympus公司产品。

(二)重组FN肝素结合域多肽酵母表达载体的构建及多肽的制备

本发明将FN的C端的肝素结合域多肽基因和FN的N端的肝素结合域多肽基因克隆至酵母表达载体，并在GS115酵母细胞中进行表达。

1.1)FN C端和FN N端肝素结合域多肽基因PCR扩增引物设计

根据FNcDNA序列，及与FN分子结构中的氨基酸序列进行比对，确定纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽(rhFNHC-36)和N端肝素结合域多肽(rhFNHN-29)的克隆位置，结合酵母表达载体的酶切位点，设计重组rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR引物和酶切位点。

FN N端肝素结合域多肽是由FN分子中N端的五个I型同源结构组成，含有237个氨基酸(Ser46-Gly282)。编码该多肽的DNA序列长711bp(403bp-1113bp)，PCR扩增片断长741bp，双酶切后片断长729bp，该多肽命名为rhFNHN-29。其目的基因片断PCR扩增的引物如下：

上游引物5-ATGCTC^↓TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAG CAGTCAAAGCAAGCCCGGTTGTTA-3

下游引物5-ACGTAG^↓AATTCTCCG CTCGATGTGGTCTGCA-3

上游酶切位点XhoI，下游酶切位点EcoR I。

FN C端肝素结合域多肽是由FN分子中的III-12、III-13、III-14三个III型同源结构组成，含有272个氨基酸(Tyr1720-Tyr1991)。编码该多肽的DNA序列长816bp(5428bp-6244bp)，PCR扩增片断长835bp，双酶切后片断长828bp，该多肽命名为 rhFNHC-36。其目的基因片断PCR扩增的引物如下：

上游引物5-ATGCTC^↓TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGGCACCAACTGAC-3

下游引物5-ACGTAG^↓AATTCTCCGCTCGTCTGTCTTTTTCCTTCC-3上游酶切位点XhoI，下游酶切位点EcoR I。

1.2)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR扩增及纯化回收

PCR扩增体系：FNcDNA 0.1μl(50ng)，10×缓冲液5μl，dNTP 1μl，pfu 1μl(3U)，上下游引物各1μl(10pmol)，双蒸水41μl，构成50μl反应体系。

PCR扩增条件：94℃5分钟预变性，94℃30秒，63℃(rhFNHN-29，66℃)40秒，72℃40秒，25个循环，72℃10分钟。

PCR扩增产物经1％低溶点胶电泳，割取含目的基因的低溶点胶，用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片断，加双蒸水溶解，测OD值。

1.4)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因连接至酵母表达载体

1.4.1)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因连接到pGEM-T载体

rhFNHN-29和rhFNHC-36基因末端加A。反应体系20μl：PCR回收产物12.4μl，MgCL₂1.6μl，ATP2μl，10×缓冲液2μl，Taq酶2μl，在72℃连接30分钟。

rhFNHN-29和rhFNHC-36基因连接pGEM-T载体。反应体系20μl：pGEM-T载体2μl，末端加A的rhFNHN-29基因6μl，2×缓冲液10μl，T连接酶2μl，4℃连接16小时。

1.4.2)阳性重组pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)载体的选择

10μl连接产物加入到50μlDH5a感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，加150μl LB(AMP^-)，37℃225rpm振摇1小时。100μl的转染液涂至三块AMP⁺的LB板上，37℃培养过夜。挑选单个菌斑至5mlAMP⁺的LB中37℃225rpm振摇6小时，提取质粒进行DNA测序和酶切鉴定。

1.4.3)rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因连接到pAo815SM载体

将以上挑选鉴定正确的阳性菌斑进一步振摇扩增，用UNIQ-200柱式质粒大量抽提试剂盒提取pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)阳性质粒。操作按说明书进行。

重组pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒的XhoI酶切：重组pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒20μl(1μl含100ng)，10×缓冲液20μl，10×BSA20μl，XhoI1.5μl，双蒸水138.5μl，200μl体系，37℃酶切2小时。酶切产物分两管，分别用95％乙醇沉淀，一管加10μl双蒸水，电泳观察酶切效果。若已酶切彻底，另一管再用EcoR I酶切。

重组pGEM-T-FNHN-29质粒的EcoR I酶切：另一管继续EcoRI酶切，上述酶切沉淀质粒，10×缓冲液4μl，10×BSA4μl，EcoR I 2μl，双蒸水30μl.40μl体系，37℃2小时。1％低溶点琼脂糖回收FNHN-29(rhFNHC-36)基因片断，加10μl双蒸水溶解。

pAo815SM载体的酶切。取pAo815SM质粒，用XhoI酶切，酶切体系：pAo815SM质粒20μl(1μl含100ng)，10×缓冲液20μl，10×BSA20μl，XhoI1.5μl，双蒸水138.5μl，200μl体系，37℃酶切2小时，琼脂糖电泳检测酶切效果，酶切完全后用95％乙醇沉淀，加10μl双蒸水溶解。得到的产物再用EcoR I酶切，酶切体系：上述酶切沉淀质粒，10×缓冲液4μl，10×BSA4μl，EcoR I 2μl，双蒸水30μl.40μl体系，37℃2小时。1％低溶点琼脂糖回收pAo815SM线性质粒，加10μl双蒸水溶解。

连接反应：以上rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因酶切回收产物2μl，10×缓冲液1.5μ l，T连接酶1μl，酶切回收的pAo815SM载体1μl，双蒸水10μl，15.5μl体系，14℃连接过夜。

1.4.4)重组pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒转染DH5a感受态细胞选择阳性克隆

以上15.5μl的连接产物加入到50μl DH5a感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，加150μlLB(AMP^-)，37℃225rpm振摇1小时。每100μl转染后的DH5a菌液涂至三块AMP⁺的LB板上，37℃培养过夜。从转化平板上挑出5个单菌落分别到5mlAMP⁺的LB中，37℃225rpm振摇过夜。用质粒提取试剂盒提取质粒，EcoR I酶切验证。选出阳性克隆继续下一步试验。

pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒双酶切(EcoR I)：pAo815SM-FNHN-29质粒30μl，10×缓冲液(M)6μl，10×BSA 6μl，EcoR I 2μl，BamH I 2μl双蒸水14μl，60μl体系，37℃酶切3小时。琼脂糖电泳检测酶切充分后，酶切物用2％琼脂糖和1％低溶点胶回收rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因。双蒸水溶解。

1.4.5rhFNHN-29基因(rhFNHC-36)连接到酵母表达载体pPIC9K

pPIC9K质粒双酶切(EcoR I和BamH)：pPIC9K空质粒用EcoR I和BamH在37℃酶切3小时。琼脂糖电泳检测酶切充分后，用2％琼脂糖和1％低溶点胶回收pPIC9K线性质粒，双蒸水溶解。

连接反应：EcoR I和BamH双酶切回收的FNHN-29(rhFNHC-36)基因6μl，EcoR I和BamH I双酶切的pPIC9K 1μl，T4缓冲液1μl，T4连接酶1μl，双蒸水1μl，10μl体系，14℃连接16小时。

1.4.6重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒转染DH5a感受态细胞选择阳性克隆

1μl重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)载体加入到50μl DH5a感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，加150μlLB(AMP^-)，37℃225rpm振摇2时。每100μl转染后的菌液涂至三块AMP⁺的LB板上，37℃培养过夜。挑单菌斑至5mlAMP⁺的LB中37℃325rpm振摇6小时，测序和提取质粒并进行酶切鉴定。测序正确的质粒进一步扩增，在100mlLB(AMP⁺)中振摇6时，测OD值，在对数生长期中，用大柱提取质粒，按说明书进行操作，所提取的质粒溶于50μl双蒸水中。

1.5)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽在酵母细胞中的表达

1.5.3)重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒转染酵母细胞及rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的表达

线性质粒的准备：取20μl重组的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒进行酶切。酶切体系：质粒20μl，10×缓冲液40μl，10×BSA 40μl，Bgl II 6μl，双蒸水294l，400μl体系。37℃酶切过夜。酶切物用氯仿按1∶1抽提一次，再用氯仿抽提一次，上清用95％乙醇沉淀，70％乙醇清洗一次，真空抽干，加双蒸水10μl溶解，得到重组的pPIC9K-FNHN-29线性质粒(pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)/Bgl II)，-20℃保存备用。

线性质粒转染酵母细胞：取2μl重组的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)线性质粒转染GS115感受态细胞，转染的GS115细胞涂布于RDB平板上，28℃培养4-5日，挑取10单菌斑至2mlYPD中，28℃，250rpm振摇培养过夜。取100μl菌液加100μl 30％甘油混合，-80℃冰箱保存。剩余菌液全部倒入20mlBMMY中，28℃，250rpm振摇培养过夜。再诱导48小时培养，早晚各补加0.25％甲醇诱导，48小时后，4℃中，离心取上清，4×缓冲液上样电泳，鉴定是否表达及表达的量。挑选出表达最好的菌种，并保存菌种于-80℃中。

将表达量最高的菌液150μl接种到3mlYPD中，28℃，250rpm振摇培养过夜。培养过夜的3ml菌液全部再接种到200mlBMGY中，28℃，250rpm振摇培养过夜。培养过夜的菌液再按1∶20比例接种到BMMY中，早晚各补加0.25％甲醇诱导，诱导48小时.诱导结束后，4℃中，6000rpm离心5分钟，取40μl上清做SDS-PAGE电泳分析，鉴定是否表达及表达的量。

1.5.4)rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的分离纯化

酵母发酵液的沉淀分离：80％硫酸胺沉淀酵母发酵液上清(以4000ml为单位)，调Ph至7.3，放置30分钟，20℃，10000rpm离心20分钟，去上清，沉淀物再用200ml去离子水溶解，离心，去上清，150ml去离子水再溶解，40μl做SDS-PAGE电泳分析。

S-100柱的分离纯化：将以上沉淀分离的样品液50ml，上样至980ml的FFS-100柱子上。用平衡液进行洗脱纯化，平衡液为10mmNaCl，20mmTris-Cl，Ph8.5。洗脱纯化过程中，收集各个峰洗脱液体，并做SDS-PAGE电泳分析，以确定rhFNHN-29多肽所在的峰。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脱液体，再进行SP柱纯化。

SP柱的分离纯化：从S-100纯化中收集的第二个峰洗脱液调Ph值至7.0，稀释一倍后再上SP柱进一步纯化。A液：10mMNaCl，20mMTris-Cl，Ph7.0；B液：200mMNaCl，20mMTris-Cl，Ph7.0。洗脱纯化过程：样品上柱平衡好后，60％B液洗脱。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脱液体，并进行SDS-PAGE电泳分析、分子量测定、含量测定、浓缩处理。

1.6)纯化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的生物学特性分析

1.6.1)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的含量测定

用Bradford试剂盒测定纯化液中目的蛋白的含量，按说明书操作，在酶标仪(354型，thermo LabSystems)上测590nm光密度值(OD值)，计算待测样品浓度，再用透析袋透析浓缩。

1.6.2)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽分子量测定

将纯化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE电泳凝胶在凝胶图象分析系统中测定多肽的分子量，以低分子量标准蛋白为参照。

1.6.3)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽结合肝素活性与FN抗原性

rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽是FN分子中的肝素结合区域。在完整的FN分子中该区域具有结合肝素的活性，为了验证在昆虫细胞中表达的rhFNHC-36多肽和在酵母细胞中表达的rhFNHN-29多肽是否保留结合肝素的能力及是否具有FN抗原性的特性，特设计了Western blot和斑点杂交实验。

Western blot：按SDS-PAGE常规方法制胶，分离胶浓度为7％，浓缩胶浓度为3％胶大小为10cm×10cm，20μl rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽样品(40μg)，加20μl 2×上样缓冲液，煮沸5分钟，上样电泳(上样时以相同的排列顺序上样两处，中间以一空泳道相隔，以便制成两张相似的膜，一张用于酶联显色，一张用于放射显影)，电泳条件为浓缩胶8mA稳流电泳30分钟，分离胶18mA稳流电泳2小时，电泳结束后，小心将胶移至转膜仪上，在胶的上方放上一张同样大小的硝酸纤维素膜，在稳压30V状态下过夜转膜。次日将转好的膜切成两张(一张用于酶联显色，一张用于放射显影)，将硝酸纤维素膜置1％BSA的TBS缓冲液中封闭1小时，再将膜置含肝素钠(625单位/ml)的TBS缓冲液中，室温孵育1小时，TBS缓冲液漂洗二次后，将膜置于含大鼠抗肝素抗体(2μg/ml)的TBS缓冲液，室温孵育1小时，TBS缓冲液漂洗后，加入辣根酶标记山羊抗大鼠IgG(H+L)，室温孵育1小时，显色液显色。另一张进行放射显影：将膜放在保鲜膜上，于暗室中用化学发光工作液Western Blot-t ing Luminol Reagent(Santa Cruz)按每2cm²膜各加显色液A，B 0.5ml，均匀覆盖NC膜，盖上保鲜膜，室温反应5分钟。然后移入X射线胶片盒中，在预先裁减好的X射线胶片(KODAK)上爆光，时间为2分钟、5分钟。FN抗原性检测的一抗为鼠抗人FN单抗，二抗为羊抗鼠IgG-HRP(斑点杂交相同)。

斑点杂交：取20μl的rhFNHC-36、rhFNHN-29多肽样品(40μg)直接点在硝酸纤维素膜上(同时处理两张膜，一张用于酶联显色，一张用于放射显影)，待样品稍干后，封膜、结合肝素、结合抗肝素抗体、结合二抗和显色同Western blot。另一张膜进行放射显影，方法同前。

结果

1目的基因在重组载体上的鉴定

1.1rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重组载体上的PCR鉴定

见图1-1 1pUC8；2rhFNHC-36；3rhFNHN-29

1.2重组pAo815SM-FNHN-29载体EcoR I和BamH双酶切鉴定

见图1-2 1pUC18；2pAo815SM-FNHN-29载体；3空载体对照

1.3重组pAo815SM-FNHC-36载体的BamHI和HindIII双酶切鉴定

见图1-3bacmid-FNHC-36重组载体上rhFNHC-36基因的PCR和双酶切鉴定

1、PCR鉴定；2、双酶切鉴定；3、pUC8

1.5重组pGEM-T-FNHN-29载体中目的基因的DNA序列测定

见图1-4 rhFNHN-29基因的正向测序图

见图1-5rhFNHN-29基因的反向测序图

1.4重组bacmid/FNHC-36载体中目的基因的DNA序列测定

见图1-6 rhFNHC-36基因的正向测序图

见图1-7 rhFNHC-36基因的反向测序图

2.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽SDS-PAGE分析

见图1-8FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析

见图1-9纯化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析

1、纯化的FNHC-36多肽；2、M

2.2rhFNHN-29多肽的分子量测定

rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE电泳图，经凝胶图象分析仪扫描分析。见图1-10rhFNHN-29多肽分子量测定

2.3 rhFNHC-36多肽的分子量测定

rhFNHC-36多肽经SDS-PAGE电泳，在凝胶图像分析仪中扫描分析。见图1-11 rhFNHC-36多肽的分子量测定

2.4斑点杂交

斑点杂交法检测rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽与肝素及FN抗体结合的能力，用酶联显色和放射显影法，结果两多肽均能与肝素结合，均不能与FN抗体结合。

多肽结合肝素斑点杂交放射显影图，见图1-12

左右箭头为rhFNHC-36多肽，中间箭头为rhFNHN-29多肽

多肽结合肝素斑点杂交酶联反应显色图，见图1-13

左右箭头为rhFNHC-36多肽，中间箭头为rhFNHN-29多肽

讨论

本发明将纤维连接蛋白N端和C端的肝素结合域多肽基因片断克隆至酵母表达载体中，成功获得了重组的含纤维连接蛋白N端和C端肝素结合域多肽基因片断的酵母表达载体pPICK-FNHN-29(FNHC-36)，并在GS115酵母细胞中表达多肽。

本发明在用Western blot法检测多肽结合肝素能力时，多肽未能与肝素结合，可能的原因是在Western blot检测中，多肽在SDS-PAGE电泳时其空间结构被破坏，故不能与肝素结合。而在用FN抗体结合时，多肽同样未能与FN抗体结合。多肽结合肝素的能力在斑点杂交实验中得到了确认。在斑点杂交实验中多肽仍不能与FN抗体结合，提示多肽不具有FN的抗原性。以上结果显示利用酵母表达系统表达FN肝素结合域多肽是可行的。表达的多肽具有相应的结合肝素的活性。

(三)实验方法

一、重组FN多肽对B16细胞粘附能力及B16细胞相关粘附基因mRNA表达的影响

1.细胞粘附能力的测定^[1]

不同浓度的天然全长纤维连接蛋白及rhFNHN-29多肽、rhFNHC-36多肽包被96孔板，第1孔包被浓度为80μg/ml，对倍稀释至第7孔(共4排)，4℃过夜；0.02％PBS液洗涤3次，加1％BSA封闭1h。包被孔中每孔加入B16细胞5×10⁵/ml，100μl/孔。置培养箱中温育2h后，0.02％PBS液轻轻洗涤上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的细胞，每孔再加入无血清培养液100μl，MTT 20μl，37℃继续孵育4h。吸出培养上清夜，每孔加入150μl DMSO，酶标仪上振荡10min，测定492nm、630nm双波长吸光值(OD值)。

2.细胞-基质粘附实验^[1]

5mg/ml的Matrigel Matrix包被96孔板，4℃过夜，0.02％PBS液洗涤3次，加1％BSA封闭1h。在B16细胞培养中，加入重组FN多肽使其终浓度为20μg/ml，每天换液重新加入重组FN多肽；3d后，按照有无加入重组FN多肽将B16细胞分成重组FN多肽干预组和对照组，将两组细胞分别接种于上述包被的96孔板中，包被孔中每孔加入细胞5×10⁵/ml，100μl/孔，37℃培养20、40、60、80及100分钟。0.02％PBS液轻轻洗涤上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的细胞，每孔加入无血清培养液100μl，MTT 20μl，37℃继续孵育4h。吸出培养上清夜，每孔加入150μl DMSO，酶标仪上振荡10min，测定492nm、630nm双波长吸光值(OD值)。

3.同质性粘附实验^[1]

B16细胞培养中，加入重组FN多肽使其终浓度为20μg/ml，每天换液重新加入重组FN多肽；3d后，按照有无加入重组FN多肽将B16细胞分成重组FN多肽干预组和对照组，同时设立空白组(空白组的细胞不加重组FN多肽干预)。将重组FN多肽干预组、对照组及空白组的细胞分别接种于普通的96孔板中；待其长满单层不留空隙后，重组FN多肽干预组和对照组分别加入5×10⁵/ml同种细胞，每孔100μl，空白组不加入细胞；37℃摇床孵育，40r/min，分别于孵育20、40、60、80、100分钟，吸出含有未粘附细胞的培养液，用0.25％胰蛋白酶消化粘附的细胞并计数细胞数。

4.细胞分离实验^[1]

B16细胞培养中，加入重组FN多肽使其终浓度为20μg/ml，每天换液重新加入重组FN多肽；3d后，按照有无加入重组FN多肽将B16细胞分成重组FN多肽干预组和对照组，将两组细胞分别接种于普通的6孔板中，每孔加入细胞5×10⁵/ml，1ml/孔，使其长满单层不留空隙；再加入0.02％乙二胺四乙酸1ml，37℃摇床孵育，40r/min，分别于孵育2、4、6、8、10分钟，吸出含有未粘附细胞的培养液，计数上述培养液中的细胞数得出脱落细胞数。

5.B16细胞粘附纤维蛋白原活性的检测^[1]

625ng/ml的纤维蛋白原包被96孔板，4℃过夜，0.02％PBS液洗涤3次，加1％BSA封闭1h。在B16细胞培养中，加入重组FN多肽使其终浓度为20μg/ml，每天换液重新加入重组FN多肽；3d后，按照有无加入重组FN多肽将B16细胞分成重组FN多肽干预组和对照组，将两组细胞分别接种于上述包被的96孔板中，包被孔中每孔加入细胞5×10⁵/ml，100μl/孔。置培养箱中温育2h后，0.02％PBS液轻轻洗涤上述96孔板包被孔2次，除去未粘附的细胞，每孔加入无血清培养液100μl，MTT 20μl，37℃继续孵育4h，吸出培养上清夜，每孔加入150μl DMSO，酶标仪上振荡10min，测定492nm、630nm双波长吸光值(OD值)。

6.B16细胞相关粘附基因mRNA表达的检测

B16细胞培养中，加入重组FN多肽使其终浓度为20μg/ml，每天换液重新加入重组FN多肽；3d后，按照有无加入重组FN多肽将B16细胞分成重组FN多肽干预组和对照组，两组各取1×10⁶个细胞，抽提RNA，RT-PCR检测av、β3、FAK基因的mRNA表达。

6.1总RNA提取：

收集重组FN多肽干预组及对照组细胞，用0.02M PBS(PH 7.4)洗涤后用RNA提取液(Trizol，Lifetechology)，氯仿、异丙醇、75％乙醇，分步分离提取、沉淀，步骤详见Trizol试剂说明书。RNA沉淀加20-40μl经0.1％DEPC处理的无菌去离子水溶解。所提取RNA经紫外分光光度计定量OD260∶OD280≥1.8，取1μg用于1.0％琼脂糖凝胶(含1μg/ml溴化乙锭)电泳，100V，15分钟，用UV紫外分析仪分析结果。提取RNA所用的器具均为一次性无菌塑料制品，电泳缓冲液经0.1％DEPC处理，高压无菌，电泳槽用0.1％DEPC水浸泡后使用。

6.2cDNA合成

在0.2ml EP管中按顺序加入下列逆转录成分

各组总RNA 1.0μg

MgCl₂(25mM) 4.0μl

10×Buffer 2.0μl

dNTP Mix(10mM) 2.0μl

Oligo(dT)Primer 1.0μl

RNasin 0.5μl

AMV(20U/μl) 0.625μl

加ddH₂O至总体积 20μl

混匀后，置PCR仪42℃60分钟，99℃5分钟灭活AMV。cDNA作为PCR反应模板，-20℃保存。

6.3PCR扩增引物浓度均为25pmol/μl，加样体积如下：

10×PCR buffer(含镁离子) 5.0μl

dNTP Mix(2.5mM) 4.0μl

目的上、下游引物各 0.4μl

β-actin上、下游引物各 0.4μl

cDNA 3.0μl

Taq酶 0.4μl

ddH₂O 36.0μl

总体积 50μl

引物序列、扩增片段长度、PCR反应条件等参数见表1

表1引物名称、扩增长度及PCR反应条件

引物名称和扩增长度	序列	扩增反应条件
			av 225bp	上游 5’-ATGAACAAGGAGAACCAGAA-3’ 下游 5’-TACAAATACCAACACAGCCA-3’	94℃变性30s，57 ℃退火40s，72℃ 延伸50s，35个循环
β3331bp	上游 5’-GAAGGAGTGTGTGGAGTGTA-3’ 下游 5’-ATGAATGGTGATGAGTAGCT-3’	94℃变性30s，53 ℃退火40s，72℃ 延伸50s，35个循环
			FAK 755bp	上游 5’-TGTCAAGGCCAAAACACTAA-3’ 下游 5’-TCTCTCTCACGCTGTCCGAA-3’	94℃变性30s，57 ℃退火40s，72℃ 延伸50s，35个循环
β-actin 500bp	上游5’-ATGTCACGCACGATTTCCCGC- 3’ 下游5’-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC- 3’	根据目的基因不同而异

6.4PCR产物分析

取5μlPCR产物加1μl上样缓冲液，2.0％琼脂糖凝胶(含1μlGoldView染料)电泳，100V，15分钟，用UV紫外分析仪分析结果。测定各组B16细胞av、β3、FAK和-actin基因mRNA表达的光密度值，求出各组B16细胞相关粘附基因mRNA表达和β-actin基因mRNA表达的光密度相对比值。

二、重组FN多肽对小鼠黑色素瘤细胞侵袭转移能力的影响

1.重组FN多肽抑制B16瘤细胞皮下生长的实验

收集指数增殖期B16细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，置于无血清的培养液中，轻轻摇动，细胞悬液经计数、锥虫蓝染色，检测细胞活力在95％以上，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。C57BL/6小鼠30只，用75％乙醇消毒小鼠右侧腋下皮肤，取上述瘤细胞悬液接种于小鼠右腋皮下，每只接种2×10⁵/ml细胞(0.2ml)；然后随机分成对照组和rhFNHN-29多肽干预组、rhFNHC-36多肽干预组，每组10只。从接种B16瘤细胞当天开始，对照组连续接种部位注射7天PBS液(100μl/次.只)，重组FN多肽干预组连续接种部位注射7天重组FN多肽(100μg/次.只)。观察小鼠生活情况及皮下肿瘤生长情况，第30天解剖未死亡小鼠，观察小鼠皮下肿瘤生长情况，剥离皮下肿瘤并称重；观察心、肝、脾、肺、肾有无肿瘤转移，观察腹腔内有无肿瘤结节形成。

2.重组FN多肽抑制抑制B16细胞腹腔内肿瘤结节形成的实验

上述方法收集B16黑色素瘤细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。C57BL/6小鼠30只，用75％乙醇消毒小鼠腹部皮肤，取上述瘤细胞悬液接种于小鼠腹腔，每只接种2×10⁵/ml细胞(0.2ml)；然后随机分成对照组和rhFNHN-29多肽干预组、rhFNHC-36多肽干预组，每组10只。从接种B16瘤细胞当天开始，对照组连续腹腔注射4天PBS液(100μl/次.只)，重组FN多肽干预组连续腹腔注射4天重组FN多肽(100μg/次.只)。观察小鼠生活情况，第7天每组各解剖8只小鼠，观察其腹腔肿瘤生长情况，计数腹腔内肿瘤结节数；观察心、肝、脾、肺、肾有无肿瘤转移。观察各组剩余小鼠的生活情况，观察其腹腔肿瘤生长情况，计数腹腔内肿瘤结节数；观察心、肝、脾、肺、肾有无肿瘤转移。

3.重组FN多肽抑制小鼠黑色素瘤人工血行转移的实验

上述方法收集B16黑色素瘤细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml。C57BL/6小鼠30只，用75％乙醇消毒小鼠尾部皮肤，通过小鼠尾静脉注射1.5×10⁶瘤细胞(0.15ml)；然后随机分成对照组和rhFNHN-29多肽干预组、rhFNHC-36多肽干预组，每组10只。从接种B16瘤细胞当天开始，对照组连续尾静脉注射7天PBS液(100μl/次.只)，重组FN多肽干预组连续尾静脉注射7天重组FN多肽(100μg/次.只)。观察小鼠生活情况，第30天解剖未死亡小鼠，观察其肺部肿瘤生长情况，计数肺脏肿瘤结节数。观察心、肝、脾、肾、腹腔有无肿瘤转移。

三、统计学分析

体外实验均重复3次。应用SPSS 13.0软件包，采用t检验和卡方检验整理数据。

(三)结果

1.重组FN多肽对B16细胞粘附能力的影响

OD值随着FN及重组FN多肽的浓度增高而增加，FN及重组FN多肽浓度为40μg/ml时，OD值的增加达到平台期。提示B16细胞与FN及重组FN多肽的粘附力均呈浓度依赖性；FN的ED50为23μg/ml，rhFNHN-29多肽的ED50为18μg/ml，rhFNHC-36多肽的ED50为20μg/ml，重组FN多肽的ED50和FN基本一致，提示B16细胞与rhFNHN-29多肽及rhFNHC-36多肽的粘附黏附力和FN基本一致。

2.重组FN多肽对B16细胞与人工基底膜粘附力的影响

OD值随着时间的增加而增加，提示重组FN多肽干预组及对照组的B16细胞与人工基质基底膜的粘附力均呈时间依赖性；在各时相内，重组FN多肽干预组B16细胞与人工基质基底膜的粘附力明显高于对照组，两者相比，差别有统计学意义(P＜0.01)；rhFNHN-29多肽组B16细胞与人工基质基底膜的粘附力和rhFNHC-36多肽组基本一致，两者相比，差别无统计学意义(P＞0.05)。

重组FN多肽组和对照组对比：P＜0.01

3.重组FN多肽对B16细胞之间粘附力的影响

粘附细胞数随着时间的增加而增加，提示重组FN多肽干预组及对照组的B16细胞之间的粘附力均呈时间依赖性；在各时相内，重组FN多肽干预组B16细胞之间的粘附力明显高于对照组，两者相比，差别有统计学意义(P＜0.001)；rhFNHN-29多肽组B16细胞之间的粘附力和rhFNHC-36多肽组基本一致，两者相比，差别无统计学意义(P＞0.05)。

重组FN多肽组和对照组对比：P＜0.001

4.重组FN多肽对B16细胞相互间分离的影响

脱落细胞数随着时间的增加而增加，提示重组FN多肽干预组及对照组脱落的B16细胞数目随着时间的推移而逐渐增多；在各时相内，重组FN多肽干预组脱落的B16细胞数目明显低于对照组，两者相比，差别有统计学意义(P＜0.01)；rhFNHN-29多肽组脱落的B16细胞数目和rhFNHC-36多肽组基本一致，两者相比，差别无统计学意义(P＞0.05)。

重组FN多肽组和对照组对比：P＜0.01

5.重组FN多肽对B16细胞与纤维蛋白原粘附力的影响

rhFNHN-29多肽组及rhFNHC-36多肽组的OD值明显小于对照组，提示重组FN多肽组B16细胞与纤维蛋白原的粘附力明显低于对照组，两者相比，差别有统计学意义(P＜0.05)；rhFNHN-29多肽组OD值和rhFNHC-36多肽组基本一致，提示rhFNHN-29多肽组B16细胞与纤维蛋白原的粘附力和rhFNHC-36多肽组基本一致，两者相比，差别无统计学意义(P＞0.05)。

重组FN多肽组和对照组对比：P＜0.05

6.重组FN多肽对B16细胞相关粘附基因mRNA表达的影响

从总RNA电泳图可知，各组总RNA均显示28S和18S清晰的两条rRNA带，经UV紫外分析仪分析28S和18S的比值都在1.8～2.0之间，说明提取的总RNA完整性较好。

实验表明重组FN多肽处理3天后，B16细胞的av、β3和FAK基因的mRNA表达受到明显抑制。重组FN多肽干预组B16细胞相关粘附基因mRNA表达的光密度相对比值明显低于对照组，差别有统计学意义(P＜0.001)，提示重组FN多肽对B16细胞的av、β3和FAK基因mRNA表达具有明显的抑制作用；rhFNHN-29多肽组B16细胞相关粘附基因mRNA表达的光密度相对比值低于FNCHBD多肽，差别有统计学意义(P＜0.01)，提示rhFNHN-29多肽对B16细胞的av、β3和FAK基因mRNA表达的抑制作用强于rhFNHC-36多肽。

二、重组FN多肽对小鼠黑色素瘤细胞侵袭转移能力的影响

1.重组FN多肽对B16瘤细胞皮下生长的影响

接种当天小鼠生活习性均未见明显改变，但18天后对照组小鼠乏力、活动减少、呆滞及厌食渐明显，死亡3只(分别死于接种后第19天、接种后第21天和接种后第23天)，解剖发现腹腔内长有大量黑色结节，其中2只小鼠可见肺脏表面长有黑色结节；重组FN多肽干预组部分小鼠出现乏力、活动减少、呆滞及厌食，rhFNHN-29多肽组于接种后第25天死亡1只小鼠，rhFNHC-36多肽组于接种后第24天死亡1只小鼠，解剖均发现腹腔内长有大量黑色结节，但未见肺脏及其他部位出现黑色结节。接种后第30天解剖各组未死亡小鼠，对照组4只小鼠腹腔内长有大量黑色结节，未见肺脏及其他部位出现黑色结节；rhFNHC-36多肽组1只小鼠腹腔内长有大量黑色结节，未见肺脏及其他部位出现黑色结节；rhFNHN-29多肽组未见腹腔、肺脏及其他部位出现黑色结节。对照组腹腔侵袭率为70％(7/10)，rhFNHN-29多肽组为10％(1/10)，rhFNHC-36多肽组为20％(2/10)，与对照组相比，差别均有统计学意义(P＜0.01)；对照组小鼠死亡率为30％(3/10)，rhFNHN-29多肽组为10％(1/10)，rhFNHC-36多肽组为10％(1/10)，与对照组相比，差别均无统计学意义(P＞0.05)(见图2)。rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽均可明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长，rhFNHN-29多肽组和rhFNHC-36多肽组皮下肿瘤的平均重量明显轻于对照组，差别均有统计学意义(＜0.05)(见图3)。

2.重组FN多肽对B16细胞腹腔内肿瘤结节形成的影响

接种当天小鼠生活习性均未见明显改变。接种后第7天每组各解剖8只小鼠，对照组肿瘤细胞开始在腹腔内中呈侵袭性生长，腹腔内可见大量的微小黑色结节(＜1mm)，分布于肠系膜静脉网及腹腔大血管周围，肝脏、脾脏及肾脏表面可见大量黑色结节，肺脏及心脏表面未见黑色结节；而重组FN多肽干预组肿瘤细胞局限生长，腹腔内微小黑色结节明显减少，肝脏和脾脏表面可见少量黑色结节，肾脏、肺脏及心脏表面未见黑色结节。对照组腹腔肿瘤总结节数为(106.9±12.8)个，FNNHBD rhFNHN-29多肽组为(39.9±6.4)个，抑制率达62.7％，rhFNHC-36多肽组为(48.6±11.1)个，抑制率达54.5％。重组FN多肽对＜4mm的肿瘤结节的抑制作用较强，对≥4mm的肿瘤结节没有抑制作用(表2、图4)。12天后对照组和干预组未解剖小鼠均有明显乏力、活动减少、呆滞、厌食表现，最终死亡，解剖后发现系肿瘤巨大或数目较多和(或)肿瘤转移至肺或肝等而导致小鼠衰竭死亡。

表2重组FN多肽对B16细胞腹腔内肿瘤结节形成的影响

3.重组FN多肽对小鼠黑色素瘤人工血行转移的影响

接种后1-3小时，1只小鼠出现活动减少和晕厥样表现，后渐好转。15天后对照组小鼠乏力、活动减少、呆滞及厌食渐明显，死亡8只(其中接种后第15天死亡3只小鼠，接种后第19天死亡1只小鼠，接种后第27天死亡4只小鼠)，解剖发现肺脏表面长满黑色结节和(或)肝脏等腹腔部位长有黑色结节；rhFNHN-29多肽组部分小鼠出现乏力、活动减少、呆滞及厌食，死亡5只(其中接种后第25天死亡3只小鼠，接种后第27天死亡2只小鼠)，解剖发现肺脏表面局部长有黑色结节(其中1只小鼠左肺及右肺前叶、中叶、后叶、心叶均长有黑色结节，2只小鼠右肺前叶、中叶、后叶均长有黑色结节，2只小鼠左肺长有黑色结节)，其他部位未见黑色结节；rhFNHC-36多肽组部分小鼠出现乏力、活动减少、呆滞及厌食，死亡4只(均在接种后第27天死亡)，解剖发现肺脏表面局部长有肿瘤结节(其中1只小鼠左肺及右肺前叶、中叶、后叶、心叶均长有黑色结节，1只小鼠右肺前叶、中叶、后叶均长有黑色结节，2只小鼠左肺长有黑色结节)，其他部位未见黑色结节。接种后第30天解剖各组未死亡小鼠，对照组小鼠肺脏表面均长满黑色结节，未见腹腔及其他部位长有黑色结节，rhFNHN-29多肽组和rhFNHC-36多肽组小鼠肺脏表面未见明显的黑色结节。对照组小鼠黑色素瘤肺转移率为100％(10/10)，rhFNHN-29多肽组为50％(5/10)，rhFNHC-36多肽组为404/10)，与对照组相比，差别均有统计学意义(P＜0.05)；对照组肺脏肿瘤结节平均数目为(96.4±4.6)/只，rhFNHN-29多肽组为(20.5±19.6)/只，rhFNHC-36多肽组为(19.1±25.6)/只，与对照组相比，差别均有统计学意义(P＜0.01)；对照组小鼠死亡率为80％(8/10)，rhFNHN-29多肽组为50％(5/10)，rhFNHC-36多肽组为40％(4/10)，与对照组相比，差别均无统计学意义(P＞0.05)(见图5)。

(四)结论

1、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制B16瘤细胞皮下生长，减弱皮下肿瘤腹腔侵袭的能力。

2、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制B16瘤细胞在腹腔形成微小肿瘤结节的能力。

3、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽具有抑制小鼠黑色素瘤人工血行转移的能力。

4、rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽通过影响整合素av β3的功能起到抑制肿瘤侵袭转移的作用。

因而，重组FN肝素结合域多肽能在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用。

参考文献：

1、高进，章静波主编.癌的侵袭与转移-基础与临床.北京：科学出版社.2003.5：236-239.

Claims

1.一种重组纤维连接蛋白N端肝素结合域rhFNHN-29多肽在制备抑制黑色素瘤细胞血行转移的药物中的应用。