CN102719521A - 胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT抑制剂在肝癌治疗中的应用 - Google Patents
胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT抑制剂在肝癌治疗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT抑制剂在肝癌治疗中的应用。具体地,本发明提供了一种肝癌中高表达的标志物xCT。此外,xCT的表达或活性高低与病人的预后相关,因此,xCT在肝癌细胞或组织中表达情况,可用于辅助性诊断或判断检测对象患肝癌的几率高低以及用于肝癌病人的预后。本发明还提供了相应的检测方法、试剂盒和筛选方法。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域。更具体地,本发明涉及胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT在肝癌检测和预后方面的应用。本发明还涉及胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT抑制剂在肝癌治疗中的应用。
背景技术
氨基酸转运体系统-xc(system-xc)一种异二聚体氨基酸运输载体,由轻链xCT和重链4F2hc两种亚基组成,在介导胱氨酸摄入同时伴随着细胞内谷氨酸排出。
胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT是氨基酸转运体系统-xc(system-xc)的一个功能性亚基。xCT在细胞摄取胱氨酸和维持细胞内谷胱甘(Glutathione,GSH)肽含量及细胞内氧化还原平衡方面起着重要作用。研究显示一些疾病的发生与该基因的异常有关。然而,迄今为止尚没有xCT与肝癌相关的报道。
原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一,占居民肿瘤死亡第二位。肝癌出现症状时多属中晚期,切除后复发、转移率高。因此,肝癌的早期诊断以及肝癌的预后判断对采用合理的治疗手段、延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。
因此,本领域迫切需要开发与肝癌诊断和治疗相关的蛋白。
发明内容
本发明的目的就是提供一种与肝癌诊断和治疗相关的蛋白xCT。
本发明的另一目的是提供所述蛋白xCT及其拮抗剂在肝癌诊断和治疗方面的应用。
在本发明的第一方面,提供了一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT基因或蛋白的用途,它被用于(a)制备检测肝癌的试剂或试剂盒;或(b)制备进行肝癌预后的试剂或试剂盒。
在另一优选例中,所述的试剂盒包括:对xCT进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。
在另一优选例中,所述的标签或说明书中记载了以下使用说明:对胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT进行定量检测,并将检测结果用于表征肝癌几率高低和/或肝癌预后。
在另一优选例中,所述的试剂包括xCT特异性抗体,或xCT的特异性引物。
在另一优选例中,上述的试剂包括检测用芯片,包括核酸芯片和蛋白质芯片。
在另一优选例中,所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针,所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与xCT的特异性结合的探针。
在另一优选例中,所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体,所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗xCT的特异性抗体。
在本发明的第二方面,提供了一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的用途,它被用作肝癌预后的标志物。
在本发明的第三方面,提供了一种用于检测肝癌预后的诊断试剂盒,所述的试剂盒含有一容器,所述容器中含有检测胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的检测试剂;以及标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌预后。
在另一优选例中,所述的检测试剂包括:特异性抗体和/或特异性引物。
在另一优选例中,所述的标签或说明书中注明以下内容:
当检测对象的xCT的mRNA表达量与β-肌动蛋白的mRNA表达量之比≥0.0025(较佳地≥0.003,更佳地≥0.004),则表明该对象的预后差(低于全体或一般肝癌患者的平均预后);和/或
当检测对象的xCT的mRNA表达量与β-肌动蛋白的mRNA表达量之比≤0.002(较佳地≤0.002,更佳地≤0.001),则表明该对象的预后好(高于全体或一般肝癌患者的平均预后)。
在另一优选例中,所述的试剂盒用于检测人肝脏样品或血液样品。
在本发明的第四方面,提供了一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT拮抗剂的用途,所述的拮抗剂被用于制备抑制肝癌细胞生长或增殖的药物,或用于制备治疗肝癌的药物。
在另一优选例中,所述的拮抗剂包括:xCT的抗体、xCT的反义RNA、siRNA、以及xCT的活性抑制剂。
在另一优选例中,所述的xCT的活性抑制剂是柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SASP)。
在本发明的第五方面,提供了一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长或增殖的方法,包括步骤:在xCT拮抗剂存在下,培养癌细胞,从而抑制癌细胞生长或增殖。
在另一优选例中,所述的方法包括向癌细胞的培养体系中添加xCT拮抗剂,从而抑制抑制癌细胞生长或增殖。
在另一优选例中,所述的癌细胞是肝癌细胞。
在本发明的第六方面,提供了一种筛选治疗肝癌的候选化合物的方法,所述方法包括步骤:
(a)测试组中,在细胞的培养体系中添加测试化合物,并观察所述测试组的细胞中胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的表达量和/或活性;在对照组中,在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组的所述细胞中胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的表达量和/或活性;
其中,如果测试组中细胞的xCT的表达量和/或活性小于对照组,就表明该测试化合物是对xCT的表达和/或活性有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。
在另一优选例中,所述的细胞包括:肝癌细胞、肝细胞以及其他非癌细胞。
在另一优选例中,所述的xCT活性是通过活性氧(ROS)检测而得出的。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:
(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物,进一步测试其对肝癌细胞生长或增殖的抑制作用。
在另一优选例中,在步骤(b)中包括步骤:测试组中,肝癌细胞的培养体系中添加测试化合物,并观察肝癌细胞的数量和/或生长情况;在对照组中,在肝癌细胞的培养体系中不添加测试化合物,并观察肝癌细胞的数量和/或生长情况;其中,如果测试组中肝癌细胞的数量或生长速度小于对照组,就表明该测试化合物是对肝癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。
在本发明的第七方面,提供了一种抑制或治疗癌症的方法,包括步骤:给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT拮抗剂的用途。
在另一优选例中,所述的癌症包括肝癌。
在另一优选例中,所述的拮抗剂包括:xCT的抗体、xCT的反义RNA、siRNA、以及xCT的活性抑制剂。
在另一优选例中,所述的xCT的活性抑制剂是柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SASP)。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了xCT在癌组织中的表达水平要明显高于对应的癌旁组织及正常肝组织(图1A)并且低表达xCT的病人的相对于高表达的病人有更好的预后(图1B)。
图2显示了xc的两个亚基(xCT亚基和4F2hc亚基)在多种肝癌细胞系中mRNA相对表达(基于β-肌动蛋白进行归一化处理)(图2A和2B),以及xCT蛋白在多种肝癌细胞系中的表达(图2C)。
图3显示了xCT的抑制剂SASP能够显著抑制肝癌细胞Huh-7和SK-Hep-1的生长。
图4显示了针对xCT的拮抗剂siRNAs可以抑制Huh-7和SK-Hep-1细胞内的xCT表达,并且进而抑制肝癌细胞的生长和增殖。
图5显示了xCT拮抗剂能够抑制肝癌细胞Huh-7和SK-Hep-1的克隆形成能力。图中,″blank″表示空白对照。
图6显示了xCT拮抗剂能够抑制肝癌细胞Huh-7体内移植瘤的生长。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现,xCT在各种肝癌细胞系中均有高表达,可作为肝癌检测的标志物用于检测或辅助性检测肝癌。此外,xCT的表达或活性高低与病人的预后相关,可作为病人预后的判断指标。此外,xCT的拮抗剂可抑制癌细胞的生长。在此基础上完成了本发明。
具体地,本发明人通过试验证实,xCT在各种不同肝癌细胞系中有高表达,并且在病人的在肝癌组织中的表达明显高于对应的癌旁组织或正常肝脏组织。此外,高表达或高活性的xCT和病人的预后呈现负相关性。因此,xCT在肝癌细胞或组织中表达情况,可用于辅助性诊断或判断检测对象患肝癌的几率高低、以及肝癌病人的预后。
试验还证明,应用xCT的特异抑制剂柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SASP)及干扰RNA(siRNA)可以在体外明显抑制肝癌细胞的生长和克隆形成能力;SASP还能在体内抑制肿瘤的生长。因此,使用xCT拮抗剂来抑制xCT的功能,可以抑制体外和体内的肝癌细胞的生长,从而为肝癌的治疗提供了新的途径。
xCT蛋白和多核苷酸
在本发明中,“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“xCT蛋白”可互换使用,指胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT。应理解,所述术语还包括xCT的活性片段和衍生物。
在本发明中,“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码xCT蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列,包括正义和反义核酸。
在本发明中,术语“xCT蛋白”、“xCT多肽”或“肝癌标志物xCT”可互换使用,都指具有人蛋白xCT氨基酸序列的蛋白或多肽。
胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的核苷酸和氨基酸序列可参见Primary GenBankAccession:NM_014331,Entrez Gene ID:23657,UniProt ID:Q9UPY5。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的xCT蛋白或多肽”是指xCT蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化xCT蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码xCT的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段,包括正义和反义的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码xCT蛋白的多核苷酸。
本发明的人xCT核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或xCT蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的xCT蛋白。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码人xCT蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人xCT编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体
本发明还包括对人xCT蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于人xCT基因产物或片段。较佳地,指那些能与人xCT基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体。
抗人xCT蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的人xCT蛋白。
拮抗剂和药物组合物
利用本发明蛋白,通过各种常规筛选方法,可筛选出与xCT蛋白发生相互作用的物质,尤其是抑制剂或拮抗剂等。
本发明xCT蛋白的拮抗剂(包括抗体、抑制剂),当在治疗上进行施用(给药)时,可抑制xCT蛋白的表达和/或活性,进而抑制癌细胞(包括肝癌)的生长或增殖。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明xCT拮抗剂(如抗体、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物,可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
检测方法和试剂盒
本发明还涉及定量和定位检测人xCT蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人xCT蛋白水平,可以用于诊断肿瘤和用于肝癌预后。
一种检测样品中是否存在xCT蛋白的方法是利用xCT蛋白的特异性抗体进行检测,它包括:将样品与xCT蛋白特异性抗体接触;观察是否形成抗体复合物,形成了抗体复合物就表示样品中存在xCT蛋白。
xCT蛋白或其多核苷酸可用于xCT蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上,用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗xCT的抗体可以固定在蛋白质芯片上,用于检测样品中的xCT蛋白。
本发明还提供了一种检测肝癌或肝癌预后的的试剂盒,它含有特异性扩增xCT的引物对和/或xCT特异性抗体。
筛选方法
本发明还提供了基于胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(抑制)xCT表达或活性的化合物,然后对筛选出的化合物进一步测试其对癌细胞。
其中,代表性的癌细胞包括(但并不限于):肝癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞等。
一种筛选方法可基于xCT的mRNA的表达水平。
另一种筛选方法可基于活性氧检测。活性氧(ROS)检测是一种常规的检测细胞内活性氧含量的方法,可通过检测ROS可以确定xCT的活性。xCT的活性越高,则ROS越低。
活性氧(ROS)检测可用市售的检测试剂盒进行。一种活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFHDA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本发明的主要优点包括:
(a)xCT的表达水平和活性水平可用作肝癌检测的标志物。
(b)xCT的表达水平和活性水平可用作肝癌预后的标志物。
(c)xCT拮抗剂可有效抑制肝癌细胞生长。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例
材料
一、抗体
●Anti-xCT抗体,购自LifeSpan BioSciences,Seattle,USA。
●Anti-GAPDH抗体,购自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。
二、引物
引物序列见表1。
表1用于Real-time PCR的引物
通用方法
一、反转录和PCR
1.组织及细胞总RNA的提取:
细胞于5%CO2,37℃,10%胎牛血清条件下常规培养。用Trizol试剂抽提生长状态良好的细胞总RNA,每皿细胞(直径6cm)加入1ml Trizol,水平放置片刻,使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞;使用移液枪吹打细胞使其脱落将内含细胞的裂解液转移至离心管中,用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀;室温静置5分钟。
组织块则放于液氮中,冷冻后研磨成粉,每克组织加入1ml Trizol,充分吹打至不粘稠;室温静置5min;12,000g 4℃离心5min;小心吸取上清液,移入新的离心管中。
向上述步骤中得到的匀浆裂解液中加入1/5体积氯仿,剧烈振荡,待溶液充分乳化后室温静置5min;4℃,12,000g离心15min;将无色上清液移入新的离心管中,加入等体积异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀,室温静置10min;4℃,12,000g离心10min;弃上清,75%乙醇(每毫升原始体积Trizol至少用1ml 75%乙醇)洗涤,4℃,12,000g离心5min;弃去乙醇,室温干燥RNA沉淀2~5min,用RNase-free H2O溶解沉淀;待RNA沉淀完全溶解后分光光度计法定量并于-80℃保存备用。
2.反转录及Real-time PCR:
每个反应取2μl 5×PrimeScriptRT Master Mix,500ng total RNA,加入RNase Free dH2O配成10μl体系。在PCR仪上37℃反转录30min;85℃5sec使反转录酶的失活。xCT或4F2hc在肝癌组织或肝癌细胞系中的表达水平采用Real-time PCR方法来检测。定量扩增时,每个反应取SYBRPremix ExTaqTM(2×)反应液10μl,cDNA 1μl,ROX Reference Dye 0.4μl,上下游引物(10μM)各1μl,最后加ddH2O配成20μl体系。按如下条件进行扩增:预变性95℃15sec;95℃5sec,60℃31sec,共40个循环。
根据所获得的标准曲线,得到各检测标本中正常肝组织、癌旁组织、癌组织的相对浓度差异。根据ABI PRISM 7300Sequence Detection System或ABI9700PCR System的自带软件进行分析。待检样品为三复孔。
二、细胞培养及Western blot分析
1.细胞及组织蛋白抽提:
人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、Huh-7、PLC/PRF/5和SK-Hep-1均购自ATCC。胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于5%CO2、37℃细胞培养箱内持续培养。细胞长至70%-80%融合度时,用0.25%胰酶消化,进行1∶3-1∶6传代。
2.Quick StartTM Bradford Protein Assay试剂盒蛋白定量
稀释标准蛋白,使标准蛋白浓度分别为0μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,125μg/ml,250μg/ml,500μg/ml,1000μg/ml和2000μg/ml;在酶标板中加入1μl标准蛋白或1μl样品,再加入100μl蛋白检测染料,震荡混匀,室温孵育5min,酶标仪读取595nm吸光度值。以吸光度值为纵坐标,标准蛋白浓度为横坐标,绘制蛋白浓度标准曲线。根据标准曲线,计算样品的浓度。
3.SDS-PAGE
确定适合的凝胶浓度和体积,按配比配制分离胶溶液,加入TEMED混匀后,立即将分离胶注入干净的预置玻璃板间隙中。在顶层加入适量乙醇以阻止空气对凝胶聚合的抑制作用,室温静置30min,待分离胶已经聚合后弃掉上层压胶乙醇醇,并用滤纸吸净残留的乙醇。将配制好的积层胶溶液立即注入玻璃板间隙中,插入10齿或15齿梳子。在积层胶凝聚后拔去梳子,将凝胶放入电泳槽,加入电泳缓冲液。各泳道上样等量预处理蛋白样品进行电泳。
4.转膜(半干转移法)
转移缓冲液预冷至4℃;SDS-PAGE电泳的同时,剪6张滤纸与1张硝酸纤维素膜,大小等同于分离胶。滤纸预先用转移缓冲液浸泡,硝酸纤维素膜用Milli-Q H2O预湿,再用转移缓冲液浸泡3min;电泳结束后,将凝胶用转移缓冲液轻轻冲洗干净,膜放置在胶上,上下各放3张滤纸;转移时胶靠近负极,膜靠近正极;根据凝胶面积以1.0mA/cm2的电流进行电转移60min。转移后的膜在双蒸水中浸泡5min后,丽春红染色液染色5min,双蒸水脱色5min,观察转移效率。
5.抗体标记
将蛋白质转印后的硝酸纤维素滤膜在适量封闭液中室温封闭1hr。弃去封闭液,按照0.1ml/cm2的体积加入以封闭液配制的抗体液,加入杂交袋,排除气泡后加热封闭,4℃孵育过夜。次日弃去抗体液,用20ml PBST室温漂洗滤膜,共漂洗3次,每次15min。将滤膜放入另一干净杂交袋内,加入以封闭液配制的含0.01μg/ml辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗(购自Thermo FisherScientific公司)的抗体液,排除气泡后密封塑料袋,于室温下在平稳摇床上温育1.5hr。弃去含二抗的抗体液,用20ml PBST漂洗滤膜,共漂洗3次,每次15min。
6.化学发光检测
将漂洗后的滤膜在双蒸水中平衡5min。按照SuperSignalWestPico化学发光检查试剂盒(Pierce公司)说明书等比例混合底物和增强剂。根据滤膜面积,按照0.125ml/cm2的体积将混合后的检测试剂均匀加在杂交膜上,反应5min。将杂交膜放入封口膜中,赶尽多余液体,封口,压片,显影后读片。
三、RNA干扰实验
1.细胞转染前24h,胰酶消化,计数后种于6孔板中,培养过夜分别使细胞至50%融合度。
2.将100pmol(5μ1)siRNAs和5μl Lipofectamine RNAi-max分别溶于200μl无血清无双抗的DMEM培养基中,室温孵育5min,然后将两者轻柔混合;室温孵育20min。
siRNA的序列如下:
5’-AATCTTCATCTCTCCTAAGGG-3’(SEQ ID NO.:7);
5’-TTGGCTATGTGCTGACAAA-3’(SEQ ID NO.:8)
3、吸除6孔板内细胞培养液,以无血清无双抗的DMEM培养液轻洗细胞2次,每孔加入该培养液600μl,将孵育后的混合物加入相应6孔板内,37℃,5%CO2培养6h后,各孔更换为含10%胎牛血清培养基1.5ml,继续培养。
四、细胞增殖实验
待检细胞根据细胞特性和实验需求,以1500~2000cells/well浓度接种于96孔板。次日,根据实验需求更换含有不同药物的完全培养基(含10%胎牛血清)。细胞增殖采用cell counting kit-8(CCK-8)试剂(购自Dojindo Laboratories公司)检测。此法是基于WST-8染料的一种计数方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。formazan在450nm有特异吸收峰,可通过酶标仪检测吸光度值(OD450),OD450nm与活细胞数量成正比。检测前,将CCK-8试剂和培养基以1∶9比例新鲜配制成CCK-8工作液;96孔板弃去原有培养基后,每孔加入100μl CCK-8工作液。37℃孵育2h后,检测450nm波长吸收值。待检样品为三复孔,同类实验至少重复三次。
实施例1
xCT在肝癌组织中表达上调且和病人的预后相关
本实施例中,通过Real-time PCR检测了42对肝癌组织(HCC)、相对应的癌旁组织(NT)及9例正常肝组织(Normal)中的xCT表达,并且基于β-肌动蛋白的表达量进行了归一化处理。
结果表明,xCT在癌组织中的表达水平要明显高于对应的癌旁组织及正常肝组织(图1A)。这一结果在另一个独立的14对肝癌组织和对应的癌旁组织中得到了验证。
在此基础上,进一步分析了肿瘤组织中xCT的表达和病人的各项临床参数之间的关系。
结果发现,xCT的表达量和病人的预后密切相关。42个病人按照癌组织中xCT的表达量被均分为2组:相对高表达xCT组(High)和相对低表达xCT组(Low)。低表达xCT的病人的相对于高表达的病人有更好的预后(Log-rank(Mantel-Cox)Test,P=0.016)。两组病人的中位生存期分别为27.4个月和13.9个月,相差约一倍(图1B)。
这表明,xCT的表达情况可用于肝癌的预后判断。基于图1,可如下进行预后判断:
当检测对象的xCT的mRNA表达量与β-肌动蛋白的mRNA表达量之比≥0.0025(较佳地≥0.003,更佳地≥0.004),则表明该对象的预后差(低于全体或一般肝癌患者的平均预后);
当检测对象的xCT的mRNA表达量与β-肌动蛋白的mRNA表达量之比≤0.002(较佳地≤0.002,更佳地≤0.001),则表明该对象的预后好(高于全体或一般肝癌患者的平均预后)。
实施例2
系统-xc的两个亚基在肝癌细胞系中均有表达
在本实施例中,通过Real-time PCR在Huh-7、SK-Hep-1、Hep G2、Hep3B和PLC/PRC/5等多种肝癌细胞系中检测了系统-xc的两个亚基(xCT亚基和4F2hc亚基)的表达情况。
结果如图2A和2B所示。结果显示,xCT亚基在这些肝癌细胞系中有较高的表达。另外4F2hc亚基在这些肝癌细胞系中也有表达。
另外,在本实施例中还通过Western blot法,检测了各个细胞系中xCT的蛋白表达。
结果如图2C所示,表明在这些肝癌细胞系中存在的表达的xCT亚基。
实施例3
xCT抑制剂SASP通过抑制xCT,进而抑制Huh-7和SK-Hep-1细胞的生长
上述实施例的结果表明,xCT在肝癌组织中显著低表达,这提示xCT有可能在肝癌发生发展过程中可能发挥某种功能。因此,在本实施例中通过影响xCT的表达和或活性,来观察xCT对肝癌细胞生长的作用。
首先,在体外试验中,添加xCT的特异性抑制剂SASP。
结果表明,特异性抑制剂SASP能够显著抑制Huh-7和SK-Hep-1细胞的生长,并且这种抑制具有剂量依赖效应(图3)。
其次,为了进一步确认xCT在肝癌细胞生长中的功能,用特异靶向xCT的siRNAs来抑制Huh-7和SK-Hep-1细胞内的xCT表达,随后进行相关功能实验。
结果表明,使用特异靶向xCT的反义核酸(siRNA)时,可有效干扰Huh-7和SK-Hep-1中的xCT的表达(图4A和4B)。xCT的表达被干扰后,肝癌细胞的生长和增殖被明显抑制(图4C和4D)。
实施例4
抑制xCT能够抑制Huh-7和SK-Hep-1细胞的克隆形成能力
肿瘤细胞具备集落生长的特性,因此在本实施例中,通过体外克隆形成试验,测试xCT在肝癌细胞株Huh-7和SK-Hep-1克隆形成能力方面的影响。方法如下:
待检细胞根据细胞特性和实验需求,以500-1500细胞/孔的浓度接种于6孔板。次日,根据实验需求更换含有不同药物的完全培养基(含10%胎牛血清)。其中,SASP的浓度分别为300μM和200μM。8-15天后,待形成肉眼可见的细胞集落,用1%结晶紫溶液染色,扫描结果用Image-Pro Plus 5.0软件(MediaCybernetics)分析处理。待检样品为三复孔,同类实验至少重复三次。
结果如图5A和5B所示。试验表明,xCT的拮抗剂SASP能够显著抑制Huh-7和SK-Hep-1细胞的克隆形成能力。
实施例5
SASP能够抑制Huh-7细胞体内移植瘤的生长
上述体外实验表明,抑制SASP能够抑制肝癌细胞Huh-7和SK-Hep-1的生长和克隆形成能力。在本实施例中,进一步研究了通过裸鼠移植瘤实验,研究抑制xCT对于Huh-7细胞体内移植瘤生长的影响。方法如下:
1.皮下移植瘤模型建立
Huh-7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养,取对数生长期细胞。将2.5×106个Huh-7细胞悬浮在200μl DMEM中,以皮下接种的方式种于裸鼠背侧近腋部(雌性BALB/c-nu/nu,8周龄)。
2.SASP腹腔注射
在Huh-7细胞移植2周后,将成瘤的裸鼠随机分成2组,每组6只。SASP处理组每天注射8mg SASP,对照组则射等量体积(200μ1)生理盐水。
3.体内生长曲线测定
从第2周分组开始用游标卡尺测量皮下肿瘤瘤径,每周两次测量肿瘤瘤径。运用如下公式计算肿瘤体积:V(cm3)=Width2(cm2)×Length(cm)/2(Length为长径,width为短径),并绘制生长曲线。
4.皮下移植瘤标本留取及固定
SASP处理17天后,经颈椎脱臼法牺牲荷瘤裸鼠,取出皮下移植瘤,测定肿瘤质量。将部分肿瘤分离后用锡纸包裹,放入液氮中速冻,再转移至-80℃超低温冰箱中保存;剩余部分放入含有10%中性福尔马林的50ml离心管中,进行固定,室温保存。
结果
如图6A所示,结果表明,SASP能够抑制Huh-7细胞体内移植瘤的生长;从SASP处理10天后开始,处理组的肿瘤体积和对照组的相比即有明显差异。
SASP处理17天后,将荷瘤裸鼠牺牲,称取各组皮下肿瘤质量。结果如图6B所示,SASP处理组的肿瘤质量要显著低于对照组。
试验还表明,SASP对于小鼠没有明显的毒性,对小鼠的体重也没有明显影响(图6C)。
实施例6
筛选药物
取肝癌细胞Huh-7细胞,进行体外培养,并随机分成三组,每组设3个重复孔。采用双盲法,对各组别的细胞培养体系,分别添加以下三组测试物质中的一种,即(a)已知的具有抑制肝癌细胞生长作用的阳性化合物SASP,(b)已知无抑制作用的阴性化合物PBS;以及(c)空白对照(生理盐水),并通过ROS测定法,测定xCT活性。
虽然添加时并不知道给予何种物质,但测定的xCT活性与所给予的测试物的性质是相符的,即xCT活性是空白对照和阴性对照组的xCT活性都大于添加了SASP的测试组。这表明,用本发明的筛选方法可用于筛选通过抑制xCT途径进而抑制肝癌的候选药物。
实施例7
筛选药物
重复实施例6,不同点在于:随机分成4组,每组设3个重复孔。采用双盲法,对各组别的细胞培养体系,分别添加以下4组测试物质中的一种,即(a)已知的具有抑制肝癌细胞生长作用的阳性化合物SASP,(b)已知无抑制作用的阴性化合物PBS;(c)空白对照(生理盐水),(d)未知的待测化合物(测试时不告知何种测试物)。
同样通过ROS测定法,测定各组别中的xCT活性。
结果表明,该未知的待测化合物具有抑制xCT活性的能力。虽然添加时并不知道给予何种物质,但测定的xCT活性与所给予的测试物的性质是相符的,因为该未知测试化合物是抗xCT的抗体。
这表明,用本发明的筛选方法可用于筛选通过抑制xCT途径进而抑制肝癌的候选药物。
实施例8
检测试剂盒
在本实施例中,制备检测xCT的诊断试剂盒,该试剂盒含有1000微升抗xCT的特异性抗体以及描述如何使用试剂盒来检测xCT的说明材料。
试剂盒还可含有下组中的一种或多种:用于协助检测的各种标记物或标记试剂;用于杂交的试剂(包括缓冲液等);以及阳性和阴性杂交对照等。
该检测试剂盒可用于肝癌检测和肝癌预后。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT基因或蛋白的用途,其特征在于,用于(a)制备检测肝癌的试剂或试剂盒;或(b)制备进行肝癌预后的试剂或试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的试剂盒包括:对xCT进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。
3.一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的用途,其特征在于,被用作肝癌预后的标志物。
4.一种用于检测肝癌预后的诊断试剂盒,所述的试剂盒含有一容器,所述容器中含有检测胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的检测试剂;以及标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌预后。
5.一种胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT拮抗剂的用途,其特征在于,所述的拮抗剂被用于制备抑制肝癌细胞生长或增殖的药物,或用于制备治疗肝癌的药物。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述的拮抗剂包括:xCT的抗体、xCT的反义RNA、siRNA、以及xCT的活性抑制剂。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的xCT的活性抑制剂是柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SASP)。
8.一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长或增殖的方法,其特征在于,包括步骤:在xCT拮抗剂存在下,培养癌细胞,从而抑制癌细胞生长或增殖。
9.一种筛选治疗肝癌的候选化合物的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(a)测试组中,在细胞的培养体系中添加测试化合物,并观察所述测试组的细胞中胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的表达量和/或活性;在对照组中,在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物,并观察对照组的所述细胞中胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT的表达量和/或活性;
其中,如果测试组中细胞的xCT的表达量和/或活性小于对照组,就表明该测试化合物是对xCT的表达和/或活性有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述方法还包括步骤:
(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物,进一步测试其对肝癌细胞生长或增殖的抑制作用。
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