CN106046134B - 小分子多肽nfib的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤小分子多肽NFIB^Δ的应用。本发明利用生物工程技术，基因重组一段NFIB截短体，为长度231个氨基酸的多肽，能特异性结合SOX2，并阻断内源性全长NFIB与SOX2的相互作用；生物学实验表明该小分子多肽NFIB^Δ具有抑制肺癌细胞增殖的作用。本发明为肺肿瘤靶向治疗提供新的实验依据，并且因多肽具有高效、低毒的等特性将在肺癌靶向性治疗的药物研发上具有重要的临床应用价值。

Description

小分子多肽NFIBΔ的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及小分子多肽NFIB^Δ及其载体和在抗肺癌增殖中的应用。

背景技术

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在诸多国家已居主要癌症相关死亡原因之首。尽管近几年肺癌诊断和多模式治疗包括化疗有了长足的进步，但是预后仍然不容乐观。肺癌的发生是积累性基因损伤，随着新的肺癌癌基因的不断发现和深入研究，针对相应基因的靶向药物的治疗也逐渐进入临床。

随着生物技术的高速发展，多肽类药物不断涌现。其以原料简单易得、药效高、副作用低、用途广泛、品种繁多、目标明确、针对性强等特点受到关注，并开始用于癌症的预防和治疗。随着生物工程技术的迅速发展，生物技术活性物质不断面世，已有不少生物技术药物应用于临床，目前正在研究的则成倍增加，在这些品种中，大量的均为多肽和蛋白质类药物。

尽管诱导肿瘤的病理机制众多，细胞周期调控的异常和不受控制的细胞增殖是肿瘤发生的共同机制。以往研究表明，转录因子SOX2在众多肿瘤中高表达，如肺癌、肝癌、乳腺癌等。它通过直接作用于细胞周期素Cyclin D1的启动子区，促进Cyclin D1表达，加速细胞周期进程；而SOX2信号通路的失活，将导致癌细胞增殖的抑制，因此SOX2信号通路失活机制也是肿瘤研究的热点领域之一。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种抗肿瘤小分子多肽NFIB^Δ，具有抗肺肿瘤增殖的能力。本发明的另一目的是提供上述抗肿瘤小分子多肽NFIB^Δ的表达载体。本发明还有一目的是提供上述抗肿瘤小分子多肽NFIB^Δ的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

小分子多肽NFIB^Δ在制备抗肺癌药物中的应用；所述的小分子多肽NFIB^Δ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的小分子多肽NFIB^Δ的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的小分子多肽NFIB^Δ的编码基因的载体。

所述的载体，将小分子多肽NFIB^Δ的编码基因克隆到p3XFLAG-Myc-CMV真核表达载体，构建出重组表达质粒。

有益效果：与现有技术相比，本发明利用生物工程技术，基因重组一段231个氨基酸多肽的NFIB^Δ到6.3kb p3XFLAG-Myc-CMV载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此重组蛋白多肽转染到肺癌A549细胞中，免疫印迹检测多肽蛋白表达，实现多肽重组。并且研究表明该多肽能特异性结合SOX2，通过阻断内源性全长分子NFIB与SOX2相互作用，抑制SOX2信号通路的激活，达到抑制肺肿瘤细胞增殖作用，及抗肿瘤效果。因此，作为高效、低毒的多肽将在肺癌的药物研发上具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1是肺癌组织及细胞中全长蛋白NFIB和SOX2相互作用免疫沉淀结果图；

图2是小分子多肽NFIB^Δ的编码基因载体质粒图；

图3是多肽NFIB^Δ重组真核表达质粒双酶切电泳鉴定结果图；

图4是肺癌细胞中不同NFIB截短体多肽与SOX2相互作用免疫沉淀结果图；

图5是流式检测肺癌细胞小分子多肽NFIB^Δ转染后对肿瘤细胞周期的影响。

图6是CCK8实验检测肺癌细胞小分子多肽NFIB^Δ转染后对肿瘤细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：肺癌组织及细胞NFIB全长蛋白和SOX2免疫共沉淀

材料：Protein A/G beads，细胞裂解液，NFIB抗体，SOX2抗体，IgG。

方法：新鲜组织小块匀浆；细胞予预冷的0.01M PBS洗涤2次；加入1mL PBS后，细胞刮冰上刮取细胞，移至1.5mL离心管中，1000g×5min离心收集A 549细胞；加入配置好的500μL细胞裂解液置于轮转仪上4℃轮转30min彻底裂解细胞，12000g 4℃离心10min，将上清液转移至新EP管。预澄清加入20μL混匀的Protein A/G beads，在DNA混合仪上转动1小时，900g离心5min(4℃)，将上清液转移至新离心管，弃珠子。取40-60μL上清液作为Input，加入等量2×SDS loading buffer，沸水煮5-10min，离心后冻存。其余部分平分为两等分，分别加入等量(1μg)Normal IgG或相应抗体,在DNA混合仪上转动2小时(4℃)。在每个离心管中各加入30μL混匀的Protein A/G beads继续转动2小时。然后900g离心5min(4℃)，弃上清。加入1mL洗涤缓冲液洗涤珠子。900g离心5min(4℃)，共洗涤3次。最后将40-60μL 2×SDSloading buffer加入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，离心后冻存。连同Input样品一起进行We stern blot检测。

结果如图1所示：在肺癌组织IP和细胞IP中均存在全长蛋白NFIB和SOX 2的相互作用。

实施例2：小分子多肽NFIB^Δ克隆载体构建及与SOX2免疫共沉淀鉴定

本发明提供一种能竞争结合SOX2并抑制肿瘤细胞增殖的小分子多肽，该小分子多肽由其编码基因设计对应引物，经聚合酶链反应(PCR)合成后插入表达质粒。随后表达载体转入大肠杆菌BL21，在LB培养基中培养，37℃下诱导表达。破菌取上清，应用OMEGA公司的DNA抽提试剂盒获得纯化目的DNA，命名为NFIB^Δ；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。之后转染肺癌A549细胞，免疫共沉淀检测NFIB^Δ与SOX2的相互作用。具体构建过程如下：

1)表达载体的构建：设计引物，经PCR法扩增693bp DNA目的片段，通过限制性内切酶Hind 3和BamH 1双酶切后，插入6.3kb p3XFLAG-CMV-13质粒，载体质粒图谱如图2所示。构建的表达载体经酶切鉴定正确，双酶切电泳鉴定结果见图3。

材料：E.coli BL21/DE3工程菌株为本室冻存；T4DNA连接酶为Gibco BRL公司产品；限制性内切酶为Biolab公司产品；Taq DNA聚合酶为Promega公司产品；质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物技术公司；Ni离子亲和层析介质购自本元正阳公司；胎牛血清(FCS)、DMEM培养基、1640培养基为Hyclone公司产品。

方法：基因片段的PCR引物由上海桑尼公司合成，引物序列如下：上游引物：5’-GCTAAGCTTACCATGGGACAATCAGGAAGTCCAAGC(含Hind3酶切位点)；下游引物：5’-GCTGGATCCGCCCAGGTACCAGGACTGGCT(含Bam H1酶切位点)。PCR反应体系为：H₂O 22μL，上游引物1μL，下游引物1μL，NFIB全长真核表达质粒1μL(GV141载体，上海吉凯基因化学技术有限公司构建)，Taq DNA聚合酶25μL。PCR反应条件为：94℃变性4min，55℃退火，72℃引物延伸。在基因片段两端设计了Hind III和Bam H1两个限制性酶切位点，双酶切连入p3XFLAG-Myc-CMV质粒。连接体系为：H₂O10μL，T4连接酶buffer1μL，T4连接酶2μL，Fragment1μL。另设对照组，不加fragment，以H₂O补足体积。PCR机中连接过夜。用连接产物转化JM109感受态菌。转化步骤为：1)100μL感受态菌置于冰水，加入DNA 0.5μL，静置30分钟；2)42℃水浴2分钟；3)冰浴5分钟；4)加入不含抗生素的LB培养基，37℃下，150RPM震荡培养50分钟。5)将转化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37℃孵箱培养过夜。6)挑选阳性克隆5个，分别接种于LB液体培养基，置37℃摇床震荡培养。

2)表达载体的鉴定：

挑取5个生长在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上的单克隆菌落，接种于2.0mL含Amp的LB液体培养基中，37℃恒温，250rpm振荡培养过夜约12～14h，用质粒小量抽提试剂盒少量制备细菌质粒DNA；酶切鉴定含有阳性片段的质粒DNA。酶切电泳结果如图3所示：在挑选的5个克隆中，其中3号、4号克隆电泳检测到了与目的片段大小一致的DNA条带。并且阳性质粒送上海桑尼生物技术公司测序。将相应含阳性片段质粒DNA的感受态细胞保种，保存于-70℃。

挑取LB琼脂培养板上生长的阳性单克隆菌落，接种于2～3mL LB选择性液体培养基内，37℃恒温，300rpm剧烈振荡培养过夜(约12～14h)；取1.5mL新鲜菌液离心，6,000g×15min，4℃，弃上清；按照QIAGEN Plasmid Mini Kit说明书进行质粒抽提：将细菌沉淀重悬于0.3mL Buffer P1，振荡混匀；加入0.3mL Buffer P2，剧烈颠倒混匀4～6次，室温放置5min；加入0.3mL预冷的Buffer P3，立即剧烈颠倒混匀4～6次，冰浴5min；最大转速离心10min，弃沉淀；在此过程中用1mL Buffer QBT室温平衡QIAGEN-tip 20柱，让其在重力作用下完全过柱；将冰浴后的细菌裂解液加入已平衡好的QIAGEN-tip 20柱，让其在重力作用下过柱；加入2mL Buffer QC室温洗QIAGEN-tip 20柱两次；加入0.8mL Buffer QF室温洗脱QIAGEN-tip 20柱上吸附的质粒DNA；在洗脱液中加入0.56mL异丙醇吹打混匀后沉淀质粒DNA，4℃离心，15,000g×30min，小心弃上清；加入1mL 70％乙醇洗涤质粒DNA，4℃离心，15,000g×10min，小心弃上清；37℃烘箱或超净工作台室温干燥DNA 5～10min，加入适量Buffer TE溶解质粒DNA，核酸蛋白定量仪定量及测定OD260/280比值来计算质粒DNA的纯度，分装后-20℃保存备用。

3)截短IP：将NFIB^Δ表达载体转入肺癌A549细胞中，细胞免疫共沉淀证明重组截短体蛋白NFIB^Δ与SOX2相互作用，具体步骤同实施例1。

结果如图4所示：免疫沉淀检测NFIB全长(WT)及构建的不同小分子多肽包括截短1(S1)，及截短2(S2)与ASCL1的相互作用。。结果显示，除了NFIB全长蛋白(WT)能与SOX2蛋白相互作用外，NFIB截短突变体(S2)，即本发明专利的小分子多肽NFIB^Δ也能与SOX2蛋白发生相互作用，但是截短1与ASCL1无相互作用。

实施例3：小分子多肽NFIB^Δ抗肺癌功能的检测

1)PI染色流式细胞术证明NFIB^Δ对肺癌细胞周期的抑制

材料：A549细胞，无血清培养基，PBS，胰酶，低速振荡器，碘化丙啶，枪头。

方法：细胞按每孔4×10⁵个的密度接种于60mm细胞培养皿内，培养过夜后，用不同的表达质粒(表达NFIB野生全长型的3XFLAG-CMV-13质粒；空载质粒对照；表达231氨基酸小分子多肽NFIB^Δ型p3XFLAG-CMV-13质粒)转染A549细胞，PI染色流式细胞分析检测细胞周期。胰酶消化收集细胞，并用1mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。800rpm离心5分钟，去除上清，加5mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS中。用低速振荡器边震动边加入5mL预冷的70％乙醇，固定，4℃过夜。次日将固定好的细胞以1000rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4mL PBS清洗一次，用0.4mL PBS重悬细胞。加入5μL RNaseA(10mg/mL)37℃消化1小时，加入终浓度50mg/mL碘化丙啶(propidium iodide PI)4℃避光染色过夜(或者37℃避光染色1小时)，在EPICS XL流式细胞仪上分析。

结果如图5所示，空载对照组细胞(中)停滞在G0/G1期的细胞为70.43％，进入S期的细胞为21.74％；与对照空载组细胞相比，表达NFIB野生全长型的A549细胞(左)其细胞增殖能力明显较强，进入S期的细胞为26.47％，而停滞在G0/G1期的细胞为59.54％；与此同时，与对照空载组细胞及表达NFIB野生全长型细胞相比，表达截短体小分子多肽NFIB^Δ的细胞(右)其细胞增殖能力明显下降，进入S期的细胞为5.14％，而停滞在G0/G1期的细胞为91.50％。该结果表明小分子多肽NFIB^Δ能抑制肿瘤细胞的增殖

2)CCK-8实验证明NFIB^Δ抑制肺癌细胞的增殖

CCK-8细胞增殖实验：在A549细胞中，分别转染质粒空载对照，及小分子多肽NFIB^Δ质粒载体，48h后收集细胞，每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL。每孔换液(CCK-8与培养液的比例为1:10)，37℃孵育2h，终止培养，酶标仪以490nm波长测量各孔的吸光度值，每组设四复孔。每24h测定各组CCK-8吸光度值一次，共检测3天，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

主要方法为：①在96孔板中接种A549细胞悬液(100μL/孔)，密度为10⁴-10⁵/mL，将培养板在培养箱预培养过夜(在37℃，5％CO₂的条件下)，刺激细胞。②到达时间点后换液，向每孔加入100μL含10μL CCK-8溶液的细胞培养基(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。③将培养板在培养箱内孵育1.5-2h。(不同时间点要保持相同的时间)④用酶标仪测定(测定波长490nm，参照波长630nm)处的吸光度。

结果如图6所示，与空载对照组相比，转染231氨基酸的小分子多肽NFIB^Δ的细胞增殖速度下降。

Claims (4)

1.小分子多肽NFIB^Δ在制备抗肺癌药物中的应用；所述的小分子多肽NFI B^Δ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的小分子多肽NFIB^Δ的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述的小分子多肽NFIB^Δ的编码基因的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：将小分子多肽NFIB^Δ的编码基因克隆到p3XFLAG-Myc-CMV真核表达载体，构建出重组表达质粒。