CN111606991B

CN111606991B - 一种特异性结合nfib的单克隆抗体及其在制备药物以及化妆品的用途

Info

Publication number: CN111606991B
Application number: CN202010496405.4A
Authority: CN
Inventors: 张海涛; 王青
Original assignee: Zhuhai Teng Pai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhuhai Teng Pai Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: CN111606991A

Abstract

本发明涉及一种特异性结合NFIB的单克隆抗体及其在制备药物以及化妆品的用途，经过检测该抗体具有较好的抑制黑色瘤细胞增殖的效果，具有较好的应用前景。

Description

一种特异性结合NFIB的单克隆抗体及其在制备药物以及化妆品的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种特异性结合NFIB的单克隆抗体及其在制备药物以及化妆品的用途。

背景技术

黑色素瘤又称恶性黑色素瘤。是一种与骨伤科有关的皮肤肿瘤。恶性黑色素瘤(melanoma)来源于神经嵴的黑色素细胞，是由此类细胞异常增生引发的皮肤恶性肿瘤。良性黑色素瘤又称色素痣，多不引起注意。黑色素瘤可以一开始即为恶性，但通常由交界痣恶变而来。这是一种恶性程度较高的肿瘤，较为常见。多见于30岁以上的成年人，男女之比为2：1。好发部位为下肢，以足部为最多，其次是上肢、头颈、躯干等处。发病原因尚不明，但部分病例有皮肤受伤的病史，烧伤及X线照射可能是诱因，有少数病例与内分泌因素有关，家族性倾向也有报道。肿瘤呈灰黑色，结节状，质软，时有溃烂。镜下瘤细胞多呈梭形，圆形或多角形，胞浆中含有多少不等的黑色素颗粒，外观呈黑色，瘤细胞大小不等，呈弥散状、巢状、腺样或小梁状排列。好发于皮肤、粘膜和色素膜，其恶性程度极高，是死亡率极高的恶性肿瘤之一。

在全世界范围内黑色素瘤发病率和死亡率均持续上升，2014年在美国就有大约8万新增恶性黑素瘤患者，其中有约1万位患者死于该病。在我国2000年发病率统计仅为0.2/10万，2005-2007年我国发病率约1/10万，2008年我国发病率约1.3/10万，占恶性肿瘤的2％，且黑色素瘤患病人数正以每6-10年增加一倍的速度增长。2018年8月，从北京大学肿瘤医院和中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会黑色素瘤专家委员会获悉，中国黑色素瘤检出率增加，每年新发病例约2万例。

黑色素瘤早期发现并行原发灶切除即可治愈，但其发病隐匿，病程进展较快并具有很高的复发率和转移率。对于恶性黑色素瘤进展至中晚期的患者，主要采用联合治疗方案，包括IFN-α2b、白介素-2、达卡巴嗪及替莫唑等化疗、放疗，免疫治疗和生物治疗的方式。新近发展起来的小分子靶向药物(BRAF抑制剂vemurafenib、dabrafenib及MAPK/MEK抑制剂trametinib，cobimetinib)为携带BRAF等相关基因突变的恶性黑色素瘤患者带来了治疗上的新曙光，但相对那些没有BRAF突变或者BRAF突变治疗后病情恶化进展的患者，几乎没有进一步可选的治疗方法。同时免疫靶向治疗药物CTLA-4抗体、PD-L1抗体对部分抗PD-1阳性的患者病情有所缓解，但易产生耐药性。一旦产生耐药性的恶性黑色瘤患者病情发展呈爆发式，几乎无治疗手段可有效控制转移性恶性黑色素，5年存活率仅16％。黑色素瘤已经成为危害我国人民健康的疾病之一，深入研究黑色素瘤发病机制已成为全世界的难题。

随着现代肿瘤免疫学的迅速发展，针对恶性黑色素瘤发生、发展和转移等多个环节进行免疫治疗已成为目前研究的热点。肿瘤免疫治疗的目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。抗体药物是肿瘤免疫治疗的重要组成部分，以与肿瘤发生发展密切相关的分子作为靶点，通过不同机制，包括抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡以及干扰肿瘤新生血管形成等，实现对肿瘤细胞的特异性抑制、杀伤或对肿瘤生长微环境的针对性干扰。因此，与传统治疗措施相比，抗体药物效果更为明显而不良反应大大降低，用于恶性肿瘤的治疗已显示出良好的应用前景，成为包括黑色素瘤在内的恶性肿瘤免疫治疗中一个重要的研究方向。

目前抗PD-L1抗体以及多款PD-1抗体已经用于治疗恶性黑色素瘤，US20190194328A1公开了一种治疗黑素瘤的方法，包括给予患有黑素瘤肿瘤的患者一种抗-PD-1抗体或其抗原结合部分，其以每两周240mg或每四周480mg的平剂量特异性结合人PD-1(“抗-PD-1抗体”)同时还给予抗-CTLA-4抗体或其与人CTLA-4特异性结合的抗原结合部分(“抗-CTLA-4抗体”)。US10308721B2公开了一种治疗受试者黑色素瘤的方法，其中所述黑色素瘤的特征在于具有高于阈值指数值的DLL3表达水平，所述方法包括给予所述受试者抗DLL3抗体药物偶联物的步骤。但是针对其他靶点用于治疗黑色素瘤的抗体还较少涉及。

已有研究表明NFIB的下调显着抑制黑素瘤细胞增殖，减弱集落形成能力，并抑制细胞迁移和侵袭。总之，这些结果表明NFIB在黑素瘤发生发展中发挥重要作用。但是针对NFIB的单克隆抗体的研究还非常少。

发明内容

本发明提供一种具有高抗原决定簇的NFIB多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供一种具有高抗原决定簇的NFIB多肽，其核苷酸酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明另外，提供一种制备NFIB单克隆抗体的方法，其特征在于以NFIB多肽为免疫原。

进一步的，本发明提供一种NFIB单克隆抗体，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了NFIB单克隆抗体用于制备针对黑色素瘤的药物或者化妆品的用途。

此外，还提供含轻链可变区序列如SEQ ID NO：3所示，重链可变区序列如SEQ IDNO：4所示的NFIB单克隆抗体片段。

进一步的，本发明还提供了一种药物组合物，其含有NFIB单克隆抗体。

在某些实施例中，所述单克隆抗体可被制成单位剂量的可注射形式，例如溶液、悬液或乳液。适于注射的药物制剂通常为无菌水性溶液和分散体系。用于可注射制剂的载体可为溶剂或分散介质，含例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适混合物。本领域技术人员可容易地确定将在本发明方法中给予的组合物中的细胞和可选添加剂、媒介(vehicle)和/或载体的量。通常，任何添加剂(除所述细胞以外)都以0.001wt％-50wt％的量存在于溶液例如磷酸缓冲盐水中。所述活性组分以微克至毫克量级存在，例如约0.0001wt％到约5wt％，优选约0.0001wt％到约1wt％，最优选约0.0001wt％到约0.05wt％，或者约0.001wt％到约20wt％，优选约0.01wt％到约10wt％，最优选0.05wt％到约5wt％。

有益效果

本发明针对NFIB蛋白进行特异性的抗原决定簇分析以及相应的密码子进行优化得了特异性的NFIB抗原肽的氨基酸和核苷酸序列，将所述抗原肽进行重组表达纯化后免疫小鼠，制备得到相应的杂交瘤细胞以及相应的单克隆抗体，经过检测该抗体具有较好的抑制黑色瘤细胞增殖的效果，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为NFIB抗原肽核苷酸序列密码子优化前后对比图。

图2为NFIB抗原肽重组表达及纯化后的SDS-PAGE图。

图3为抗体效价结果图。

图4为Western blot检测结果图，左边是空白对照，右边是NFIB抗原肽与单克隆抗体的检测结果。

图5为单克隆抗体的效价检测结果图。

图6为黑色素瘤细胞抑制实验结果图。

具体实施方式

实施例1NFIB抗原表位的筛选

利用TMHMM Serverv.2.0在线软件预测NFIB蛋白的跨膜结构，通过SOPMA在线软件分析NFIB蛋白的二级结构，利用Predicting Antigenic Peptides在线软件预测NFIB蛋白的抗原决定簇。根据经验优化并调整所述的抗原表位肽序列结构，最终获得了优化后的NFIB抗原肽序列如SEQ ID NO：1所示。

该抗原肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2重组蛋白表达

将SEQ ID NO：2委托上海生工公司进行合成并连接pMD-19-T载体。将质粒pMD19-T-NFIB和pET-30a载体用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET-30a载体。将回收的产物按4:1摩尔比加入1.5mL的离心管，混匀后在4℃冰浴中过夜连接，后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂于含有50mg/mL的卡那霉素抗性平板培养过夜，筛选并鉴定得到阳性克隆，将阳性单克隆接种到15mL含相应抗性的LB液体培养基中，37℃,200r/min培养，培养至OD＝0.6-0.8，用0.5mM的IPTG,37℃,200r/min诱导培养2h。取1mL诱导的菌液，12000r/min，离心1min，弃上清，沉淀用10mMTris-HC1 pH8.0溶液吹散，加入等体积的缓冲液及2X loading buffer与1.5mL离心管中，100℃煮10min,SDS-PAGE电泳检测，后按照1:50比例接菌到卡那抗性的LB液体培养基中，进行大量诱导表达。

用去离子水洗镍柱，至pH 7.0。挂镍，至pH 2-3用去离子水洗柱至pH 7.0，用10OmMTris-HCl，pH8.0溶液平衡镍柱100mL。用含8M尿素、0.5M氯化钠的1OmM Tris-HCl，pH 8.0溶液平衡镍柱，约50mL。样品用含0.5M氯化钠、8M尿素、1OmM Tris-HCl(pH 8.0)进行稀释上样。上样结束后，用含8M尿素、0.5M氯化钠的1OmM Tris-HC1(pH 8.0)溶液洗柱。分别用含15mM咪唑、60mM咪唑、500mM咪唑的10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液洗脱，分别收集蛋白峰后电泳检测蛋白纯化效果。

从图2可以看出，SDS-PAGE图可以清楚看到目标蛋白得到了高表达，通过Ni柱纯化，也可以清楚的看到目标蛋白得到了有效的纯化。

实施例3抗体的制备

1.免疫小鼠

将纯化的NFIB蛋白抗原肽，按40μg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫SPF Balb/c雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。分别按7d的时间进行三次加强免疫，每次免疫量为30μg/只。加强免疫后眼眶取血，测血清效价。用NFIB蛋白抗原肽，2μg/mL 4℃包被过夜；2％的脱脂乳，3℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照为PBS，阴性对照为200倍稀释阴性血清。

免疫3只小鼠后采用眼球采血，对血清从200倍进行2倍梯度稀释进行效价的测定，发现NFIB-2号小鼠具有最好的效价效果。结果如图3所示的抗体效价检测结果，小鼠的效价明显高于空白对照和阴性对照能用于杂交瘤细胞的制备(空白对照为PBS，阴性对照为阴性血清200倍稀释)。

2.细胞的融合与杂交瘤细胞的筛选

取NFIB-2号小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。经培养后挑取单克隆细胞分别用NFIB蛋白及带His标签的蛋白包板，进行杂交瘤细胞的筛选。筛选得到了2株阳性效果最显著的杂交瘤细胞命名为NFIB-2-4D4和NFIB-2-5F3，同时对筛选的阳性杂交瘤细胞进行亚种鉴定具体结果如表1所示，其中空白对照为PBS，阴性对照为阴性血清200倍稀释。

表1 2株阳性杂交瘤细胞的鉴定结果

3.小鼠腹水的制备及采集

以阳性最好的杂交瘤细胞NFIB-2-4D4进行小鼠腹水的制备。提前7d给试验的Balb/c小鼠注射1mL的石蜡油，待杂交瘤细胞培养并计数后给小鼠进行腹腔注射，每只小鼠注射不少于1X10⁶个杂交瘤细胞。注射杂交瘤细胞待第五天后，对小鼠进行观察若小鼠腹部己明显变大即可采集腹水并进行标记。

4.单克隆抗体的纯化

取1份腹水8 000r/min离心5min，弃沉淀，加2份0.06mol/L(pH 5.0)的醋酸缓冲液，用1.0M HC1调pH至4.8。加入适量辛酸在室温搅拌下逐滴加入正辛酸，室温混匀30min,4℃静置至少2h，然后以12000r/min离心35min，弃沉淀。若离心后上清仍有细小颗粒悬浮，需要以12000r/min再离心15min，弃沉淀。按照上清液体积的1/10加入0.01M PBS，用1.0MNaOH调pH至7.2。在冰水浴中按0.277g/mL加入硫酸按至45％-50％饱和度，混匀30min后于4℃静置2h,12500r离心30min，弃上清。沉淀溶于适量PBS，加入5％体积甘油，混匀后装入透析袋，于4℃冰箱中在2L 0.01mol几PBS缓冲液中透析至少3h,期间更换缓冲液至少3次。将透析物以10000r/min离心10min，除去不溶性沉淀，加入5％体积甘油，分装-20℃冻存。小鼠腹水经纯化后进行SDS-PAGE检测，发现可见目的条带，且有较高的纯度。

5.用BCA试剂盒测定蛋白含量

(1)取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待检测蛋白eryA样品各25μL，加入到微孔板中(检测范围20-2000Pg/mL)

(2)在每个孔中加入200μL工作液，并在震荡器上震荡30s，使其充分混合

(3)将微孔板密封，在37摄氏度孵育30min

(4)将微孔板冷却到室温。使用微孔板读数仪，测量样品在562nm处的吸光值。

(5)将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。

(6)将BCA标准品在562nm处经过空白校正的平均吸光值对其浓度进行作图，

绘制标准曲线。通过BCA试剂盒对纯化蛋白的含量进行测定，经标准曲线的绘制，得R²为0.9948证明该抗体有较高浓度。纯化抗体结果如表2所示。

表2抗体纯化数据

实施例4抗体的检测

将实施例1制备的蛋白经过SDS-PAGE后蛋白转移到PVDF膜上，以14V的电压电转50min。将膜放入预先用PBST缓冲液洗涤后的平皿，用1％的脱脂乳4℃过夜封闭，用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次15min。加入1:500比例稀释的来自实施例3纯化的单克隆抗体，37℃孵育4h，用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次15min，然后加入1:5000比例稀释的辣根过氧化氢酶标记的兔抗羊IgG,37℃孵育2h,PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次15min。后用显色剂显色后拍照。从图4可以看出，使用Western blot检测发现重组蛋白可以有效的结合单克隆抗体，说明抗体制备成功。

实施例5单克隆抗体的效价检测

以纯化的实施例2的重组蛋白为抗原，以小鼠免疫前血清作为阴性对照，将从实施例3制备的腹水中纯化的单克隆抗体进行等倍稀释，采用间接ELISA法检测。结果表明，实施例3制备的单克隆抗体效价达到1:1024000(图5，其中i表示不同稀释倍数对应样品孔的吸光度值/阴性对照孔的吸光度值>2.1)。

实施例6单克隆抗体序列鉴定

参照SMARTer RACE试剂盒(clonetech，634859)使用说明书，根据鼠重链IgG1和轻链Kappa的Fc片段保守区设计下游引物，利用RACE PCR技术，对抗体重链和轻链可变区基因进行扩增和测序。经鉴定，得到抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：3和重链可变区序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例7抗NFIB抗体与NFIB蛋白结合能力测定

将实施例3中获得的抗体用培养基稀释成1000ng/ml，250ng/ml，62.5ng/ml，15.63ng/ml，3.91ng/ml，0.98ng/ml的浓度梯度，4℃孵育2h，吸出培养基，加入戊二醛室温孵育10min，用PBS洗涤3次后加入100ul抗人IgG抗体，室温孵育2h。用PBS洗涤3次后加入50μl显色液，室温避光孵育15min，加入终止液终止显色反应，用酶标仪检测样品在450nm波长处的吸光度值，并用620nm波长处的吸光度值校正。处理数据，最终确定各样品EC50值，结果见下表3。

表3抗NFIB抗体与NFIB结合能力测定

名称	EC50(ng/ml)
		NFIB-2-4D4	14.3±1.2

实施例8黑色素瘤细胞抑制实验

实验所用的细胞系人源原位黑素瘤细胞系A375购买自武汉大学细胞库中心。

将黑色素细胞进行培养，选择细胞融合率在80％左右时进行细胞传代细胞计数以每孔1000个细胞的标准将细胞均匀接种到3个96孔板中，每孔保持为100u1的培养基，同时每个实验组(本发明的抗体，浓度为10ug/孔)和对照组(PBS溶液)均设计6个复孔设立，做好标记。配置好CCK-8稀释溶液(l0ul/ml，吹打混匀后加入实验组和对照组并在没有细胞的空中设立空白对照组放入培养箱孵育至少3h，保证每天在固定时间，用酶标仪选取在490nm检测细胞的吸光度，连续检测24h,48h,72h数据。将数据空白校准取均值进行统计学分析。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制黑色素瘤细胞生长曲线。结果如图6所示。结果发现，在沉默表达NFIB的A375细胞增殖得到显著的抑制。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 北京欣颂生物科技有限公司

<120> 一种特异性结合NFIB的单克隆抗体及其在制备药物以及化妆品的用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Asn Pro Asp Gln Lys Gly Lys Ile Arg Arg Ile Asp Cys Leu Arg

1 5 10 15

Gln Ala Asp Lys Val Trp Arg Leu Asp Leu Val Met Val Ile Leu Phe

20 25 30

Lys Gly Ile Pro Leu Glu Ser Thr Asp Gly Glu Arg Leu Met Lys Ser

35 40 45

Pro His Cys Thr Asn Pro Ala Leu Cys Val Gln Pro His His Ile Thr

50 55 60

Val Ser Val Lys Glu Leu Asp Leu Phe Leu Ala Tyr Tyr Val Gln Glu

65 70 75 80

Gln Asp Ser Gly Gln Ser Gly Ser Pro Ser His Asn Asp Pro Ala Lys

85 90 95

Asn Pro Pro Gly Tyr Leu Glu Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Val Phe

100 105 110

Asn Val Ser Glu Leu Val Arg Val Ser Arg Thr Pro Ile Thr Gln Gly

115 120 125

Thr Gly Val Asn Phe Pro Ile Gly Glu Ile Pro

130 135

<210> 2

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcaatcctg accaaaaggg caaaattcgt cgtatcgatt gtctgcgtca ggcggacaag 60

gtttggcgtc tggacctggt gatggttatt ctgttcaaag gcattccgct ggaatccacc 120

gatggcgaac gcctgatgaa atcccctcac tgtaccaacc cagcactgtg cgtgcagccg 180

catcacatca ccgtgagcgt caaagaactg gatctgtttc tggcatatta cgtacaagaa 240

caggactccg gccagagcgg ctctccgtct cataacgatc cggcgaaaaa tcctccaggc 300

tatctggagg actctttcgt taaaagcggt gtttttaacg tgagcgaact ggtacgcgtc 360

tcccgtaccc cgatcaccca gggtactggc gtgaatttcc cgatcggcga gatcccg 417

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Arg Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Ala His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Pro

35 40 45

Ile Tyr Asp Thr Ser Pro Leu Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Asp Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Asp Gln Trp Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Leu Ser Phe Gly Ala Ser Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Glu Val Gln Leu Glu Gly Ser Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Glu Tyr

20 25 30

Trp Ser Pro Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Thr Gln Ala Thr

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Gln Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Tyr Asn Ala Arg Pro Asp Ser Trp Ala Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

Claims

1.一种特异性针对NFIB抗原肽的单克隆抗体或其抗体片段，其轻链可变区如SEQIDNO：3所示，重链可变区如SEQ ID NO：4所示，所述抗体片段为Fab或F(ab)2。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗体片段在制备治疗黑色瘤的药物或者抑制黑色素细胞增殖的化妆品中的用途。