CN105949285B

CN105949285B - Rbbp5截短体的应用

Info

Publication number: CN105949285B
Application number: CN201610388089.2A
Authority: CN
Inventors: 沈爱国; 季俐俐; 茅国新; 徐臻
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Yiwu Guoxin termite control Co.,Ltd.
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2036-06-03
Also published as: CN105949285A

Abstract

本发明公开了一种RBBP5截短体的应用。本发明利用生物工程技术，基因重组一段135个氨基酸多肽的RBBP5截短体到3.8kb PCMV‑HA载体，经酶切和序列分析证明重组成功后，细胞转染免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的抗增殖的能力行了试验，为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。

Description

RBBP5截短体的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及RBBP5截短体的应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为危害人类健康的主要疾病，对应的抗肿瘤药物是被广泛关注和研究的热点问题之一。寻找新型高效、低毒的抗肿瘤药物一直是国内外医药研发的热点。多肽药物是目前生物医药领域中极具发展前景的崭新领域，抗肿瘤小分子多肽具有分子量小、毒性低、活性高、易于穿透肿瘤细胞等特点，且能以多种方式给药，易于多途径吸收、不易产生耐药性等特点。蛋白质类大分子药物分子量大、结构复杂，不易穿透细胞，且具有免疫源性，而小分子多肽结构易于改造，人工合成成本较低，在临床上具有良好的应用前景。

肺神经内分泌肿瘤，包括SCLC和部分NSCLC，其恶性程度高，极易出现转移、复发，目前缺少有效的早期诊断及治疗手段，预后不良。转录因子ASCL1的表达与肺神经内分泌肿瘤的分化表型和分化程度密切相关，在肺神经内分泌瘤的发生发展中扮演重要角色。其可通过负性调控Wnt通路抑制因子DKK1，调节肺癌细胞周期转化及促进肿瘤细胞的增殖。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供RBBP5截短体的应用，具有抗肺癌细胞增殖的临床应用价值。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

RBBP5截短体在制备抗肺癌药物中的应用；所述的RBBP5截短体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的RBBP5截短体的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的RBBP5截短体的编码基因的载体。

所述载体：将RBBP5截短体的编码基因克隆到PCMV-HA真核表达载体，构建出重组表达质粒。

本发明人研究结果表明，RBBP5可以通过与ASCL分子相互作用，促进AS CL1对DKK1的负性调控，以促进肺癌细胞增殖。因此依据竞争性结合的原理，阻断RBBP5-ASCL1相互作用，将抑制ASCL1通路，达到抗肿瘤增殖的作用。

有益效果：与现有技术相比，本发明利用生物工程技术，基因重组一段135个氨基酸多肽的RBBP5截短体到3.8kb PCMV-HA载体，经酶切和序列分析证明重组成功后，细胞转染免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的抗增殖的能力行了试验，为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。

附图说明

图1是肺癌组织、细胞中RBBP5和ASCL1的相互作用结果图；

图2是载体质粒图谱PCMV-HA的结构示意图；

图3是免疫印迹检测RBBP5全长和不同截短重组多肽RBBP5的表达结果图；

图4是A549细胞中免疫沉淀检测RBBP5全长及其截短体与ASCL1的相互作用结果图；

图5是RBBP5截短体的表达后对肺癌细胞周期的影响结果图；

图6是RBBP5截短体的表达后对肺癌细胞增殖的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 RBBP5与ASCL1相互作用结构域的确定

免疫沉淀分析RBBP5和ASCL1在肺癌组织及细胞中的相互作用。组织及细胞匀浆后，以RBBP5或ASCL1的抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀后进行免疫印迹分析两者的相互作用。

具体方法：新鲜肺癌组织匀浆。细胞予预冷的0.01M PBS洗涤2次；加入1mL PBS后，细胞刮冰上刮取细胞，移至1.5mL离心管中，1000g×5min离心收集细胞；加入配置好的500μL细胞裂解液置于轮转仪上4℃轮转30min彻底裂解细胞，12000g 4℃离心10min，将上清液转移至新EP管。预澄清加入20μL混匀的Protein A/G beads，在DNA混合仪上转动1小时，900g离心5min(4℃)，将上清液转移至新离心管，弃珠子。取40-60μL上清液作为Input，加入等量2×SDS loading buffer，沸水煮5-10min，离心后冻存。其余部分平分为两等分，分别加入等量(1μg)Normal IgG或相应抗体,在DNA混合仪上转动2小时(4℃)。在每个离心管中各加入30μL混匀的Protein A/G beads继续转动2小时。然后900g离心5min(4℃)，弃上清。加入1mL洗涤缓冲液洗涤珠子。900g离心5min(4℃)，共洗涤3次。最后将40-60μL 2×SDSloading buffer加入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，离心后冻存。连同Input样品一起进行West ern blot检测。

实验结果如图1所示，在组织IP和细胞IP中均存在RBBP5全长蛋白和AS CL1的相互作用。

实施例2 RBBP5截短体克隆载体构建

提取肺癌细胞mRNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，上游引物为5’-CGGAATTCATGAACCTCGAGTTGCTGGAGTC-3’(含ECOR1酶切位点)；下游引物为5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCACCCTGTCTGCTCAGGCTCACTC-3’(含NotI酶切位点)，应用PCR技术成功扩增出含135个氨基酸的RBBP5截短体(序列如SEQ ID NO.1所示)对应的405bp的DNA序列(序列如SEQ IDNO.2所示)。扩增得到的片段与PCMV-HA载体连接(载体质粒图谱见图2)，将连接产物转入感受态大肠杆菌中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，并进行酶切鉴定。

基因片段的PCR引物由上海桑尼公司合成，引物序列如下：

上游引物：5’-CGGAATTCATGAACCTCGAGTTGCTGGAGTC-3’；

下游引物：5’-GGGGTACCGAAAGCTGTGAGATGATATTGGGTGCC-3’。

PCR反应体系为：H₂O 22μL，上游引物1μL，下游引物1μL，PCMV-N-HA-RBBP5质粒1μL(质粒来自PPL质粒与抗体共享库，网址http://ppl.biogot.com/产品编号：5929(BC053856))，Taq DNA聚合酶25μL。

PCR反应条件为：94℃变性4min，55℃退火，72℃引物延伸。

在基因片段两端设计了EcoRI和NotI两个限制性酶切位点，双酶切连入PC MV-HA质粒。

连接体系为：H₂O10μL，T4连接酶buffer1μL，T4连接酶2μL，Fragment1 μL。

另设对照组，不加fragment，以H₂O补足体积。PCR机中连接过夜。

用连接产物转化JM109感受态菌。转化步骤为：1)100μL感受态菌置于冰水，加入DNA 0.5μL，静置30分钟；2)42℃水浴2分钟；3)冰浴5分钟；4)加入不含抗生素的LB培养基，37℃下，150RPM震荡培养50分钟。5)将转化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37℃孵箱培养过夜。6)挑选阳性克隆4个，分别接种于LB液体培养基，置37℃摇床震荡培养。

经转化、提取等步骤获得重组真核表达载体。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定；将正确连接的多肽真核表达载体转染肺癌A549细胞，48小时后搜集样品，结果如图3：A549细胞转染后免疫印迹检测RBBP5全长(WT)及不同小分子多肽(截短1，及截短2即RBBP5^△)的表达。A549细胞成功表达RBBP5截短体(截短2)，分子量大小为15KD。具体过程如下：

挑取LB琼脂培养板上生长的阳性单克隆菌落，接种于2～3ml含Amp的LB液体培养基中，37℃恒温，250rpm振荡培养过夜约12～14h，用质粒小量抽提试剂盒少量制备细菌质粒DNA；酶切鉴定含有阳性片段的质粒DNA，双酶切体系为：H₂O14μL，Green buffer2μL，DNA2μL，Hind III1μL，Kpn I1μL，37℃水浴4小时。并且阳性质粒送上海桑尼生物技术公司测序。将相应含阳性片段质粒DNA的感受态细胞保种，保存于-70℃。

其中质粒抽提的具体步骤为：挑取LB琼脂培养板上生长的阳性单克隆菌落，接种于2～3mL LB选择性液体培养基内，37℃恒温，300rpm剧烈振荡培养过夜(约12～14h)；取1.5mL新鲜菌液离心，6,000g×15min，4℃，弃上清；按照质粒抽提试剂盒说明书进行质粒抽提：收集的转化菌沉淀块加入solution I 250uL，离心机13000R离心10min；加入solutionII 250uL，反复颠倒20次，呈拉丝状后离心机13000R离心10min；加入solution III 350uL，离心机13000R离心10min；加入DNA washing buffer 750uL，离心机13000R离心1min。

RBBP5截短体重组质粒表达鉴定：①细胞传代：转染前一天，将0.5-1.5×10A549细胞用1640培养基传代至6cm培养皿中，使得第二天转染时融合度在80-90％左右；②将2-4ug的质粒加入200μL的无血清培养基中，混匀；③将Lipofectamine 2000取出，轻柔摇匀，再将质粒量1-3倍量的Lipofectamine 2000用另一200μL的无血清培养基稀释，吹打混匀，静置5min；④将质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温静置20min；⑤将混合物加入培养皿中，轻柔地摇匀，静置，36-48h后收集细胞；⑥RIPA细胞裂解液裂解，免疫印迹检测多肽的表达。

实施例3 RBBP5截短体与ASCL1在肺癌细胞中的相互作用

将RBBP5截短体表达载体转入肺癌细胞中，进行细胞免疫共沉淀，具体实验步骤同实施例1。

实验结果如图4所示：免疫沉淀检测RBBP5全长(WT)及构建的不同小分子多肽(截短1，及截短2即RBBP5^△)与ASCL1的相互作用。其中除了RBBP5全长蛋白(WT)能与ASCL1蛋白相互作用外，RBBP5截短突变体2(即即RBBP5^△)也能与ASCL1蛋白发生相互作用，而截短1与ASCL1无相互作用。

实施例4 流式细胞术检测RBBP5截短体的表达对细胞周期的影响

将RBBP5截短体转染入A549细胞，培养细胞48h后，胰酶消化，用完培终止并收集到5mL EP管中离心，1200rpm离心5min，弃掉培养基，用预冷的细胞PBS重悬洗涤2次，再离心，弃掉PBS，用70％乙醇重悬，置于-20℃固定至少24小时，1200rpm离心5min，弃乙醇，用PBS洗涤3次，并用含1％triton X-100的PBS 4℃通透10min，每管200μL。加入RNase A，与tritonX-100的PBS比例为1:1000，避光4℃反应20min，每管300-400μL。加入200μL PI染色剂，避光4℃染色20min，每管200μL，过滤(400目筛子)。置于冰盒内，流式细胞仪检测。

结果如图5：流式检测小分子多肽RBBP5^△转染后对A549肺癌细胞周期的影响。，与空白对照组A549细胞(左)相比，小分子多肽RBBP5^△转染后(右)，A549细胞的细胞增殖能力明显受到抑制。对照组细胞停滞在G1期的为55.34％，而转染RBBP5截短体的细胞停滞在G1期的增加至73.27％，并且进入S期的细胞由对照组21.76％减少为9.34％。与对照组相比，转染RBBP5截短体后能够将细胞周期阻滞在G1期，有明显的细胞周期抑制作用。

实施例5 CCK8检测RBBP5截短体的表达对细胞增殖的影响

CCK-8细胞增殖实验：在A549细胞中，转染RBBP5截短体48h后收集细胞，每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL。每孔换液(CCK-8与培养液的比例为1:10)，37℃孵育2h，终止培养，酶标仪以490nm波长测量各孔的吸光度值，每组设四复孔。每24h测定各组CCK-8吸光度值一次，共检测3天，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

主要方法为：①在96孔板中接种H1299细胞悬液(100μL/孔)，密度为10⁴-10⁵/mL，将培养板在培养箱预培养过夜(在37℃，5％CO₂的条件下)，刺激细胞。②到达时间点后换液，向每孔加入100μL含10μL CCK-8溶液的细胞培养基(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。③将培养板在培养箱内孵育1.5-2h。(不同时间点要保持相同的时间)④用酶标仪测定(测定波长490nm，参照波长630nm)处的吸光度。

结果如图6CCK8实验检测小分子多肽RBBP5^△转染后对A549肺癌细胞增殖的影响。结果显示：转染RBBP5截短体的细胞增殖速度低于空白对照组。

Claims

1.RBBP5截短体在制备抗肺癌药物中的应用；所述的RBBP5截短体，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的RBBP5截短体的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述的RBBP5截短体的编码基因的载体。

4.根据权利要求3所述载体，其特征在于：将RBBP5截短体的编码基因克隆到PCMV-HA真核表达载体，构建出重组表达质粒。