CN103189067A - Wdr5与其结合配偶体的相互作用的抑制及治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开抑制MLL1与WDR5之间相互作用的肽拟似物。本文也公开抑制MLL1活性的方法和治疗癌症的方法。

Description

WDR5与其结合配偶体的相互作用的抑制及治疗方法
相关申请的交叉参考
该申请要求2010年6月16日递交的美国临时专利申请第61/355449号的权益，其通过引用以其全部结合到本文中。
发明领域
本发明涉及WDR5 (WD重复域5)和其与WDR5的Arg结合位点相互作用的结合配偶体之间相互作用的肽拟似物抑制剂。更具体地讲，本发明涉及阻断MLL (混合谱系白血病)结合于WDR5的肽拟似物化合物。本发明涉及由WDR5与其结合配偶体相互作用产生的活性调节，包括但不限于导致H3-K4甲基化和由这些复合体靶向的基因表达的H3-K4 (组蛋白3赖氨酸4)甲基化复合体的活性。本发明也涉及与WDR5和它的的结合配偶体(包括但不限于MLL)之间相互作用有关的疾病和病症的治疗。
发明背景
组蛋白在DNA组织进入染色质结构和遗传信息检索方面是重要的。对组蛋白的特异性修饰调节基因活性，导致表达或者静默(1,2)。在已被检测的真核细胞的常染色质的修饰当中，组蛋白3-赖氨酸4 (H3-K4)三甲基化被认为是转录活跃的基因的标志(3)。确信三甲基化的H3-K4为一转录所需要的另外因子募集的识别位点(4,5)。在各种癌症中已观察到H3-K4甲基化酶的异常(6,7)，它们当中最突出的实例是混合谱系白血病(MLL) (8)，其也被称为MLL1、ALL-1、HRX和HTRX1。
MLL在多蛋白复合体中为酶促活性的并且作为全基因和特异性基因调节子起作用(9,10)。MLL的最熟知的靶标为同源异型框(Hox)基因例如Hox-a9和Hox-c8。这些基因对一类在胚胎发育期间调节器官形成以及成人体内合适的造血作用的同源异型域转录因子编码(11-13)。某些Hox基因的表达水平增加，伴随MLL畸变，例如基因融合和扩增，常常在急性白血病例如急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞性白血病(AML)中被观察到(14-16)。把过度表达Hox-a7和Hox-c8的细胞注射给予裸鼠，在4-5周内导致良好生长的血管化肿瘤(vascularized tumors) (17)。异常Hox基因表达也在实体肿瘤例如前列腺癌和原发性结肠直肠肿瘤中被观察到(18,19)。因此MLL对几种类型的白血病和实体肿瘤为一种有前途的治疗靶标。
翻译后，MLL立即经蛋白水解裂解得到180-kDa C-末端(MLL1C) 和320-kDa N-末端片段(MLL1N)(20)。这些被一同装配在含有几种其它蛋白的多亚单位复合体中，包括WD重复域5 (WDR5)。缺乏小的或者同源异型样(Ash2L)，和成视网膜细胞瘤结合蛋白5 (RbBP5)，其每一个为所有已知的使人H3-K4甲基化的复合体的共有组件。
MLL与在体外能使H3-K4二甲基化的WDR5、RbBP5和Ash2L形成催化活性的核心复合体。尽管单独的MLL可最小部分地使H3-K4单甲基化，核心复合体的所有其它成员需要二甲基化，包括WDR5，后者在MLL与核心复合体的其余部分之间形成桥。在WDR5不存在下，MLL不能与RbBP5和Ash2L缔合(associate)，并且体外不能使H3-K4二甲基化(21,22)。已知敲除WDR5导致293细胞内的H3-K4三甲基化的水平和Hox-a9及Hox-c8基因的表达明显下降(23)。因此阻断WDR5-MLL相互作用为一种抑制MLL活性的有效策略。
最近已经显示MLL经含有精氨酸(Arg)(残基3765)的序列结合于WDR5(24,25)，这与通过H3的N-末端在其与WDR5的相互作用中使用的类似(26-29)。WDR5具有含中心腔的正则构象(canonical conformation)，并且H3和MLL肽两者使用Arg残基通过精氨酸结合位点与其腔穴相互作用。尽管晶体结构显示H3和MLL肽在该精氨酸结合位点上对WDR5具有极相似的结合模式，MLL肽对WDR5比对H3肽具有更高的亲和力(30)。MLL衍化的12-残基WIN (WDR5相互作用基序)肽(残基3762-3773)(表1)已经显示体外使MLL与复合体的其余部分分离(21)。因此WIN肽代表用于设计阻断MLL与WDR5相互作用的抑制剂的起点。
表1. WIN肽的序列和H3的肽N-末端。H3中的残基1-10和MLL1中的3762-3773被显示。以下指定的编号比较这两种肽中的残基。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
缩写：G-Gly-甘氨酸；S-Ser-丝氨酸；A-Ala-丙氨酸；R-Arg -精氨酸；T-Thr-苏氨酸；E-Glu-谷氨酸；K-Lys-赖氨酸；V-Val-缬氨酸；G-Gln-谷氨酰胺；H-His-组氨酸；L-Leu -亮氨酸。
尽管与WDR5复合的H3和MLL1肽的晶体结构的可获得性，对其高亲和力结合于WDR5需要的MLL1中的必需关键结合元素尚未定义，负责MLL1和H3肽与WDR5之间大结合亲和力差异的关键结构特征也没有定义。阐明这些结合元素和结构特征在本领域将是重要的进展，并且对MLL1-WDR5相互作用诱导的疾病和病症提供新的治疗方法。
发明概述
本发明涉及能够抑制WDR5通过WDR5中的Arg结合位点与其结合配偶体的相互作用的化合物。更具体地讲，本发明涉及抑制MLL1与WDR5的结合的肽拟似物。本发明也涉及通过MLL-WDR5相互作用介导的疾病和病症的治疗。
本发明的一个方面涉及具有以下通式(I)的肽拟似物化合物或其药学上可接受的盐或水合物：
其中R1选自H；取代或未取代的C1-9直链或分支烷基、C3-7环烷基；-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；-Y-R1’，其中Y为O或NX且R1’和X独立地选自H、取代或未取代的C1-9直链或分支烷基或C3-7环烷基、-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；
R2、R2’、R5和R5’独立地选自-H；C1-9取代或未取代的直链或分支烷基、C3-7环烷基；-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；-C(A)(B)(D)，其中A选自-H、-OH、-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-SH、-SCH3，并且B和D独立地选自H、取代或未取代的C1-6直链或分支烷基、C3-7环烷基、-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；或者
R2和R2’与它们连接的碳原子一起可形成C3-7碳环；或者
R5和R5’与它们连接的碳原子一起可形成C3-7碳环或者R5和R5’不存在；
R3为H、或者取代或未取代的C1-6直链或分支烷基、或者C3-7环烷基；
R4为-H、C1-6烷基、-(CH2)n-E、芳基E或
Figure DEST_PATH_IMAGE003
，其中n=2-6和E选自-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N+(CH3)3、-FL-C(=NJ)NKK’、-FL-C(=O)NKK’和-FL-C(=S)NKK’，其中F为C1-6烷基、N或CH，和L、J、K、K’独立地为H或-CH3；
R4’为-H、C1-6直链或分支烷基或C3-7环烷基，每一个为未取代的或被一个或多个卤素或OH取代；
R6选自H、取代或未取代的C1-12直链或分支烷基、C3-7环烷基；-C(=O)N(M)Q，其中M和Q独立地选自-H、C1-12直链或分支烷基、C3-7环烷基、苯基、苄基或杂芳基，其中每一个任选地被-OH、-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2或卤素中的一个或多个取代；和-(CH2)nCPP’P”，其中n= 0-6并且P、P’和P”独立地选自未取代或取代的苯基、苄基或杂芳基，或者M和Q与它们连接的氮原子一起可形成3-8元环。
本发明的另一方面提供抑制WDR5通过WDR5中的精氨酸结合位点，即其中MLL和H3蛋白结合于WDR5的结合位点，与其结合配偶体的相互作用的肽拟似物。这个实施方案包括但不限于使用通式(I)的肽拟似物抑制WDR5-MLL和WDR5-H3相互作用。
本发明的还一方面提供治疗疾病或病症的方法，其中抑制WDR5与其结合配偶体(包括但不限于MLL)之间的相互作用提供益处。所述方法包括给予有需要的个体治疗有效量的本发明的肽拟似物化合物。肽拟似物化合物可作为单独的疗法，或与治疗有效量的已知用于治疗所提及的疾病或病症的第二种药物共同给予。例如，疾病或病症可为癌症，并且所述第二种药物为第二种抗癌剂，例如放射和/或化学疗法。
本发明的另一方面涉及其中WDR5参与的组蛋白甲基转移酶复合体的H3K4甲基化活性的调节。抑制对使H3K4甲基化的复合体的活性需要的WDR5与其结合配偶体之间的相互作用，导致破坏其使其靶标甲基化的能力。
本发明的还一方面涉及通过H3K4甲基化控制的基因表达的调节。该实施方案包括但不限于Meis 1和Hox基因，特别是HoxA9、HoxA 7和HoxC8。
本发明的另一方面提供通过给予有需要的个体治疗有效量的MLL1-WDR5相互作用的本发明肽拟似物抑制剂，治疗以下疾病的方法：白血病，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)，或实体肿瘤，例如前列腺癌和原发性结直肠肿瘤。
本发明的还一方面提供用于疗法的肽拟似物化合物。本发明的还一方面提供用于癌症疗法，例如白血病疗法或实体肿瘤疗法的肽拟似物化合物。
在另一方面，本发明提供包含本发明的肽拟似物化合物和药学上可接受的赋形剂的药用组合物。
本发明的另一方面为在治疗个体的其中抑制WDR5-MLL和WDR-L3相互作用提供益处的疾病或病症的方法中，采用包含结构式(I)的化合物和第二种治疗活性物质的肽拟似物组合物。
在更进一步的实施方案中，本发明提供包含结构式(I)的肽拟似物化合物和任选的第二种治疗剂的组合物在制备用于治疗所提及的疾病或病症例如癌症的药物中的用途。
本发明的还一方面提供用于人药物应用的试剂盒，其包含：(a) 容器，(b1) 包含本发明的肽拟似物化合物的包装的组合物，和，任选地，(b2) 包含用于治疗所提及的疾病或病症的第二种治疗剂的包装的组合物，和(c) 含有用于一种或多种组合物的用法说明(在治疗所提及的疾病或病症中同时或依序给予)的包装插页。
本发明的另一方面提供用于准确和定量评价各种化合物与WDR5的结合亲和力的WDR5的荧光标记的示踪剂。本发明的化合物抑制MLL1-WDR5相互作用，并因此也用于体外研究组蛋白及其在生物学过程中的作用的研究工具。
本发明的这些和其它方面和特征自优选实施方案的以下附图和详述将变为显而易见。
附图简述
图1含有对使用0.6 nM荧光示踪剂的饱和结合实验的mP对比WDR5 (log μΜ)的曲线图；
图2含有显示用10mer-Thr-FAM经24小时的饱和结合实验的稳定性的mP对比WDR5 (log μΜ)的曲线图；和
图3含有显示组蛋白甲基转移酶活性的抑制作用的放射性(每分钟计数)对比化合物浓度(log μΜ)的曲线图。
优选实施方案的详述
本发明结合优选的实施方案进行描述。应该意识到，本发明不限于这些公开的实施方案。应该理解，鉴于本文本发明实施方案的描述，可由本领域的技术人员作出各种修饰。这样的修饰可包括以下权利要求书。
本文使用的术语“治疗”、“处理”、“医治”等指的是消除、减少或减轻疾病或病症和/或与之有关的症状。尽管不排除在外，治疗疾病或病症不需要疾病、病症或与之有关的症状被完全消除。本文使用的术语“治疗”、“处理”、“医治”等可包括“预防性治疗”，其是指在尚未患有，但是处于重新发生疾病或病症或者疾病或病症的复发的风险下或者处于易感状态的受试者中，减小重新发生疾病或病症、或者先前控制的疾病或病症的复发的可能性。术语“治疗”和同义词包括给予需要这种治疗的个体治疗有效量的本发明化合物。
在本发明的含义中，“治疗”也包括复发预防或阶段预防，以及急性或慢性体征、症状和/或功能障碍的治疗。治疗可根据症状确定方向，例如抑制症状。其可经短期起效，经中期确定方向，或者可长期治疗，例如在维持疗法的情况下。
本文使用的术语“治疗有效量”或“有效剂量”指的是当通过本发明的方法给予时，足以向需要它的个体有效传递用于治疗所提及的疾病或病症的活性成分的活性成分的量。在癌症或其它增殖性疾病的情况中，药物的治疗有效量可减少(即在某种程度上延迟和优选地停止)不需要的细胞增殖；减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小；抑制(即在某种程度上延迟和优选地停止)癌细胞向外周器官浸润；抑制(即在某种程度上延迟和优选地停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长和/或在某种程度上缓解一种或多种与癌症有关的症状。在所给予的化合物或组合物防止生长和/或杀死现有的癌细胞的程度上，其可为抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。
术语“容器”意指适合于储存、运输、分配和/或处理药用产品的任何容器和封闭包装(closure)。
术语“插页”意指与药用产品一起的信息，其连同使得医生、药剂师和患者能够关于产品的使用作出知情决策需要的安全性和有效性数据一起提供如何给予产品的描述。包装插页通常被看作是药用产品的“标签”。
“同时给予”、“组合给予”、“一并给予”及类似短语意指两种或更多种药物被同时给予正被治疗的受试者。所谓的“同时地”意味着每一种药物在不同的时间点同时或以任何顺序依序给予。然而，如果不同时给予，它们一方面在时间上足够接近地给予，以使提供药物组合的要求的治疗作用。药物的合适给药间隔和给药顺序对本领域的技术人员而言将是显而易见的。也考虑两种或更多种药物自分开的组合物给予，并且在一方面，一种组合物在给予其它组合物之前被给予。在给予之前指的是在1天(24 小时)内给予药物。进一步考虑一种药物在给予其它药物之后给予。随后给予意指描述自给予第一种药物之后30分钟-至多1天(24 小时)给予第二种药物。在24 小时内可包括在30分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20或24小时后给予。
术语“一种”、“一个”、“该”和类似指示物在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)的使用打算被视为包括单数和复数两者，除非另外指明。本文数值范围的列举仅打算用作单独指落入所述范围内的每一个单独数值的速记方法，除非本文另外指明，并且每一个单独数值被纳入说明书中，好像其在本文被单独列举一样。本文提供的任何和所有实施例，或者示例性的语言(如“例如”)的使用，打算更好地说明本发明，并且不为对本发明范围的限制，除非另外要求。说明书中的语言不应解释为表明任何非权利要求的元素为本发明的实践所必需的。
本文使用的术语“结合配偶体”意指与WDR5的Arg结合位点相互作用例如结合的化合物、低聚体、聚合物、蛋白和相关实体。
本发明涉及具有以下结构式(I)的肽拟似物化合物或其药学上可接受的盐或水合物：
其中R1选自H；取代或未取代的C1-9直链或分支烷基、C3-7环烷基；-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；-Y-R1’，其中Y为O或NX且R1’和X独立地选自H、取代或未取代的C1-9直链或分支烷基或C3-7环烷基、-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；
R2、R2’、R5和R5’独立地选自-H；C1-9取代或未取代的直链或分支烷基、C3-7环烷基；-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；-C(A)(B)(D)，其中A选自-H、-OH、-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-SH、-SCH3，并且B和D独立地选自H、取代或未取代的C1-6直链或分支烷基、C3-7环烷基、-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；或者
R2和R2’与它们连接的碳原子一起可形成C3-7碳环；或者
R5和R5’与它们连接的碳原子一起可形成C3-7碳环或者R5和R5’不存在；
R3为H、或者取代或未取代的C1-6直链或分支烷基、或者C3-7环烷基；
R4为-H、C1-6烷基、-(CH2)n-E、芳基E或
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，其中n=2-6和E选自-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N+(CH3)3、-FL-C(=NJ)NKK’、-FL-C(=O)NKK’和-FL-C(=S)NKK’，其中F为C1-6烷基、N或CH，和L、J、K、K’独立地为H或-CH3；
R4’为-H、C1-6直链或分支烷基或C3-7环烷基，每一个为未取代的或被一个或多个卤素或OH取代；
R6选自-H、取代或未取代的C1-12直链或分支烷基、C3-7环烷基；-C(=O)N(M)Q，其中M和Q独立地选自-H、C1-12直链或分支烷基、C3-7环烷基、苯基、苄基或杂芳基，其中每一个任选地被-OH、-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2或卤素中的一个或多个取代；和-(CH2)nCPP’P”，其中n= 0-6并且P、P’和P”独立地选自未取代或取代的苯基、苄基或杂芳基，或者M和Q与它们连接的氮原子一起可形成3-8元环。
本文使用的术语“烷基”指的是直链和分支的饱和烃基，其非限制性实例包括甲基、乙基，以及直链和分支的丙基、丁基、戊基和己基。术语Cn-y意指烷基具有“n”-“y”个碳原子。烷基可被例如卤代、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、烷基氨基或氨基取代。
本文使用的术语“芳基”指的是单环或多环芳基，优选地为单环或双环芳基，例如苯基或萘基。除非另外指明，芳基可为未取代的或者用一个或多个，并且特别是1-4个独立地选自例如卤代、烷基、链烯基、-OCF3、-NO2、-CN、-NC、-OH、烷氧基、氨基、烷基氨基、-CO2H、-CO2烷基、芳基和杂芳基的基团取代。示例性的芳基包括但不限于苯基、萘基、四氢化萘基、氯苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、三氟甲基苯基、硝基苯基、2,4-甲氧基氯苯基等。
本文使用的术语“杂芳基”指的是含有1或2个芳环和在芳环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或双环系统。除非另外指明，杂芳基可为未取代的，或者被一个或多个，并且特别是1-4个选自例如卤代、烷基、-(CH2)1-4卤代、链烯基、-CF3、-OCF3、-NO2、-CN、-NC、-OH、烷氧基、-(CH2)1-4OR、-CO2NR2、氨基、-CO2H、-CO2烷基、-SR、-SO2R、-SO3R、芳基和杂芳基的取代基取代。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、呋喃基、噁唑基、喹啉基、噻吩基、异喹啉基、吲哚基、三嗪基、三唑基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、嘧啶基、噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、吡唑基、吡嗪基、喹啉基、四唑基、噁唑基、吡咯基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、三嗪基、异吲哚基、嘌呤基、噁二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、二氢喹啉基、四氢喹啉基、二氢异喹啉基、四氢异喹啉基、苯并呋喃基、呋喃并吡啶基、吡咯并嘧啶基和氮杂吲哚基。
本文使用的基团例如
Figure 678692DEST_PATH_IMAGE004
和
Figure DEST_PATH_IMAGE005
为
Figure 555381DEST_PATH_IMAGE006
和
Figure DEST_PATH_IMAGE007
的缩写。
本文使用的术语“C3-9环烷基”意指含有3-9个碳原子的单环脂肪族环。
在各种实施方案中，R1为H、C1-4烷基、C3-5环烷基、-NH(C1-3烷基)、芳基或-CH2芳基。在一些优选的实施方案中，R1为CH3-、-CH(CH3)2、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-(CH2)3CH3、环丙基、环丁基、环戊基、苯基、苄基或-NH(CH3)。
在各种实施方案中，R2和R2’独立地为H、C1-4烷基、-(CH2)1-2SH、C3-6环烷基、-CH2-杂芳基、-CH2芳基或-C1-4亚烷基OH，或者R2和R2’与它们连接的碳一起形成C4-C6螺环接结构(spiro structure)。在一些实施方案中，R2为H和R2’为H、C1-4烷基、-(CH2)1-2SH、C2-6环烷基、-CH2-杂芳基、-CH2芳基、-C1-4亚烷基OH或苯基。在其它的实施方案中，R2和R2’每一个为C1-4烷基。在一些优选的实施方案中，R2和R2’独立地为H、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)3、-(CH2)2CH3、-C(CH3)2、-CH2SH、-CH2CH(CH3)2、环戊基、环己基、
Figure 377844DEST_PATH_IMAGE008
、-CH2苯基、-CH2OH、-CH(OH)CH3，或者R2和R2’与它们连接的碳一起形成螺环接C3、C4、C5或C6部分。在其它优选的实施方案中，R2为H和R2’为CH3或者R2和R2’两者为-CH2CH3。
在一些优选的实施方案中，R3为H。
在各种实施方案中，R4为H、-(CH2)n-FH-C(=NJ)NKK’、芳基-FH-C(=NJ)NKK’、
Figure DEST_PATH_IMAGE009
、C1-4烷基或-(CH2)nNH2。在一些优选的实施方案中，R4为H、、
Figure DEST_PATH_IMAGE011
、-(CH2)3CH3、-(C2)3-4NH2、
Figure 968411DEST_PATH_IMAGE012
或。在各种实施方案中，R4’为H、-(CH2)nFH-C(=NJ)NKK’或芳基-FH-C(=NJ)NKK’。在一些优选的实施方案中，R4’为H、
Figure 699607DEST_PATH_IMAGE014
或。
在各种实施方案中，R5和R5’独立地为不存在、H、C1-4烷基、-(CH2)1-3SH、-(CH2)1-3OH、C3-6环烷基、-CH2芳基、-CH(OH)CH3、-(CH2)1-3CO2H、任选地被卤代取代的芳基，或者R5和R5’与它们连接的碳一起形成C3-C6螺环接部分(spiro moiety)。在一些优选的实施方案中，R5和R5’独立地为不存在、H、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2SH、-CH2OH、-CH2CH(CH3)2、
Figure 692970DEST_PATH_IMAGE016
、-CH(OH)CH3、-C(CH2)3、环己基、-(CH2)2CO2H、环戊基，或者R5和R5’与它们连接的碳一起形成C3、C4、C5或C6螺环接部分。
在各种实施方案中，R6为-C(=O)N(M)(Q)，其中M和Q独立地为H、C1-8烷基、芳基、-(CH2)1-4芳基、任选地被卤代取代的-CH(芳基)2、-CH(CH3)芳基或C3-6环烷基。在优选的实施方案中，R6为-C(=O)N(M)(Q)，其中M和Q独立地为H、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)2、环己基、环戊基、苯基、
Figure DEST_PATH_IMAGE017
。在几个实施方案中，M和Q两者为H或C1-4烷基。在其它的实施方案中，M和Q中的一个为H和另一个不同于H。
本发明的肽拟似物化合物可作为盐存在。在一些实施方案中，肽拟似物化合物的药学上可接受的盐在本发明的方法中可为优选的。本文使用的术语“药学上可接受的盐”指的是肽拟似物化合物的盐或两性离子形式。化合物的盐可在化合物的最后分离和纯化期间，或者单独通过使化合物与具有合适的阳离子的酸反应进行制备。本发明化合物的药学上可接受的盐可为用药学上可接受的酸形成的酸加成盐。可用于形成药学上可接受的盐的酸的实例包括无机酸，例如硝酸、硼酸、盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸；以及有机酸，例如草酸、马来酸、琥珀酸和枸橼酸。本发明化合物的盐的非限制性实例包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、2-羟基乙磺酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、抗坏血酸盐、羟乙基磺酸盐(isethionate)、水杨酸盐、甲磺酸盐、均三甲苯磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、葡萄糖酸盐、甲磺酸盐、乙二磺酸盐、苯磺酸盐和对-甲苯磺酸盐。鉴于上述，本文出现的对本发明化合物的任何涉及打算包括肽拟似物化合物及其药学上可接受的盐和水合物。
如先前讨论的那样，混合谱系白血病1 (MLL1 )为组蛋白3-赖氨酸4 (H3-K4)甲基转移酶，并且为癌症治疗靶标。MLL1的催化活性通过形成由MLL1、WDR5、RbBP5和Ash2L组成的核心复合体进行调节。WDR5和MLL1之间的相互作用在调节MLL1的H3-K4甲基转移酶活性中起必要作用，并且靶向该相互作用代表有吸引力的治疗策略。
根据本发明，已经发现其高亲和力结合于WDR5需要的MLL1的必要元素。实施MLL1和H3肽与WDR5的相互作用的系统分析，并且发现在MLL1衍化的肽，-CO-Ala-Arg-Ala-NH-为其高亲和力结合于WDR5的最小基序。分析进一步显示，在该基序内形成的分子内氢键对高亲和力结合于WDR5起作用。
在H3肽中缺乏这些分子内氢键中的一种为造成其与WDR5弱结合亲和力的原因。具体地讲，具有游离N-末端的野生型H3肽(即ARTKQTARKS)具有与WDR5的15 μΜ的Ki值，但是在其N-末端引入乙酰基提供缺失分子内氢键，改善结合亲和力大于10000倍，并且生成的肽具有小于1 nM的Ki值。在本发明的一个实施方案中，2种3-mer肽即Ac-ARA-NH2和Ac-ART-NH2被制备，并且分别呈现与WDR5的120 nM和20 nM的Ki值。这个发现提供了使用肽拟似物化合物通过靶向MLL1与WDR5相互作用抑制MLL1活性的坚实基础。
更具体地讲，在MLL1中高亲和力结合于WDR5的最小基序首先被鉴定。含有WIN序列的MLL1肽已经显示结合于WDR5，kd为0.12 μΜ (21)。为了鉴定对高亲和力结合需要的残基，残基在WIN肽(即Ac-GSRAREVHLRKS-NH2)的N-末端或C-末端被系统性删除，其编号在表1中给出。除非另外指出，所产生的所有肽在N-末端被乙酰化，并在C-末端用酰胺封端。每一种肽与WDR5的结合亲和力通过基于荧光偏振(FP)的竞争性结合测定进行测量。数据概述在表2中。
在测定结合于MLL1的肽拟似物需要的必要元素并从而破坏MLL1-WDR5相互作用之后，MLL1-WDR5相互作用的本发明肽拟似物抑制剂被设计、合成和测试。
表2. 截短MLL肽与WDR5的结合亲和力.
Figure 509617DEST_PATH_IMAGE018
Ac为肽和肽类似物的N-末端的乙酰基(H3C-CO-)。
如在表2中所见的那样，12-残基WIN肽具有0.16 μΜ的Ki值，其类似于所报道的数值(21,24)。自-2位去除Gly不显著影响结合。出人意料地，自11-残基肽(Ac-11mer)的-1位进一步删除Ser导致高度有效的10-残基肽(Ac-10mer)，其具有Ki值=3 nM，比WIN肽更加有效，为WIN肽的Ki值的50倍。也发现Ac-11mer的N-末端乙酰基不利于其结合于WDR5。具有游离的N-末端的H2N-11mer肽比Ac-11mer更加有效，为Ac-11mer效力的10倍。自Ac-10mer进一步删除Ala1，得到Ac-9mer，降低结合亲和力达1500倍。
从Ac-10mer开始截短C-末端的序列。同时删除Arg8、Lys9和Ser10，在WIN-WDR5复合体的共晶体结构中未拆分的残余物，导致形成Ac-7mer，其具有为Ac-10mer的1/10的结合亲和力(25)。自C-末端进一步逐步删除，产生Ac-6mer、Ac-5mer、Ac-4mer和Ac-3mer，其全部具有与12-残基WIN肽相似的结合亲和力。然而，自Ac-3mer肽去除Ala3导致对WDR5的结合亲和力丧失大于199/200。因此，发现Ac-3mer (Ac-ARA-NH2)为获得与WDR5的高亲和力结合的最短MLL1肽。
也研究了MLL1肽中的分子内氢键对与WDR5的高亲和力结合的作用。在WDR5-WIN复合体的晶体结构中，在WIN肽的主链中存在两个分子内氢键(25)。第一个在-1位的Ser羰基与Ala3的酰胺质子之间，和第二个在Ala1羰基与Glu4酰胺质子之间。这些分子内氢键使得肽能够采取310螺旋二级结构，并且推论这种构型可有助于WIN肽与WDR5的结合亲和力。Ac-ARA-NH2呈现与12mer WIN肽相似的结合亲和力，并且这种3mer保持这两种分子内氢键。
为了确定氢键的作用，通过自Ala1去除乙酰基或者通过将Ala3氮甲基化破坏氢键1。自Ac-3mer肽的N-末端Ala1去除乙酰基得到H2N-3mer，其直到所测试的浓度也不结合于WDR5 (表3)。为了进一步证实该氢键的影响，也自最有效的Ac-10mer肽去除乙酰基，并且观察到结合亲和力降低大于1500倍。当自Ac-7mer、Ac-6mer和Ac-5mer肽去除N-末端乙酰基时观察到类似倍数的结合亲和力丧失。
Ala3氮的甲基化(肽Δ1)，其也破坏氢键1，导致其与WDR5的结合完全丧失。其次，自N-末端乙酰基去除甲基，得到CHO-ARA-NH2肽(CHO-3mer)，以确定在不存在甲基时羰基的贡献。用甲酰基替代乙酰基降低结合亲和力达25的因数，提示N-末端乙酰基中的甲基有助于增加结合亲和力，尽管在较小的程度上。总共地，这些数据显示氢键1在保持这些有效的MLL1肽与WDR5的高结合亲和力中起重要作用。
表3. Ac-ARA-NH2的肽类似物的结合亲和力
Figure DEST_PATH_IMAGE019
N-Me为N-甲基Ala
Figure 308945DEST_PATH_IMAGE020
为了扰乱氢键2，C-末端酰胺使用Ac-3mer单-或二甲基化(表3)。单甲基化的衍生物(Δ2a)通过建模显示以其结合构象保持氢键2，并且具有Ki=0.15 μΜ，类似于Ac-3mer的Ki。然而，二甲基化的衍生物(Δ2b)为Ac-3mer效力的1/50。用甲酯替代C-末端酰胺基提供Δ2c，其为Ac-3mer效力的1/10。这些数据表明，尽管氢键2对Ac-3mer的结合亲和力作出重要贡献，增加达或许一个数量级，但是其没有氢键1那么关键。
H3肽与WDR5的结合也被研究。尽管H3和MLL1肽与WDR5具有类似的结合模式，H3肽显示比MLL1肽弱得多的亲和力(30)。
H3肽具有与MLL1肽中的ARA结合基序类似的ART结合基序，但是在Ala1残基具有游离氨基。为了研究该游离氨基是否为造成较弱的H3结合亲和力的原因，H3-3mer和H3-10mer肽被乙酰化(表4)。在两者情况中，游离氨基的乙酰化显著增加与WDR5的结合亲和力(对于Ac-H3-3mer为1500倍和对于Ac-H3-10mer为大于10000倍)。Ac-H3-3mer和Ac-H3-10mer肽与WDR5分别具有20 nM和小于1 nM的Ki值，并且两者也比相应的MLL1肽Ac-3mer和Ac-10mer更加有效(表3和表4)。数据显示，H3肽与WDR5的较弱结合亲和力的主要特征基础为Ala1中的游离氨基和不存在分子内氢键1。
也检查Lys4 (K4)的甲基化是否显著改变H3-10mer与WDR5的结合亲和力。K4的单-、二-或三-甲基化导致与H3-10mer相比较与WDR5的结合亲和力无显著性差异(表4)。这与使用等温滴定曲线测量的试验一致(28)。
表4. 组蛋白3肽与WDR5的结合亲和力.
Figure DEST_PATH_IMAGE021
表4中的K(Me)指的是其中侧链的胺基被单甲基化的Lys残基。
表4中的K(Me2)指的是其中侧链的胺基被二甲基化的Lys残基。
表4中的K(Me3)指的是其中侧链的胺基被三甲基化的Lys残基。
如上所述，MLL通常被发现在癌症中未经调节，导致增加连接MLL与其致瘤性的Hox靶标基因的表达水平(8,32)。结果，抑制MLL活性为对于癌症疗法的有吸引力的策略。
单独的MLL1蛋白对H3-K4的体外单-甲基化具有最小的酶活性，不能二-和三甲基化，并且当其与WDR5、Ash2L和RbBP5蛋白形成核心复合体时，其整体的催化活性有很大的增强(33)。先前的研究明确地确定，对MLL1核心复合体的H3-K4催化活性需要WDR5和MLL1之间的相互作用(21,22)。因此，用小分子抑制剂抑制WDR5-MLL1相互作用可有效地抑制MLL1的酶活性。上述研究显示，短的MLL1肽高亲和力地结合于WDR5，并且基于这些研究推断，-CO-ARA-NH-为WIN肽中用于高亲和力结合于WDR5的最小基序。
已经发现MLL1与WDR5高亲和力结合需要的元素，MLL1-WDR5相互作用的抑制剂被设计、合成和测试。具体地讲，基于上述研究，一系列3-mers被设计和合成。3-mer肽拟似物与WDR5的结合亲和力也被测定。以下概述化合物和结合亲和力(表5)。
表5. 化合物的结构、结合亲和力和ESI-Mass表征.
Figure 894648DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE023
Figure 386809DEST_PATH_IMAGE024
Figure DEST_PATH_IMAGE027
Figure 28192DEST_PATH_IMAGE028
Figure DEST_PATH_IMAGE029
Figure 733979DEST_PATH_IMAGE030
Figure 154900DEST_PATH_IMAGE032
Figure DEST_PATH_IMAGE033
Figure 946139DEST_PATH_IMAGE034
Figure 87270DEST_PATH_IMAGE036
Figure DEST_PATH_IMAGE037
Figure 585247DEST_PATH_IMAGE038
Figure DEST_PATH_IMAGE039
Figure 419211DEST_PATH_IMAGE040
Figure DEST_PATH_IMAGE041
Figure 432167DEST_PATH_IMAGE042
Figure DEST_PATH_IMAGE043
本发明因此提供如通过本文公开的化合物举例说明的WDR5与其结合配偶体相互作用的抑制剂，所述抑制剂用于治疗其中抑制WDR5相互作用具有有益作用的疾病和病症。优选地，本发明的肽拟似物化合物与WDR5结合配偶体相比较优先结合于WDR5达至少10倍，优选地至少100倍，和更优选地达到至少1000倍。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗患有其中抑制WDR5与其结合配偶体相互作用提供益处的疾病或病症的个体的方法，所述方法包括给予有需要的个体治疗有效量的本发明肽拟似物化合物。
本文描述的方法涉及本发明肽拟似物化合物，单独或连同用于治疗所提及的疾病或病症的任选的第二种治疗剂，用于治疗其中抑制WDR5与其结合配偶体的相互作用(包括但不限于MLL1-WDR5相互作用)提供益处的疾病和病症的用途。本发明的方法可通过给予作为纯净的化合物或作为药用组合物的本发明肽拟似物化合物实现。给予药用组合物或纯净的肽拟似物化合物可在所提及的疾病或病症发作期间或之后实施。通常，药用组合物为无菌的，并且不含有毒性、致癌性或致突变的化合物，这样的化合物在给予时引起不良反应。
在许多实施方案中，本发明的肽拟似物化合物连同用于治疗其中抑制WDR5与其结合配偶体的相互作用(包括但不限于MLL)提供益处的疾病或病症的第二种治疗剂一起给予。第二种治疗剂不同于本发明的肽拟似物化合物。本发明的肽拟似物化合物和第二种治疗剂可同时或依序给予。另外，本发明的肽拟似物化合物和第二种治疗剂可自单一组合物或两种分开的组合物给予。本发明的肽拟似物化合物和任选的第二种治疗剂可同时或依序给予以获得要求的作用。
第二种治疗剂以提供其要求的治疗作用的量给予。对于每一种第二种治疗剂的有效剂量范围为本领域已知的，并且第二种治疗剂在这种建立的范围内被给予有需要的个体。
本发明也涉及包含本发明的肽拟似物化合物和第二种治疗剂的药用组合物，所述第二种治疗剂用于治疗其中抑制WDR5与其结合配偶体的相互作用提供益处的疾病和病症。进一步提供包含分开包装或包装在一起的本发明的肽拟似物化合物和任选地第二种治疗剂，以及具有使用这些活性剂的用法说明书的插页的试剂盒，所述第二种治疗剂用于治疗其中抑制WDR5与其结合配偶体的相互作用提供益处的疾病和病症。
本发明的肽拟似物化合物和第二种治疗剂可作为单一的单位剂量或者分开地作为多个单位剂量一起给予，其中本发明的肽拟似物化合物在第二种治疗剂之前给予，或反之亦然。可给以一个或多个剂量的本发明的肽拟似物化合物和/或一个或多个剂量的第二种治疗剂。本发明的肽拟似物化合物因此可连同一种或多种例如包括但不限于抗癌剂的第二种治疗剂一起使用。
在本发明的含义中，术语“疾病”或“病症”意指干扰和/或异常，其通常看作是病理学的病症或功能，并且其本身可以特定的体征、症状和/或功能障碍的形式来显示。如以下证实的那样，本发明的肽拟似物化合物为WDR5相互作用的有效抑制剂，并可用于治疗其中抑制WDR5与其结合配偶体的相互作用提供益处的疾病和病症。
在一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括：(a) 给予有需要的个体一定量的本发明的肽拟似物化合物；和(b) 给予该个体一定量的放射疗法、化学疗法或两者。所给与的量各自有效治疗癌症。在另一个实施方案中，所述量一起有效治疗癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的方法，所述方法包括给予需要它的受试者包含一定量的有效治疗癌症的本发明的肽拟似物化合物的药用组合物。
这些疗法可在在各种环境下用于治疗多种癌症。在具体的实施方案中，需要治疗的个体先前已经历癌症治疗。这样的先前治疗包括但不限于之前的化学疗法、放射疗法、手术或免疫疗法，例如癌症疫苗。
可按照本发明治疗的疾病和病症包括例如癌症。可治疗各种癌症，所述癌症包括但不限于：癌，包括膀胱(包括加速和转移性膀胱癌)、乳腺、结肠(包括结肠直肠癌)、肾脏、肝脏、肺(包括小和非小细胞肺癌及肺腺癌)、卵巢、前列腺、睾丸、泌尿生殖道、淋巴系统、直肠、喉、胰腺(包括外分泌胰腺癌)、食管、胃、胆囊、子宫颈、甲状腺、肾脏和皮肤(包括鳞状细胞癌)；淋巴系造血系统肿瘤，包括白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤(Burketts lymphoma)；髓系造血系统肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病和早幼粒细胞白血病；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间叶细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；及其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌、畸胎癌、肾细胞癌(RCC)、胰腺癌、骨髓瘤、骨髓性和成淋巴细胞性白血病、成神经细胞瘤和成胶质细胞瘤。
可用本发明的肽拟似物化合物治疗的另外形式的癌症包括例如成人和儿科肿瘤、实体肿瘤/恶性肿瘤的生长、粘液样和圆形细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性癌症、人体软组织肉瘤，包括尤因氏肉瘤；癌症转移，包括淋巴转移；特别是头和颈部的鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、口腔癌、血细胞恶性肿瘤，包括多发性骨髓瘤；白血病，包括急性成淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病、渗出性淋巴瘤(effusion lymphoma) (基于体腔的淋巴瘤)、胸腺淋巴瘤、肺癌(包括小细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肾上腺皮质癌、产生ACTH的肿瘤、非小细胞癌、乳腺癌，包括小细胞癌和导管癌)、胃肠癌(包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌和与结直肠肿瘤有关的息肉)、胰腺癌、肝癌、泌尿系统癌症(包括膀胱癌、例如原发性浅表性膀胱肿瘤、浸润性膀胱移行细胞癌和肌肉浸润性膀胱癌)、前列腺癌、女性生殖道恶性肿瘤(包括卵巢癌、原发性腹膜上皮性肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌和卵泡实体肿瘤)、男性生殖道恶性肿瘤(包括睾丸癌和阴茎癌)、肾癌(包括肾细胞癌)、脑癌(包括内在脑肿瘤、成神经细胞瘤、星形细胞脑瘤、神经胶质瘤和中枢神经系统的转移性肿瘤细胞侵袭)、骨癌(包括骨瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括恶性黑色素瘤、人皮肤角质形成细胞的肿瘤发展和鳞状细胞癌)、甲状腺癌、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、腹膜渗漏、恶性肿瘤性胸腔积液、间皮瘤、维耳姆斯氏瘤、胆囊癌、滋养层肿瘤、血管外皮细胞瘤和卡波济氏肉瘤。因此，给予本发明的肽拟似物化合物预计增强治疗方案。
可用本发明的化合物和方法治疗的其它癌症包括但不限于选自以下的实体肿的癌症和转移：包括但不限于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤；血源性癌症，包括但不限于：急性成淋巴细胞性白血病、急性B细胞型成淋巴细胞性白血病、急性T细胞型成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(mycloblastic leukemia)、急性早幼粒细胞性白血病、急性成单核细胞性白血病、急性成红白血细胞白血病(erythroleukemic leukemia)、急性成巨核细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病(myclomonocytic leukemia)、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病和多发性骨髓瘤；急性和慢性白血病：成淋巴细胞的、骨髓性淋巴细胞性和髓细胞性白血病；淋巴瘤：何杰金氏病和非何杰金氏淋巴瘤；多发性骨髓瘤；瓦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinamia)；重链病和红细胞增多症。
在本发明的方法中，通常按照药学实践配制的治疗有效量的本发明的肽拟似物化合物被给予需要它的人。这样的治疗是否为适应的，取决于个案并经医学评价(诊断)，这种医学评价考虑存在的体征、症状和/或功能障碍；发生具体体征、症状和/或功能障碍的风险等因素。
本发明的肽拟似物化合物可经任何合适的途径给予，例如通过口服、颊、吸入、舌下、直肠、阴道、脑池内或通过腰椎穿刺的鞘内、经尿道、鼻、经皮即经皮肤或者非肠道(包括静脉内、肌内、皮下、冠状动脉内、皮内、乳房内、腹膜内、关节内、鞘内、眼球后、肺内注射和/或在特定部位的手术植入)给予。非肠道给予可使用针头和注射器或者使用高压技术实现。
药用组合物包括其中本发明的肽拟似物化合物以实现其打算的用途的有效量给予的那些组合物。精确配方、给药途径和剂量由各个医生鉴于所诊断的病症或疾病来确定。剂量和间隔可被单独地调整以提供足以保持治疗作用的本发明肽拟似物化合物的水平。
本发明的肽拟似物化合物的毒性和治疗效力可通过标准制药程序，以细胞培养或实验动物，例如用于测定LD50 (群体的50%致死的剂量)和ED50 (在群体的50%治疗有效的剂量)来确定。在毒性和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数，表示为LD50与ED50之间的比率。呈现高治疗指数的化合物为优选的。得自这样的数据的数据可用于配制用于人的剂量范围。剂量优选地在其包括ED50并具有很小或者没有毒性的循环化合物浓度的范围内。剂量可依所采用的剂型和所采用的给药途径而在该范围内变化。确定治疗有效量在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开。
用于疗法需要的本发明肽拟似物化合物的治疗有效量随着正被治疗的病症的性质、所要求的活性的时间长度以及患者的年龄和病情变化，并且最终由主治医师确定。剂量和间隔可被个别调整，以提供足以保持要求的治疗作用的的肽拟似物化合物的血浆水平。所要求的剂量便利地可以单剂量或者作为以合适的间隔给予的多剂量给予，例如作为每天1、2、3、4或更多个亚剂量。通常要求或需要多剂量。例如本发明的肽拟似物化合物可以以下频率给予：作为每天1个剂量以4天间隔传递的4个剂量(q4d x 4)；作为每天1个剂量以3天间隔传递的4个剂量(q3d x 4)；以5天间隔每天传递1个剂量(qd x 5)；每周1个剂量共3周(qwk3)；5个每天剂量，两天休息，和另一次5个每天剂量(5/2/5)；或者；确定适合于所述情况的任何给药方案。
含有本发明的肽拟似物化合物的组合物或者含有相同组成的组合物的剂量可为约1 ng/kg-约200 mg/kg,、约1 μg/kg-约100 mg/kg或约1 mg/kg-约50 mg/kg。组合物的剂量可以任何剂量存在，包括但不限于约1 μg/kg。组合物的剂量可以任何剂量存在，包括但不限于约1 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg、100 μg/kg、125 μg/kg、150 μg/kg、175 μg/kg、200 μg/kg、225 μg/kg、250 μg/kg、275 μg/kg、300 μg/kg、325 μg/kg、350 μg/kg、375 μg/kg、400 μg/kg、425 μg/kg、450 μg/kg、475 μg/kg、500 μg/kg、525 μg/kg、550 μg/kg、575 μg/kg、600 μg/kg、625 μg/kg、650 μg/kg、675 μg/kg、700 μg/kg、725 μg/kg、750 μg/kg、775 μg/kg、800 μg/kg、825 μg/kg、850 μg/kg、875 μg/kg、900 μg/kg、925 μg/kg、950 μg/kg、975 μg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg kg、45 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg、70 mg/kg、80 mg/kg、90 mg/kg、100 mg kg、125 mg/kg、150 mg/kg、175 mg/kg或200 mg/kg。以上剂量为示例性的平均情况，但是可存在其中应为更高或更低剂量的个别情况，并且这样的情况处于本发明的范围内。实际上，医生确定最适合于个体患者的实际剂量方案，这种剂量方案可随着具体患者的年龄、体重和应答而变化。
用于本发明方法的本发明的肽拟似物化合物可以约0.005-约500毫克每剂、约0.05-约250毫克每剂或约0.5-约100毫克每剂的量给予。例如，本发明的肽拟似物化合物可每剂以约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500毫克的量，包括以0.005-500毫克之间的所有剂量给予。
在癌症治疗中，本发明的肽拟似物化合物可与化学治疗剂和/或放射，或者作为手术辅助手段一起给予。
本发明的实施方案采用以下电磁辐射：γ-辐射(10-20-10-13 m)、X-射线辐射(10-12-10-9 m)、紫外线(10 nm-400 nm)、可见光(400 nm-700 nm)、红外辐射(700 nm-1 mm)和微波辐射(1 mm-30 cm)。
许多癌症治疗方案目前采用电磁辐射例如X-射线激活的辐射敏化剂。X-射线激活的辐射敏化剂的实例包括，但不限于甲硝唑、米索硝唑、去甲基米索硝唑、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫拉唑、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FUdR)、羟基脲、顺铂及其治疗有效的类似物和衍生物。
癌症的光动力学疗法(PDT)采用可见光作为敏化剂的辐射活化剂。光动力学辐射敏化剂的实例包括但不限于：血卟啉衍生物、PHOTOFRIN?、苯卟啉衍生物、NPe6、锡初卟啉(tin etioporphyrin) (SnET2)、脱镁叶绿酸-a、细菌叶绿素-a、萘酞菁(naphthalocyanines)、酞菁、锌酞菁及其治疗有效的类似物和衍生物。
辐射敏化剂可连同除本发明的STAT3抑制剂外的治疗有效量的一种或多种化合物，例如包括但不限于以下的化合物一起给予：促进辐射敏化剂结合靶标细胞的化合物、控制治疗剂、营养物和/或氧气流向靶标细胞的化合物、伴随或不伴随另外的辐射对肿瘤起作用的化学治疗剂或者用于治疗癌症或其它疾病的其它治疗有效的化合物。可连同辐射敏化剂一起使用的另外治疗剂的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸、氧、卡波金(carbogen)、红细胞输血、全氟化碳(例如FLUOSOLW?-DA)、2,3-DPG、BW12C、钙通道阻滞剂、己酮可可碱、抗血管生成化合物、肼苯酞嗪和L-BSO。
化学治疗剂可为诱导细胞凋亡的任何药物或化合物。药物或化合物可为例如小的有机分子、肽、多肽、核酸或抗体。可使用的化学治疗剂包括但不限于烷化剂、抗代谢物、激素及其拮抗剂、天然产物及其衍生物、放射性同位素、抗体以及天然产物及其组合。例如，本发明的肽拟似物化合物可与抗生素例如多柔比星及其它蒽环霉素类似物、氮芥例如环磷酰胺、嘧啶类似物例如5-氟尿嘧啶、顺铂、羟基脲、紫杉醇及其天然和合成的衍生物等一起给予。作为另一个实例，在混合瘤例如乳腺癌的情况中，其中肿瘤包括促性腺激素依赖的和促性腺激素不依赖的细胞，化合物可连同亮丙立德或戈舍瑞林(LH-RH的合成肽类似物)一起给予。其它的抗肿瘤方案包括与另一种治疗形式例如手术或辐射(本文也称为“辅助抗肿瘤形式”)一起使用的抑制剂化合物。用于本发明的另外的化学治疗剂包括激素及其拮抗剂、放射性同位素、抗体、天然产物及其组合。
用于本发明方法的化学治疗剂的实例列于下表中。
表6
烷化剂类 天然产物
氮芥类 抗有丝分裂的药物
氮芥  
环磷酰胺 紫杉烷类
异环磷酰胺 紫杉醇
美法伦 长春花生物碱
苯丁酸氮芥 长春碱(VLB)
尿嘧啶氮芥 长春新碱
替莫唑胺 长春瑞滨
  长春地辛
亚硝基脲类 Taxotere? (多西他赛)
卡莫司汀(BCNU) 雌莫司汀
洛莫司汀(CCNU) 磷酸雌莫司汀
司莫司汀(甲基-CCNU)  
氮芥 表鬼臼毒素
链脲菌素 依托泊苷
  替尼泊苷
乙烯亚胺/甲基-三聚氰胺  
三乙撑蜜胺(TEM) 抗生素
三乙烯硫代磷酰胺 放线菌素D
(噻替派) 道诺霉素(红比霉素)
六甲蜜胺 多柔比星(阿霉素)
(HMM, 六甲蜜胺) 米托蒽醌依达比星
  博来霉素
烷基磺酸酯 普卡霉素(splicamycin) (光神霉素)
白消安 丝裂霉素-C (mitromycin-C)
哌泊溴烷(pipobroman) 放线菌素D
  阿非迪霉素(aphidicolin)
三嗪类 表柔比星
达卡巴嗪DTIC) 伊达比星
  道诺霉素
抗代谢物 光神霉素
叶酸类似物 光神霉素
甲氨蝶呤  
三甲曲沙 酶
培美曲塞 L-天冬酰胺酶
(多靶点抗叶酸剂) L-精氨酸酶
   
嘧啶类似物 辐射敏化剂
5-氟尿嘧啶 甲硝唑
氟脱氧尿苷 米索硝唑
吉西他滨 去甲基米索硝唑
阿糖胞苷 哌莫硝唑
(AraC, 阿糖胞苷) 依他硝唑
5-氮杂胞苷 尼莫拉唑
2,2’-二氟脱氧-胞苷 RSU 1069
氟尿苷 E09
喷司他汀 RB 6145
嘌呤类似物 非甾体类抗雄激素
6 -巯基嘌呤 SR4233
6-硫鸟嘌呤 氟他胺
硫唑嘌呤 烟酰胺
2’-脱氧助间型霉素 5-溴脱氧尿苷
(喷司他汀) 5-碘脱氧尿苷
赤羟基壬基腺嘌呤(EHNA) 溴脱氧胞苷
磷酸氟达拉滨  
2-氯脱氧腺苷 其他药物
(克拉屈滨, 2-CdA) 铂配位络合物
  顺铂
I型拓扑异构酶抑制剂 卡铂
喜树碱 奥沙利铂
托泊替康 蒽二酮(anthracenedione)
伊立替康 米托蒽醌
   
生物应答调节剂 取代的脲
G-CSF 羟基脲
GM-CSF  
  甲基肼衍生物
分化剂 N-甲基肼(MIH)
视黄酸衍生物 丙卡巴肼
   
激素和拮抗剂 肾上腺皮质抑制剂
肾上腺皮质甾类/拮抗剂 米托坦(ο, p’- DDD)
泼尼松和等效物 氨鲁米特(ainoglutethimide)
地塞米松  
氨鲁米特 细胞因子
  干扰素(α, β, γ)
孕激素类 白细胞介素-2
羟孕酮己酸酯  
醋酸甲羟孕酮 光敏剂
醋酸甲地孕酮 血卟啉衍生物
  PHOTOFRIN?
雌激素类 苯卟啉衍生物
己烯雌酚 Npe6
炔雌醇/等效物 锡初卟啉(SnET2)
  脱镁叶绿酸-a
抗雌激素 细菌叶绿素-a
他莫昔芬 萘酞菁类
  酞菁类
雄激素类 锌酞菁
丙酸睾酮  
氟甲睾酮/等效物 辐射
  X-射线
抗雄激素类 紫外光
氟他胺 γ辐射
促性腺激素释放 可见光
激素类似物 红外线照射
亮丙瑞林 微波辐射
微管影响剂干扰细胞有丝分裂，并且对其细胞毒活性为本领域熟知的。用于本发明的微管影响剂包括但不限于别秋水仙碱(NSC 406042)、软海绵素B (NSC 609395)、秋水仙碱(NSC 757)、秋水仙碱类衍生物(例如NSC 33410)、海兔毒素10 (NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根霉素(NSC 332598)、紫杉醇(NSC 125973)、TAXOL?衍生物(例如NSC 608832)、硫代秋水仙碱(NSC 361792)、三苯甲基半胱氨酸(NSC 83265)、硫酸长春碱(NSC 49842)、硫酸长春新碱(NSC 67574)，天然和合成的埃坡霉素，包括但不限于埃坡霉素A、埃坡霉素B，以及蜥皮海绵内酯(参见Service, (1996) Science, 274:2009)、雌莫司汀、诺考达唑、MAP4等。这些药物的实例也描述于Bulinski (1997) J. Cell Sci. 110: 3055 3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 397:268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8:973-985; 和Panda (1996) J. Biol. Chem. 271: 29807-29812中。
可被使用的细胞生长抑制剂包括但不限于激素和类固醇类(包括合成类似物)：17-α-乙炔基雌二醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲泼尼龙、甲睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、诺雷德。
其它细胞生长抑制剂为抗血管生成剂例如基质金属蛋白酶抑制剂和其它VEGF抑制剂，例如抗-VEGF抗体例如ZD6474和SU668。也可采用抗-Her2抗体。EGFR抑制剂为EKB-569 (一种不可逆的抑制剂)。也包括对EGFR和Src抑制剂有免疫专一性的抗体C225。
也适合用作细胞生长抑制剂的为提供雄激素依赖性癌的非增殖性的CASODEX? (比卡鲁胺, Astra Zeneca)。细胞生长抑制剂的还一个实例为抑制雌激素依赖性乳腺癌的增殖或生长的抗雌激素TAMOXIFEN?。细胞增殖信号转导的抑制剂为细胞生长抑制剂。代表性的实例包括表皮生长因子抑制剂、Her-2抑制剂、MEK-1激酶抑制剂、MAPK激酶抑制剂、PI3抑制剂、Src激酶抑制剂和PDGF抑制剂。
本发明的肽拟似物化合物通常以与根据打算的给药途径和标准药学实践选择的药用载体的混合物给予。用于根据本发明用途的药用组合物以常规方式，使用一种或多种药理学上可接受的载体配制，所述药理学上可接受的载体包括便于处理肽拟似物化合物的赋形剂和助剂。
这些药用组合物可例如通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、乳化、包囊、截留(entrapping)或冻干方法制备。合适的配方取决于所选择的给药途径。组合物通常可以片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂或酏剂的形式存在。当以片剂形式给予时，组合物另外可含有固体载体，例如明胶或辅助剂。片剂、胶囊剂和粉剂含有约0.01%-约95%，和优选地含有约1%-约50%的本发明肽拟似物化合物。当以液体形式给予时，可加入液体载体，例如水、石油或者动物或植物来源的油。液体形式的组合物可进一步含有生理盐水溶液、右旋糖或其它糖溶液、或者二醇类。当以液体形式给予时，组合物含有按重量计约0.1%-约90%，和优选地约1%-约50%的本发明的肽拟似物化合物。
当治疗有效量的本发明肽拟似物化合物通过静脉内、皮肤或皮下注射给予时，组合物以无热原的非肠道可接受的水性溶液剂的形式存在。考虑到pH、等渗性、稳定性等这样的非肠道可接受的溶液剂的制备处于本领域技术人员的范围内。用于静脉内、皮肤或皮下注射的优选组合物通常含有等渗媒介物。本发明的肽拟似物化合物可经10-30分钟跨度或经几小时用其它流体注入。
本发明的肽拟似物化合物可易于与本领域熟知的药学上可接受的载体组合。这样的载体使得活性剂能够配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂、凝胶、糖浆剂、浆状物、混悬剂等。通过向固体赋形剂加入本发明的肽拟似物化合物，任选地碾磨生成的混合物，并且如果需要，在加入合适的助剂之后加工颗粒混合物，得到片剂或糖衣丸芯，可得到药用制剂。合适的赋形剂包括例如填充剂和纤维素制剂。如果需要，可加入崩解剂。
本发明的肽拟似物化合物可被配制为用于通过注射，例如通过快速浓注或连续输注经非肠道给药。用于注射的制剂可以例如在安瓿或多剂量容器中伴随加入防腐剂的单位剂型呈现。组合物可采取如混悬剂、溶液剂或者在油性或水性媒介物中的乳剂这样的形式，并可含有配制剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于非肠道给予的药用组合物包括活性剂在水溶性形式中的水溶液剂。另外，本发明的肽拟似物化合物的混悬剂可作为合适的油性注射混悬剂制备。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油类或合成的脂肪酸酯。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂的粘度的物质。任选地，混悬剂也可含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度并允许制备高浓度溶液的物质。或者，本发明的组合物可以粉剂形式存在，用于在使用之前用合适的媒介物例如无菌的无热原水构成。
本发明的肽拟似物化合物也可以直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠配制，例如含有常规栓剂基质。除了先前描述的剂型，化合物也可配制为储库制剂。这种长效剂型可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此，例如，组合物可用合适的聚合物或疏水性材料(例如作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制。
作为另外的实施方案，本发明包括包含一种或多种化合物或组合物，以便利于其用于实施本发明方法的方式包装的试剂盒。在一个简单的实施方案中，试剂盒包括本文描述的用于方法实施的化合物或组合物(例如组合物包含本发明的肽拟似物化合物和任选的第二种治疗剂)，其包装于容器例如密封瓶或容器中，具有粘贴于容器或包含在试剂盒中的标签，所述标签描述化合物或组合物实施本发明方法的用途。优选地，所述化合物或组合物以单位剂型包装。试剂盒还可包含适合于根据打算的给药途径给予组合物的装置。
根据本发明的重要特征，肽拟似物化合物作为WDR5与其结合配偶体相互作用的抑制剂被合成和评价。例如，本发明的化合物通常具有小于100 μΜ、小于50 μΜ、小于10 μΜ和小于1 μΜ的对WDR5的结合亲和力(IC50)。
程序和实施例
用于分析鉴定的荧光标记的肽
定量FP基试验对于准确评价肽拟似物化合物的结合亲和力是重要的。最初，使用具有两个不同连接子(linkers)的WIN序列的两种5-羧基荧光素(5-FAM)标记的示踪剂(WIN-FAM-1和WIN-FAM-2)被设计和合成，如在表7中显示的那样。发现这两种示踪剂在WDR5饱和试验中具有类似的Kd值和动态范围(表7和图1)。WIN-FAM-1、WIN-FAM-2、10mer-Thr-FAM和10mer-Alc-FAM分别用WDR5滴定。
表7. 荧光标记的示踪剂与WDR5蛋白的结合亲和力.
Figure 376989DEST_PATH_IMAGE044
Figure DEST_PATH_IMAGE045
*βΑ=β丙氨酸 **Ahx=6-氨基己酸
为了以100 μl分析缓冲液(0.1 M磷酸盐, 25 mM KC1, 0.01% Triton, pH 6.5)稀释WDR5 (残基23-334) (2.2-0 μl)，加入20 μl在分析缓冲液中的固定浓度的示踪剂，随后加入5 μl DMSO，得到125 μl的总体积。每个试验有两个对照组，即空白组(不含蛋白和示踪剂)和仅有示踪剂组(不含蛋白)。在室温下，于振动器上温育培养板以达到平衡，并在3小时时间点测量mP值。
本发明的另一方面为发展基于荧光偏振(FP)的竞争性结合测定。选择10mer-Thr-FAM作为竞争性结合测定的示踪剂。首先，评价在竞争性结合测定中产生总荧光强度100000需要的10mer-Thr-FAM的最小浓度。这在0.6 nM或者更高的浓度下实现，这个浓度被选作用于测定条件的进一步评价的示踪剂浓度。其次，在不同时间点测量millipolarization (mP)值以测定平衡持续时间和稳定性。在2小时时达到示踪剂和蛋白之间的平衡并稳定24小时以上(图2)。
较高的蛋白浓度可增加测定的动态范围(ΔmP)，但是为了保持检测灵敏度，蛋白浓度不应超过饱和曲线的线性范围(31)。因此，研究用于竞争性测定的最佳蛋白浓度。评价在竞争性结合测定中含有0.6 nM 10mer-Thr-FAM的WDR5 (2、3和4 nM)，并且测定Ac-10mer在这些测定条件下的结合亲和力。尽管对于这3种蛋白浓度得到非常类似的IC50值，当蛋白浓度从2 nM增加至4 nM时，动态范围从31增加至40 mP。因此，4 nM被选作最佳WDR5蛋白浓度和0.6 nM的10mer-Thr-FAM示踪剂在竞争性结合测定中用于测定在表2-4中显示的所有肽的IC50值。
本发明的另一方面为开发研究WDR5与其结合配偶体(包括但不限于MLL和H3蛋白)相互作用的作用，以及WDR5在其细胞功能(包括但不限于H3K4甲基化、Hox基因的表达和骨骼发育)的作用的工具。这些工具可为通式(I)的肽拟似物或如在表2-4中显示的衍生于H3和MLL序列的肽。
化学
缩写：
OtBu－叔丁氧化物；Trt-三苯甲基；Boc-叔丁氧基羰基；Mtt-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑啉酮溴化物；Pbf－3-苯基-苯并呋喃酮；HOBt－1-羟基苯并三唑；HBTU－N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)-亚甲基]-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物；DIC－Ν,Ν’-二异丙基碳二亚胺；HOAt－7-氮杂-羟基苯并三唑；DMF－二甲基甲酰胺；TFA－三氟乙酸；DTT－二硫苏糖醇；TIS－三异丙基硅烷；Fmoc－9-芴基甲氧基羰基；DIEA－二异丙基乙胺；DCM－二氯甲烷；THF－四氢呋喃；HATU－2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐甲铵；min－分钟；h－小时；eq－当量；ml－毫升；MeOH－甲醇；IPTG－异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷；KCl－氯化钾；HEPES－(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；PMSF－苯甲基磺酰氟；DMSO－二甲基亚砜。
固相肽合成
肽手工或用ABI 433肽合成仪使用Fmoc化学进行合成。Rink酰胺树脂用作固相支持体。为了避免副反应，如下保护氨基酸残基：Glu (OtBu)、His (Trt)、Lys (Boc或Mtt)、Gln (Trt)、Arg (Pbf)、Ser (OtBu)、Thr (OtBu)、HOBt/HBTU或DIC/HOAt用作偶联剂。在DMF中的HCOOH/DIC/HOAt用于珠上甲酰化，其中反应使用没有施加真空的旋转蒸发仪，在室温下旋转过夜的烧瓶中进行。所有的肽使用TFA:DTT:TIS:H2O (17.5 ml:0.5 g:0.5 ml:1 ml)裂解合剂(cocktail)自树脂裂解，这也导致去除保护基。蒸发裂解溶液，并用乙醚沉淀粗产物，随后使用C18反相柱(Waters, SUNFIRE? Prep C18, 19 x 150 mm, 5 μm)进行HPLC纯化。所有纯化的最终肽经分析型RP-HPLC (Waters, SUNFIRE? C18, 4.6 x 150 mm, 5 μm)分析纯度，并如在表8中概述的那样经电喷雾电离质谱(ESI-MS)测定肽的表征。
表8. 合成肽的表征数据
C-末端修饰的肽的合成.
具有C-末端-COOH基团的相应的肽中间体使用Fmoc-固相化学和2-氯三苯甲基氯树脂用作固相支持体进行合成。首先在DCM中和在3当量DIEA存在下加载残余物(3当量)经3小时过夜。然后，用Fmoc化学实施经典的链延长。通过用在DCM中的4 ml的1% TFA处理(3 x 10分钟)自树脂裂解羧酸中间体。蒸发滤液，并使用C18反相柱经HPLC纯化。把溶解于10 ml 的THF中的-COOH中间体(0.2 mmol)与3当量HATU、3当量HOAt、5当量DIEA和3当量相应的胺混合。反应混合物在室温下搅拌24小时，蒸发溶剂。并经HPLC纯化粗产物。通过用裂解合剂处理自精氨酸去除Pbf保护基，随后经HPLC纯化。
Δ2c的合成
把Ac-AR(Pbf)A-COOH中间体(0.2 mol)溶解于无水MeOH中，并加入0.5 mL的TFA。把反应混合物在室温下搅拌3天，蒸发溶剂，并通过用裂解合剂处理去除Pbf保护基，得到最终产物，其经HPLC纯化。
示踪剂的合成
如以上描述的那样用Mtt保护基基于C-末端赖氨酸残基上合成肽。通过用在DCM中的5 ml的1% TFA去除Mtt保护基(4 x 10分钟)，随后用1.5当量5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(5-FAM, SE)和4当量DIEA处理过夜，把荧光素标记物5-FAM引入到C-末端赖氨酸残基的侧链。如以上描述的那样自树脂裂解肽并经HPLC纯化。
结合测定
用于结合测定的蛋白表达和纯化
在Rosetta2(DE3) pLysS细胞(Novagen)自pET28-MHL载体表达N-末端His-标记的WDR5Δ23 (残基24-334)。细胞在30℃下于4L 2XTY中生长至OD600= 0.4-0.6，在16℃下用0.1 mM IPTG诱导16小时，并以20 mM HEPES pH 7.5, 500 mM KCl, 10% glycerol, 0.1 mg/ml PMSF, 0.05% NP40收获。细胞通过加入0.2 mg/ml鸡蛋白溶菌酶溶解，随后进行声处理，并通过在15000 rpm下离心30分钟澄清。树脂用40 ml细胞裂解缓冲液洗涤3次计10分钟。经3 x 15分钟用20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 10%甘油, 250 mM咪唑pH 7.5洗脱，自树脂洗脱His-WDR5Δ23。通过在2000 rpm下离心1分钟，通过0.45 μΜ膜(Millipore)注射器过滤，然后加载到两个使用AKTApurifier (GE Healthcare)的5 ml SP-Sepharose Hi-Trap柱上，澄清洗脱液。用20 mM HEPES pH 7.5, 含有0-1000 mM的KCl梯度的10%甘油洗脱部分，合并峰部分，并使用Amicon Ultra离心过滤器10000 MWCO (Amicon)浓缩为64 μΜ。把浓缩蛋白等分，并把样品在干冰上冷冻，且储存于-80℃下。
基于FP的试验
所有基于FP的试验在MICROFLUOR? 2 Black, “U”形底(“U”Bottom), 96-孔微量滴定板(ThermoSci.)中实施，并以在485 nm激发和在530 nm发射的微型板读数器(Tecan Ultra)作为mP单位测量FP。示踪剂的Kd和抑制剂的IC50值使用GraphPad Prism 4软件计算。
测定示踪剂的解离常数(Kd)的饱和结合实验
为了以100 μl分析缓冲液(0.1 M磷酸盐, 25 mM KCl, 0.01% Triton, pH 6.5)稀释WDR5Δ23 (2.2-0 μM)，加入20 μl在分析缓冲液中的固定浓度的示踪剂，随后加入5 μl DMSO，得到125 μl的总体积。每个试验有两个对照组，即空白组(不含蛋白和示踪剂)和仅有示踪剂组(不含蛋白)。在室温下，于振动器上温育板以达到平衡，并在3小时时间点测量mP值。
竞争性结合实验
使用该竞争性结合测定测量在研究中显示的合成肽的结合亲和力。把WDR5Δ23和示踪剂在120 μl分析缓冲液中的预先温育的多元溶液(complex solution)加入到受试化合物在5 μl DMSO中的稀释液中，得到最终浓度分别为4 nM和0.6 nM的WDR5Δ23和示踪剂。在每个板中包含3个对照组孔：空白组(不含蛋白和示踪剂)、100%抑制(仅有示踪剂)和0%抑制(仅有多元溶液)。把板在室温下伴随振动进行温育。在温育5小时后测量mP值，并使用先前描述的方程式计算K值(31)。
抑制MLL1核心复合体的组蛋白甲基转移酶活性
WDR5与MLL1的相互作用对MLL1核心复合体的H3K4甲基转移酶活性是关键的。阻断这种相互作用的抑制剂预计抑制核心复合体的催化活性。
开发使用重组MLL1、WDR5、RbBP5和Ash2L蛋白、H3-10mer (残基1-10)肽作为底物，和放射标记的辅因子3H-S-腺苷基蛋氨酸的体外功能测定。在室温下，以50 mM HEPES pH 7.8, 100 mM NaCl, 1.0 mM EDTA和5%甘油实施测定。每一个反应含有1.5 μCi的辅因子、3H-S-腺苷基蛋氨酸(Perkin Elmer)。以50 μΜ存在的组蛋白3肽(残基1-10)用作底物。以0.125-128 μΜ范围内的浓度加入抑制剂。通过以0.5 μΜ的最终浓度加入包含细菌表达的片段MLL3762-C’、WDR523-C’、RbBP5和Ash2LSPRY的MLL复合体引发反应，并在计数之前进行30分钟。作为阴性对照组，使用与非相互作用突变体WDR5D107A装配的0.5 μΜ MLL复合体进行测定。通过向组蛋白3肽底物中的赖氨酸残基中引入放射性，并用闪烁计数器测定，监测MLL1组蛋白甲基转移酶活性。使用该试验，评价在基于FP的试验中与WDR5具有不同范围的结合亲和力的多种化合物的抑制活性。结果显示在图3中。
在结合测定中强烈结合于WDR5的一种肽(ARAbu)，有效抑制MLL1组蛋白甲基转移酶活性，具有1.8 μΜ的IC50值。具有比ARAbu更弱的亲和力结合于WDR5的另一种肽VRA抑制MLL1组蛋白甲基转移酶活性，具有12 μΜ的IC50值。具有非常弱的亲和力结合于WDR5的第三种肽GRA在直到100 μΜ的浓度下不能抑制MLL1组蛋白甲基转移酶活性。这些功能数据显示，被设计结合于WDR5中的MLL结合位点的小化合物抑制核心复合体的MLL1组蛋白甲基转移酶活性。
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Claims (25)

1. 一种治疗其中抑制MLL1-WDR5相互作用提供益处的疾病或病症的方法，所述方法包括给予有需要的个体治疗有效量的肽拟似物化合物，所述肽拟似物化合物具有式I的结构：
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE002
其中R1选自H；取代或未取代的C1-9直链或分支烷基、C3-7环烷基；-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；-Y-R1’，其中Y为O或NX且R1’和X独立地选自H、取代或未取代的C1-9直链或分支烷基或C3-7环烷基、-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；
R2、R2’、R5和R5’独立地选自-H；C1-9取代或未取代的直链或分支烷基、C3-7环烷基；-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；-C(A)(B)(D)，其中A选自-H、-OH、-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-SH、-SCH3，并且B和D独立地选自H、取代或未取代的C1-6直链或分支烷基、C3-7环烷基、-(CH2)n-U，其中U为取代或未取代的苯基或杂芳基和n=0-6；或者
R2和R2’与它们连接的碳原子一起可形成C3-7碳环；或者
R5和R5’与它们连接的碳原子一起可形成C3-7碳环，或者R5和R5’不存在；
R3为H、或者取代或未取代的C1-6直链或分支烷基、或者C3-7环烷基；
R4为-H、C1-6烷基、-(CH2)n-E、芳基E或
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE004
，其中n=2-6和E选自-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-N+(CH3)3、-FL-C(=NJ)NKK’、-FL-C(=O)NKK’和-FL-C(=S)NKK’，其中F为C1-6烷基、N或CH，和L、J、K、K’独立地为H或-CH3；
R4’为-H、C1-6直链或分支烷基或C3-7环烷基，每一个为未取代的或被一个或多个卤素或OH取代；
R6选自-H、取代或未取代的C1-12直链或分支烷基、C3-7环烷基；-C(=O)N(M)Q，其中M和Q独立地选自-H、C1-12直链或分支烷基、C3-7环烷基、苯基、苄基或杂芳基，其中每一个任选地被-OH、-OCH3、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2或卤素中的一个或多个取代；和-(CH2)nCPP’P”，其中n= 0-6并且P、P’和P”独立地选自未取代或取代的苯基、苄基或杂芳基，或者M和Q与它们连接的氮原子一起可形成3-8元环；
或其药学上可接受的盐或水合物。
2. 权利要求1的方法，其中R1为H、C1-4烷基、C3-5环烷基、-NH(C1-3烷基)、芳基或-CH2芳基。
3. 权利要求1的方法，其中R1为CH3-、-CH(CH3)2、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-(CH2)3CH3、环丙基、环丁基、环戊基、苯基、苄基或-NH(CH3)。
4. 权利要求1的方法，其中R2和R2’独立地为H、C1-4烷基、-(CH2)1-2SH、C3-6环烷基、-CH2-杂芳基、-CH2芳基或-C1-4亚烷基OH，或者R2和R2’与它们连接的碳一起形成C4-C6螺环接结构。
5. 权利要求1的方法，其中R2和R2’独立地为H、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)3、-(CH2)2CH3、-C(CH3)2、-CH2SH、-CH2CH(CH3)2、环戊基、环己基、
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE006
、-CH2苯基、-CH2OH、-CH(OH)CH3，或者R2和R2’与它们连接的碳一起形成螺环接C3、C4、C5或C6部分。
6. 权利要求1的方法，其中R3为H。
7. 权利要求1的方法，其中R4为H、-(CH2)n-FH-C(=NJ)NKK’、芳基-FH-C(=NJ)NKK’、
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE008
、C1-4烷基或-(CH2)nNH2。
8. 权利要求1的方法，其中R4为H、
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE010
、
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE012
、-(CH2)3CH3、-(CH2)3-4NH2、
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE014
或。
9. 权利要求1的方法，其中R4’为H、-(CH2)nFH-C(=NJ)NKK’或芳基-FH-C(=NJ)NKK’。
10. 权利要求1的方法，其中R5和R5’独立地为不存在、H、C1-4烷基、-(CH2)1-3SH、-(CH2)1-3OH、C3-6环烷基、-CH2芳基、-CH(OH)CH3、-(CH2)1-3CO2H、任选地卤代取代的芳基，或者R5和R5’与它们连接的碳一起形成C3-C6螺环接部分。
11. 权利要求1的方法，其中R5和R5’独立地为不存在、H、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2SH、-CH2OH、-CH2CH(CH3)2、
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE018
、-CH(OH)CH3、-C(CH2)3、环己基、-(CH2)2CO2H、环戊基，或者R5和R5’与它们连接的碳一起形成C3、C4、C5或C6螺环接部分。
12. 权利要求1的方法，其中R6为-C(=O)N(M)(Q)，其中M和Q独立地为H、C1-8烷基、芳基、-(CH2)1-4芳基、任选地卤代取代的-CH(芳基)2、-CH(CH3)芳基或C3-6环烷基。
13. 权利要求1的方法，其中R6为-C(=O)N(M)(Q)，其中M和Q独立地为H、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)2、环己基、环戊基、苯基、
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE020
、、-CH(CH3)CH2CH3、
Figure 2011800398719100001DEST_PATH_IMAGE024
或。
14. 权利要求1的方法，其中肽拟似物化合物选自1A -1J、2A-2G、3A -3J、4A-4K、5A-5G、6A-6G、7A-7F、8A、8B、9A- 9J、10A-10N、11A-11N、12A及其任何混合物。
15. 权利要求1的方法，所述方法进一步包括给予治疗有效量的用于治疗疾病或病症的第二种治疗剂。
16. 权利要求15的方法，其中所述肽拟似物化合物和第二种治疗剂同时或分开给予。
17. 权利要求1的方法，其中所述疾病或病症为癌症。
18. 权利要求17的方法，所述方法进一步包括给予治疗有效量的一种或多种化学治疗剂、放射和免疫疗法。
19. 权利要求17的方法，其中癌症为血细胞恶性肿瘤。
20. 权利要求17的方法，其中所述血细胞恶性肿瘤选自淋巴系造血系统肿瘤、白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤；髓系造血系统肿瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病、早幼粒细胞性白血病、血细胞恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病、渗出性淋巴瘤、胸腺淋巴瘤、肺癌、小细胞癌、血源性癌症、急性B细胞型淋巴细胞性白血病、急性T细胞型淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性成单核细胞性白血病、急性成红白血细胞白血病、急性成巨核细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
21. 权利要求17的方法，其中所述癌症为实体肿瘤癌症。
22. 权利要求21的方法，其中所述实体肿瘤癌症为纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、间胶质瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
23. 一种组合物，其包含：(a) 具有式I结构的肽拟似物化合物或其药学上可接受的盐或水合物，(b) 用于治疗其中抑制MLL1-WDR5相互作用提供益处的疾病或病症的任选的第二种治疗剂；和(c) 赋形剂和/或药学上可接受的载体。
24. 权利要求23的组合物，所述组合物进一步包含第二种治疗剂。
25. 权利要求23的组合物，其中所述第二种治疗剂包括用于治疗癌症的化学治疗剂。
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