CN104473939B - xCT抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

一种xCT抑制剂的用途，它属于生物工程技术领域，特别涉及xCT抑制剂的用途，用于制备治疗活动性结核的药物；所述xCT抑制剂优选为柳氮磺胺吡啶。本发明xCT基因在结核病人中的表达水平明显高于潜伏感染以及健康人群的表达水平，因此xCT基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速；同时试验证明，xCT基因的特异抑制剂可以显著减轻结核菌感染的小鼠体内的细菌含量，因此其可作为治疗活动性结核的新靶点。

Description

xCT抑制剂的用途
技术领域:
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及xCT抑制剂的用途。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌(结核菌)感染引起的慢性传染病。由于缺乏有效疫苗，当前的结核病防治策略主要是早期发现，早期治疗。药物治疗不仅是降低结核病病死率的关键，而且是减少结核病播散的关键，因而是当前结核病防治实践中最有效的手段。我国目前使用世界卫生组织推荐的短程化疗方案，包括由一线抗痨药物异烟肼(INH)，利福平(RFP)，吡嗪酰胺(PZA)，链霉素(SM)，乙胺丁醇(EMB)等不同组合治疗。近年来，奎诺酮类被越来越多的应用在结核患者的治疗。尽管这些药物的应用挽救了超过2千万结核患者的生命，但当前结核病治疗药物显然不能满足患者和结核病防治的要求。由于结核菌耐药的发生，尤其是耐多药和广泛耐药的发生，使结核病防治面临着严峻的挑战。据统计，在我国结核病人中，耐多药发病率为8.32％，总计约为12万人，总数量仅次于印度位居世界第二位，广泛耐药发病率则为0.68％，总计大约为1万人，其危害远远超过艾滋病。因此，控制结核病亟需高效新型抗结核药物的研发。
xCT是一种具有12个跨膜结构域的转运蛋白质，通过形成二硫键与4Fhc相结合，共同组成谷氨酸/胱氨酸转运体(glutamate/cystineantiporter)又称为xc-系统，是1980年由Bannai和Kitamura在人成纤维细胞中首先发现的转运L-胱氨酸和L-谷氨酸的Na+非依赖性的转运系统。Xc-转运体是一种专一性、电中性的阴离子转运体。生理状态下细胞外的胱氨酸以阴离子形式被转运至细胞内，同时细胞内的谷氨酸被释放到细胞外，二者的比例为1:1。胱氨酸在细胞内迅速被还原成半胱氨酸,一部分参与胞内重要自由基清除剂谷胱甘肽的合成,另一部分则出胞氧化成胱氨酸,重新参与xc-系统循环。因此，细胞内的胱氨酸水平远远低于细胞外。xc-的活性可通过使用L-胱氨酸和L-谷氨酸作为底物来进行定量分析，并且这种转运过程是Cl-依赖性的和Na+非依赖性的[。由于谷氨酸、胱氨酸和xc-的亲和性相似，因此胱氨酸的摄取可被谷氨酸抑制，反过来也一样。
xc-转运体有两个主要功能。一方面它介导细胞摄取胱氨酸，这对维持细胞内GSH水平尤为重要，因为GSH是保护细胞免受氧化应激和其他化学物质损伤所必需的。另一方面，它可以维持细胞胱氨酸和半胱氨酸的氧化还原平衡。在细胞外的环境中，半胱氨酸迅速被氧化成胱氨酸，因此胱氨酸在循环中尤其在培养基中是主要的氨基酸形式，而细胞内则以半胱氨酸为主。进入细胞内的胱氨酸(cystine，CySS)被还原为半胱氨酸(cysteine，Cys)，参与蛋白质、假黑色素(pheomelanin)和还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成。在细胞内，GSH可被氧化为氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione.GSSG)。GSH/GSSG偶联体与CySS/Cys偶联体组成体内主要的氧化还原势(redoxstate)，参与活性氧素(reactiveoxygenspecies，ROS)生成、基因表达、细胞增殖、和细胞凋亡等的调节。
xCT在多种肿瘤中高表达，通过促进肿瘤生长和转移在肿瘤的发生发展中起着重要作用，临床上，靶向xCT的示踪剂在肝癌等肿瘤的PET－CT检查被证明具有很好的应用前景。相比之下，有关xCT在感染性疾病发生中的作用知之甚少，目前还没有关于xCT与结核病发生关系的文献报道。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是提供利用xCT作为活动性治疗的新靶点，可用于治疗干预活动性结核。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
本发明提供了一种xCT抑制剂的用途，用于制备治疗活动性结核的药物。
所述xCT抑制剂优选为柳氮磺胺吡啶。
本发明xCT基因在结核病人中的表达水平明显高于潜伏感染以及健康人群的表达水平，因此xCT基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速；同时试验证明，xCT基因的特异抑制剂可以显著减轻结核菌感染的小鼠体内的细菌含量，因此其可作为治疗活动性结核的新靶点。
附图说明：
图1是本发明实施例1的xCT基因在人外周血中差异表达的定量RT-PCR结果图。
图2是本发明实施例2的xCT敲除小鼠在感染结核菌后，与野生型小鼠肺部菌量的比较结果。
图3是本发明实施例2的xCT敲除小鼠在感染结核菌后，与野生型小鼠肺部病理情况的结果。
图4是本发明实施例2的利用SASP治疗结核小鼠后,与野生型小鼠肺部菌量的比较结果。
具体实施方式：
下面结合实施例和附图对本发明进行进一步描述：
实施例1
本实施例将人群分为三组：结核病患者、潜伏感染人群和健康人群(各20例)，通过检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中xCT基因mRNA变化，发现其在结核病患者中呈明显的上调表达趋势。
本实施例用定量RT-PCR方法检测每例xCT基因的表达变化。具体步骤如下：
步骤一：外周血单个核细胞(PBMC)悬液的制备
在离心管中加入淋巴细胞分离液(FreseniusKabiNOrgeAs:LYS3773)5ml；取上述确诊的结核病患者，潜伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝静脉血各2ml与等量1M的磷酸缓冲液(PBS)充分混匀得到混合液，用移液器将混合液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上，保持清晰的界面，2000转/分离心20分钟；用吸管吸取中间云雾层置入另一离心管后接着加入5倍体积的1MPBS，1500转/分离心10分钟洗涤细胞，弃上清，相同条件重复洗涤细胞一次，接着加入含小牛血清体积百分比为10％的的RPMI1640(Thermoscientific：SH30807.01b)1ml，重悬细胞，得到三组人群的各20例PBMC悬液；每例取20μl的PBMC悬液于血球计数板上，计数细胞浓度。
步骤二：RNA抽提
采用Qiagene公司的RNeasyMiniKit(货号74106)对上述得到的三组人群的各20例PBMC悬液进行RNA抽提。具体操作是：取上述含1×106个细胞的PBMC悬液于去DNA酶和RNA酶的离心管中，3000转/分离心10分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入350μlBufferRLT，充分混匀裂解；加入250μl无水乙醇，混匀，把液体转移到RNeasy柱子中，8,000g离心30秒，弃废液；加入350μlBufferRW1以8,000g离心30秒，弃废液；加入80μlDNase溶液(10μlDNase+70μlBufferRDD)，柱上消化15min，8,000g离心30秒，弃废液；加入350μlBufferRW1，8,000g离心30秒，弃废液；加入500μlBufferRPE，8,000g离心30秒，弃废液；空甩，8,000g离心1分钟；把柱子转移到一个去DNA酶和RNA酶的1.5ml离心管，加入40μl无RNase的ddH2O，10,000g离心1分钟，收集三组人群的各20例的RNA于-80℃保存、待用。
步骤三：反转录
采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047)，取步骤二得到的RNA0.5μg进行反转录，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。
分步如下:
(1)基因组DNA的去除反应
表1
试剂 使用量
5×gDNA Eraser缓冲液 2μl
gDNA Eraser 1μl
总RNA 0.5μg
Rnase Free ddH2O 补至10μl
按照表1配好反应体系后，在42℃温浴2min，于4℃下保存。
(2)反转录反应
反应体系配制均在冰上进行，具体体系如下：
表2
试剂 使用量
5×Prime Script缓冲液2 4μl
PrimeScript RT酶混合物I 1μl
RT引物混合物 1μl
去处基因组DNA的RNA反应液 10μg
Rnase Free ddH2O 补至20μl
按照表2配好反应体系后，在37℃温浴15min，85℃放置5秒，反应完放4℃保存。
步骤四：荧光定量PCR反应
模板：上述反转录产物作为荧光定量PCR反应的模板，模板用量为1μl。利用xCT基因(NM_014331.3)和GADPH基因(NM_002046.4)序列，用primer5软件设计两对引物。
引物：由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，设计如下：
表3
PCR反应的体系：
PCR反应采用TAKARA公司的PremixExTaqTMII(货号：DRR081D)，此产品能够抑制非特异性反应，在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和改良后的HotStart法用DNA聚合酶TaKaRaExTaqHS组合使用，可以进行再现性好、可信度高的RealTimePCR解析。
表4
按照上表配制荧光定量的反应液，并使用仪器为ABI7500实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR反应。
实时定量PCR反应采用两步法PCR，扩增标准程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃30秒，40个循环。
根据实时定量PCR的结果，用ABI7500softwarev2.0.6对结果进行处理分析，以GADPH基因为内参基因，利用2-ΔΔCT的方法计算出结核患者和潜伏感染人群相对于健康人群的表达量，结果如图1所示，其中横坐标表示不同的人群，纵坐标表示相对表达量(RQ)，纵坐标越大表明其表达水平越高，结果表明，xCT基因在结核病人中的表达水平明显高于潜伏感染以及健康人群的表达水平(见图1，其中1个星号代表组间具有显著性差异，下同)，差异显著(P<0.05)。在图1中，“TB”指活动性结核感染者，“LTBI”指潜伏性结核感染者，“HC”指健康对照。
根据上述实验结果，表明xCT基因在结核患者中表达显著增高。
实施例2
本实施例利用小鼠模型，将xCT基因从小鼠中敲除，成为活动基因缺陷型小鼠。利用结核分枝杆菌(H37Rv)(来自美国菌种保藏中心ATCC)对上述活动基因缺陷型小鼠进行感染，发现活动基因缺陷型小鼠肺部的细菌载量降低，病理变轻；同时利用xCT基因的特异抑制剂SASP对结核菌感染的小鼠进行治疗，发现服用了SASP之后，可以降低小鼠肺部中的细菌载量。其中SASP全名为柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)，产品编号S0883，CAS号为
599-79-1，由Sigmaaldrich公司生产。
本实施例具体包括如下步骤：
步骤一：小鼠的感染
把小鼠分为三组：A组，B组和C组(每组6只)。其中A组为xCT基因缺陷型小鼠；B组为野生型小鼠；C组为野生型小鼠，后采用上述SASP对其进行治疗。利用结核分枝杆菌(H37Rv)对A组的xCT基因缺陷型小鼠、B组的野生型小鼠和C组的野生型小鼠进行感染，感染的剂量为200CFU/只。感染后C组的野生型小鼠采用SASP对其进行治疗，每2天给药一次，每次给药剂量为4mg/只。
步骤二：取组织
在感染后15天和30天，处死小鼠，取出肺部组织，用于做病理切片和细菌载量计数，相关步骤如下：
1、病理切片：
取小鼠肺部组织，经10％甲醛固定24小时，常规石蜡包埋、切片、HE染色检查肺部的病理情况。
2、细菌计数：
处死小鼠后，在无菌条件下，取肺部组织匀浆，并且稀释不同梯度，接种于Middlebrook7H11琼脂培养基，37℃培养3-4周，观察并计数菌落。
在感染后的15天和30天处死小鼠，取肺部组织进行涂板以及病理检测。CFU计数显示，在结核分枝杆菌(H37Rv)感染的野生型小鼠(即B组)的肺部中，其细菌载量显著高于xCT基因敲除型小鼠，说明xCT的敲除可以抑制结核菌在小鼠体内的增殖(图2，图中WT代表B组的野生型小鼠，xCT-/-代表A组的xCT基因缺陷型小鼠，下同；纵坐标表示小鼠肺部结核菌数的对数值)。病理结果也显示，在结核分枝杆菌(H37Rv)感染的野生型小鼠(即B组)的肺中，出现的大量的细胞浸润，而敲除型小鼠(即A组)的肺组织并没有发现明显的炎症病变，而前者(即B组)病变的组织面积显著高于后者(即A组)病变的的面积(图3)，利用xCT基因的特异抑制剂SASP注射结核菌感染的小鼠(即C组)，结果发现注射了SASP之后，小鼠的肺部细菌载量比野生型小鼠(B组)的显著减少(图4，图中Mock代表B组的野生型小鼠，SASP代表C组的经xCT基因的特异抑制剂SASP注射结核菌感染的小鼠；纵坐标表示小鼠肺部结核菌数)，表明用了xCT基因的特异抑制剂之后，可以显著减轻小鼠体内的细菌含量。

Claims (1)

1.柳氮磺胺吡啶的用途，其特征在于，用于制备治疗活动性结核的药物。
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CN102719521A (zh) * 2011-03-31 2012-10-10 上海市肿瘤研究所 胱氨酸/谷氨酸反向转体xCT抑制剂在肝癌治疗中的应用

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