CN110354260B - 免疫增强剂、药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开免疫增强剂、药物组合物及其应用。本发明的免疫增强剂包含(a)IL12p70或其功能性片段，或它们的编码核酸；(b)能够抑制配体与PD‑1结合的PD‑1重组蛋白或其编码核酸；和(c)能够抑制TGF‑β与受体结合的融合蛋白或其编码核酸。本发明免疫增强剂能够显著增强DC细胞致敏T细胞的效果，可以诱导出更强比例的IFN‑r和TNF‑a阳性的CD4以及CD8 T淋巴细胞，引起更强的抗原特异的抗肿瘤免疫应答。

Description

免疫增强剂、药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及医药制品，具体涉及免疫增强剂、药物组合物及其应用。

背景技术

机体的免疫反应首先是由抗原递呈细胞(APC)捕获抗原，经过加工和处理后将抗原信息递呈给淋巴细胞，继而引发一系列的特异性免疫应答。树突状细胞(DC)是目前认为的功能最强的APC，其最大的特点是能够刺激初始型T细胞(

T cells)的增殖和活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节。在机体抗肿瘤免疫中，由T细胞介导的细胞免疫发挥着重要作用。

研究发现，肿瘤患者存在DC数量减少及功能缺陷的特点，肿瘤组织及其周围浸润DC的数量、功能与肿瘤的发生、发展、转移、预后有着密切的关系。DC密集浸润的肿瘤分化程度高，预后较好；而DC轻度浸润的肿瘤常伴有分化程度低和恶性进展。肿瘤细胞具有较高水平的Fas表达，能诱导FasL表达的淋巴细胞凋亡，并能分泌TGF-β、IL-10等免疫抑制性细胞因子，导致抗原提呈能力下降，从而逃避免疫攻击。

近年来，已经清楚了免疫系统确实识别肿瘤抗原，但是尽管存在肿瘤抗原，T细胞确保持静止状态。基于此现象，有这样的假说：患者体内的抗原呈递细胞，不能正确识别肿瘤抗原，将之呈递给T淋巴细胞，引起肿瘤特异的免疫应答。近年来，如何增加抗原呈递细胞的数量，提高抗原呈递细胞，特别是DC细胞摄取、转运、呈递抗原、刺激T细胞的能力，是目前肿瘤免疫研究中的一个重点。

近年来，有大量的使用负载了抗原的DC疫苗治疗肿瘤的报道，从目前报道的数据来看，DC疫苗似乎代表了一种用于改善的肿瘤免疫治疗的新的非常有潜力的方法。然而，单独的DC疫苗的使用通常不能导致所期待的免疫治疗效果的改善，不能得到令人满意的临床效果。

PD-1在活化的T细胞、B细胞以及在参与调解免疫激活与耐受平衡的单核细胞上表达。其主要作用是在针对感染的炎性应答中限制炎性周围的T细胞活性和限制自身免疫性。该调节的基础是PD-1分子的配体PD-L1和PD-L2相应多种促炎性因子被上调，并且可以结合炎症组织中活化T细胞上的PD-1分子，抑制T细胞功能，从而限制免疫应答。

另外，发现在多种不同的肿瘤中，PD-L1表达通常上调，其通过与肿瘤浸润的淋巴细胞上面的PD-1结合而抑制局部的抗肿瘤T细胞应答，从而导致免疫逃逸的发生。研究发现在宫颈癌和肝癌中，有近半数以上的肿瘤浸润CD8阳性T细胞表达PD-1分子，其与肿瘤细胞表面表达的PD-L1分子结合后，可以导致T细胞的耗竭以及凋亡。

最近，已经有数个靶向PD-1受体及其配体PD-L1的免疫检验点抑制剂药物获批上市。这些免疫检验点抑制剂在多种肿瘤如黑色素瘤、肾癌、结直肠癌、非小细胞肺癌和肝癌等患者中都有比较好的临床疗效。然而，目前的多个临床研究数据表明，仅仅使用PD-1/PD-L1抗体临床应答率较低，如在肝癌患者中，仅仅15％左右的患者能够获得临床受益。在更近的研究中，已经有在临床模型中评价了与PD-1途径免疫检验点抑制剂组合的抗肿瘤效果。

例如，研究报道了使用PD-1配体PD-L1和PD-L2的siRNA转染到树突细胞(DC)里面抑制PD-L1和PD-L2的表达，并用次要的组织相容性抗原(MiHA)负载树突细胞制备成树突细胞疫苗。这些负载有MiHA的PD-L1/L2沉默的DC表现出了高效的激活以及扩增MiHA特异性T细胞功能：能够显著地增强MiHA特异性的CD8+T细胞的功能；与未对PD-L1/L2沉默的负载MiHA的DC相比，在一周的体外刺激过程中，其扩增出来的MiHA特异性的CD8+T细胞增加了14.4倍，体外刺激两周后，其扩增出来的T细胞增加了20倍(A.B.van der Waart等，2015年，Cancer Immunol Immunother(2015)64:645–654)。

类似地，以靶向PD-L1/L2的siRNA-脂-纳米颗粒复合物沉默DC细胞的PD-L表达，再给DC负载抗原mRNA或者多肽制备成的树突细胞疫苗，能够有效地增加来自异体干细胞移植肿瘤患者的辅助性T细胞(Th1和Th2细胞)以及抗原特异性CD8+T细胞应答(MiekeW.H.Roeven等，J Immunother2015；38:145–154)。

另一项研究检验了肝脏中PD-L1沉默的浦肯野氏细胞(KC)对自然杀伤细胞(NK细胞)和CD8+T细胞的影响。数据表明，在感染了病毒的肝脏中，PD-L1沉默的浦肯野氏细胞(KC)能够增加NK细胞的功能和聚集；同时还能增强CD8+T细胞在病毒感染组织的集聚、对病毒感染细胞的杀伤能力以及细胞增殖、CD8+T细胞介导的病毒清除能力以及记忆(Joseph SDolina等，Molecular Therapy–Nucleic Acids(2013)2,e72)。

另一份检验PD-L1抑制对肿瘤生长的影响的报道表明，系统性使用抗PD-L1抗体加黑素瘤肽负载的树突细胞(DC)能够产生更多数量的黑素瘤肽特异性的CD8+T细胞，但是该组合并不足以延缓已存在的B16黑素瘤的生长。尽管另外的机体辐照延缓肿瘤生长，但是抗原-特异性的CD8+T细胞的进一步的过继转移是实现所治疗的小鼠的肿瘤消退和长期存活所需要的(Pilon-Thomas等2010.J Immunol(免疫学杂志)1；184(7)：3442-9)。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明在深入研究后发现通过组合三种不同的成分得到的调节剂可协同增强或提高抗原的免疫力。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供免疫增强剂，其包含下述(a)至(c)三种成分：

(a)IL12p70或其功能性片段，或它们的编码核酸；

(b)能够抑制配体与PD-1结合的PD-1重组蛋白或其编码核酸；和

(c)能够抑制TGF-β与受体结合的融合蛋白或其编码核酸。

在某些实施方案中，所述成分(a)中的功能性片段是指具有至少下述功能(1)至(3)之一的源自IL12p70的截短的片段：

(1)促进CD4+Th0细胞分化为Th1细胞；

(2)诱导CTL和NK细胞的细胞毒活性，并促进其分泌IFN-γ、TNF-α和/或GM-CSF细胞因子；

(3)促进NK细胞和IL-2rα、TNF受体及CD56分子的表达。

在某些实施方案中，所述PD-1重组蛋白包含PD-1蛋白胞外结构域。

在某些实施方案中，所述PD-1重组蛋白是PD-1蛋白胞外结构域和免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白。

在某些实施方案中，所述成分(c)为含TGFBR3胞外结构域的重组蛋白或其编码核酸。

在某些实施方案中，所述成分(c)为可溶性TGFBR3胞外结构域与免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白或其编码核酸。

本发明的第二方面，提供药物组合物，其包含第一方面的免疫增强剂，和抗原或编码所述抗原的核酸。

本发明的第三方面，提供提高淋巴细胞中TNF-a和/或IFN-r含量的方法，其包括使本发明的免疫增强剂，或本发明的药物组合物作用于淋巴细胞的步骤。

本发明的第四方面，提供一种提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法，其包括使本发明的免疫增强剂，或本发明的药物组合物作用于淋巴细胞群的步骤。

本发明的第五方面，提供另一种提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法，其包括以下步骤：

1)将试剂引入表达细胞得到转染细胞的步骤；和

2)使所述转染细胞与所述淋巴细胞群共培养，或使所述转染细胞的至少部分分泌物与所述淋巴细胞群接触的步骤；

其中所述试剂包含：(a’)IL12p70或其功能性片段的编码核酸；(b’)能够抑制配体与PD-1结合的PD-1重组蛋白的编码核酸；和(c’)含TGFBR3胞外结构域的重组蛋白的编码核酸。

相对现有的技术，本发明免疫增强剂能够显著增强DC细胞致敏T细胞的效果。在体外致敏实验中，可以诱导出更强比例的IFN-r和TNF-a阳性的CD4以及CD8T淋巴细胞，引起更强的抗原特异的抗肿瘤免疫应答。

附图说明

图1sPD-1-Fc、IL12p70以及sTGFBR3-Fc的表达水平。其中每组柱中，左侧的柱为mDC对照，右侧的柱为转染了本发明组合物mRNA的mDC细胞。

图2转染编码融合蛋白的核酸后DC的表型(CD80、CD83以及CD86)。其中每组柱中，左侧的柱为mDC对照，右侧的柱为转染了本发明组合物的mDC细胞。

图3.CD4细胞的应答图。

图4CD8细胞的应答图。

图5CD4T细胞应答统计结果。其中每组柱中，从左侧至右侧分别为CD8IFN-r+，CD8TNF-a+,IFN-r+，CD8TNF-a+。

图6CD8T细胞应答统计结果。其中每组柱中，从左侧至右侧分别为CD8IFN-r+，CD8TNF-a+,IFN-r+，CD8TNF-a+。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本发明中，术语“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位并且可以被主要组织相容性复合体(MHC)呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。

本发明中，术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(即DNA)和核糖核酸(即RNA)。为了增强宿主细胞的适应性，优选对核酸中的至少部分密码子进行偏好性改造。在RNA的情况下，为了防止RNA的不稳定性和多种途径的降解，根据已知的RNA多种天然降解途径，可以对核酸分子进行多种优化。例如，末端结构对mRNA的稳定是至关重要的。比如，在天然存在的mRNA的5’端，存在有修饰的鸟苷核苷酸，称之为5’帽子结构，并且3’端有一段长约200～300个碱基的腺苷核苷酸(即多聚A尾巴)结构，5’和3’端的UTR序列，比如人的beta-球蛋白的UTR序列。

[免疫增强剂]

本发明的第一方面，提供免疫增强剂，其至少包括下述(a)至(c)三种成分：

(a)IL12p70或其功能性片段，或它们的编码核酸；

(b)能够抑制配体与PD-1结合的PD-1重组蛋白或其编码核酸；和

(c)能够抑制TGF-β与受体结合的融合蛋白或其编码核酸。

本发明发现当组合使用上述三种成分时，其免疫增强效果远大于单独每一种成分的增强效果，三者之间表现为协同效果。本发明中，对于(a)、(b)和(c)之间的含量或比例不特别限定，本领域技术人员可根据三种成分的类型以及受试者的情况而自由的确定。当(a)、(b)和(c)三者均为蛋白时，三者的摩尔比一般为(0.5-1.5):(0.5-1.5):(0.5-1.5)，优选1:1:1。本发明的免疫增强剂的形式不特别限定，可以是(a)、(b)和(c)三种蛋白的粉末的混合物，还可以提供为含有(a)、(b)和(c)三种核酸的细胞形式。

成分(a)

本发明的成分(a)为IL12p70或其功能性片段，或者它们的编码核酸。成分(a)的来源不特定，一般为哺乳动物来源，优选为人来源。成分(a)可为天然来源，或在天然来源的基础上经本领域技术人员优化以增强其固有功能或额外增加除固有功能之外的新功能而得到的成分。在体内IL12p70由抗原提呈细胞和B细胞产生，是异源二聚体形式的前炎症细胞因子，并以这种形式分泌到细胞外。

在某些实施方案中，本发明的成分(a)为IL12p70。本文中，IL12p70可以是p40和p35两个亚基结合形成的二聚体，也可以是p40和p35两个亚基融合形成的具有功能的融合蛋白。优选地，本发明的IL12p70为由SEQ ID NO:1所示序列的核酸编码得到的蛋白。

在某些实施方案中，本发明的成分(a)为IL12p70的功能性片段。本文中功能性片段是指源自IL12p70的截短的多肽片段，且该多肽片段具有IL12p70的基本功能。基本功能包括下述(1)至(3)所述功能中的至少一种：(1)促进CD4+Th0细胞分化为Th1细胞；(2)诱导CTL和NK细胞的细胞毒活性，并促进其分泌IFN-γ、TNF-α和/或GM-CSF细胞因子；(3)促进NK细胞活性和促进IL-2rα、TNF受体及CD56分子的表达，从而增强对肿瘤细胞的ADCC效应。优选地，本发明的功能性片段具有上述(1)至(3)全部功能。本文中，截短的多肽片段包括从全长蛋白的序列两端之一或两端分别截短得到的多肽片段，也包括从全长蛋白的序列中间部分截短后得到的多肽片段。

在某些实施方案中，本发明的成分(a)为IL12p70或其功能性片段的编码核酸。本发明的核酸可以是RNA，也可以是DNA。优选为mRNA。优选地，本发明的成分(a)为具有SEQ IDNO:1所示序列的核酸。

成分(b)

本发明的成分(b)是指能够抑制配体与PD-1结合的PD-1重组蛋白或其编码核酸。成分(b)的来源不特定，一般为哺乳动物来源，优选为人来源。成分(b)可为天然来源，或在天然来源的基础上经本领域技术人员优化以增强其固有功能或额外增加除固有功能之外的新功能而得到的成分。

本发明使用PD-1重组蛋白或编码核酸来抑制PD-1的配体(例如，PD-L1和/或PD-L2)与PD-1的结合，进而解除对T细胞功能的抑制，延长T细胞的存活时间。

在某些实施方案中，本发明的成分(b)为包含PD-1蛋白胞外结构域的重组蛋白或其编码核酸。优选地，成分(b)为PD-1蛋白胞外结构域和免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白(缩写sPD-1-Fc)，该融合蛋白具有延长的半衰期，更为稳定。Fc片段至少包含SEQ ID NO:4所示的序列，优选地，Fc片段具有SEQ ID NO:5所示的序列，更优选地，Fc片段由SEQ ID NO:5所示的序列组成。示例性成分(b)的实例为具有SEQ ID NO：2所示序列的核酸或其编码的蛋白。

成分(c)

本发明的成分(c)是能够抑制TGF-β与受体结合的融合蛋白或其编码核酸。成分(c)的来源不特定，一般为哺乳动物来源，优选为人来源。成分(c)可为天然来源，或在天然来源的基础上经本领域技术人员优化以增强其固有功能或额外增加除固有功能之外的新功能而得到的成分。

转化生长因子-β(TGF-β)是一种多功能的细胞因子，可以影响细胞的生长、分化、凋亡等。此外，TGF-β还有重要的免疫调节作用。TGF-β可以有效的抑制T细胞功能和DC细胞的抗原呈递能力。最近的研究已经阐明了TGF-β在上调浆细胞样DC(pDC)免疫调节酶吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达中的直接作用，并导致长期的T细胞耐受。通过催化必需氨基酸色氨酸的降解，IDO抑制效应T细胞的活性和促进调节性T细胞(Treg)分化和活化。

转化生长因子-β(TGF-β)通过结合转化生长因子-β受体(TGFBR)复合物而进行信号转导。根据分子结构和功能特征的不同，TGFBR家族包括I型受体(TGFBR1)、II型受体(TGFBR2)和III型受体(TGFBR3)。TGFBR1/2均属于跨膜型受体丝氨酸/苏氨酸激酶家族，胞内均含有丝氨酸/苏氨酸激酶区。转化生长因子-β与TGFBR1/2异源二聚体结合后，活化下游信号分子，进而激活信号传导。TGFBR3胞内段不含有激酶活性区，不直接参与信号传导，主要是调节TGF-β与信号受体的结合，又被称为协同受体。

III型转化因子-β受体(TGFBR3)是典型的TGF-β信号传递途径的共同受体，参与介导SMAD依赖的和SMAD非依赖的下游信号途径。研究发现在许多肿瘤的早期阶段，比如乳腺癌中，TGFBR3的表达水平与患者癌旁正常组织比有明显的下调。有数据显示，在一些肿瘤模型中，TGFBR3抑制细胞的迁移和侵袭，表明TGFBR3具有抑制肿瘤进展和转移的功能。

本发明发现含TGFBR3胞外结构域的重组蛋白与成分(a)、(b)组合具有优异的免疫调节，特别是增强作用。因此，本发明优选使用含TGFBR3胞外结构域的重组蛋白或其编码核酸作为成分(c)。优选地，成分(c)为可溶性TGFBR3胞外结构域与免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白或其编码核酸。示例性成分(c)的实例为具有SEQ ID NO:3所示序列的核酸或由其编码的蛋白。

[药物组合物]

本发明的第二方面，提供药物组合物(本文有时也称为“本发明的组合物”)，其能够为有需要的受试者提供一种或多种抗原(优选免疫原)用于减轻、缓解、延缓或治愈受试者所患病况或病症的物质。与单独提供抗原的药物相比，本发明的药物组合物具有增强、提高或加强的免疫能力。本发明的药物组合物至少包含免疫增强剂和抗原或编码该抗原的核酸。可选地，还可包含其他成分，例如药物学可接受载体。

本发明的药物组合物中所包含的免疫增强剂，已在第一方面进行了详细说明，在此不再赘述。下面详细说明本发明的抗原。

本发明的抗原可以是编码至少一种抗原开放阅读框的核酸。本发明的核酸可以是一个，也可以是多个。在一个实施方案中，抗原核酸分子编码细菌、病毒、真菌、或者其他病原体的具有免疫原性的肽段。其中病原体包括但不限于人的肝炎病毒包括HAV、HBV、HCV、巨细胞病毒CMV、人免疫缺陷病毒HIV、EB病毒、登革热病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人嗜T淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)、流行性感冒、牛白血病病毒(BLV)、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、天花、带状疱疹、炭疽、破伤风、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘、脑膜炎球菌、炭疽、脑炎、肺炎球菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、呼吸道合胞病毒、副流感、腺病毒、水痘、黄病毒、结核分枝杆菌和疟疾等。

在一个实施方案中，抗原核酸分子编码肿瘤抗原。在该情形中，肿瘤抗原可以表达于肿瘤细胞的表面、细胞质或者细胞核等位置。肿瘤抗原也可以选自与正常细胞相比在肿瘤细胞中过表达的蛋白。肿瘤抗原可以进一步分为肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异抗原(TSA)。TAA是一类在肿瘤细胞和正常细胞都存在的抗原分子，其实例包括：胚胎性蛋白、糖蛋白抗原，鳞状细胞抗原等。TAA并非肿瘤细胞所特有，正常细胞也可以微量合成，而在肿瘤细胞增殖时高度表达。TSA指仅表达在肿瘤细胞表面而不存在于正常细胞的新抗原。这类抗原可存在于不同个体同一组织类型的肿瘤中，如人恶性黑色素瘤基因编码的黑色素瘤特异性抗原，可存在于不同个体的黑色素瘤细胞，但正常的黑色素细胞不表达。TSA也可以为不同组织学类型的肿瘤所共有，如突变的Ras基因产物可常见于肺癌、消化道肿瘤等，但由于其氨基酸序列与正常的原癌基因Ras的表达产物不一致，可以被机体的免疫系统识别，激发机体的免疫反应。通常，这类由突变产生的抗原，称之为新抗原(neoantigen)。这些抗原都能够被细胞毒性T淋巴细胞所识别，并且呈递该抗原的细胞可以被T淋巴细胞所杀伤。

在某些实施方案中，本发明的抗原为至少一种多肽。此处的多肽包含至少一个抗原表位。本发明的抗原优选肿瘤抗原，其可选自由下述组成的组中的至少一种：TDO2、MAGEC1、HMOX1、WT1、LY6H、AIM2、IDO1、CHI3L1、IL13RA2、LCK、GFAP、KIF20A、CNTN2、MUC16、PEG10、TNC、SOX11、IGF2BP3、S100A8、AKAP4、TTK、CHI3L2、PTHLH、CDC45、PMEL、TOP2A、PTTG1、NRCAM、HMMR、MUC4、LY6K、SOX10、FOSL1、PRAME、FOLR1、BIRC5、KIF2C、ITGAV、ART4、PROM1、CT83、S100A9、PPIB、S100A12、STAT1、EPCAM、ROR1、MLANA、KAAG1、KLK3、NT5E、PTPRZ1、SPAG4、MET、RGS1、CSPG4、PDCD1LG2、MUC1、CD274、PSCA、WDHD1、FABP7、PLIN2、PTGER2、HAVCR2、TPD52、ABCC3、TSSK6、ERBB2、CCDC110、TERT、CTAG2、SEC61G、ADORA2A、AURKB、ACPP、EPHX1、PTGS1、EZH2、PTGS2、PLK4、DDX43、PA2G4、PAX8、IDH1、SFMBT1、EPHA2、NAPSA、LPGAT1、NUF2、SPAG5、STAT3、MELK、ST8SIA1、EBAG9、KIFC3、CEACAM5、RPL19、SYCP2、DSE、ANKRD30A、TRAPPC1、RGS5、MGAT5、KRT19、B3GALNT1、CAGE1、AGER、ACRBP、LAG3、NELFA、RAB38、CCND1、SART1、UBE2V1、SLAMF7、KCNMA1、MUM1、HSPH1、GUCY1A3、AKAP13、SQSTM1、BCAN、CCNB1、TP53、SUGT1、AURKA、RAN、LY6D、NLGN4X、SART3、PRKDC、FOXP3、HBEGF、PIK3R1、SLC1A3、PCNA、KIF1C、BSG、ATP2A3、SPAG9、RPSA、NFYC、LRRC8A、IQGAP1、LY6E、TRIOBP、ART1、BAGE、BIRC7、CA9、CCDC54、DCT、IDO2、MAGED4、SOX2、SYCP1、TYR、5T4、BAGE2、BORIS、CALR3、CSAG2、CSH1、CTAG1A、CTAG1B、CTAGE1、E6、FMR1NB、GAGE1、GAGE2A、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、GRDX、HNPRL、IGHD、MAGEA1、MAGEA10、MAGEA12、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、PAGE4、PAP、SAGE1、SPANXB1、SPO11、SSX1、SSX2、SSX4、Brachyury/TFT、TTR、TYRP1、VSIR、XAGE1B、XAGE1E、ENAH、AKR1B10、GPC3、AFP、FLVCR1、FGF19、PSPH、ABL2、CCT3、SMYD3、TMEM106C、ZNF260、EPCAM、ICK、PHF20L1、ANXA3、ZNF623、CASK、FAM122B、IRS1、OTUD6B、TMEM68、VASH2、FGF3、TERF1、TSHZ2、TTC13和UTP14A。

此外，肿瘤抗原还可以包括肿瘤患者个体特异的、由肿瘤细胞中基因突变产生的新抗原。该突变的基因可以是细胞内的任何一个基因，其表达产物可以表达在细胞表面，也可以表达在细胞内部。

本发明的抗原还表现为含有编码抗原的核酸的细胞，如DC细胞或者PBMC细胞。

除了上述成分(a)至(c)外，本发明的免疫增强剂还可包括其他成分。此类其他成分的实例包括药物学可接受载体。其在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。药物学可接受载体包括稀释剂和赋形剂。

合适的药物学可接受载体的实例包括但不限于：(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白；(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。

本发明的药物组合物可以是任何适宜的剂型。例如，注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

优选地，将本发明的药物组合物通过体内递送到宿主细胞。在一个实施方案中，由病毒载体如腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒等将核酸分子向有需要的受试者引入本发明的药物组合物。此外，也可以由脂质体纳米颗粒转染进入到宿主细胞进而向受试者引入本发明的药物组合物。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以以电穿孔的方法导入到受试者自身DC细胞中，以DC细胞为载体导入受试者体内。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以以电穿孔的方法导入到受试者自体PBMC细胞或者是异体来源的PBMC细胞中，以自体PBMC细胞或者是异体来源的PBMC细胞为载体导入受试者体内。

[提高淋巴细胞中TNF-a和/或IFN-r含量的方法]

本发明的第三方面，提供提高淋巴细胞中TNF-a和/或IFN-r含量的方法，其包括使本发明的免疫增强剂或药物组合物作用于淋巴细胞的步骤。

本发明的淋巴细胞是药物组合物作用的靶细胞，其包括体外培养的细胞或受试者体内的细胞。优选CD4+细胞和/或CD8+细胞。药物组合物与淋巴细胞的作用可通过多种方式进行。在药物组合物包含蛋白情况下，可通过使药物组合物直接与淋巴细胞接触而作用于淋巴细胞。在药物组合物包含核酸的情况下，可通过使药物组合物中的核酸表达为相应的蛋白，而后使得到的蛋白与淋巴细胞接触。例如，使药物组合物中的核酸首先在表达细胞内表达，然后使表达细胞与作为靶细胞的淋巴细胞接触。此处的表达细胞包括PBMC细胞和/或DC细胞。

[提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法]

本发明的第四方面，提供提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法，其包括将免疫增强剂或药物组合物作用于淋巴细胞群的步骤。药物组合物与淋巴细胞群的作用方式可与上述提高淋巴细胞中TNF-a和/或IFN-r含量的方式相同。在此不再赘述。

在某些实施方案中，提高淋巴细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法包括以下步骤：

1)将试剂引入如DC细胞或PBMC细胞等表达细胞得到转染细胞的步骤；和

2)使所述转染细胞与所述淋巴细胞群共培养，或使所述转染细胞的至少部分分泌物与所述淋巴细胞群接触的步骤；

其中所述试剂包含下述(a’)((b’)和((c’)：

(a’)IL12p70或其功能性片段的编码核酸；

(b’)能够抑制配体与PD-1结合的PD-1重组蛋白的编码核酸；和

(c’)含TGFBR3胞外结构域的重组蛋白的编码核酸。

实施例1

本实施例为制备编码抗原以及免疫检验点抑制剂的DNA和mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

构建用于体外致敏的人肿瘤抗原GPC3以及AKR1B10的编码的DNA序列、编码sPD-1-Fc mRNA的DNA序列、编码IL12p70mRNA的DNA序列以及编码sTGFBR3-Fc融合蛋白mRNA的DNA序列。将这些DNA用于后续的体外转录反应。通过密码子优化引入高GC序列以稳定合成的mRNA，接着是一段多聚腺苷片段来制备构建体。这些DNA的序列如表-1所示。

表-1

2.体外转录

按照相应的DNA质粒，首先使用speI内切酶将质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例2

本实施例用于验证免疫抑制剂mRNA在树突细胞中的表达水平以及对树突细胞表型的影响。

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取人静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基。该新鲜mDC培养基的配方如下：1600U/mL GM-CSF和1000U/mL IL-4，TNF-a(5ng/ml),IL-1β(5ng/ml),IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1ug/ml)。重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8～18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.免疫抑制剂组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染～4ugmRNA的比例，混合DC细胞和可溶性蛋白mRNA，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的AIM-V培养基重悬，调整细胞密度到1×10⁶DCs/ml，以每孔200ul的体积种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养。以同样的条件转染GFP mRNA到DC细胞中，作为对照组。

3.转染效率的测定

转染24小时后，以流式细胞仪分析表达绿色荧光蛋白的DC细胞占所有DC细胞的比例，如图1所示，转染24小时后DC细胞转染效率大于50％。

4.重组蛋白表达检测

转染24小时后，收集细胞上清，使用ELISA试剂盒分别检测上清中各种重组蛋白的浓度。结果可以看出，本发明的编码可溶性蛋白的mRNA，在DC细胞中能够表达较高水平的目的蛋白。

5.DC细胞表型的鉴定

应用直接免疫荧光标记法，将转染DC细胞离心，用FACS buffer(含2％FBS的PBS溶液)重悬DC细胞，细胞浓度为1×10⁶cells/ml，取100ul转染DC细胞悬液加入流式细胞管，分别加入5ul相应的抗体CD80、CD83、CD86，以及相应的同型对照。4℃避光染色30min。每管加入3ml FACS Buffer洗细胞，弃上清，加入500ul FACS buffer，流式分析检测CD80、CD83、CD86的表达。如图2所示，与未转染的DC细胞相比，DC-免疫调节剂组合物细胞表面分子CD80、CD83、CD86稳定表达，没有明显的差异。

实施例3

本实施例用于研究免疫调节剂组合物对T细胞应答的影响

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基，其配方为：1600U/mLGM-CSF和1000U/mL IL-4，TNF-a(5ng/ml),IL-1β(5ng/ml),IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1ug/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8～18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.免疫抑制剂组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染4ugmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与重组蛋白(sPD-1-Fc、IL12p70、sTGFBR3-Fc)mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。

3.将复苏过夜的MNC细胞以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：MNC空白对照组，MNC+抗原mRNA-DC疫苗组，MNC+抗原/免疫调节剂mRNA-DC疫苗组，MNC+PMA/Ionomycin阳性对照组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，MNC:DC＝10:1；阳性对照中Anti-CD3/anti-CD28的浓度为1μg/ml或PMA/Ionomycin浓度为50ng/ml及1ug/ml；37℃培养10～12天。

4.在收集细胞前5-8h，在细胞培养液中加入终浓度为2μM monensin或3μg/mlBrefeldin A，充分混匀，由此，阻断蛋白运输，该试剂在细胞液中的时间不应超过12h。

5.将细胞转移到流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-a和IFN-r抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-a+和IFN-r+细胞的比例。

结果如图3-图6所示，使用单独的抗原mRNA或者抗原/免疫调节剂组合物mRNA都可以引起T淋巴细胞抗肿瘤特异的免疫反应，加了免疫调节剂组合物的组，其T淋巴细胞具有更强的抗肿瘤特异的免疫反应。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

序列表

<110> 启辰生生物科技（珠海）有限公司

<120> 免疫增强剂、药物组合物及其应用

<130> BH1900067-1

<141> 2019-08-19

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1812

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60

catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120

ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180

gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240

gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300

gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360

ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420

aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480

atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540

atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600

atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660

gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720

gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttccg gatccggagc caccaacttc 780

agcctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaaccccg gccccatgtg tcaccagcag 840

ttggtcatct cttggttttc cctggttttt ctggcatctc ccctcgtggc catatgggaa 900

ctgaagaaag atgtttatgt cgtagaattg gattggtatc cggatgcccc tggagaaatg 960

gtggtcctca cctgtgacac ccctgaagaa gatggtatca cctggacctt ggaccagagc 1020

agtgaggtct taggctctgg caaaaccctg accatccaag tcaaagagtt tggagatgct 1080

ggccagtaca cctgtcacaa aggaggcgag gttctaagcc attcgctcct gctgcttcac 1140

aaaaaggaag atggaatttg gtccactgat attttaaagg accagaaaga acccaaaaat 1200

aagacctttc taagatgcga ggccaagaat tattctggac gtttcacctg ctggtggctg 1260

acgacaatca gtactgattt gacattcagt gtcaaaagca gcagaggctc ttctgacccc 1320

caaggggtga cgtgcggagc tgctacactc tctgcagaga gagtcagagg ggacaacaag 1380

gagtatgagt actcagtgga gtgccaggag gacagtgcct gcccagctgc tgaggagagt 1440

ctgcccattg aggtcatggt ggatgccgtt cacaagctca agtatgaaaa ctacaccagc 1500

agcttcttca tcagggacat catcaaacct gacccaccca agaacttgca gctgaagcca 1560

ttaaagaatt ctcggcaggt ggaggtcagc tgggagtacc ctgacacctg gagtactcca 1620

cattcctact tctccctgac attctgcgtt caggtccagg gcaagagcaa gagagaaaag 1680

aaagatagag tcttcacgga caagacctca gccacggtca tctgccgcaa aaatgccagc 1740

attagcgtgc gggcccagga ccgctactat agctcatctt ggagcgaatg ggcatctgtg 1800

ccctgcagtt ag 1812

<210> 2

<211> 1200

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480

aggccagccg gccagttcca agagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 540

tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 600

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 660

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 720

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 840

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 900

tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1020

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1080

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1140

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1200

<210> 3

<211> 2637

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atgaccagcc actacgtgat cgccatcttc gccctgatga gcagctgtct ggccacagca 60

ggaccagagc caggcgccct gtgtgaactc agcccagtgt ccgcttctca tccagtgcag 120

gccctgatgg agagcttcac agtgctgagc ggctgcgcca gcagaggcac aacaggactg 180

cctcaggagg tgcacgtgct gaacctgaga accgcaggac agggaccagg acagctgcag 240

agggaagtga ccctgcacct gaaccccatc agcagcgtgc acatccacca caagagcgtg 300

gtgttcctgc tgaacagccc tcacccactg gtctggcacc tgaagaccga gagactggct 360

acaggcgtgt ccagactgtt cctggtgtcc gaaggcagcg tggtgcagtt tagcagcgct 420

aacttcagcc tgaccgccga aaccgaggag agaaacttcc cccacggcaa cgagcacctg 480

ctgaattggg ccaggaagga gtacggagcc gtgaccagct tcaccgagct gaagatcgcc 540

cggaacatct acatcaaggt cggcgaggac caggtgttcc cacccaagtg caacatcggc 600

aagaacttcc tgagcctgaa ctacctggcc gagtatctgc agcctaaagc cgcagagggc 660

tgcgtgatgt ctagccagcc ccagaacgag gaggtgcaca tcatcgagct gatcaccccc 720

aacagcaacc cctacagcgc cttccaggtg gacatcacca tcgacatccg gcctagccag 780

gaggatctgg aggtcgtgaa gaacctgatc ctgatcctca agtgcaagaa gagcgtgaat 840

tgggtcatca agagcttcga cgtgaagggc agcctgaaga tcatcgcccc caacagcatc 900

ggctttggca aagagagcga gcggagcatg accatgacca agagcatccg ggacgacatc 960

ccctctacac agggcaacct cgtcaagtgg gcactggata acggctacag ccctatcacc 1020

agctacacca tggccccagt ggccaacaga ttccacctgc ggctggagaa caacgccgaa 1080

gagatgggcg acgaggaagt gcacaccatc cctcccgagc tgagaatcct gctggacccc 1140

ggcgccctgc cagctctgca gaatcctcct attagaggcg gcgagggaca gaacggagga 1200

ctgcctttcc ctttccccga catcagcagg agagtgtgga acgaggaggg cgaagacgga 1260

ctgcctagac ctaaggaccc cgtgatccct agcatccagc tgttcccagg cctgagagag 1320

ccagaggaag tgcagggaag cgtggacatc gctctgagcg tcaagtgcga caacgagaag 1380

atgatcgtgg ccgtggagaa ggacagcttc caggctagcg gatacagcgg aatggacgtg 1440

accctgctgg accctacttg caaggccaag atgaacggca cccacttcgt gctggagtcc 1500

cccctgaacg gttgcggcac aagacctagg tggagcgctc tggacggagt ggtgtactac 1560

aactccatcg tgatccaggt gcccgctctg ggagattcta gcggttggcc agacggctac 1620

gaggatctgg agagcggaga caacggcttc ccaggcgata tggacgaggg agacgcttct 1680

ctgttcacca ggcccgagat cgtggtgttc aattgcagcc tgcagcaggt ccgcaaccct 1740

tctagcttcc aggagcagcc tcacggcaac atcaccttca acatggagct gtacaacacc 1800

gacctgttcc tggtgccatc acagggagtg ttcagcgtgc ccgagaacgg acacgtgtac 1860

gtggaggtgt ccgtgaccaa ggcagaacag gagctgggct tcgccatcca gacttgcttc 1920

atcagcccct acagcaacga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1980

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 2040

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 2100

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 2160

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2220

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2280

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2340

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 2400

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2460

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2520

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2580

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 2637

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 5

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

Claims (5)

1.一种药物组合物，其特征在于，包含免疫增强剂组合物，和AKR1B10或其编码核酸，其中，所述免疫增强剂组合物由下述(a)至(c)三种成分组成：

(a) SEQ ID NO:1所示序列的核酸或由其编码得到的蛋白；

(b) SEQ ID NO:2所示序列的核酸或由其编码得到的蛋白；和

(c) SEQ ID NO:3所示序列的核酸或由其编码得到的蛋白。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述(a)、(b)和(c)分别为蛋白，且三者的摩尔比为(0 .5-1.5):(0 .5-1.5):(0 .5-1.5)。

3.一种提高体外CD8细胞中TNF-a和/或IFN-r含量，或者提高体外CD8细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法，其特征在于，包括使根据权利要求1或2所述的药物组合物作用于体外CD8细胞或CD8细胞群的步骤。

4.一种提高体外CD4细胞中TNF-a含量，或者提高体外CD4细胞群中TNF-a+细胞的比例的方法，其特征在于，包括使药物组合物作用于体外CD4细胞或CD4细胞群的步骤，其中所述药物组合物由下述成分组成：

(a) SEQ ID NO:1所示序列的核酸或由其编码得到的蛋白；

(b) SEQ ID NO:2所示序列的核酸或由其编码得到的蛋白；

(c) SEQ ID NO:3所示序列的核酸或由其编码得到的蛋白；和

GPC3或其编码核酸。

5.一种提高体外CD8细胞群中TNF-a+和/或IFN-r+细胞的比例的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将试剂引入表达细胞得到转染细胞的步骤；和

2)在体外使所述转染细胞与所述CD8细胞群共培养，或使所述转染细胞的至少部分分泌物与所述CD8细胞群接触的步骤；

其中所述试剂由SEQ ID NO:1-3所示的核酸序列和编码AKR1B10的核酸组成。

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