CN112210543A

CN112210543A - 一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞

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Publication number: CN112210543A
Application number: CN202011234421.2A
Authority: CN
Inventors: 刘明录; 强邦明; 卢永灿; 王立新; 金海锋; 冯建海; 张传鹏; 许淼; 王亮
Original assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Research Institute Of Adult Cell Industry Technology Co ltd
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-11-07
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2040-11-07
Also published as: CN112210543B

Abstract

本发明提供一种针对实体瘤克服TGF‑β免疫抑制的CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞，为阻断TGF‑β信号的靶向实体瘤的CAR‑T细胞；本发明采用双靶点CAR增加实体肿瘤表面“有效”抗原的数量，进行更广泛的免疫应答，通过协同作用增强T细胞的活化，提高CAR‑T与肿瘤细胞的结合效率，更大程度解决肿瘤免疫逃逸引发的复发和转移的问题。设计能在TME中保持活性、对抗免疫抑制细胞因子的CAR，通过基因编辑技术（CRISPR/CAS9）下调T细胞表面相应免疫抑制因子（TGFβRII）的表达，克服肿瘤微环境，提高CAR‑T细胞的活性，使CAR‑T细胞在实体肿瘤治疗中更有效。

Description

一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞

技术领域

本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的新型CAR设计方法。

背景技术

近年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，成为继手术、放、化疗之后的第四大肿瘤治疗新技术，受到医学界的广泛关注，成为肿瘤治疗领域的热点和突破口。肿瘤免疫疗法包括免疫细胞治疗、免疫检查点抑制剂、细胞因子、细胞疫苗等。其中，嵌合抗原受体T细胞（ChimericAntigen Receptor T-Cell,CAR-T细胞）疗法是一种新型的细胞疗法，与传统免疫疗法不同，通过基因工程技术人工改造肿瘤患者的T细胞，在体外大量培养后生成肿瘤特异性CAR-T细胞，再将其回输至患者体内用以攻击癌细胞，其靶向更精确、杀伤力更强、作用更持久。CAR-T细胞疗法已在血液肿瘤临床治疗中取得了巨大突破，以CD19-CAR-T治疗晚期恶性B细胞和淋巴瘤效果最为显著，掀起了肿瘤细胞免疫治疗研究的热潮。但相比血液系统肿瘤，实体瘤缺乏特异性靶点且易受肿瘤微环境（tumor micro environment，TME）的干扰等原因，成为 CAR-T 治疗实体肿瘤的一大障碍。如何突破实体瘤的治疗障碍是CAR-T 治疗研究的聚焦点之一。

现有实体瘤免疫细胞治疗指数的技术有将检查点抑制剂（PD-1、CTLA-4 和LAG-3）与CAR-T细胞联合治疗，以改善肿瘤微环境及提高CAR-T细胞的杀伤效果，此外还有免疫细胞治疗联合手术、放化疗治疗实体瘤。

现有实体瘤免疫细胞治疗存在以下问题：检查点抑制剂与CAR-T细胞联合治疗，由于肿瘤组织具有高度异质性，治疗过程中，治疗过程中会出现肿瘤组织的脱靶效应和肿瘤免疫逃逸的问题，并伴随毒副作用，使CAR-T治疗实体瘤的效果不佳。其次，免疫治疗联合放化疗治疗，放化疗会造成患者出现恶心、呕吐、骨髓抑制和轻微器官损伤的副作用，使得CAR-T细胞治疗实体瘤总体有效率偏低，临床使用价值意义不大。

转化生长因子-β（TGF-β)能促进癌细胞增殖、导致免疫抑制和血管生成、诱导肿瘤细胞免疫逃逸，使癌细胞更具浸润性，TGF-β的免疫抑制被认为是抗肿瘤活性不成功的主要原因。现有的肿瘤特异性CAR-T细胞在治疗肿瘤过程中，肿瘤微环境中含有较多的TGF-β，会导致CAR-T细胞对肿瘤的杀伤效果差，进而导致抗肿瘤活性不高。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞及其制备方法，实现以下发明目的：

（1）改善肿瘤微环境，提高靶向肿瘤特异性CAR-T细胞的IL-2和IFN -r的释放量；

（2）提高靶向肿瘤特异性CAR-T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效果；

（3）提高靶向肿瘤特异性CAR-T细胞的增殖能力。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞，为阻断TGF-β信号的靶向实体瘤的CAR-T细胞。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述CAR-T细胞，为表达TGF-β单链抗体的靶向实体瘤的CAR-T细胞。

所述TGF-β单链抗体的核酸人工序列为SEQ ID NO.2所示。

所述靶向实体瘤的CAR-T细胞，表达含TGF-β单链抗体的融合基因片段；

所述CAR-T细胞为表达Dn-TGFβRII因子的靶向实体瘤的CAR-T细胞。

所述Dn-TGFβRII的核酸人工序列为SEQ ID NO.11所示。

所述CAR-T细胞为敲除TGFβRII基因的靶向实体瘤的CAR-T细胞。

所述敲除TGFβRII基因的sgRNA的核苷酸序列为gtgagacgttgactgagtgc。

所述CAR-T细胞表达靶向实体瘤的单链抗体；

所述实体瘤为结直肠癌。

所述靶向实体瘤的单链抗体为GPC3单链抗体。

所述表达TGF-β单链抗体的靶向实体瘤的CAR-T细胞，同时表达TGF-β单链抗体、GPC3单链抗体；

所述表达TGF-β单链抗体的靶向实体瘤的CAR-T细胞，表达含TGF-β单链抗体的融合基因片段；

所述含TGF-β单链抗体的融合基因片段，包括CD8导引子、TGF-β单链抗体、Linker、GPC3单链抗体、

CD8 Hinge区、CD8跨膜区、CD226共刺激区、41BB共刺激区、CD3ζ信号传导区；

所述表达Dn-TGFβRII因子的靶向实体瘤的CAR-T细胞，同时表达Dn-TGFβRII因子、GPC3单链抗体；

所述表达Dn-TGFβRII因子的靶向实体瘤的CAR-T细胞，表达含Dn-TGFβRII因子的融合基因片段；

所述含Dn-TGFβRII因子的融合基因片段，包括Dn-TGFβRII因子、T2A、GPC3单链抗体、

所述敲除TGFβRII基因的靶向实体瘤的CAR-T细胞的制备方法，表达含GPC3单链抗体的融合基因片段；

所述含GPC3单链抗体的融合基因片段，包括CD8导引子、GPC3单链抗体、CD8 Hinge区、

CD8跨膜区、CD226共刺激区、41BB共刺激区、CD3ζ信号传导区。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

（1）本发明采用双靶点CAR增加实体肿瘤表面“有效”抗原的数量，进行更广泛的免疫应答，通过协同作用增强T细胞的活化，提高 CAR-T与肿瘤细胞的结合效率，更大程度解决肿瘤免疫逃逸引发的复发和转移的问题。设计能在TME中保持活性、对抗免疫抑制细胞因子的CAR，通过基因编辑技术（CRISPR/CAS9）下调T细胞表面相应免疫抑制因子（TGFβRII）的表达，克服肿瘤微环境，提高CAR-T细胞的活性，使CAR-T细胞在实体肿瘤治疗中更有效。

（2）本发明构建基因编辑的CAR-T细胞（TGF-β单链抗体、显性失活TGFβRII和敲除TGFβRII基因）可以减少或消除TGF-β对CAR-T细胞的负作用，能够改善肿瘤微环境。在TGF-β存在的情况下，与对照组Anti-GPC3-CAR-T细胞相比，Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞(实验A组)、Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞(实验B组)、敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞(实验C组)，IL-2和IFN -r的释放量大幅增加。

实验组A的IL-2分泌量是对照组的9.9倍，IFN –r分泌量是对照组的9.7倍；实验组B的IL-2分泌量是对照组的10.3倍，IFN –r分泌量是对照组的10倍；实验组C的IL-2分泌量是对照组的12倍，IFN –r分泌量是对照组的13.3倍。

（3）本发明所述的三种CAR-T细胞，细胞增殖能力强，并且能够延长敲除TGFBRII的CAR-T细胞的存活时间，进而显著提高抗肿瘤疗效。

存在TGF-β时，实验组A细胞的OD值为对照组的3.5倍，实验B细胞的OD值为对照组的3.9倍，

实验组C细胞的OD值最大，是对照组的4.7倍。

（4）本发明构建基因编辑的三种CAR-T细胞（TGF-β单链抗体、显性失活TGFβRII和敲除TGFβRII基因）能够突破肿瘤微环境的影响，增强细胞的杀伤能力。

本发明Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞、Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞、敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞和Anti-GPC3-CAR-T细胞对靶细胞的杀伤率分别是89%、90%、95%和20%。

附图说明

图1 Anti-TGF-β-GPC3-CAR表达载体结构示意图。

图2 Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR表达载体结构示意图。

图3 pX330A-TGFβRII表达载体结构示意图。

图4流式细胞术检测Anti-TGF-β-GPC3-CAR载体在T细胞表面的表达效率的流式图。

图5 流式细胞术检测Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR载体在T细胞表面的表达效率的流式图。

图6 不同TGF-β浓度对GPC3-CAR-T细胞释放IL-2和IFN-γ因子的影响图。

图7 不同CAR-T细胞IL-2和IFN-γ因子分泌量比较图。

图8 MTT法检测OD值的柱状图。

图9不同CAR-T细胞对靶细胞的体外杀伤率的柱状图。

具体实施方式

实施例1 实体肿瘤靶点的选择

本发明采用CAR-T细胞等基因编辑技术，具体如下：

构建双靶点CAR，以TGF-β为靶点，利用抗TGF-β单克隆抗体中和肿瘤微环境中的TGF-β因子，抑制肿瘤细胞生长；

构建共表达显性失活转化生长因子受体II（Dn-TGFβRII）的GPC3 CAR-T，利用Dn-TGFBRII阻断TGF-β信号通路；

将CAR-T细胞治疗结合转化生长因子受体II（TGFβRII），利用CRISPR/Cas9技术敲除CAR-T细胞内的TGFβRII，阻断TGF-β信号通路。

实施例2 CAR表达载体的构建

1. Anti-TGF-β-GPC3-CAR双表达载体的构建

Anti-TGF-β-GPC3-CAR模块示意图1。Anti-TGF-β-GPC3-CAR各模块核酸序列如下：

（1）CD8导引子Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.1)

（2）Anti-TGF-β(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.2)

（3）Linker核酸人工序列(SEQ ID NO.3)

（4）Anti-GPC3(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.4)

（5）CD8 Hinge区(CD8α)核酸人工序列(SEQ ID NO.5)

（6）CD8跨膜区(CD8 TM)核酸人工序列(SEQ ID NO.6)

（7）CD226共刺激区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)

（8）41BB共刺激区核酸人工序列(SEQ ID NO.8)

（9）CD3ζ信号传导区核酸人工序列(SEQ ID NO.9)

分别将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC57载体上，得到pUC-TGF-β-GPC3-CAR。将pUC-TGF-β-GPC3-CAR和pLent-C-GFP（SEQ ID NO.10）载体进行Fast Digest AsiSI(购自Thermo Fisher公司)和Fast Digest NotI(购自Thermo Fisher公司)双酶切后，16℃进行过夜连接形成pLent-anti-TGF-β-GPC3-CAR双靶点表达载体。将上述pLent-anti-TGF-β-GPC3-CAR转化到E.coli(DH5α)。提取质粒anti-TGF-β-GPC3-CAR并委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。

2. Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR共表达载体的构建

Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR模块示意图2。Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR各模块核酸序列如下：

（1）Dn-TGFβRII核酸人工序列(SEQ ID NO.11)

（2）T2A核酸人工序列(SEQ ID NO.12)

（3）Anti-GPC3(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.4)（本公司专利CN108913709A）

（4）CD8 Hinge区(CD8α)核酸人工序列(SEQ ID NO.5)

（5）CD8跨膜区(CD8 TM)核酸人工序列(SEQ ID NO.6)

（6）CD226共刺激区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)

（7）41BB共刺激区核酸人工序列(SEQ ID NO.8)

（8）CD3ζ信号传导区核酸人工序列(SEQ ID NO.9)

分别将SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC57载体上，得到pUC-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR。其余载体构建步骤同上述anti-TGF-β-GPC3-CAR，最终得到测序正确的Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR共表达载体。

3. CRISPR/CAS9敲除TGFβRII表达载体的构建

根据网站http://chopchop.cbu.uib.no/设计sgRNA（见下表1），并从TGFβRII基因（SEQID NO.13）中筛选脱靶位点少、特异性强的sgRNA片段（TGFβRII sgRNA3）；

表1

将筛选得到的TGFβRII sgRNA3核酸序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成并插入标准载体连接至CRISPR/CAS9表达载体pX330A（购自上海遐永医药科技有限公司，SEQ IDNO.14）的BbsI酶切位点，得到pX330A-TGFβRII载体（模块示意图3）。

Anti-GPC3-CAR载体的制备：

各模块核酸序列如下：

（1）CD8导引子Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.1)

（2）Anti-GPC3(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.4)

（3）CD8 Hinge区(CD8α)核酸人工序列(SEQ ID NO.5)

（4）CD8跨膜区(CD8 TM)核酸人工序列(SEQ ID NO.6)

（5）CD226共刺激区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)

（6）41BB共刺激区核酸人工序列(SEQ ID NO.8)

（7）CD3ζ信号传导区核酸人工序列(SEQ ID NO.9)

分别将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC57载体上，得到pUC- -GPC3-CAR，转化到E.coli(DH5α)，提取质粒Anti-GPC3-CAR并委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，经测序正确后备用。

实施例3 慢病毒包装及滴度检测

将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10% FBS 10cm培养皿中，37℃、5%的CO2条件下培养，贴壁率为70%-80%时准备转染。取无菌的1.5ml EP管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：3ml； anti-TGF-β-GPC3-CAR质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix：10μL(10μg)；HG Transgene TM Reagent：60μL。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，置于CO2培养箱中培养。转染24h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10%血清新鲜的培养基继续培养。换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。收获病毒后进行浓缩，获得浓缩过的TGF-β-GPC3-CAR病毒液，直接去检测滴度或-70℃低温冰箱中保存备用。将上述病毒采用TCID 50测定滴度，将处于对数生长期的293T细胞以1×10⁴Cells/孔的量接种于96孔细胞培养板，样品用5% FBS DMEM按10倍倍比稀释系列浓度，加样于96孔板中，每个浓度加样10孔，设2孔空白对照。于37℃、5% CO2培养，逐日观察细胞出现毒斑情况，一般需要观察5-7天，据出现毒斑的浓度和孔数计算样品的TCID 50结果。结果表明，anti-TGF-β-GPC3-CAR重组慢病毒的滴度5.21×10⁷pfu/mL。

Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR和Anti-GPC3-CAR载体重组慢病毒制备方法同Anti-TGF-β-GPC3-CAR，其病毒滴度分别为4.96×10⁷pfu/mL和5.33×10⁷pfu/mL。

实施例4 CAR-T细胞和敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞的制备

1. Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞的制备

（1）T细胞制备

取50ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离获得PMBC。用含有1000 IU/ml重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基DMEM(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1000IU/ml的重组IL-2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5%的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3⁺、CD56⁺的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3⁺阳性率>80%，CD3⁺CD56⁺双阳性率>20%，视为T细胞诱导成功，并留取该细胞待病毒感染。

（2）慢病毒感染T细胞

T细胞经活化后，取出1×10⁶个细胞，加入浓缩过的anti-TGF-β-GPC3-CAR病毒液，混匀，MOI＝7。分别在一周后对转染的T细胞进行相关检测。通过荧光显微镜检测嵌合抗原受体表达，由于GFP与CAR共表达，检测GFP的阳性细胞即为表达TGF-β-GPC3嵌合抗原受体的阳性细胞。

图4为流式细胞术检测的利用本发明构建的Anti-TGF-β-GPC3-CAR载体在T细胞表面上的表达情况。结果表明有35.3%的细胞是GFP(慢病毒载体本身表达GFP蛋白)阳性，说明利用本发明构建的Anti-TGF-β-GPC3-CAR能够在T细胞表面表达，且转染效率为35.3%。

2. Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞的制备

Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞的制备方法同Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞的制备。

图5为流式细胞术检测的利用本发明构建的Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR共表达载体在T细胞表面上的表达情况。结果表明有33.7%的细胞是GFP(慢病毒载体本身表达GFP蛋白)阳性，说明利用本发明构建的Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR能够在T细胞表面表达，且转染效率为33.7%。

3. 敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞的制备

（1）Anti-GPC3-CAR-T细胞的制备

Anti-GPC3-CAR-T细胞的制备方法同Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞的制备。

（2）pX330A-TGFβRII载体电转染Anti-GPC3-CAR-T细胞

(1)清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2h，然后在紫外灯下照射15min。

(2)取1×10⁷个Anti-GPC3-CAR-T细胞，加入500μL电转缓冲液重悬细胞，并上下吹打均匀。

(3)细胞悬液中加入pX330A-TGFβRII质粒（10ug），上下吹打均匀。

(4)将含有pX330A-TGFβRII质粒的CAR-T细胞悬液转移入相应规格的电转杯中（0.2cm），按照预定条件设置参数：300V，10ms，进行2次电击操作。

(5)电击完成后，将电转杯置于冰上孵育10min，以使核酸充分进入细胞。

(6)将电击杯从冰上取出，将细胞从电转杯中转移出来，过滤后计数，按照一定的细胞密度（3×10⁶/ml）接种于新鲜的DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱培养。

(7)培养48h后，即可进行细胞电转效率的检测。

流式细胞技术检测电转染前的CAR-T细胞TGFβRII表达率为40%，转染后表达率为9%，电转染效率计算公式为：（电转染前基因表达率-电转染后基因表达率）/电转染前基因表达率*100%，电转染效率=（40%-9%）/40%*100%=77.5%，即本发明构建的敲除TGFβRII基因的效率为77.5%。

实施例5 CAR-T细胞与靶细胞共培养后IL-2和IFN-γ分泌检测

（一）不同TGF-β浓度对anti-GPC3-CAR-T细胞释放IL-2和IFN-γ因子的影响

将高表达GPC3的肝细胞癌靶细胞系Hep3B（购自南京凯基生物科技发展有限公司）作为靶细胞，Anti-GPC3-CAR-T细胞（本公司专利CN108913709A）作为效应细胞，按效应细胞：靶细胞(E：T)为1：1，混合培养72h时，并用ELSA方法（购自达科为试剂公司）检测其IL2和IFN-γ的分泌量。TGF-β1试剂（配制浓度为100ng/ml，购自大连美仑生物技术公司）。ELISA检测具体实验步骤如下：

1. 细胞培养

用10%FBS(胎牛血清)的DMEM调整效应细胞（Anti-GPC3-CAR-T细胞）和靶细胞（Hep3B细胞）的浓度并接种于96孔板，100μL/孔，细胞数为1×10⁵/孔（E:T=1:1，即效应细胞和靶细胞细胞数均为0.5×10⁵/孔）。分别加入0μL、2μL、4μL、6μL、8μL的TGF-β1试剂，每组三个重复，放入37℃，5％CO2培养箱共培养72小时，收集培养上清液用于细胞因子检测。

2. 细胞培养上清液IFN-γ和IL-2的检测

(1) 取出IFN-γ和IL-2试剂盒放置至室温，按说明书准备IFN-γ和IL-2各5个标准品浓度梯度。抗体预包被孔中加入100μL标准品。

(2) 样品准备，取100μL细胞培养上清直接加入孔板，同时设置空白对照组。。

(3) 每孔加入按比例稀释的生物素标记的一抗50μL，37℃孵育90min；孵育结束后弃上清，洗液清洗4-5次，每次1min；加入按比例稀释的酶结合二抗100μL，37℃孵育30min；孵育结束后弃上清，洗液清洗4-5次，每次1min。

(4) 加入100μL底物TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），37℃孵育显色5-15min，显色明显后即可加入100μL终止液，置于酶标仪中OD450nm读数。

结果：在TGF-β存在的情况下，Anti-GPC3-CAR-T细胞分泌IL-2和IFN -r显著减少；且随着TGF-β浓度的升高，CAR-T细胞分泌IL-2和IFN –r的降低量逐渐减少，当TGF-β的浓度大于4ng/ml时，Anti-GPC3-CAR-T细胞分泌的IL-2和IFN –r的量基本上维持稳定。（图6）。

（二）不同CAR-T细胞释放IL-2和IFN-γ因子比较

将Hep3B作为靶细胞，Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞、Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞和敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞、Anti-GPC3-CAR-T细胞作为效应细胞，分别按E：T=1：1，混合培养72h时，并用ELSA方法分别检测Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞、Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞、敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞IL2和IFN-γ的分泌量。TGF-β1试剂（配制浓度为100ng/ml）。

1. 细胞培养

用10%FBS(胎牛血清)的DMEM调整效应细胞和靶细胞的浓度并接种于96孔板，100μL/孔，细胞数为1×10⁵/孔（E:T=1:1，即效应细胞和靶细胞细胞数均为0.5×10⁵/孔）。每孔加入4μL TGF-β1试剂（终浓度为4ng/ml），分为四组：

实验组A：Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

实验组B：Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

实验组C：敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

对照组：Anti-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

每组三个重复，放入37℃，5％CO2培养箱共培养72小时，收集培养上清液用于细胞因子检测。

2. 细胞培养上清液IFN-γ和IL-2的检测

检测方法同上述。

结果表明：

在TGF-β存在的情况下，与对照组Anti-GPC3-CAR-T细胞相比，Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞、Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞、敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞，IL-2和IFN -r的释放量会大幅增加（图7）。实验组A的IL-2分泌量是对照组的9.9倍，IFN –r分泌量是对照组的9.7倍；实验组B的IL-2分泌量是对照组的10.3倍，IFN –r分泌量是对照组的10倍；实验组C(敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞)分泌量最高，IL-2分泌量是对照组的12倍，IFN –r分泌量是对照组的13.3倍。本发明构建基因编辑的CAR-T细胞（TGF-β单链抗体、显性失活TGFβRII和敲除TGFβRII基因）可以减少或消除TGF-β对CAR-T细胞的负作用，能够改善肿瘤微环境。

表2本发明制备的CAR-T细胞的细胞因子分泌量（pg/ml）

实施例6 MTT法检测细胞增殖活力

分别取上实施例5（二）共培养细胞接种至96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，细胞数为1×105/孔。每组3孔，同时设置空白对照组。加入4μL TGF-β1试剂（终浓度为4ng/ml）。

实验组A1：Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养，加TGF-β1试剂；

实验组A2：Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

实验组B1：Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养，加TGF-β1试剂；

实验组B2：Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

实验组C1：敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养，加TGF-β1试剂；

实验组C2：敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

对照组1 ：Anti-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养，加TGF-β1试剂；

对照组2 ：Anti-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

每孔加入10μL MTT溶液（5mg/mL），在37℃、5% CO2培养箱内继续孵育4h，小心弃去孔内上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振荡10min，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

检测结果见图8，根据MTT检测得知，添加（或不添加）TGF-β试剂，效应细胞与靶细胞共培养时，实验组的A、B、C的细胞的OD值为0.56、0.63、0.75（0.66、0.78、0.95），对照组细胞的OD为0.16（0.32）。其中，存在TGF-β时，实验组A细胞的OD值为对照组的3.5倍，实验B细胞的OD值为对照组的3.9倍，

实验组C（敲除TGFβRII基因的CAR-T）细胞的OD值最大，是对照组的4.7倍。结果表明，本发明构建的CRISPR敲除TGFBRII的OD值最高，细胞增殖能力最强，并且能够延长敲除TGFBRII的CAR-T细胞的存活时间，进而显著提高抗肿瘤疗效。

表3 本发明制备的CAR-T细胞细胞增殖活力OD值

实施例7不同CAR-T细胞体外杀伤实验

将Hep3B作为靶细胞，Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞、Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞和敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞、Anti-GPC3-CAR-T细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定。按照效应细胞（5×10⁵/孔）与靶细胞（1×10⁵/孔）数量比例为5:1加入96孔培养板中，每孔加入4μL TGF-β1试剂（终浓度为4ng/ml），置于5% CO2、37℃培养箱培养，24 h后每孔加入20ml CCK-8，继续孵育2h后，酶标仪检测450nm波长，读取OD值。

具体分组如下：

实验组A：Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

实验组B：Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

实验组C：敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

对照组：Anti-GPC3-CAR-T细胞和Hep3B细胞共培养；

空白组：Hep3B细胞（6×10⁵/孔）。

按以下公式计算细胞杀伤率：杀伤率/%＝[1-(空白组OD值-效应细胞组OD值)/空白组OD值]×100%。

结果表明（见图9），Anti-TGF-β-GPC3-CAR-T细胞、Anti-Dn-TGFβRII-GPC3-CAR-T细胞、敲除TGFβRII基因的CAR-T细胞和Anti-GPC3-CAR-T细胞的杀伤率分别是89%、90%、95%和20%，在TGF-β存在的情况下，实验组的CAR-T细胞杀伤效率显著高于对照组。因此，本发明构建基因编辑的CAR-T细胞（TGF-β单链抗体、显性失活TGFβRII和敲除TGFβRII基因）能够突破肿瘤微环境的影响，增强细胞的杀伤能力。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞

<130> 2020

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 1

atggactgga tttggagaat cctcttcttg gtgggagcag cgactggtgc ccactcc 57

<210> 2

<211> 729

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 2

caggtccaac tggtgcaatc tggcgctgag gtgaagaagc ctggatccac ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcagc agcaatgttc tcagctgggt gcgacaggcc 120

actggacaag ggattgagtg gatgggagga gtcatcccta tcgctgatat agcaaactac 180

gcacagagat tcaagggcag agtcacgatt accgctgacg aatccacgag cacaacctac 240

atggagctga gcatcctgag atctgaggac acggacgtgt attactgtgc gtcaactctg 300

ggactagtcc ccgacgtcat ggactactgg gggcaggcaa acccggtcac cgactcctca 360

ggaggtgggg gcagtggtgg cgggggatct ggaggtggag gttccggaac ggttctcacg 420

cagtctccag gcacgctgtc tatttctcca ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc 480

agtcagagtc ttggcagcag ctacttagcc tggtaccagc agaaacctag ccaggctccc 540

aggctcctca tctatggtgc atccagcagg gcccctggca tcccagacag gttcagtggc 600

agtggctctg ggacagactt cactctcacc atcagcagac tggagcctgg agatttcgca 660

gcgtattact gtcagcagta tgctgactac ccgatcacct tcgaccaagg gacacgactg 720

gagactaaa 729

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 3

ggaggtgggg gcagtggtgg cgggggatct ggaggtggag gttcc 45

<210> 4

<211> 726

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 4

caagtgcagc tgcagcaatc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttaat gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120

cctgtgcatg gcctgaagtg gattggagct cttgaaccta agactggtga tactgcctac 180

tctcagaagt tcaagggcaa ggccactctg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac atcttgttat 300

tattacactt actctggcca agggactctg gtcactgtct ctgcaggagg tgggggcagt 360

ggtggcgggg gatctggagg tggaggttcc gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc 420

ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta 480

cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag 540

ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt 600

ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt 660

tatttctgct ctcaaaatac acatgttcct cccacgttcg gttctgggac caagctggag 720

attaaa 726

<210> 5

<211> 135

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 5

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 6

<211> 84

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 6

atctacatct gggcgccctt ggccgggacc tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gcaaccacag gaac 84

<210> 7

<211> 183

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 7

aacagaagga gaaggagaga gagaagagat ctatttacag agtcctggga tacacagaag 60

gcacccaata actatagaag tcccatctct acctctcaac ctaccaatca atccatggat 120

gatacaagag aggatattta tgtcaactat ccaaccttct ctcgcagacc aaagactaga 180

gtt 183

<210> 8

<211> 126

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 8

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 9

<211> 336

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 9

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 10

<211> 7387

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 10

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat cgcgttgaca 240

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020

cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080

gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 1140

tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg 1200

gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260

attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320

gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 1380

aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440

aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500

aagtaagacc accgcacagc aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat 1560

atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta 1620

ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga 1680

ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca 1740

atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat 1800

ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag 1860

cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg 1920

atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg 1980

agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa 2040

attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa 2100

aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac 2160

ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt 2220

ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca 2280

ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa 2340

gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atcggcactg 2400

cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg 2460

gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac 2520

taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag 2580

cagagatcca gtttggttag taccgggccc gctctagaca tgtccaatat gaccgccatg 2640

ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 2700

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 2760

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 2820

gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 2880

tcaagtgtat catatgccaa gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 2940

ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 3000

attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata 3060

gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 3120

ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc cgttgacgca 3180

aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 3240

tcagaatttt gtaatacgac tcactatagg gcggccggga ttcgtcgact ggatccggta 3300

ccgaggagat ctgccgccgc gatcgccggc gcgccagatc tcaagcttaa ctagctagcg 3360

gaccgacgcg tacgcggccg ctcgagatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg 3420

tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg 3480

gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg 3540

gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct 3600

tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag 3660

gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg 3720

aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca 3780

aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct 3840

atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca 3900

tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg 3960

gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc 4020

ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc 4080

tcggcatgga cgagctgtac aagaataagg tttatccgat ccaccggatc tagataagat 4140

aaacggccgg ccgcggtctg tacaagtagg attcgtcgag ggacctaata acttcgtata 4200

gcatacatta tacgaagtta tacatgttta agggttccgg ttccactagg tacaattcga 4260

tatcaagctt atcgataatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 4320

tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 4380

tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 4440

tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc 4500

tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt 4560

cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 4620

gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc 4680

ctttccttgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 4740

cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 4800

gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc 4860

cccgcatcga taccgtcgac ctcgatcgag acctagaaaa acatggagca atcacaagta 4920

gcaatacagc agctaccaat gctgattgtg cctggctaga agcacaagag gaggaggagg 4980

tgggttttcc agtcacacct caggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 5040

atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 5100

gacaagatat ccttgatctg tggatctacc acacacaagg ctacttccct gattggcaga 5160

actacacacc agggccaggg atcagatatc cactgacctt tggatggtgc tacaagctag 5220

taccagttga gcaagagaag gtagaagaag ccaatgaagg agagaacacc cgcttgttac 5280

accctgtgag cctgcatggg atggatgacc cggagagaga agtattagag tggaggtttg 5340

acagccgcct agcatttcat cacatggccc gagagctgca tccggactgt actgggtctc 5400

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 5460

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 5520

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagcatgt 5580

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 5640

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 5700

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 5760

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 5820

cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 5880

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 5940

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 6000

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 6060

acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 6120

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 6180

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 6240

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 6300

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 6360

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 6420

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 6480

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 6540

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 6600

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 6660

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 6720

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 6780

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 6840

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 6900

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 6960

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 7020

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 7080

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 7140

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 7200

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 7260

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 7320

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggtcccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 7380

cacctga 7387

<210> 11

<211> 600

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 11

atgggtcgcg ggctgctctg gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg tacgcgtatc 60

gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggttaata acgacatgat agtcactgac 120

aagaacggtg cagtcaagtt tccacaactg tgtaaatttt gtgatgtgag attttccacc 180

tgtgacaacc agaaatgctg catgagcaac tgcagcatca cctccatctg tgagaagcca 240

caggaagtct gtgtggctgt atggagaaag aatgacgaga acataacact agagacagtt 300

tgccatgacc ccaagctccc ctaccatgac tttattctgg aagatgctgc ttctccaaag 360

tgcattatga aggaaaataa aaagcctggt gagactttct tcatgtgttc ctgtagctct 420

gatgagtgca atgacaacat catcttctca gaagaatata acaccagcaa tcctgacttg 480

ttgctagtca taattcaagt tacagacatc agcctcctgc caccactggg agttgccata 540

tctgtcatca tcatcttcta ctgctaccgc gctaacaggc agaagaagct gagttcaacc 600

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 12

gaaggccgag ggagcctgct gacatgtggc gatgtggagg aaaacccagg acca 54

<210> 13

<211> 1701

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 13

atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60

gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggttaata acgacatgat agtcactgac 120

aacaacggtg cagtcaagtt tccacaactg tgtaaatttt gtgatgtgag attttccacc 180

tgtgacaacc agaaatcctg catgagcaac tgcagcatca cctccatctg tgagaagcca 240

caggaagtct gtgtggctgt atggagaaag aatgacgaga acataacact agagacagtt 300

tgccatgacc ccaagctccc ctaccatgac tttattctgg aagatgctgc ttctccaaag 360

tgcattatga aggaaaaaaa aaagcctggt gagactttct tcatgtgttc ctgtagctct 420

gatgagtgca atgacaacat catcttctca gaagaatata acaccagcaa tcctgacttg 480

ttgctagtca tatttcaagt gacaggcatc agcctcctgc caccactggg agttgccata 540

tctgtcatca tcatcttcta ctgctaccgc gttaaccggc agcagaagct gagttcaacc 600

tgggaaaccg gcaagacgcg gaagctcatg gagttcagcg agcactgtgc catcatcctg 660

gaagatgacc gctctgacat cagctccacg tgtgccaaca acatcaacca caacacagag 720

ctgctgccca ttgagctgga caccctggtg gggaaaggtc gctttgctga ggtctataag 780

gccaagctga agcagaacac ttcagagcag tttgagacag tggcagtcaa gatctttccc 840

tatgaggagt atgcctcttg gaagacagag aaggacatct tctcagacat caatctgaag 900

catgagaaca tactccagtt cctgacggct gaggagcgga agacggagtt ggggaaacaa 960

tactggctga tcaccgcctt ccacgccaag ggcaacctac aggagtacct gacgcggcat 1020

gtcatcagct gggaggacct gcgcaagctg ggcagctccc tcgcccgggg gattgctcac 1080

ctccacagtg atcacactcc atgtgggagg cccaagatgc ccatcgtgca cagggacctc 1140

aagagctcca atatcctcgt gaagaacgac ctaacctgct gcctgtgtga ctttgggctt 1200

tccctgcgtc tggaccctac tctgtctgtg gatgacctgg ctaacagtgg gcaggtggga 1260

actgcaagat acatggctcc agaagtccta gaatccagga tgaatttgga gaatgttgag 1320

tccttcaagc agaccgatgt ctactccatg gctctggtgc tctgggaaat gacatctcgc 1380

tgtaatgcag tgggagaagt aaaagattat gagcctccat ttggttccaa ggtgcgggag 1440

cacccctgtg tcgaaagcat gaaggacaac gtgttgagag atcgagggcg accagaaatt 1500

cccagcttct ggctcaacca ccagggcatc cagatggtgt gtgagacgtt gactgagtgc 1560

tgggaccacg acccagaggc ccgtctcaca gcccagtgtg tggcagaacg cttcagtgag 1620

ctggagcatc tggacaggct ctcggggagg agctgctcgg aggagaagat tcctgaagac 1680

ggctccctaa acactaccaa a 1701

<210> 14

<211> 8964

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 14

aggtacccgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 60

gcccattgac gtcaatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 120

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 180

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcattg tgcccagtac atgaccttat 240

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg 300

tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt 360

atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg 420

cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg 480

cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc 540

ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgacgctg ccttcgcccc 600

gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc 660

ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg 720

taagggttta agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg 780

cctgaaatca ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg 840

gagactacaa ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga 900

agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc 960

tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca 1020

gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg 1080

gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca 1140

gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg 1200

agatggccaa ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag 1260

aggataagaa gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc 1320

acgagaagta ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg 1380

ccgacctgcg gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc 1440

tgatcgaggg cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg 1500

tgcagaccta caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca 1560

aggccatcct gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc 1620

tgcccggcga gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga 1680

cccccaactt caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg 1740

acacctacga cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc 1800

tgtttctggc cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga 1860

acaccgagat caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc 1920

accaggacct gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag 1980

agattttctt cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc 2040

aggaagagtt ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac 2100

tgctcgtgaa gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca 2160

gcatccccca ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt 2220

tttacccatt cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc 2280

cctactacgt gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga 2340

gcgaggaaac catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc 2400

agagcttcat cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc 2460

ccaagcacag cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat 2520

acgtgaccga gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg 2580

tggacctgct gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact 2640

tcaagaaaat cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg 2700

cctccctggg cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca 2760

atgaggaaaa cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca 2820

gagagatgat cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga 2880

agcagctgaa gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg 2940

gcatccggga caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg 3000

ccaacagaaa cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc 3060

agaaagccca ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg 3120

gcagccccgc cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga 3180

aagtgatggg ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga 3240

ccacccagaa gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca 3300

aagagctggg cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg 3360

agaagctgta cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg 3420

acatcaaccg gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg 3480

acgactccat cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca 3540

acgtgccctc cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg 3600

ccaagctgat tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga 3660

gcgaactgga taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa 3720

agcacgtggc acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc 3780

tgatccggga agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg 3840

atttccagtt ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc 3900

tgaacgccgt cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg 3960

tgtacggcga ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa 4020

tcggcaaggc taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg 4080

agattaccct ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa 4140

ccggggagat cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca 4200

tgccccaagt gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt 4260

ctatcctgcc caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta 4320

agaagtacgg cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag 4380

tggaaaaggg caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca 4440

tggaaagaag cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag 4500

aagtgaaaaa ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg 4560

gccggaagag aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc 4620

cctccaaata tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc 4680

ccgaggataa tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga 4740

tcatcgagca gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca 4800

aagtgctgtc cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata 4860

tcatccacct gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca 4920

ccaccatcga ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc 4980

accagagcat caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca 5040

aaaggccggc ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag 5100

agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 5160

ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 5220

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 5280

ggacagcaag ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga 5340

acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 5400

gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 5460

gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 5520

ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 5580

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 5640

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 5700

aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 5760

cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 5820

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 5880

aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 5940

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt 6000

acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc 6060

cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 6120

tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca 6180

ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 6240

ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 6300

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 6360

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 6420

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 6480

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 6540

aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 6600

tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 6660

ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 6720

catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 6780

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 6840

ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 6900

gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 6960

aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 7020

gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 7080

gctgataaat ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca 7140

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 7200

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 7260

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 7320

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 7380

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 7440

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 7500

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 7560

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 7620

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 7680

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 7740

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 7800

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 7860

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 7920

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 7980

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 8040

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgtgagggc ctatttccca tgattccttc 8100

atatttgcat atacgataca aggctgttag agagataatt ggaattaatt tgactgtaaa 8160

cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc 8220

agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt 8280

cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac accgggtctt cgagaagacc 8340

tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag 8400

tggcaccgag tcggtgcttt tttgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 8460

gtccgttttt agcgcgtgcg ccaattctgc agacaaatgg ctctagagac cggcgccgct 8520

acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 8580

ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 8640

ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg agcgcgcgta 8700

atacgactca ctatagggcg aattgggtac cgggcccccc ctcgaggtcc tccagctttt 8760

gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 8820

tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 8880

aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 8940

ctttccaccg gtggtctctt ctag 8964

Claims

1.一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞，为阻断TGF-β信号的靶向实体瘤的CAR-T细胞。

2.根据权利要求1所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞，为表达TGF-β单链抗体的靶向实体瘤的CAR-T细胞。

3.根据权利要求2所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述TGF-β单链抗体的核酸人工序列为SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞为表达Dn-TGFβRII因子的靶向实体瘤的CAR-T细胞。

5.根据权利要求4所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述Dn-TGFβRII的核酸人工序列为SEQ ID NO.11所示。

6.根据权利要求1所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞为敲除TGFβRII基因的靶向实体瘤的CAR-T细胞。

7.根据权利要求6所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述敲除TGFβRII基因的sgRNA的核苷酸序列为gtgagacgttgactgagtgc。

8.根据权利要求1-6任一项所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞表达靶向实体瘤的单链抗体。

9.根据权利要求8所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述实体瘤为结直肠癌。

10.根据权利要求8所述的一种针对实体瘤克服TGF-β免疫抑制的CAR-T细胞，其特征在于：所述靶向实体瘤的单链抗体为GPC3单链抗体。