CN109957549A

CN109957549A - 一种双功能溶瘤病毒及其应用

Info

Publication number: CN109957549A
Application number: CN201811466408.2A
Authority: CN
Inventors: 高鹏; 应述欢; 李玉霞; 谢国明
Original assignee: Sheng Wu (beijing) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sheng Wu (beijing) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-07-02

Abstract

本发明提供了一种双功能溶瘤病毒，在溶瘤病毒的分子结构中插入表达免疫检查点阻断剂的功能片段。本发明提供的基因改造的柯萨奇溶瘤病毒，改变了实体瘤的肿瘤微环境，病毒直接溶瘤的同时增强了机体自身的免疫抗肿瘤能力，整体抗肿瘤效果得到增强，且安全性良好。

Description

一种双功能溶瘤病毒及其应用

技术领域

本发明涉及病毒生物学、肿瘤生物学领域，具体涉及一种双功能溶瘤病毒及其抗肿瘤应用。

背景技术

病毒具有侵染细胞的能力，进入细胞的病毒会复制病毒基因组，表达病毒蛋白并包装形成新的病毒颗粒，通常这个过程会导致宿主细胞裂解死亡。在此思路上，对病毒进行一定程度的修改，保持对肿瘤细胞的裂解能力的同时，降低对机体的毒性，由此便形成溶瘤病毒。另外，溶瘤病毒可以通过损伤相关的分子模式(damage associated molecularpatterns，DAMPs)等，激活免疫系统，将“冷肿瘤”变成“热肿瘤”；裂解产生的肿瘤抗原，激活特异性免疫，形成原位肿瘤疫苗。溶瘤病毒大多来源于人体非致病性病毒或致病性轻微的病毒，在保证施用安全的前提下，溶瘤效果仍有待提高。已有报道证实，溶瘤病毒与其它抗肿瘤药物联用，可以取得更好的抗肿瘤效果。

肿瘤细胞与正常细胞相比具有许多遗传性以及表观遗传性改变，理论上可以提供足够数量的抗原被免疫系统识别区分，进而引发抗肿瘤免疫反应。但是肿瘤相关的免疫抑制使得肿瘤抗原难以引发有效的抗肿瘤免疫。在有效的抗肿瘤免疫过程中，T细胞作为核心的执行者，首先被T细胞受体介导的抗原识别信号激活，同时众多的共刺激信号和共抑制信号精细调节T细胞反应的强度和质量，这些抑制信号即为免疫检查点。肿瘤细胞发展出多种途径抑制体内免疫细胞的杀伤。其中一种方式是通过识别免疫细胞的免疫检查点，躲避免疫细胞的识别和攻击。免疫检查点阻断剂阻断了肿瘤细胞对免疫细胞的伪装，免疫细胞从而能够正确识别肿瘤细胞并进行特异性杀伤。并在此理论指导下，研发出一系列单克隆抗体药物，例如CTLA-4抗体药物Ipilimumab；PD-1抗体药物Pembrolizumab和Nivolumab；PD-L1抗体药物Atezolizumab和Durvalumab。免疫检查点阻断剂并非对所有患者有效，如PD-1抑制剂治疗实体瘤有效率只有20％，肿瘤局部复杂的肿瘤微环境仍是阻碍其成功应用于乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌等肿瘤的主要障碍。打破肿瘤微环境，重新激发机体对肿瘤细胞的免疫杀伤，是目前实现高效低毒抗肿瘤目标的重要实现途径。

发明内容

本发明提供了柯萨奇B3病毒通过载体功能表达抗肿瘤免疫调节蛋白技术方案与成果。将现有的免疫检查点单抗与溶瘤病毒有机结合，有可能实现溶瘤病毒递送表达抗肿瘤蛋白的作用。因此，本发明提供了一种能够表达免疫检查点阻断剂的柯萨奇溶瘤病毒，在实现病毒裂解肿瘤细胞功能的同时，实现体内表达免疫检查点阻断剂抗肿瘤的功能。

本发明具体技术方案如下

一种双功能溶瘤病毒，其特征在于所述双功能溶瘤病毒在病毒的基本分子结构中插入有一种或几种表达免疫检查点阻断剂的功能片段，所述溶瘤病毒为小RNA病毒，所述小RNA病毒包括肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、副肠孤病毒属、嵴病毒属，所述肠病毒属包括脊髓灰质炎病毒、肠病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒等。本发明所述的双功能溶瘤病毒能够保持原有裂解肿瘤细胞的功能，且能够表达一种或几种免疫检查点阻断剂。

本发明的一个优选方案，选用柯萨奇病毒作为溶瘤病毒，包括柯萨奇A组病毒和柯萨奇B组病毒。优选的柯萨奇B组病毒包括柯萨奇B1-B6，6个亚型。进一步优选柯萨奇B3病毒。柯萨奇B3病毒包括常见的Nancy株、Woodruff株、H3株、H21/0株、CV-B3/20株、CV-B3/28株、CV-B3/0株、CV-B3/GA株、CV-B3/CO株及其变种，以及临床分离株。

本发明所述的双功能溶瘤病毒，所述免疫检查点阻断剂为抑制性免疫共刺激分子的受体PD-1、KIR、LAG3、TIM3、A2aR、CTLA-4、BTLA或配体PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、CD155、B7-H3、B7-H4、B7-H5、HVEM、GAL9、MHC class I or II的抗体或具有抗原结合部位的片段或其组合，所述具有抗原结合部位的片段为Fab或scFv。

本发明的一个优选方案以PD-1分子位点作为免疫检查点，免疫检查点阻断剂为PD-1抑制剂，优选为抗-PD-1的抗体或抗体样分子，或具有PD-1抗原结合部位的片段。优选的scFv，是通过柔性链接连接的VH和VL，例如常用(Gly₄Ser)₃连接VH和VL成为连续的单链蛋白。

本发明所述的双功能溶瘤病毒，保持了小RNA病毒的基本分子结构，在病毒元件之间插入表达免疫检查点阻断剂的基因，且通过分子生物学和病毒学原理进行设计，形成插入蛋白的游离表达。

本发明一个优选的方案，在柯萨奇B3病毒H3株(GenBank Accession：U57056)基因组序列的5'非翻译区和蛋白P1区之间插入抗人PD-1单克隆抗体scFv序列。

上述抗人PD-1单克隆抗体scFv序列核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

本发明具体的一种双功能溶瘤病毒，其感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID No：11所示。

本发明的另一目的在于提供所述双功能溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的其它癌症和上述各种癌症的组合类型。

本发明的另一目的在于提供一种抗肿瘤药物，含有本发明所述的双功能溶瘤病毒。本发明所述的双功能溶瘤病毒既可以用作单一药剂进行抗肿瘤治疗，也可以与手术切除、放疗、化疗、靶向药物治疗和其它免疫治疗联合使用进行抗肿瘤治疗。并且通过优选的联合实施方案，改善抗肿瘤效果。本发明所述的双功能溶瘤病毒及其联合治疗药物可以使用各种已知的途径给予人体或动物受试者。例如，可以通过常规针头或影像辅助的体内定点给药方式，通过肿瘤内、肠胃内外、皮下、口腔、表皮、皮内、肌肉内、腹膜内和血管内。亦可通过喷雾、液体制剂、膏剂、片剂等已知剂型等给予鼻腔、眼内、气管内、肠内、耳内等。

本发明优点：

本发明所述的溶瘤病毒在肿瘤细胞内完成病毒生活周期“复制-包装-释放”，导致肿瘤细胞裂解和肿瘤抗原释放，病毒感染肿瘤细胞引起局部炎症并激活先天免疫反应。利用溶瘤病毒的载体功能，在肿瘤内原位表达表达免疫检查点阻断剂，进一步增强了T细胞的肿瘤免疫反应和抑制肿瘤细胞的活性。

附图说明

图1为本发明提供的表达外源抗肿瘤蛋白基因改造的溶瘤柯萨奇病毒的基因结构示意图。

图2为本发明表达外源抗肿瘤蛋白基因改造的溶瘤柯萨奇病毒拯救盲传镜检结果。

图3为利用qPCR检验本发明插入溶瘤柯萨奇病毒的外源基因的稳定性结果。

图4为插入Ono外源基因的溶瘤柯萨奇病毒杀伤A549肺癌细胞的镜检结果。

图5为本发明提供的溶瘤柯萨奇病毒杀伤小鼠肿瘤模型的终点记录。

具体实施方式

实施例1带有抗人PD-1单克隆抗体的柯萨奇B3病毒的制备

以柯萨奇B3病毒H3株(GenBank Accession：U57056)序列为基础，在H3基因组序列的5’非翻译区和蛋白P1区之间，顺次插入SfiI酶切位点和3C蛋白酶切割位点。拼接获得的核苷酸序列为未插入外源基因的溶瘤病毒的cDNA序列，交予北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行全序列合成，命名为WH3SfiI，序列为SEQ ID No：1。利用酶切连接方法，把全合成的序列克隆到载体pBluescript II SK的多克隆位点。

全序列合成抗人PD-1单克隆抗体scFv两条，分别命名为Pem和Ono，Pem的氨基酸序列为SEQ ID No：2，长度为680aa，核苷酸序列为SEQ ID No：3，长度为2040bp；Ono的氨基酸序列为SEQ ID No：4，长度为235aa，，核苷酸序列为SEQ ID No：5，长度为705bp。通过PCR、酶切、连接的方式，分别把Pem和Ono利用SfiI酶切位点插入WH3SfiI，形成WH3SfiIPem和WH3SfiIOno。扩增引物分别为：

PemF 5’-GCATgGGGGCCGGAGGGGCCGAGATCGTGCTGACACAGTC-3’(SEQ ID No：6)；

PemR 5’-CCCCCTCCGGCCCCTCCGGCCTTGCCCAGAGACAGGGACAG-3’(SEQ ID No：7)；

OnoF 5’-GCAACAGGCCGGAGGGGCCGAAATTGTGTTGACACAGTCTCC-3’(SEQ ID No：8)；

OnoR 5’-CCCCCTCCGGCCCCTCCGGCCttTGAGGAGACGGTGACCAGGG-3’(SEQ ID No：9)。

WH3SfiIPem感染性克隆核苷酸序列为SEQ ID No：10，WH3SfiIOno感染性克隆核苷酸序列为SEQ ID No：11。构建好的质粒在大肠杆菌种进过扩增后，使用质粒提取试剂盒进行抽提。提取好的质粒使用内切酶进行线性化操作。线性化后的质粒作为模板进行体外转录操作。根据试剂盒说明，配制体外转录体系，包括：10μl 5×Buffer，2.5μg模板，4.5μlATP，4.5μl CTP，4.5μl UTP，1.5μl GTP，3.75μl CAP，2μl RNA酶抑制剂，5μl转录酶，最后用去离子水补齐50μl。37℃温育3h；然后加入5μl DNase，37℃作用5min，去除DNA模板。并使用RNeasyPlus Mini kit回收纯化RNA，分获得WH3SfiIPem和WH3SfiIOno的RNA，使用核酸定量仪检测RNA的提取质量和浓度。

使用WH3SfiIPem和WH3SfiIOno的RNA转染HeLa细胞，拯救病毒。具体方法是使用转染试剂，转染体外转录获得的RNA到HeLa细胞种，培养2～3天，若无细胞病变现象，则将细胞培养液反复冻融3次，盲传到汇合度到达～90％的HeLa细胞中，反复盲传步骤直至观察到细胞病变现象，即细胞皱缩变圆，结果如图2所示。此时收集细胞培养液上清，使用常速离心和0.45μm过滤方法去除细胞碎片。超速离心获得病毒沉淀，重悬后分装冻存在-80℃环境中。

实施例2实时定量PCR鉴定基因改造的溶瘤病毒稳定性

采用实时定量PCR的方法检测考察插入外源基因的柯萨奇病毒的基因转录。使用基因改造的柯萨奇B3病毒感染A549，在感染48小时观察到细胞病变后，收集游离的病毒和细胞RNA。然后通过逆转录和qPCR方法完成外源基因转录鉴定。

具体方法为，在病毒感染终点，收集细胞培养液，离心去除细胞碎片，使用天根RNA提取试剂盒提取RNA(TIANGEN DP430)，具体实验步骤见操作说明书。提取完毕后，使用核酸定量仪检测RNA的提取质量和浓度，并加入RNA酶抑制剂(Thermo#E00382)。紧接着使用罗氏反转录试剂盒(Roche 11483188001)进行反转录，即先行退火，再加入其它反转录试剂进行反转录，具体操作步骤见操作说明书。反转录获得cDNA后，进行实时定量PCR。WH3SfiIPem实时定量PCR引物F 5’-CCCTGGACAGGGACTTGAATGGATG-3’(SEQ ID No：12)，引物R 5’-AGCCCATGTCGAATCTGT-3’(SEQ ID No：13)；WH3SfiIOno实时定量PCR引物F 5’-CTGGAGTCGCCTTCAGTAA-3’(SEQ ID No：14)，引物R 5’-GTAATACATAGCCGTGTCCTC-3’(SEQ IDNo：15)。结果如图3所示，结果显示WH3SfiIPem病毒和WH3SfiIOno病毒在多次传代后，并非都能维持外源基因表达。WH3SfiIPem病毒稳定性较差，被检的外源基因存在丢失情况。而WH3SfiIOno被检的外源基因含量几乎不会随着传代代次增加而减少。根据稳定性需求，后续仅对WH3SfiIOno病毒进行溶瘤效果和安全性分析。

实施例3考察基因改造的柯萨奇B3病毒感染A549细胞效果

通过溶瘤病毒对肺癌肿瘤细胞的体外杀伤实验，评价基因改造的柯萨奇B3病毒的肿瘤杀伤效果。具体方法为，使用10％FBS DMEM培养基将A549细胞重悬至浓度为5×10⁵个/ml，接种于6孔细胞板。当A549细胞在培养板中形成的单层细胞汇合度到达80～95％时，在二级生物安全环境中，更换培养基为2％FBSDMEM培养基，按照感染复数(病毒数/细胞数)＝10加入病毒液WH3SfiIOno。感染后48小时，观察病毒引起的细胞病变情况，结果如图4所示，结果显示A549细胞皱缩变圆，发生病毒引起的细胞病变效应，表明基因改造的柯萨奇B3病毒WH3SfiIOno具有对肺癌肿瘤细胞A549的毒性杀伤能力。

实施例4基因改造的柯萨奇B3病毒溶瘤效果小鼠实验

通过溶瘤病毒对肺癌肿瘤细胞的体内杀伤实验，评价基因改造的柯萨奇B3病毒的肿瘤杀伤效果。具体方法为，消化对数生长期的A549细胞，用PBS缓冲液洗涤重悬后，按照5×10⁶/只的数量接种于周龄为4-5周的小鼠背部皮下，获得荷瘤小鼠。每2天测量肿瘤体积，当肿瘤生长至大小为50～60mm³时，对荷瘤小鼠瘤内注射溶瘤病毒WH3SfiIOno(实验组)或生理盐水缓冲液(对照组)。实验组每只小鼠注射100μl共1×10⁶TCID₅₀病毒颗粒WH3SfiIOno，对照组每只小鼠注射100μl生理盐水。每7天注射一次，共注射3次。到达实验终点，测量荷瘤小鼠的肿瘤体积，实验组小鼠的肿瘤体积显著性小于对照组小鼠的肿瘤体积，如图5所示，结果表明基因改造的柯萨奇B3溶瘤病毒WH3SfiIOno能够在小鼠活体有效消除肿瘤。

实施例5病毒安全性评估

腹腔注射溶瘤病毒WH3SfiIOno溶液，评价小鼠体重变化情况。柯萨奇病毒易感肠道和呼吸道，大量病毒感染会引起小鼠腹泻导致体重下降。为评价本发明提出的基因改造的溶瘤病毒的安全性，采用治疗计量的10倍计量，即1×10⁷TCID₅₀病毒溶液腹腔注射Balb/c小鼠。病毒注射当天为D1，其后每两天称量小鼠体重，评价病毒安全性。

结果表明，小鼠腹腔注射病毒并未显著影响小鼠体重的正常增长，提示本发明提供的柯萨奇B3溶瘤病毒并无明显毒性。

序列表

<110> 胜武（北京）生物科技有限公司

<120> 一种双功能溶瘤病毒及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7439

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaaaacagc ctgtgggttg atcccaccca cagggcctat tgggcgctag cactctggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatat cccctccccc aactgtaact tagaagtaac 120

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cggacagcac accctcaaac cagagggcag tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa 540

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ggaggatgct gtatacggta ctgaaggcct tgaggctctt gatctaacaa cgagtgcagg 6300

ttacccttat gtcgccctgg gcatcaagaa gagagacatc ctctcaaaga agaccaggga 6360

ccttactaag ctgaaagagt gcatggataa gtacggtcta aacctaccaa tggtaaccta 6420

tgtgaaagac gaactcagat ctgcagagaa ggtggcaaag ggaaagtcca ggctcattga 6480

ggcgtccagt ttgaatgact ctgtggcaat gagacagaca ttcggcaact tgtacaaaac 6540

ttttcaccta aacccagggg ttgtgactgg cagtgctgtc gggtgtgacc cggacctctt 6600

ttggagtaaa ataccagtga tgttggacgg tcatctcata gcttttgatt attctggata 6660

tgatgctagc ttgagtcccg tatggtttgc ttgtttaaaa ctactacttg aaaaacttgg 6720

ttactcgcac aaggagacca attacattga ttacctgtgc aactcccatc acctgtacag 6780

ggacaaacat tattttgtgc ggggtggcat gccatctgga tgttctggca caagcatctt 6840

taactcaatg ataaataaca tcataatcag gacactcatg ctgaaggtgt acaaagggat 6900

cgacttggat caattcagga tgattgctta tggtgacgat gtgattgcat catacccgtg 6960

gcccatagat gcgtctttgc ttgctgaagc tggcaaggac tatggattaa tcatgacacc 7020

agcagacaaa ggggagtgct tcaatgaagt tacttggact aacgtcacat tcctaaagag 7080

gtattttaga gcagatgaac aatacccctt tttagtgcac cccgttatgc ccatgaaaga 7140

catacacgaa tcaatcagat ggaccaagga tccaaagaat acccaagacc atgtgcgctc 7200

attgtgctta ttggcctggc acaacgggga gcacgaatat gaggagttta tccgcaaaat 7260

caggagcgtc ccagttggac gttgtttgac tctacctgcg ttctcaacca ttcgtaggaa 7320

gtggttggac tctttctaaa ttagagacaa tttgatctga tttgaattgg cttaacccta 7380

ctgtactaac cgaactagac aacggtgcag taggggtaaa ttctccgcat tcggtgcgg 7439

<210> 2

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser

225 230 235 240

Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys

245 250 255

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln

260 265 270

Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn

275 280 285

Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr

290 295 300

Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln

305 310 315 320

Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe

325 330 335

Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

340 345 350

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

355 360 365

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

370 375 380

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

385 390 395 400

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

405 410 415

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

420 425 430

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

435 440 445

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

450 455 460

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

465 470 475 480

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

485 490 495

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

500 505 510

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

515 520 525

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

530 535 540

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

545 550 555 560

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

565 570 575

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

580 585 590

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

595 600 605

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

610 615 620

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

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Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

645 650 655

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

660 665 670

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

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<210> 3

<211> 2040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagatcgtgc tgacacagtc tcccgccaca ctgtcactgt ctccaggcga aagagccaca 60

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cagcagaagc ccggacaggc tcccagactg ctgatctacc tggcctccta cctggaaagc 180

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agcctggaac ctgaggactt cgccgtgtac tactgccagc acagcagaga tctgcccctg 300

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atctttccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgttgt gtgcctgctg 420

aacaacttct accccagaga agccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480

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agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aagtgtacgc ctgcgaagtg 600

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gtgaccctga caaccgacag cagcaccacc accgcctaca tggaactgaa gtccctgcag 960

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gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg ctggactccg acggctcatt cttcctgtac 1920

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atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtctc tgtccctgtc tctgggcaag 2040

<210> 4

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Val Ala Phe Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg

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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp

165 170 175

Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gggaccaagg tggagatcaa aggcggaggc ggatctggtg gcggaggtag cggtggcggt 360

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 43

<212> DNA

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<400> 9

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<210> 10

<211> 9491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaaaacagc ctgtgggttg atcccaccca cagggcctat tgggcgctag cactctggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatat cccctccccc aactgtaact tagaagtaac 120

acactccgat caacagtcag cgtggcacac cagccatgtt ttgatcaagc acttctgtta 180

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gctgcgttgg cggcctgcct atggggaaac ccataggacg ctctaataca gacatggtgc 420

gaagagtcta ttgagctagt tggtaatcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg 480

cggacagcac accctcaaac cagagggcag tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa 540

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ttgagagatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgtctaat agagctatta 660

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tcccagactg ctgatctacc tggcctccta cctggaaagc ggagtgcctg ccagattttc 960

tggcagcggc tctggcaccg atttcaccct gaccataagc agcctggaac ctgaggactt 1020

cgccgtgtac tactgccagc acagcagaga tctgcccctg acatttggcg gaggcaccaa 1080

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caggacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc caagaggatc ccgaggtgca 2280

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ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc actgacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc 2580

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ccctcctgtg ctggactccg acggctcatt cttcctgtac agcagactga ccgtggacaa 2700

gagcagatgg caagagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa 2760

ccactacacc cagaagtctc tgtccctgtc tctgggcaag gccggagggg ccggaggggg 2820

tggagcttta tttcaaggag ctcaagtatc aacgcaaaag actggggcac atgagaccgg 2880

gctgaatgct agcggcaatt ccattattca ctacacgaat attaattatt acaaagacgc 2940

cgcatccaac tcagccaatc ggcaggattt cactcaagat ccgagcaagt tcacggaacc 3000

agtgaaagat atcatgatta aatcactacc agctctcaac tcccccacag tagaggagtg 3060

cggatacagt gacagggtga gatcaatcac actaggtaac tccaccataa cgactcagga 3120

atgcgctaac gtggtggtag gctatggagt gtggccagat tatctgaagg atagcgaggc 3180

tacagcagag gaccaaccga cccaaccaga cgttgccaca tgtaggttct atacccttga 3240

ctctgtacaa tggcagaaaa cctcaccagg atggtggtgg aagctgcctg atgctttgtc 3300

gaacttagga ctgtttgggc agaacatgca gtaccactac ttgggccgaa ctgggtatac 3360

catacatgtg cagtgcaatg catccaagtt ccaccaagga tgcttgctag tagtgtgtgt 3420

accggaagct gagatgggtt gcgcaacgct aaacaacacc ccatccagtg cagaattgct 3480

ggggggcgat agcgccaaag agtttgcgga caaaccggtt gcatccgggt ccaacaagtt 3540

ggtacagagg gtggtgtata atgcaggcat gggggtgggt gttggaaacc ttaccatttt 3600

ccctcaccag tggatcaatc tacgcaccaa caatagtgct acaattgtga tgccatacac 3660

caacagcgta cctatggata acatgtttag gcataacaac gtcaccctaa tggttatccc 3720

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agccccaatg tgtgccgagt acaatggact acgtttggcc gggcaccagg gcttaccaac 3840

catgaacact ccggggagct gtcaatttct gacatcagac gacttccaat caccatctgc 3900

catgccgcaa tacgacgtca cgccagagat gaggatacct ggtgaggtga agaacttgat 3960

ggaaatagct gaggttgact cagttgtccc ggtccaaaat gttggagaga aggtcaactc 4020

catggaagcg taccagatac ctgtgagatc caatgaagga tctggaacgc aagtattcgg 4080

cttcccactg caaccagggt attcgagtgt tttcagtcgg acgctcctag gagagatctt 4140

gaactattac acccattggt cgggcagcat aaagctcacg tttatgttct gtggttcggc 4200

catggccact ggaaaattcc ttttggcata ctcaccacca ggcgctgggg ctcccacaaa 4260

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cgtgctgtgc ataccctgga taagccaaac acactaccgg tatgttgctt cagatgagta 4380

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attgaaggac actcctttta tttcgcagca aaactttttc cagggccccg tggaagacgc 4560

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ggctatacca gcactcactg ctgctgagac aggtcacacg tcgcaagtag tgccgagtga 4680

caccatgcag acacgccacg ttaagaacta ccattcaagg tctgagtcga ccatagagaa 4740

cttcctatgt aggtcagcat gcgtgtactt tacagagtat gaaaactcag gcgccaagcg 4800

gtatgctgaa tgggtaataa caccacgaca agcggcacaa cttaggagaa agctagaatt 4860

ctttacctac gtccggtttg acctggagct gacgtttgtc ataacaagta ctcaacagcc 4920

ctcaaccaca cagaaccagg atgcacagat cctaacacac caaattatgt atgtaccacc 4980

aggtgggcct gtgccagaca aagtcgattc ttacgtgtgg caaacatcta cgaatcccag 5040

tgtgttttgg accgagggaa acgccccgcc gcgtatgtcc gtaccgtttt tgagcattgg 5100

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tatcaacaca ctaaacaaca tgggcacgct atatgcaaga catgtcaatg ctggaagcac 5220

gggaccaata aaaagcacca ttagaatcta cttcaaacct aagcatgtca aagcgtggat 5280

acctagacca cctagactct gccaatacga gaaggcaaag aacgtgaact tccaacccag 5340

cggagttacc actactaggc aaagcatcac tacaatgaca aatacgggcg catttggaca 5400

acaatcaggg gcagtatacg tagggaacta cagggtagta aatagacatc tagctaccag 5460

tgctgactgg caaaactgtg tgtgggaaaa ttacaacaga gacctcttag tgagcacgac 5520

cacagcacat ggatgtgata ttatagccag atgtcggtgt acaacgggag tgtacttttg 5580

tgcgtccaaa aacaaacact acccaatttc atttgaagga ccaggtatag tagaggtcca 5640

agagagtgag tactacccta ggagatacca atcccatgtg cttttagcag ctgggttttc 5700

cgaaccaggt gactgtggcg gtatcctaag gtgtgagcat ggtgtcattg gcattgtgac 5760

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tgtggtgagg aaccacgatg acctaatcac ggtgactgcc acactagccc tcattggttg 6060

tacctcgtcc ccatggcggt ggcttaagca gaaagtgtcc caatattacg gaatacccat 6120

ggctgaacgc caaaacaacg gatggctaaa aaagttcact gagatgacaa acgcctgcaa 6180

gggcatggaa tggatagcca ttaagattca gaaattcatt gagtggctca aagttaaaat 6240

tttacctgag gtcagggaaa aacacgaatt cctgaacaga ctcaaacagc tccccctgtt 6300

agagagtcaa attgccacaa tcgagcaaag tgcaccgtca cagagtgacc aggagcaatt 6360

gttttccaat gtccaatact ttgctcacta ttgcagaaag tatgctcccc tttatgcatc 6420

agaggcaaag agagtgttct cccttgagaa gaagatgagt aattacatac agttcaagtc 6480

caaatgccgt attgagcctg tatgtctgct cctgcatggg agtcccggtg caggtaagtc 6540

agttgcaaca aatctgatcg gaagatcact cgcggaaaag ttaaacagct cagtgtattc 6600

actaccccca gacccagatc acttcgatgg ctataaacag caggctgtag tgatcatgga 6660

cgatctatgt cagaaacccg atgggaaaga tgtctccttg ttctgtcaga tggtttccag 6720

tgtggatttt gtaccaccca tggccgccct ggaagagaaa ggcatcttgt tcacctcccc 6780

gttcgttttg gcatcaacca atgcgggatc tattaacgct ccaactgtgt cagacagcag 6840

ggccttagca aggagattcc actttgacat gaatattgaa gttatttcta tgtacagcca 6900

aaatggcaag ataaacatgc caatgtcagt gaagacgtgt gatgaagagt gttgcccagt 6960

caactttaag aaatgttgcc cgttagtctg tggaaaggcc atccaattca tagacagaag 7020

aactcaagtc agatactctc tagatatgct ggtaactgag atgtttaggg aatacaacca 7080

caggcacagt gtcggggcta cccttgaggc actgttccag ggtccaccag tatacagaga 7140

gattaagatt agcgtggcac cagaaacacc accaccacca cgtatcgcgg acttgcttaa 7200

atcagtggat agcgaagccg tgagagagta ttgcaaagaa aagggatggt tggttcctga 7260

ggtcaactcc accctccaaa ttgaaaaaca tgtcagtcgg gctttcatct gcttgcaggc 7320

aataactacg tttgtgtcag tagctggaat catctatata atatacaagc tctttgcagg 7380

ctttcaaggt gcatatacag gaatacccaa ccagaagccc aaggtaccta ccctaaggca 7440

agcaaaagtg cagggtcctg catttgaatt tgctgttgca atgatgaaga ggaactcaag 7500

cacagtgaag acagagtatg gtgagttcac catgttgggc atttatgata ggtgggccgt 7560

tttgccacgt catgccaaac ccggaccaac catcctgatg aatgaccagg aggtaggcgt 7620

gctggacgct aaagagttag tggataagga tggtacaaac ctagaactga cactgctcaa 7680

gttgaacagg aacgagaagt tcagagacat cagaggcttc ttagcaaagg aggaggtgga 7740

agtcaacgag gccgtgctag caattaatac cagtaaattt cccaacatgt acattccggt 7800

gggacaagtc acggattacg gtttcctaaa cctgggtggt acgcccacta aaagaatgct 7860

tatgtacaac ttccccacga gagcaggtca atgtggcgga gtactcatgt ccaccggcaa 7920

agtcctgggg atccatgttg gtggaaatgg tcatcaaggt ttctcagcgg cacttctcaa 7980

gcactatttc aatgatgaac aaggagagat cgagtttatt gagagctcaa aggaagcagg 8040

gttccctatt atcaacacac ctagtaagac taagctggag ccgagtgtct tccaccaggt 8100

ttttgaaggt gacaaagagc cagcggtcct caggaatggt gatccacgcc tcaaagtcaa 8160

ctttgaggag gccatatttt ccaagtacat cgggaatgtt aacacacacg tggatgaata 8220

catgatggag gctgttgacc attatgccgg acaattggcc accctagaca ttagcactga 8280

accaatgaag ttggaggatg ctgtatacgg tactgaaggc cttgaggctc ttgatctaac 8340

aacgagtgca ggttaccctt atgtcgccct gggcatcaag aagagagaca tcctctcaaa 8400

gaagaccagg gaccttacta agctgaaaga gtgcatggat aagtacggtc taaacctacc 8460

aatggtaacc tatgtgaaag acgaactcag atctgcagag aaggtggcaa agggaaagtc 8520

caggctcatt gaggcgtcca gtttgaatga ctctgtggca atgagacaga cattcggcaa 8580

cttgtacaaa acttttcacc taaacccagg ggttgtgact ggcagtgctg tcgggtgtga 8640

cccggacctc ttttggagta aaataccagt gatgttggac ggtcatctca tagcttttga 8700

ttattctgga tatgatgcta gcttgagtcc cgtatggttt gcttgtttaa aactactact 8760

tgaaaaactt ggttactcgc acaaggagac caattacatt gattacctgt gcaactccca 8820

tcacctgtac agggacaaac attattttgt gcggggtggc atgccatctg gatgttctgg 8880

cacaagcatc tttaactcaa tgataaataa catcataatc aggacactca tgctgaaggt 8940

gtacaaaggg atcgacttgg atcaattcag gatgattgct tatggtgacg atgtgattgc 9000

atcatacccg tggcccatag atgcgtcttt gcttgctgaa gctggcaagg actatggatt 9060

aatcatgaca ccagcagaca aaggggagtg cttcaatgaa gttacttgga ctaacgtcac 9120

attcctaaag aggtatttta gagcagatga acaatacccc tttttagtgc accccgttat 9180

gcccatgaaa gacatacacg aatcaatcag atggaccaag gatccaaaga atacccaaga 9240

ccatgtgcgc tcattgtgct tattggcctg gcacaacggg gagcacgaat atgaggagtt 9300

tatccgcaaa atcaggagcg tcccagttgg acgttgtttg actctacctg cgttctcaac 9360

cattcgtagg aagtggttgg actctttcta aattagagac aatttgatct gatttgaatt 9420

ggcttaaccc tactgtacta accgaactag acaacggtgc agtaggggta aattctccgc 9480

attcggtgcg g 9491

<210> 11

<211> 8159

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttaaaacagc ctgtgggttg atcccaccca cagggcctat tgggcgctag cactctggta 60

tcacggtacc tttgtgcgcc tgttttatat cccctccccc aactgtaact tagaagtaac 120

acactccgat caacagtcag cgtggcacac cagccatgtt ttgatcaagc acttctgtta 180

ccccggactg agtatcaata gactgctcac gcggttgaag gagaaagcgt tcgttatccg 240

gccaactact tcgaaaaacc cagtaacacc atagaggttg cagagtgttt cgctcagcac 300

taccccagtg tagaccaggc cgatgagtca ccgcattccc cacgggcgac cgtggcggtg 360

gctgcgttgg cggcctgcct atggggaaac ccataggacg ctctaataca gacatggtgc 420

gaagagtcta ttgagctagt tggtaatcct ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg 480

cggacagcac accctcaaac cagagggcag tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa 540

ccgactactt tgggtgtccg tgtttcattt tattcctata ctggctgctt atggtgacaa 600

ttgagagatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgtctaat agagctatta 660

tatatctctt tgttggattt ataccactta gcttgagaga ggttaaaaca ttacaattca 720

ttgttaaatt gaatacaaca aaatgggggc cggaggggcc gaaattgtgt tgacacagtc 780

tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca 840

gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct ggccaggctc ccaggctcat 900

catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc 960

tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct gaagattttg cagtttatta 1020

ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa 1080

aggcggaggc ggatctggtg gcggaggtag cggtggcggt ggatctcagg tgcagctggt 1140

ggagtctggg ggagacgtgg tccagcctgg ggggtccctg agactctcct gtgcagcgtc 1200

tggagtcgcc ttcagtaact atggcatgca ctgggtccgc caggctcccg gcaaggggct 1260

ggagtgggtg gcagttatct ggtatgatgg aagtaataaa tactatgcag actccgtgaa 1320

gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacatg ctctatctgc aaatgaacag 1380

cctgagagcc gaggacacgg ctatgtatta ctgtgcgagg aacgatgact actggggcca 1440

gggaaccctg gtcaccgtct cctcaaaggc cggaggggcc ggagggggtg gagctttatt 1500

tcaaggagct caagtatcaa cgcaaaagac tggggcacat gagaccgggc tgaatgctag 1560

cggcaattcc attattcact acacgaatat taattattac aaagacgccg catccaactc 1620

agccaatcgg caggatttca ctcaagatcc gagcaagttc acggaaccag tgaaagatat 1680

catgattaaa tcactaccag ctctcaactc ccccacagta gaggagtgcg gatacagtga 1740

cagggtgaga tcaatcacac taggtaactc caccataacg actcaggaat gcgctaacgt 1800

ggtggtaggc tatggagtgt ggccagatta tctgaaggat agcgaggcta cagcagagga 1860

ccaaccgacc caaccagacg ttgccacatg taggttctat acccttgact ctgtacaatg 1920

gcagaaaacc tcaccaggat ggtggtggaa gctgcctgat gctttgtcga acttaggact 1980

gtttgggcag aacatgcagt accactactt gggccgaact gggtatacca tacatgtgca 2040

gtgcaatgca tccaagttcc accaaggatg cttgctagta gtgtgtgtac cggaagctga 2100

gatgggttgc gcaacgctaa acaacacccc atccagtgca gaattgctgg ggggcgatag 2160

cgccaaagag tttgcggaca aaccggttgc atccgggtcc aacaagttgg tacagagggt 2220

ggtgtataat gcaggcatgg gggtgggtgt tggaaacctt accattttcc ctcaccagtg 2280

gatcaatcta cgcaccaaca atagtgctac aattgtgatg ccatacacca acagcgtacc 2340

tatggataac atgtttaggc ataacaacgt caccctaatg gttatcccat ttgtaccgct 2400

agattactgc cctgggtcta ccacgtacgt cccaatcacg atcacgatag ccccaatgtg 2460

tgccgagtac aatggactac gtttggccgg gcaccagggc ttaccaacca tgaacactcc 2520

ggggagctgt caatttctga catcagacga cttccaatca ccatctgcca tgccgcaata 2580

cgacgtcacg ccagagatga ggatacctgg tgaggtgaag aacttgatgg aaatagctga 2640

ggttgactca gttgtcccgg tccaaaatgt tggagagaag gtcaactcca tggaagcgta 2700

ccagatacct gtgagatcca atgaaggatc tggaacgcaa gtattcggct tcccactgca 2760

accagggtat tcgagtgttt tcagtcggac gctcctagga gagatcttga actattacac 2820

ccattggtcg ggcagcataa agctcacgtt tatgttctgt ggttcggcca tggccactgg 2880

aaaattcctt ttggcatact caccaccagg cgctggggct cccacaaaaa gggttgatgc 2940

tatgcttggc actcatgtag tttgggatgt ggggctacaa tcaagttgcg tgctgtgcat 3000

accctggata agccaaacac actaccggta tgttgcttca gatgagtata ccgcaggggg 3060

ttttattacg tgctggtatc aaacaaacat agtcgtccca gcagatgccc aaagctcctg 3120

ttacatcatg tgtttcgtat cagcatgcaa tgatttctct gtcaggctat tgaaggacac 3180

tccttttatt tcgcagcaaa actttttcca gggccccgtg gaagacgcga taacagccgc 3240

catagggaga gttgcggaca ccgtgggtac agggccaacc aactcagagg ctataccagc 3300

actcactgct gctgagacag gtcacacgtc gcaagtagtg ccgagtgaca ccatgcagac 3360

acgccacgtt aagaactacc attcaaggtc tgagtcgacc atagagaact tcctatgtag 3420

gtcagcatgc gtgtacttta cagagtatga aaactcaggc gccaagcggt atgctgaatg 3480

ggtaataaca ccacgacaag cggcacaact taggagaaag ctagaattct ttacctacgt 3540

ccggtttgac ctggagctga cgtttgtcat aacaagtact caacagccct caaccacaca 3600

gaaccaggat gcacagatcc taacacacca aattatgtat gtaccaccag gtgggcctgt 3660

gccagacaaa gtcgattctt acgtgtggca aacatctacg aatcccagtg tgttttggac 3720

cgagggaaac gccccgccgc gtatgtccgt accgtttttg agcattggca acgcttattc 3780

aaatttctat gatgggtggt ctgaattttc caggaacggg gtttacggta tcaacacact 3840

aaacaacatg ggcacgctat atgcaagaca tgtcaatgct ggaagcacgg gaccaataaa 3900

aagcaccatt agaatctact tcaaacctaa gcatgtcaaa gcgtggatac ctagaccacc 3960

tagactctgc caatacgaga aggcaaagaa cgtgaacttc caacccagcg gagttaccac 4020

tactaggcaa agcatcacta caatgacaaa tacgggcgca tttggacaac aatcaggggc 4080

agtatacgta gggaactaca gggtagtaaa tagacatcta gctaccagtg ctgactggca 4140

aaactgtgtg tgggaaaatt acaacagaga cctcttagtg agcacgacca cagcacatgg 4200

atgtgatatt atagccagat gtcggtgtac aacgggagtg tacttttgtg cgtccaaaaa 4260

caaacactac ccaatttcat ttgaaggacc aggtatagta gaggtccaag agagtgagta 4320

ctaccctagg agataccaat cccatgtgct tttagcagct gggttttccg aaccaggtga 4380

ctgtggcggt atcctaaggt gtgagcatgg tgtcattggc attgtgacca tggggggtga 4440

aggcgtggtc ggctttgcag acatccgtga tctcctgtgg ctggaagatg atgcaatgga 4500

acagggagtg aaggactatg tggaacagct tggaaatgca ttcggctctg gcttcactaa 4560

ccaaatatgt gagcaagtca acctcctgaa ggaatcacta gtgggtcaag actccatctt 4620

agagaagtct ctaaaagcct tagttaagat aatatcagcc ttagtaattg tggtgaggaa 4680

ccacgatgac ctaatcacgg tgactgccac actagccctc attggttgta cctcgtcccc 4740

atggcggtgg cttaagcaga aagtgtccca atattacgga atacccatgg ctgaacgcca 4800

aaacaacgga tggctaaaaa agttcactga gatgacaaac gcctgcaagg gcatggaatg 4860

gatagccatt aagattcaga aattcattga gtggctcaaa gttaaaattt tacctgaggt 4920

cagggaaaaa cacgaattcc tgaacagact caaacagctc cccctgttag agagtcaaat 4980

tgccacaatc gagcaaagtg caccgtcaca gagtgaccag gagcaattgt tttccaatgt 5040

ccaatacttt gctcactatt gcagaaagta tgctcccctt tatgcatcag aggcaaagag 5100

agtgttctcc cttgagaaga agatgagtaa ttacatacag ttcaagtcca aatgccgtat 5160

tgagcctgta tgtctgctcc tgcatgggag tcccggtgca ggtaagtcag ttgcaacaaa 5220

tctgatcgga agatcactcg cggaaaagtt aaacagctca gtgtattcac tacccccaga 5280

cccagatcac ttcgatggct ataaacagca ggctgtagtg atcatggacg atctatgtca 5340

gaaacccgat gggaaagatg tctccttgtt ctgtcagatg gtttccagtg tggattttgt 5400

accacccatg gccgccctgg aagagaaagg catcttgttc acctccccgt tcgttttggc 5460

atcaaccaat gcgggatcta ttaacgctcc aactgtgtca gacagcaggg ccttagcaag 5520

gagattccac tttgacatga atattgaagt tatttctatg tacagccaaa atggcaagat 5580

aaacatgcca atgtcagtga agacgtgtga tgaagagtgt tgcccagtca actttaagaa 5640

atgttgcccg ttagtctgtg gaaaggccat ccaattcata gacagaagaa ctcaagtcag 5700

atactctcta gatatgctgg taactgagat gtttagggaa tacaaccaca ggcacagtgt 5760

cggggctacc cttgaggcac tgttccaggg tccaccagta tacagagaga ttaagattag 5820

cgtggcacca gaaacaccac caccaccacg tatcgcggac ttgcttaaat cagtggatag 5880

cgaagccgtg agagagtatt gcaaagaaaa gggatggttg gttcctgagg tcaactccac 5940

cctccaaatt gaaaaacatg tcagtcgggc tttcatctgc ttgcaggcaa taactacgtt 6000

tgtgtcagta gctggaatca tctatataat atacaagctc tttgcaggct ttcaaggtgc 6060

atatacagga atacccaacc agaagcccaa ggtacctacc ctaaggcaag caaaagtgca 6120

gggtcctgca tttgaatttg ctgttgcaat gatgaagagg aactcaagca cagtgaagac 6180

agagtatggt gagttcacca tgttgggcat ttatgatagg tgggccgttt tgccacgtca 6240

tgccaaaccc ggaccaacca tcctgatgaa tgaccaggag gtaggcgtgc tggacgctaa 6300

agagttagtg gataaggatg gtacaaacct agaactgaca ctgctcaagt tgaacaggaa 6360

cgagaagttc agagacatca gaggcttctt agcaaaggag gaggtggaag tcaacgaggc 6420

cgtgctagca attaatacca gtaaatttcc caacatgtac attccggtgg gacaagtcac 6480

ggattacggt ttcctaaacc tgggtggtac gcccactaaa agaatgctta tgtacaactt 6540

ccccacgaga gcaggtcaat gtggcggagt actcatgtcc accggcaaag tcctggggat 6600

ccatgttggt ggaaatggtc atcaaggttt ctcagcggca cttctcaagc actatttcaa 6660

tgatgaacaa ggagagatcg agtttattga gagctcaaag gaagcagggt tccctattat 6720

caacacacct agtaagacta agctggagcc gagtgtcttc caccaggttt ttgaaggtga 6780

caaagagcca gcggtcctca ggaatggtga tccacgcctc aaagtcaact ttgaggaggc 6840

catattttcc aagtacatcg ggaatgttaa cacacacgtg gatgaataca tgatggaggc 6900

tgttgaccat tatgccggac aattggccac cctagacatt agcactgaac caatgaagtt 6960

ggaggatgct gtatacggta ctgaaggcct tgaggctctt gatctaacaa cgagtgcagg 7020

ttacccttat gtcgccctgg gcatcaagaa gagagacatc ctctcaaaga agaccaggga 7080

ccttactaag ctgaaagagt gcatggataa gtacggtcta aacctaccaa tggtaaccta 7140

tgtgaaagac gaactcagat ctgcagagaa ggtggcaaag ggaaagtcca ggctcattga 7200

ggcgtccagt ttgaatgact ctgtggcaat gagacagaca ttcggcaact tgtacaaaac 7260

ttttcaccta aacccagggg ttgtgactgg cagtgctgtc gggtgtgacc cggacctctt 7320

ttggagtaaa ataccagtga tgttggacgg tcatctcata gcttttgatt attctggata 7380

tgatgctagc ttgagtcccg tatggtttgc ttgtttaaaa ctactacttg aaaaacttgg 7440

ttactcgcac aaggagacca attacattga ttacctgtgc aactcccatc acctgtacag 7500

ggacaaacat tattttgtgc ggggtggcat gccatctgga tgttctggca caagcatctt 7560

taactcaatg ataaataaca tcataatcag gacactcatg ctgaaggtgt acaaagggat 7620

cgacttggat caattcagga tgattgctta tggtgacgat gtgattgcat catacccgtg 7680

gcccatagat gcgtctttgc ttgctgaagc tggcaaggac tatggattaa tcatgacacc 7740

agcagacaaa ggggagtgct tcaatgaagt tacttggact aacgtcacat tcctaaagag 7800

gtattttaga gcagatgaac aatacccctt tttagtgcac cccgttatgc ccatgaaaga 7860

catacacgaa tcaatcagat ggaccaagga tccaaagaat acccaagacc atgtgcgctc 7920

attgtgctta ttggcctggc acaacgggga gcacgaatat gaggagttta tccgcaaaat 7980

caggagcgtc ccagttggac gttgtttgac tctacctgcg ttctcaacca ttcgtaggaa 8040

gtggttggac tctttctaaa ttagagacaa tttgatctga tttgaattgg cttaacccta 8100

ctgtactaac cgaactagac aacggtgcag taggggtaaa ttctccgcat tcggtgcgg 8159

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccctggacag ggacttgaat ggatg 25

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcccatgtc gaatctgt 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctggagtcgc cttcagtaa 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtaatacata gccgtgtcct c 21

Claims

1.一种双功能溶瘤病毒，其特征在于所述双功能溶瘤病毒在溶瘤病毒的分子结构中插入一种或几种表达免疫检查点阻断剂的功能片段，所述溶瘤病毒为小RNA病毒。

2.如权利要求1所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述小RNA病毒包含肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、副肠孤病毒属、嵴病毒属。

3.如权利要求2所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述肠病毒属包括脊髓灰质炎病毒、肠病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒。

4.如权利要求3所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述柯萨奇病毒包括柯萨奇A组病毒和柯萨奇B组病毒。

5.如权利要求4所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述柯萨奇病毒为柯萨奇B3病毒。

6.如权利要求1所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述免疫检查点阻断剂为抑制性免疫共刺激分子的受体PD-1、KIR、LAG3、TIM3、A2aR、CTLA-4、BTLA或配体PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、CD155、B7-H3、B7-H4、B7-H5、HVEM、GAL9、MHC class I or II的抗体或具有抗原结合部位的片段或其组合。

7.如权利要求6所述的双功能溶瘤病毒，其特征在于所述具有抗原结合部位的片段为Fab或scFv。

8.如权利要求1-7任一项所述的双功能溶瘤病毒，其特征在于保持小RNA病毒分子基本结构，在病毒元件之间插入表达免疫检查点阻断剂的基因。

9.如权利要求1所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述溶瘤病毒为柯萨奇B3病毒，所述表达免疫检查点阻断剂为PD-1的抗体或具有PD-1抗原结合部位的片段或其组合。

10.如权利要求9所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述表达免疫检查点阻断剂为抗人PD-1的scFv序列。

11.如权利要求10所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于柯萨奇B3病毒H3株基因组序列的5’非翻译区和蛋白P1区之间插入抗人PD-1单克隆抗体scFv序列。

12.如权利要求11所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于所述抗人PD-1单克隆抗体scFv序列核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

13.如权利要求9所述的双功能溶瘤病毒,其特征在于其感染性克隆的序列如SEQ IDNo.11所示。

14.如权利要求1-13任一项所述的双功能溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于所述肿瘤选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌或T细胞淋巴瘤。

16.一种抗肿瘤药物，其特征在于含有权利要求1-13任一项所述的双功能溶瘤病毒。

17.如权利要求16所述的抗肿瘤药物，其特征在于通过肿瘤内、肠胃内外、皮下、口腔、表皮、皮内、肌肉内、腹膜内、血管内、鼻腔、眼内、气管内、肠内或耳内给药。